CZ283540B6 - Způsob isolace lovastatinu - Google Patents

Abstract

Způsob isolace lovastatinu, podle něhož se lovastatin z fermentační živné půdy, mycelia nebo filtrátu mikroorganismu, který je schopen produkovat lovastatin, s výhodou plísně, nejlépe rodu Aspergillus terreus nebo Aspergillus oryzae, extrahuje butylacetátem, získaný roztok se zahustí za sníženého tlaku a nechá se krystalizovat.ŕ

Description

Způsob izolace lovastatinu

Oblast techniky

Tento vynález se týká způsobu izolace lovastatinu, sloučeniny, která je hypolipemicky aktivní, z fermentačního živného prostředí.

Dosavadní stav techniky

Lovastatin je produkován jako sekundární metabolit plísní Aspergillus terreus (USA patent 4 231 938), která je uložena v Americké sbírce typů kultur pod č. ATCC 20451, ATCC 20542, a Monascus ruber, která je uložena ve Fermantation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology. Ministerstvo mezinárodního obchodu a průmyslu. Japonsko (NSR spis č. 30 06 216 Al), pod č. Ferm 4822. Jsou známy také jiné druhy mikroorganismů, produkujících lovastatin, např. mutant mikroorganismu Aspergillus terreus a Aspergillus Oryzae, označený ATCC 74135.

Lovastatin je chemicky 5-laktonr,2',6',7',8a'-hexahydro-3,5-dihydroxy-2',6'-dimethyl-8',2methyl-l-oxobutoxy-l-naftalen-heptanové kyseliny (Stubbs a spol.: 1986) vzorce I (evropská patentová přihláška 0 033 537 Al)

(I)·

Aktivní formou lovastatinu je také kyselina, kterou je chemicky l,2,6,8,8a-hexahydro-P,ódihydroxy-l-naftalen-heptanová kyselina (Alberts a spol.: 1980.) vzorce II (evropská patentová přihláška 0 022 478 Al)

- 1 CZ 283540 B6

(Π).

Laktonová forma lovastatinu se používá jako činidlo pro snižování hladiny cholesterolu v krvi (Scott M. G. a Vega G. L.: 1985.). Inhibuje biosyntézu kyseliny mevalonové inhibici reduktázy 3-hydroxy-3-methylglutaryl-koenzymu A (HMG-CoA reduktáza, E.C. 1.1.1.34) (Zubay a spol.: 1984.).

Po ukončení fermentace je lovastatin přítomný v živné půdě ve formě laktonu (sloučenina vzorce I) a ve formě kyseliny (sloučenina vzorce II). Při izolaci, popsané v evropské patentové přihlášce 0 033 536 A2, se lovastatin z živné půdy extrahuje ethylacetátem. Tento extrakt se zahustí destilací ve vakuu. Jelikož lovastatin je přítomný jako lakton i jako kyselina a pouze lakton je komerčně zajímavý, měla by být forma kyseliny převedena na lakton. Laktonizace se provádí zahříváním koncentrátu v toluenu pod zpětným chladičem 2 hodiny na 106 °C. Po ukončení laktonizace se roztok zahustí na malý objem. Čistá látka se získá vyčištěním koncentrátu na kolonách silikagelu v přítomnosti rozpouštědel, jako je ethylacetát nebo hexan. Spojené frakce se opět ve vakuu zahustí. Čistý lovastatin pak vykrystaluje ve formě laktonu.

Díky komplikovanému mnohastupňovému postupu a tvrdým podmínkám, které se během izolace používají, jsou výtěžky lovastatinu obvykle nízké. Používají se různá rozpouštědla, která jsou toxická, jako je benzen, toluen, acetonitril nebo ethylacetát. Práce s těmito rozpouštědly tedy ohrožuje zdraví osob, které s nimi pracují, a představuje i ekologický problém.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je překonat shora uvedené nedostatky oblasti techniky a poskytnout takový způsob izolace lovastatinu, který je účinný a ekonomický. Dále bude věnována pozornost zdraví pracovníků, kteří pracují na izolaci lovastatinu, a také ekologickým důsledkům.

Výsledkem rozsáhlého výzkumu, který vede k tomuto vynálezu, je zjištění, že lovastatin lze snadno izolovat extrahováním ze vzorku butylacetátem, zahuštěním roztoku a krystalizací.

