DE69529765T2 - Verfahren zur fermentativen herstellung von clavamderivaten, wobei der ammoniak und harnstoffgehalt im fermentationsmedium niedrig gehalten wird - Google Patents
Verfahren zur fermentativen herstellung von clavamderivaten, wobei der ammoniak und harnstoffgehalt im fermentationsmedium niedrig gehalten wirdInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steigerung der Erzeugung von Clavulansäure und anderen Clavamen, einschließlich derjenigen mit einer starken beta-Lactamase-Hemmaktivität, aus Mikroorganismen mit den entsprechenden biosynthetischen Reaktionswegen.
- Mikroorganismen, insbesondere Streptomyces sp., erzeugen eine Anzahl von Antibiotoka, einschließlich Clavulansäure und anderer Clavame, Cephalosporine und Penicilline.
- Clavulansäure ist ein wichtiger beta-Lactamase-Hemmer, der ein Schlüsselbestandteil des unter der Bezeichnung AUGMENTIN (Marke von SmithKline Beecham plc) verkauften Antibiotikums ist. Das kommerzielle Verfahren, durch das Clavulansäure erzeugt wird, erfolgt über die Fermentation von Streptomyces clavuligerus. Ein geeignetes Fermentationsmedium zur Erzeugung von Clavulansäure wird in GB-A-1 508 977 beschrieben.
- Obwohl Clavulansäure und andere Clavame in akzeptablen Mengen durch bestehende Verfahren hergestellt werden können, besteht weiterhin ein Bedarf an der Verbesserung des Titers von Clavulansäure in der Fermentationsbouillon, so daß das Produkt wirtschaftlicher hergestellt werden kann. Eine Art, auf die das Problem angegangen werden kann, ist die Suche nach Mutanten-Stämmen von Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 oder anderen Clavulansäure erzeugenden Mikroorganismen, die zu einem höheren Titer führen. Bis heute wurde relativ wenig bezüglich Verfahrensverbesserungen veröffentlicht, durch die ein höherer Titer von Clavulansäure durch Variation der Reaktionsbedingung im Fermenter erreicht werden kann.
- Es ist gebräuchlich, Ammoniak als Stickstoffquelle einzuschließen, da die Manipulierung der Stickstoffzufuhr zur Fermentation kritisch für die Clavulansäure-Ausbeute ist. Jedoch haben wir gefunden, daß Fermentationsverfahren zur Erzeugung von Clavulansäure besonders empfindlich für die Ammoniak-Konzentration im System sind.
- Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur. Herstellung von Clavamen durch Fermentation eines Clavam-erzeugenden Mikroorganismus in einem geeigneten Medium bereitgestellt, dadurch gekennzeichnet, daß die Bedingungen im Fermenter derart sind, daß die Ammoniak-Gehalte während der Fermentation niedrig gehalten werden, um eine Repression von Urease zu vermeiden.
- Mit einem geringen Gehalt meinen wir weniger als ca. 50 ug/ml. Der Ammoniak-Gehalt sollte auf unter 50 ug/ml für einen ausreichende Zeit gehalten werden, in geeigneter Weise zwischen 1 und 10 Stunden, um eine Derepression und Biosynthese von Urease zu erlauben. Unter gebräuchlichen Fermentationsbedingungen (mit Ammoniak-Gehalten von mehr als 7.00 ug/ml) wurde gefunden, daß das Ammoniak eine Anzahl von Enzymen unterdrückt, die am Metabolismus von Stickstoff beteiligt sind, einschließlich Urease, die die Umwandlung von Harnstoff zu Ammoniak und Kohlendioxid katalysiert (siehe V. Bascaran et al., J. Gen Microbiol. 1989, Bd. 135, S. 2465 bis 2474). Jedoch waren die letzteren Untersuchungen nicht mit dem Antibiotikum-Titer verbunden und lieferten insbesondere keinen Hinweis auf irgendeine Verknüpfung mit der Verbesserung der Clavam- oder Clavulansäureerzeugung.
- Ein überraschender Befund in der Arbeit, die zur vorliegenden Erfindung führte, war, daß sich Harnstoff in Clavulansäure-Fermentationsbouillons anreichert. Harnstoff wird aus dem biosynthetischen Clavulansäureprozeß erzeugt, aber es kann genausogut andere Quellen für diesen Harnstoff geben.
- Es wurde gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung gefunden, daß die Titer von Clavulansäure beträchtlich verbessert werden, z. B. in der Größenordnung von 10%, falls man den Harnstoff, der sich während der Clavulansäureproduktion aufbauen kann, mit einem Urease-Enzym reagieren läßt.
- Entsprechend wird in einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Verfähren zur Herstellung von Clavamen durch Fermentation eines Clavam- erzeugenden Mikroorganismus in einem geeigneten Medium bereitgestellt, dadurch gekennzeichnet, daß man während des Fermentationsverfahrens erzeugten Harnstoff mit einem Urease-Enzym reagieren läßt.
