SK280255B6

SK280255B6 - Spôsob izolácie lovastatínu

Info

Publication number: SK280255B6
Application number: SK1480-95A
Authority: SK
Inventors: Pavica Hajko; Tanja Vesel; Ivan Rade; Miroslav Pokorny
Original assignee: Krka Tovarna Zdravil
Priority date: 1993-06-08
Filing date: 1994-06-08
Publication date: 1999-10-08
Also published as: RO115444B1; SK148095A3; PL178163B1; CA2164411A1; BG62852B1; CZ283540B6; SI9300303A; EP0702679B1; HU216647B; US5712130A; HU9503385D0; RU2114912C1; DE69409516T2; EP0702679A1; CZ325195A3; BG100204A; PL311880A1; ATE164842T1; HUT72836A; WO1994029292A1

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu izolácie lovastatínu, zlúčeniny, ktorá je hypolipcmicky aktívna, z fermentačného živného prostredia.

Doterajší stav techniky

Lovastatín je produkovaný ako sekundárny metabolit plesne Aspergillus terreus (USA patent 4 231 938), ktorá je uložená v Americkej zbierke typov kultúr pod č. ATCC 20451, ATCC 20542 a Monascus ruber. ktorá je uložená vo Fermentation Research Inštitúte Agency of Industrial Science and Technology, Ministerstvo medzinárodného obchodu a priemyslu, Japonsko (spis DF, č. 3 006 216 Al) pod č. Ferm. 4822. Sú známe tiež iné druhy mikroorganizmov produkujúcich lovastatín, napríklad mutant mikroorganizmu Aspergillus terreus a Aspergillus oryzae označený ATCC 74135.

Lovastatín je chemicky 5-laktón ľ, 2’, 6’, 7’, 8a’-hexahydro-3,5-dihydroxy-2’,6’-dimetyl-8’,2”-metyl-l”-oxobutoxy-l-naftalén-heptánovej kyseliny (Stubbs a kol.: 1986) vzorca (I) (európska patentová prihláška 0 033 537 Al)

Aktívnou formou lovastatínu je tiež kyselina, ktorá je chemicky 1.2,6,8,8a-hexahydro-P,δ-dihydro-l-naftalénheptánová kyselina (Alberts a kol., 1980) vzorca (II) (európska patentová prihláška 0 022 478 Al)

Laktónová forma lovastatínu sa používa ako činidlo na znižovanie hladiny cholesterolu v krvi (Scott M. G. a Vega G. L., reduktázy 3-hydroxy-3-metylglutaryl-koenzýmu A (HMG-CoA reduktáza, E. C. 1.1.1.34) (Zubay a kol., 1984).

Po skončení fermentácie je lovastatín prítomný v živnej pôde vo forme laktónu (zlúčenina vzorca I) a vo forme kyseliny (zlúčenina vzorca II). Pri izolácii, opísanej v európskej patentovej prihláške 0 033 536 A2, sa lovastatín zo živnej pôdy extrahuje etylacetátom. Tento extrakt sa zahustí destiláciou vo vákuu. Pretože lovastatín je prítomný ako laktón aj ako kyselina, a iba laktón je komerčne zaujímavý, mala by byť forma kyseliny prevedená na laktón. Laktonizácia sa uskutočňuje zahrievaním koncentrátu v toluéne pod spätným chladičom 2 hodiny na teplotu

106 °C. Po ukončení laktonizácie sa roztok zahustí na malý objem. Čistá látka sa získa vyčistením koncentrátu na kolónach silikagélu v prítomnosti rozpúšťadiel, akým je etylacetát alebo hexán. Spojené frakcie sa opäť vo vákuu zahustia. Čistý lovastatín potom vykryštalizuje vo forme laktónu.

Kvôli komplikovanému mnohostupňovému postupu a tvrdým podmienkam, ktoré sa v priebehu izolácie používajú, sú výťažky lovastatínu obyčajne nízke. Používajú sa rôzne rozpúšťadlá, ktoré sú toxické, ako benzén, toluén, acetonitril alebo etylacetát. Práca s týmito rozpúšťadlami teda ohrozuje zdravie osôb, ktorc s nimi pracujú, a predstavujú i ekologický problém.

Podstata vynálezu

Predmetom tohto vynálezu je prekonať uvedené nedostatky v oblasti techniky a poskytnúť taký spôsob izolácie lovastatínu, ktorý je účinný a hospodárny. Ďalej je venovaná pozornosť zdraviu pracovníkov, ktorí pracujú na izolácii lovastatínu, a tiež ekologickým dôsledkom.