Ve výhodném provedení se zahušťování provádí při tlaku pod 0,04 MPa. Ve výhodném provedení se zahušťování provádí za teploty nad 40 °C při tlaku pod 0,04 MPa, nebo při normálním tlaku,

Podle ještě jiného výhodného provedení vzorek lovastatinu pochází z mikroorganismů, s výhodou plísní, schopných produkovat lovastatin. V tomto případě vzorek může znamenat fermentační živnou půdu, v níž mikroorganismus nebo plíseň roste, mycelium plísně nebo filtrát.

Plísně, které jsou používány, nejsou omezeny. Mohou se používat jakékoliv plísně, které produkují lovastatin. Výhodnými jsou plísně rodu Aspergillus, s výhodou Aspergillus oryzae nebo Aspergillus terreus.

Podle ještě jiného výhodného provedení plíseň znamená Aspergillus terreus (ATCC 20542) nebo Aspergillus oryzae (ATCC 74135).

Způsobem podle tohoto vynálezu se lovastatin může získávat výlučně ve formě laktonu. Překvapivě bylo zjištěno, že vlastnosti, které umožňují dosáhnout tohoto cíle, má použité rozpouštědlo, tj. butylacetát. Při procesu laktonizace se uvolňuje voda a ta by měla být z reakčního prostředí odstraňována. Jelikož butylacetát má vyšší teplotu varu než voda a v podstatě za daných podmínek netvoří s vodou azeotropickou směs, může se odstranit v podstatě všechna voda, vytvořená během laktonizace.

Způsobem podle tohoto vynálezu je možné podstatně zkrátit dobu izolace lovastatinu. Jelikož se butylacetát může použít pro extrahování lovastatinu ze vzorku a současně pro provedení laktonizace, lze se tím vyhnout toxickým účinkům jiných rozpouštědel. Tento způsob lze průmyslově reprodukovat s konečnými výtěžky kolem 60 % hmotn. bez ohledu na to, jestli je lovastatin produkován mikroorganismy intracelulámě nebo extracelulámě, ve formě laktonu nebo kyseliny.

Izolovaná látka je v podstatě stejná jako látka, izolovaná podle způsobů z oblasti techniky. Struktura byla potvrzena IČ spektroskopií (obr. 1), hmotnostní spektroskopií (obr. 2), NMR (obr. 3) a UF spektroskopií (obr. 4).

Tento vynález je ilustrován následujícími příklady.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Fermentační živná půda (1000 ml), získaná fermentací Aspergillus terreus (ATCC 20542) nebo Aspergillus oryzae (ATCC 74135), s pH 4,8, stará 120 h as obsahem lovastatinu 300 pg/ml (lakton + kyselina), se okyselí HC1 (36 % (hmotn.)) na pH 3 až 5. Fermentační živná půda se pak ochladí pod 20 °C, přidá se butylacetát (500 ml) a extrahuje se 4 h za této teploty. Po ukončení extrakce se suspenze odstřeďuje. Vodná a organická fáze se oddělí. Mycelium a vodná fáze se odstraní. Organická fáze se dále zpracuje. Zahustí se destilací ve vakuu při teplotě nad 40 °C na objem 50 ml. Současně se zahušťováním probíhá také laktonizace. Koncentrát se pak ochladí na teplotu pod 20 °C a nechá se stát. Lovastatin vykrystaluje. Získaný surový produkt se překrystaluje. Získá se lovastatin (170 mg) jako lakton s čistotou nad 90 % hmotn.

Příklad 2

Fermentační živná půda (1000 ml), získaná fermentací Aspergillus terreus (ATCC 20542) nebo Aspergillus oryzae (ATCC 74135), s pH 4,73, stará 120 h a s obsahem lovastatinu 190 pg/ml (lakton + kyselina) ve filtrátu a 15 pg/ml v myceliu, se okyselí HCl (36 % (hmotn.)) na pH 3 až 5. Fermentační živná půda se pak zfiltruje filtrem Oliver. Mycelium se odstraní. Filtrát se ochladí na teplotu pod 20 °C a přidá se polovina objemu butylacetátu. Extrahuje se 1 h. Potom se zpracuje, jako v příkladu 1. Získá se lovastatin (79 mg) jako lakton s čistotou nad 90 % hmotn.