- Die Urease kann entweder intrinsisch (endogen) oder extrinsisch (exogen) sein, d. h. sie kann durch den Clavulansäure-erzeugenden Mikroorganismus erzeugt (intrinsische Urease) oder zum System hinzugegeben werden (extrinsische Urease).
- Falls es gewünscht ist, extrinsische Urease zu verwenden, kann das Enzym aus jeder geeigneten Quelle erhalten und zur Fermentationsreaktion hinzugegeben werden. Falls die Urease intrinsisch ist, kann sie in einem Aspekt der Erfindung durch Dereprimieren der Expression von Urease durch den Clavulansäure-erzeugenden Mikroorganismus freigesetzt werden.
- Eine solche Derepression kann z. B. durch Einstellung des pH durch jede geeignete, von Ammoniak verschiedene Base verursacht werden. In diesem Verfahren wird die Ammoniak-Konzentration in der Eermentation bevorzugt abgesenkt, bis eine Derepression auftritt. Eine solche Derepression kann in geeigneter Weise durch Untersuchung der Veränderungen im pH-Profil des Reaktionsmediums überwacht werden (siehe nachfolgende Beispiele).
- Im obigen Verfahren kann das pH-Kontrollmittel jede geeignete, von Ammoniak verschiedene Base sein, z. B. ein Alkalimetallhydroxid wie Natriumhydroxid. Sobald die Depression auftritt und Urease exprimiert wird, ist es vorteilhaft, den pH durch Ammoniak zu steuern, um eine ausreichende Stickstoffzufuhr sicherzustellen. Optional kann jedoch ein von Ammoniak verschiedenes pH-Regulierungsmittel durch die Fermentation hindurch verwendet werden.
- Ammoniak ist allgemein als Zufuhr in der typischen Fermentation bevorzugt, da es den zweifachen Zweck der pH-Regulierung und Einführung von Stickstoff in die Fermentation hat. Es wirkt ebenfalls als ionisches Gegengewicht zum sich anreichernden Clavulanat. Obwohl der durch die Derepression der durch Ammoniak repressierbaren Enzyme gewonnene Vorteil durch das Verfahren der Verwendung eines alternativen pH-Regulierungsmittels während eines Teils der Fermentation erreicht werden kann, kann er ebenfalls durch Verwendung eines alternativen pH-Regulierungsmittels und anschließende Einführung des erforderlichen Stickstoffs zur Fermentation im Ansatz oder durch Zufuhr eines Ammoniumsalzes erreicht werden.
- In einem weiteren Verfahren der Derepression von Urease kann eine Einstellung zur Menge der komplexen Stickstoffquelle vorgenommen werden, die der Fermentation zudosiert ("batched") oder zugeführt wird. Durch Desaminierung der komplexen Stickstoffquelle freigesetztes Ammoniak wird. Urease unterdrücken. Daher wird eine Einstellung der Mengen, die in der Fermentation eingeschlossen sind, oder ihrer Freisetungseigenschaften die Ureasederepression beeinflussen.
- Ein weiteres Verfahren zur Erhöhung des Titers von Clavulansänre ist die Zugabe jeder geeigneten Verbindung zur Fermentationsreaktion, die direkt oder indirekt die Ammoniak- oder Harnstoff-Konzentration in der Fermentation beeinflußt.
- Eine Art, auf die dies erreicht werden kann, ist die Zugabe einer Verbindung wie Zeolith, die zur Adsorption von Ammoniak und somit zur Reduzierung seiner Konzentration fähig ist. Geeignete Ammoniak-Adsorptionsreagenzien schließen jene ein, die zur Ausfällung von Ammoniak als Komplexsalz fähig sind, z. B. als Ammoniummagnesiumphosphat.
- Eine weitere Weise, auf die die Harnstoff-Konzentration verringert werden kann, ist die Zugabe einer Verbindung zum Fermentationsmedium, die direkt oder indirekt die Expression von Urease aus dem Clavulansäureerzeugenden Mikroorganismus erhöht.
- Verfahren der genetischen Manipulation oder Stammverbesserung können ebenfalls verwendet werden, um die Gehalte von intrinsischer Urease zu erhöhen, die durch den Clavulansäure-erzeugenden Mikroorganismus erzeugt wird. Z. B. kann eine Stammverbesserung [z. B. durch Mutagenese und anschließende Selektion auf spezifischen Medien, wie denjenigen, die Methylammonium einschließen (Microbiological Reviews; 1989; 53, 85-108)] verwendet werden, um einen Mutantenstamm eines Clavulansäure-erzeugenden Mikroorganismus herzustellen, der bestimmend für die Urease-Expression ist, d. h. Urease unterliegt nicht einer signifikanten Repression in Gegenwart von Ammoniak. Ähnliche Ergebnisse können durch gerichtete genetische Manipulationstechniken erhalten werden, einschließlich der Manipulation des Urease-Gens, um so seine Regulierung zu beeinflussen, wobei z. B. eine abgestimmte Expression mit einem Enzym verursacht wird, das am biosynthetischen Reaktionsweg für Clavulansäure beteiligt ist.