Výsledkom rozsiahleho výskumu, ktorý vedie k tomuto vynálezu, je zistenie, že lovastatín je možné ľahko izolovať spôsobom, ktorého podstata spočíva v extrakcii butylacetátom z fermentačnej živnej pôdy, mycélia alebo filtrátu mikroorganizmu, ktorý je schopný produkovať lovastatín, získaný roztok lovastatínu v butylacetáte sa zahustí vo vákuu alebo pri zníženom tlaku a pri teplote nad 40 °C a tento roztok sa nechá vykryštalizovať.

Ako mikroorganizmus schopný produkovať lovastatín sa používa pleseň, ktorá patrí do rodu Aspergillus terreus (ATCC 20542) alebo Aspergillus oryzae (ATCC 74135).

Spôsobom podľa tohto vynálezu sa lovastatín môže získať výlučne vo forme laktónu. Prekvapivé boli zistenia, že vlastnosti, ktoré umožňujú dosiahnuť tento cieľ, má použité rozpúšťadlo, t. j. butylacetát Pri procese laktonizácie sa uvoľňuje voda, a tá by mala byť z reakčného prostredia odstraňovaná. Pretože butylacetát má vyššiu teplotu varu ako voda a v podstate za daných podmienok netvorí s vodou azeotropickú zmes, môže sa odstrániť v podstate všetka voda vytvorená počas laktonizácie.

Spôsobom podľa tohto vynálezu je možné podstatne skrátiť čas izolácie lovastatínu. Pretože sa butylacetát môže použiť na extrahovanie lovastatínu zo vzorky a súčasne na uskutočnenie laktonizácie, je možné sa tým vyhnúť toxickým účinkom iných rozpúšťadiel. Tento spôsob je priemyselne reprodukovateľný s konečnými výťažkami okolo 60 % hmotn. bez ohľadu na to, či je lovastatín produkovaný mikroorganizmami intraceluláme alebo extraceluláme, vo forme laktónu alebo kyseliny.

Izolovaná látka je v podstate rovnaká ako látka izolovaná podľa spôsobov známych z oblastí techniky, pričom jej štruktúra bola experimentálne potvrdená.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje IČ spektroskopiu izolovanej látky, obr. 2 znázorňuje hmotnostnú spektroskopiu izolovanej látky, obr. 3 znázorňuje NMR izolovanej látky a obr. 4 znázorňuje UF spektroskopiu izolovanej látky.

Vynález je ilustrovaný nasledujúcimi neobmedzujúcimi príkladmi uskutočnenia.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Fermenčná živná pôda (1000 ml) získaná fermentáciou Aspergillus terreus (ATCC 20541) alebo Aspergillus oryzae (ATCC 74135) s pH 4,8 stará 120 has obsahom lovastatínu 300 pg/ml (laktón + kyselina) sa okyslí HC1 (36 % hmotn.) na pH 3 až 5. Fermentačná živná pôda sa potom ochladí pod 20 °C, pridá sa butylacetát (500 ml) a extrahuje sa 4 h pri tejto teplote. Po ukončení reakcie sa suspenzia odstred’uje. Vodná a organická fáza sa oddelí. Mycélium a vodná fáza sa odstráni. Organická fáza sa ďalej spracuje. Zahustí sa destiláciou vo vákuu pri teplote nad 40 °C na objem 50 ml. Súčasne so zahusťovaním prebieha tiež laktonizácia. Koncentrát sa potom ochladí na teplotu pod 20 °C a nechá sa stáť. Lovastatín vykryštalizuje. Získaný surový produkt sa prekryštalizuje. Získa sa lovastatín (170 mg) ako laktón s čistotou nad 90 % hmotn.

Príklad 2

Fermentačná živná pôda (1000 ml) získaná fermentáciou Aspergillus terreus (ACTT 20542) alebo Aspergillus oryzae (ATCC 74135) s pH 4,73, stará 120 has obsahom lovastatínu 190 pg/ml (laktón + kyselina) vo filtráte a 15 pg/ml v mycéliu sa okyslí HC1 (36 % hmotn.) na pH 3 až 5. Fermentačná živná pôda sa potom odfiltruje filtrom Oliver. Mycélium sa odstráni. Filtrát sa ochladí na teplotu pod 20 °C a pridá sa polovica objemu butylacetátu. Extrahuje sa 1 h. Potom sa spracuje ako v príklade (79 mg) ako laktón s čistotou nad 90 % hmotn.