-3 CZ 283540 B6

Příklad 3

Fermentační živná půda (1000 ml), získaná fermentací Aspergillus terreus (ATCC 20542) nebo Aspergillus oryzae (ATCC 74135), s pH 4,78, stará 120 h a s obsahem lovastatinu 5 pg/ml (lakton + kyselina) ve filtrátu a 300 pg/ml v myceliu, se okyselí HCI (36 % (hmotn.)) na pH 3 až 5 aodstřeďuje se. Filtrát se odstraní. K myceliu se přidá čtyřnásobný objem butylacetátu a mycelium se ochladí na teplotu pod 20 °C. Extrahuje se 4 h. Potom se odstřeďuje. Mycelium se odstraní a filtrát se zpracuje jako v příkladu 1. Získá se lovastatin (90 mg) jako lakton s čistotou nad 90 % hmotn.

Příklad 4

Fermentační živná půda (500 ml) s obsahem lovastatinu 494 pg/ml (lakton + kyselina) se okyselí na pH 4 a extrahuje 4 hodiny butylacetátem (250 ml). Po ukončení extrakce se fermentační živná půda zfiltruje a vodná fáze se oddělí od organických fází. Výtěžek extrakce je 92,9 % hmotnostních, počítáno na obsah lovastatinu. Organická fáze se zahustí ve vakuu. Výtěžek lovastatinu v laktonové formě v získaném koncentrátu je asi 97 % hmotnostních. Koncentrát se ponechá krystalizovat. Krystalizovaný lovastatin má čistotu více než 90,5 % hmotnostních a další krystalizací se získá produkt se stupněm čistoty podle USP.

Příklad 5

Fermentační živná půda (650 ml) s obsahem lovastatinu 494 pg/ml (lakton + kyselina) se okyselí na pH 4 a extrahuje 4 hodiny ethylacetátem (250 ml). Po ukončení extrakce se fermentační živná půda zfiltruje a vodná fáze se oddělí od organické fáze. Výtěžek extrakce ethylacetátem je 79,4 % hmotnostních, počítáno na obsah lovastatinu. Organická fáze se zkoncentruje ve vakuu. Výtěžek lovastatinu v laktonové formě v získaném koncentrátu je pod 30 % hmotnostních.

Použijí-li se při krystalizací stejné podmínky jako v příkladu 4, nenastává žádná krystalizace. Na ethylacetátový koncentrát se proto působilo způsobem, popsaným v EP 0033536 A2; koncentrát byl odpařen do sucha sloupcovou chromatografií na silikagelu s následnou rechromatografií na SiO₂ a reverzní fázovou chromatografií.

Obdobně existuje postup přes amoniovou sůl (EP 0 022478 Bl). K ethylacetátovému extraktu se přidá 20 % objemových acetonu a do směsi se uvádí plynný NH₃. Takto se vysráží amoniová sůl lovastatinu, která se odfiltruje. Laktonizace NEU soli na lovastatin se provádí v toluenu, z něhož vykrystalizuje lovastatin.

Claims (4)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob izolace lovastatinu, vyznačující se tím, že se lovastatin extrahuje butylacetátem z fermentační živné půdy, mycelia nebo filtrátu mikroorganismu, který je schopen produkovat lovastatin, získaný roztok lovastatinu v butylacetátu se zahustí při tlaku pod 0,04 MPa a za teploty nad 40 °C a tento roztok se nechá krystalovat.

2. Způsob izolace lovastatinu podle nároku 1, vyznačující se mikroorganismus, který je schopen produkovat lovastatin, používá plíseň.

tím, že se jako

3. Způsob izolace lovastatinu podle nároku 2, patří do rodu Aspergillus. vyznačující s e tím, že plíseň 4. Způsob izolace lovastatinu podle nároku 3, vyznačující patří do rodu Aspergillus terreus nebo Aspergillus oryzae. s e tím, že plíseň 5. Způsob izolace lovastatinu podle nároku 4, vyznačující s e tím, že plíseň

patří do rodu Aspergillus terreus (ATCC 20542) nebo Aspergillus oryzae (ATCC 74135).

4 výkresy