BG100204A - Метод за изолиране на ловастатин - Google Patents

Abstract

Методът за изолиране на хиполипазно активно вещество ловастатин от проба, например ферментационна хранителна среда, мицел или филтрат на Aspergillus terreus (ATCC 20542) или Aspergillus oryzae (АТСС74135), включва екстракция с бутилацетат. Едновременно с концентрацията на екстракта се извършва и лактонизация. След това се извършва директна кристализация на ловастатин в лактонна форма от бутилацетат.

Description

Изобретението се отнася до метод за изолиране на хиполипазно активно вещество ловастатин от ферментационна хранителна среда и ще намери приложение в областта на биотехнологията.

Ловастатинът се произвежда като вторичен метаболит на фунги (плесени, гъби) Aspergillus terreus (US 4, 231, 938), депозирани в Американската колекция за типови култури под No ATCC 20541, ATCC 20542 и Monascus ruber депозиран във Ферментационната изследователска институтска агенция на индустриалната наука и технология към Министерството на търговията и индустрията, Япония (DE 30 06 216 Al) под No Ferm 4822. Добре познати са и други видове микроорганизми, продуциращи ловастатин, например мутант на микроорганизъм A spergillus terreus uAspergillus oryza е, маркиран ATCC 74135.

Ловастатинът представлява химически Г, 2', 6', 7, 8а’ - хексахидро 3, 5 - дихидрокси - 2', 6' - диметил - 8' - 2” - метил - 1” - оксобутокси - 1 нафталин енантова киселина - 5 - лактон (описан от Stubbs et al., 1986) и се изразява с формулата посочена в ЕР 0 033 537 А1

Съединение I

Една активна форма на ловастатина е също киселина, която представлява химически 1,2,6,8,8а - хексахидро - В, - дихидрокси -1 нафталин енантова киселина (описана от Alberts et al., 1980) и се изразява с формулата (посочена в ЕР 0 022 478 А1)

Съединение Π

Лакшонната форма на ловастатина се използва като агент за понижаване нивото на холестерола в кръвта (Scott М. G. and Vega G. L, 1985). Той инхибира биосинтезите на 3,5 - диокси - 3 - метилвалерианова киселина чрез инхибиране на 3 - хидрокси - 3 - метилглутарил А редуктазния коензим (HMG-CoA reductase, Е. С. 1.1.1.34) (Zubay et al., 1984).

Предшестващо шелшпехниката

След завършената ферментация, ловастатин се подава в хранителната среда в лактонна форма (съединение I) и в кисела форма (съединение II). В изолационния процес, както е описан в ЕР 0 033 536 А2, ловастатинът се екстрахира от хранителната среда с етилацетат.

Екстрактът се концентрира чрез вакуумна дестилация. Тъй като ловастатина се представя в лактонна форма, както и в кисела форма и само лактонът представлява търговски интерес, киселата форма трябва да се превърне в лактон.

Лактонизацията се осъществява чрез дефлегмация на концентрата в толуол при 106°С за 2 часа. След като лактонизацията завърши, разтворът се концентрира до малък обем. Чиста субстанция се получава посредством пречистване на концентрата през колона, запълнена със силикагел, в присъствие на разтворители, такива като етилацетат или п-хексан. Сборните фракции отново се концентрират във вакуум и тогава чистият ловастатин кристализира в лактонна форма.

Поради множество сложни стъпки на процедурата и тежки условия, използвани при изолирането, добивите на ловастатин са обикновено ниски. Различните разтворители които се използват, такива като бензин, толуол, ацетонитрил или етилацетат, проявяват отчасти токсичност. След работа с тези разтворители здравето на включилите се лица е изложено на опасност и поставя проблеми с опазване на околната среда.

Сьщноахитиобретението

Предмет на настоящето изобретение е да се преодолеят посочените по-горе недостатъци на състоянието на техниката и да се даде метод за изолиране на ловастатин по един ефикасен и икономичен начин. В допълнение би следвало да се обърне внимание на здравните аспекти за включените в изолирането работници и за опазване на околната среда.

Като резултат от обширното проучване, довело до настоящето изобретение, настоящите изобретатели откриха, че ловастатинът може да бъде изолиран лесно чрез екстрахиране на ловастатин от проба с бутилацетат, концентриране на разтвора и извличането му чрез кристализация.

В едно предпочитано изпълнение бе осъществена концентрация на разтвора под понижено налягане. В едно следващо изпълнение концентрация се осъществи при температура около 40°С със или без понижено налягане.

В още едно предпочитано изпълнение пробата от ловастатин се извлича от микроорганизми, за предпочитане фунги, позволяващи продуциране на ловастатин. В този случай пробата може да бъде ферментационната среда, в която микроорганизма или съответно фунгите са били израстени, мицелия на фунгите или филтрата.

Фунгите, които могат да бъдат използвани не са ограничени и кои и да са фунги способни да продуцират ловастатин могат да бъдат използвани, като се предпочитат тези, принадлежащи към рода Aspergillus, по-точно Aspergillus oryzae или Aspergillus terreus.

В още едно предпочитано изпълнение фунгите са Aspergillus terreus (ATCC 20542) сим Aspergillus oryzae (ATCC 74135).