Príklad 3

Fermentačná živná pôda (1000 ml) získaná fermentáciou Aspergillus terreus (ACTT 20542) alebo Aspergillus oryzae (ATCC 74135) s pH 4,78, stará 120 has obsahom lovastatínu 5 pg/ml (laktón + kyselina) vo filtráte a 300 pg/ml v mycéliu sa okyslí HC1 (36 % hmotn.) na pH 3 až 5 a odstred’uje sa. Filtrát sa odstráni. Živná pôda sa potom odfiltruje filtrom Oliver. Mycélium sa odstráni. K mycéliu sa pridá štvornásobný objem butylacetátu a mycélim sa ochladí na teplotu pod 20 °C. Extrahuje sa 4 h. Potom sa odstreďuje. Mycélium sa odstráni a filtrát sa spracuje ako v príklade 1. Získa sa lovastatín (90 mg) ako laktón s čistotou nad 90 % hmotn.

Na porovnanie dosiahnutého účinku a technických výhod podľa známeho stavu techniky (EP 0 033 536 A2) a riešenia podľa vynálezu uvádzame tabuľku 1, ktorá uvádza postup podľa EP 0 033 536 A2 a tabuľku 2, ktorá dokladuje účinok riešenia pri použití butylacetátu a etylacetátu ako rozpúšťadla.

EP 0 033 536 Λ2

Tabuľka 1 živné médium

1) filtrácia

I 2) okyslenie fíltrétu na pH 4 filtrát pH 4

1) extrakcia etylacetátom (2x)

2) spojovanie extraktov kombinované extrakty koncentrácia n» 1/3 objemi pri teplote pod 30 vo vákuu koncentrát opakované odparovanie koncentrátu pri 40°C vo vákuu po pridaní metylénchloridu olejový zvyšok chromatograf iclcá izolácia

1. chromatografia na silikagéli

2. gélová chronatografía

3. chronatografia na silikagéli frakcia s lovastatínom | odparovanie suchý zvyšok | rekryštalizácla 2 etanolu lovastatín

PV 1480-95 živné n&diua

1) okyslenie na pH 3 až 5

2) extrakcia butylacetátoni

3) centrifugácia supernatant separáciu extrakt butylacetátu koncentrácia na 1/10 pri teplote viac ako vc> vákuu koncentrát

40^J'S

1) kryštalizácia pri teplote nenej ako 20

2) filtrácia lovastatín

Tabuľka 2

extrakčné rozpúšťadlo	butylacetát	etylacetát
objem živného média (L)	500	650
množstvo lovastatínu v živnom médiu (laktón + kyselina)(g)	247	296.4
objem rozpúšťadla	rovnaký	rovnaký
čas extrakcie	rovnaký	rovnaký
objem vodnej fázy (L)	500	600
množstvo lovastatínu vo vodnej fáze (laktón + kyselina)(g)	0,5	2,7
množstvo Lovastatínu v organickej ráze (laktón 4- kyselina) (g)	229.5	235,4
výťažok extrakcie (Ä)	92,9	79,4
čas koncentrácie organickej fázy	rovnaký	rovnaký
% lovastatínu vo forme laktónu v koncentráte	97,9	29
vykryštálizovaný lovastatín (g)	171	0

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Spôsob izolácie lovastatínu, vyznačujúci sa t ý m , že fermentačná živná pôda, mycélium alebo filtrát mikrooganizmu, ktorý je schopný produkovať lovastatín, sa extrahuje butylacetátom. Získaný roztok lovastatínu v butylacetáte sa zahustí vo vákuu alebo pri zníženom tlaku a pri teplote nad 40 °C a tento roztok sa nechá vykryštalizovať.

2. Spôsob izolácie lovastatinu podľa nároku 1, v y z n a í u j ú c i sa tým, že ako mikroorganizmus schopný produkovať lovastatín sa používa pleseň.

3. Spôsob izolácie lovastatinu podľa nároku 2. vyzná č u j ú c i sa tým, že pleseň patrí do rodu Aspergillus.

4. Spôsob izolácie lovastatinu podľa nároku 3, vyzná í u j ú c i sa tým, že pleseň patrí do rodu .í.spergillus terreus alebo Aspergillus oryzae.

5. Spôsob izolácie lovastatinu podľa nároku 4, vyzná í u j ú c i sa tým, že pleseň patrí do rodu Aspergillus terreus (ATCC 20542) alebo Aspergillus oryzae (ATCC 74135).