- Die obigen Verfahren haben den Vorteil, daß substantielle Zunahmen des Clavulansäure-Titers erreicht werden können. Die Clavulansäure kann durch Standardtechniken getrennt und gereinigt werden.
- Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen sind die verwendeten Verfahren und Standardtechniken wie in Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, angegeben, wenn nichts anderes angegeben wird.
- In einer Fermentation von Streptomyces clavuligerus im 1000 l-Maßstab (5% Impfbouillon-Inokulum, Sojamehl-Protein zwischen 20 und 60 g/l, Dextrin zwischen 1 und 3%, pflanzliches Öl 1 bis 5% plus einen Spurenelemente- Cocktail, wobei der pH auf 6,8 gehalten wird) kann der Clavulansäure- Ausstoß um 8% durch Einstellung des pH-Regulierungsmittels verbessert werden.
- Falls 2,5 N NaOH anstelle von Ammoniak verwendet wird, um den pH auf 6,8 Beginn der Fermentation zu halten, werden zwei Peaks im pH-Profil beobachtet. Der erste entspricht der Desaminierung von Sojaprotein, was Ammoniak freisetzt und somit den pH erhöht. Der zweite besteht aufgrund der Derepression von Urease, was ebenfalls Ammoniak freisetzt. Nachdem der zweite Peak beobachtet wird (dies kann durch das Fehlen eines Nachweises von Harnstoff durch kolorimetrische Mittel bestätigt werden), wird das pH- Regulierungsmittel zurück auf Ammoniak umgeschaltet, um eine ausreichende Stickstoffzufuhr für das Reaktionsmedium sicherzustellen.
- Mutagenisierte Stämme von S. clavuligerus können erzeugt werden, die Urease bestimmend exprimieren. Sporen, die einem Mutagen (wie UV-Strahlung oder Einwirkung von Nitrosoguanidin) unterworfen wurden, werden auf Agar plattiert, der Methylammonium und Harnstoff enthält. Im Agar ist Harnstoff die einzige Kohlenstoff- und Stickstoffquelle. Das Methylammonium kann nicht metabolisiert werden, sondern wird vom Mikroorganismus als Ammonium erkannt und hat daher eine repressive Wirkung auf die Urease-Expression.
- Mutierte Sporen, die zum Wachsen auf diesem Medium fähig sind, können selektiert werden, und es kann gezeigt werden, daß sie Urease in einer bestimmenden Weise in einer Fermentation exprimieren und einen ausgezeichneten Clavulansäure-Ausstoß ergeben.
Claims (14)
1. Verfahren zur Herstellung von Clavamen durch Fermentation eines
Clavam-erzeugenden Mikroorganismus in einem geeigneten Medium, dadurch
gekennzeichnet, daß die Bedingungen im Fermenter derart sind, daß die
Ammoniak-Gehalte während der Fermentation gering gehalten werden, um die
Repression von Urease zu vermeiden.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Ammoniak-Gehalte geringer
als ca. 50 ug/ml sind.
3. Verfahren zur Herstellung von Clavamen durch Fermentation eines
Clavam-erzeugenden Mikroorganismus in einem geeigneten Medium, dadurch
gekennzeichnet, daß man während des Fermentationsprozesses erzeugten
Harnstoff mit einem Urease-Enzym reagieren läßt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die Urease extrinsisch (zur
Fermentation hinzugegeben) ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der pH der Fermentation durch
jede geeignete, von Ammoniak verschiedene Base eingestellt wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die Base Natriumhydroxid ist.
7. Verfahren gemäß Ansprüchen 5 oder 6, worin der pH, nachdem die
Derepression aufgetreten ist und Urease exprimiert wurde, danach durch
Ammoniak gesteuert wird, um so eine ausreichende Stickstoffzufuhr
sicherzustellen.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Menge der komplexen
Stickstoffquelle im Medium, zudosiert (batched) oder zur Fermentation
zugeführt, eingestellt wird.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin eine Verbindung zur
Fermentation hinzugegeben wird, die direkt oder indirekt die Ammoniak- oder
Harnstoff-Konzentration in der Fermentation beeinflußt oder die Expression
von Urease erhöht.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, worin die Verbindung eine
Ammoniakadsorbierende Verbindung oder -ausfällende Verbindung ist.
11. Verfahren zur Herstellung von Clavamen durch Fermentation eines
Clavam-erzeugenden Mikroorganismus in einem geeigneten Medium, worin der
Mikroorganismus erhöhte Gehalte von intrinsischer Urease mittels
genetischer Manipulation oder Stammverbesserung erzeugt.
12. Verfahren zur Herstellung von Clavamen durch Fermentation eines
Clavam-erzeugenden Mikroorganismus in einem geeigneten Medium, worin der
Mikroorganismus bestimmend für die Urease-Expression ist.
13. Verfahren gemäß jedem der vorhergehenden Ansprüche, worin das
Clavam Clavulansäure ist.
14. Verfahren gemäß jedem der vorhergehenden Ansprüche, worin der
Mikroorganismus Streptomyces clavuligerus ist.
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