Съгласно метода на настоящето изобретение ловастатин може да бъде получен единствено в лактонна форма.

Изненадващо беше открито, че използвания разтворител, т.е. бутилацетата, осигурява признаци позволяващи да се постигне тази цел, а именно - в лактонизационния метод се отделя вода и тя трябва да бъде отстранена от реакционната среда, тъй като бутилацетата има по-висока температура на кипене и всъщност не образува ацеотропни смеси с вода при дадените условия. Това именно позволява всичката вода, образувана през лактонизационния процес да бъде отстранена.

Чрез метода съгласно настоящето изобретение става възможно да бъде скъсявано времето за изолиране на ловастатина. Тъй като бутилацетата може да бъде използван за да екстрахира ловастатина от проба и в същото време може да бъде оползотворен за извършване на лактонизацията, токсичните ефекти от другите разтворители могат да бъдат избегнати.

Методът може да бъде индустриално възпроизведен с крайни добиви около 60%, независимо дали ловастатина е бил продуциран чрез микроорганизми междуклетъчно или външноклетъчно, в лактонна форма или в кисела форма.

Изолираната субстанция е същата както субстанцията, изолирана съгласно методите от състоянието на техниката. Структурата беше потвърдена от IR спектроскопия (фиг.1), масспектроскопия (фиг.2), NMR (ядрено-магнитен резонанс) (фиг.З) и UV (ултравиолетова) спектроскопия (фиг.4).

Изобретението е илюстрирано от следващите примери:

Пример 1 ферментационна хранителна среда (1000 ml), получена чрез ферментация на Aspergillus terreus (ATCC 20542) или Aspergillus oryzae (ATCC 74135) и имаща pH стойност от 4.8, възраст от 120 часа и съдържание на ловастатин 300 mg/ml (лактон + киселина) бе подкислена със НС1 (36%) до pH от 3 - 5. След това ферментационната среда бе охладена под 20°С, бе добавен бутилацетат (500 ml) и тя бе екстрахирана за 4 часа при тази температура. След завършване на екстракцията, ферментационната среда бе центруфугирана и водната и органичната фази бяха разделени.

Мицелия и водната фаза бяха бракувани (отстранени) и органичната фаза бе обработвана по-нататък. Тя бе концентрирана чрез вакуумдестилация при температура около 40°С до обем от 50 ml. Едновременно с концентрирането бе извършен така добре и процеса на лактонизация. След това концентратът бе охладен до температура под 20°С и оставен да стои няколко часа, така че ловастатина да кристализира.

Полученият суров продукт бе рекристализиран. Бе получен ловастатин (170 mg) в лактонна форма, имащ чистота около 90%.

Пример 2 ферментационна хранителна среда (1000 ml), получена чрез ферментацията на Aspergillus terreus (ATCC 20542) ухлм Aspergillus oryzae (ATCC 74135) и имаща pH стойност от 4.73 , възраст от 120 часа и съдържание на ловастатин от 190 mg/ml (лактон + киселина) във филтрата и 15 mg/ml В мицелия, бе подкислена с НО (36%) до pH 3-5. Хранителната среда бе филтрирана върху Oliver филтър. Мицелият бе бракуван, филтратът бе охладен до температура под 20°С и беше добавен бутилацетат в количество равно на половината от обема на филтрата. Той бе екстрахиран за 1 час. След това бяха извършени процедурите както в Пример 1.

Бе получен ловастатин (79mg) в лактонна форма, имащ чистота около 90%.

Пример 3

Ферментационна хранителна среда (1000 ml) получена чрез ферментация на Aspergillus terreus (ATCC 20542) или Aspergillus oryzae (ATCC 74135) и имаща pH стойност 4.78, възраст от 120 часа и съдържание на ловастатин от 5 mg/ml (лактон + киселина) във филтрата и 300 mg/ml в мицелия бе подкислена с НС1 (36%) до pH от 35 и центрофугирана, филтратът бе бракуван, а 4-ри кратно намален (спрямо мицела) обем от бутилацетат бе добавен към мицелия и той бе охладен под 20°С, след което бе екстрахиран за 4 часа. Екстракцията бе последвана от центрофугиране. Мицелият бе бракуван и филтратът от него обработен както в Пример 1.

Получен бе ловастатин (90 mg) в лактонна форма, имащ чистота около 90%.

Claims (5)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   1. Метод за изолиране на ловастатин, характеризиращ се с това, че ловастанина се екстрахира от ферментационна хранителна среда, мицелий или филтрат от микроорганизъм, позволяващ продуциране на ловастатин с бутилацетат, полученият разтвор от ловастатин в бутилацетат се концентрира под понижено налягане и температура над 40°С и се оставя да кристализира.
2. 2. Метод, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че микроорганизмите, позволяващи продуциране на ловастатин са фунги.
3. 3. Метод, съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че фунгите принадлежат към рода Aspergillus.
4. 4. Метод, съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че фунгите принадлежат към рода Aspergillus terreus или Aspergillus oryzae.
5. 5. Метод, съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че фунгите са Aspergillus terreus (ATCC 20542) или Aspergillus oryzae (ATCC 74135).