CZ292673B6 - Způsob přípravy klavamů - Google Patents

Abstract

Je popsán zlepšený způsob přípravy klavamů fermentací mikroorganismu produkujícího klavam ve vhodném médiu, při kterém podmínky ve fermentoru jsou takové, že hladiny amoniaku jsou udržovány nízké během fermentace za účelem vyloučení potlačení ureázy.ŕ

Description

Vynález se týká způsobu přípravy klavamů fermentací mikroorganismu produkujícího klavam ve vhodném médiu.

Dosavadní stav techniky

Mikroorganismy, zejména Streptomyces sp. produkují mnoho antibiotik, zahrnujících klavulanovou a jiné klavamy, cefalosporiny a peniciliny.

Kyselina klavulanová je důležitým inhibitorem beta-laktamázy, který je klíčovou složkou antibiotika dostupného na trhu pod názvem AUGMENIIN (ochranná známka SmithKline Beecham plc.). Komerční způsob, kterým je kyselina klavulanová produkována, je přes fermentaci Streptomyces clavuligerus. Vhodné fermentační médium pro produkci kyseliny klavulanové je popsáno v UK patentovém popisu č. 1 508 977.

I když kyselina klavulanová a jiné klavamy mohou být připraveny v přijatelných množstvích existujícími metodami, zbývá zde stále potřeba zlepšení titru klavulanové kyseliny, ve fermentační břečce proto, aby produkt mohl být vyráběn ekonomičtěji. Jednou cestou jak směrovat tento problém je hledání mutantních kmenů Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 nebo jiných mikroorganismů produkujících kyselinu klavulanovou, které poskytují vyšší titr. Do současnosti bylo publikováno relativně málo prací, týkajících se zlepšení způsobu, kde by bylo možno dosáhnout vyššího titru kyseliny klavulanové pomocí měnících se podmínek ve fermentoru.

Je obvyklé zahrnout amoniak jako zdroj dusíku, protože nastavení vstupu dusíku do fermentace je podstatné pro výtěžek kyseliny klavulanové. Nicméně bylo zjištěno, že fermentační metody produkce kyseliny klavulanové jsou zvlášť citlivé na koncentraci amoniaku v systému.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je způsob přípravy klavamů fermentací mikroorganismy produkujícího klavam ve vhodném médiu, jehož podstata spočívá v tom, že podmínky ve fermentoru jsou takové, že hladiny amoniaku jsou udržovány nízké během fermentace za účelem vyloučení potlačení ureázy.

Podle výhodného provedení vynálezu hladiny amoniaku jsou menší než asi 50 pg/ml.

Předmětem tohoto vynálezu je způsob přípravy klavamů fermentací mikroorganismu produkujícího klavam ve vhodném médiu, jehož podstata spočívá v tom, že močovina produkovaná během fermentačního procesuje přinucena reagovat s enzymem ureázou.

Podle výhodného provedení vynálezu ureáza je vnější, to znamená přidaná k fermentaci.

Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v tom, že se při způsobu upraví hodnota pH při fermentaci jakoukoliv vhodnou bází jinou amoniak. Zvláště výhodné je, pokud bází je hydroxid sodný.

Podle jiného výhodného provedení způsobu poté, co se objeví deprese a je exprimována ureáza, pH se pak řídí amoniakem k zajištění dostatečného dodávání dusíku.

-1 CZ 292673 B6

Při výhodném provedení vynálezu amoniak se získává z komplexního zdroje dusíku.

Výhodné provedení způsobu spočívá v tom, že se do fermentace přidává sloučenina, která přímo nebo nepřímo ovlivňuje koncentraci amoniaku nebo močoviny ve fermentaci nebo zvyšuje expresi ureázy. Zvláště výhodné je, pokud sloučeninou je sloučenina adsorbující amoniak nebo srážející sloučenina.

Předmětem tohoto vynálezu je způsob přípravy klavamů fermentaci mikroorganismu produkujícího klavam ve vhodném médium, jehož podstata spočívá v tom, že geneticky manipulovaný zlepšený kmen mikroorganismu produkuje vyšší hladiny vnitřní ureázy.

Předmětem tohoto vynálezu také je způsob přípravy klavamů fermentaci mikroorganismu produkujícího klavam ve vhodném médiu, jehož podstata spočívá v tom, že mikroorganismus je podstatný pro expresi ureázy.

Podle výhodného provedení způsobu klavamem je kyselina klavulanová.

Podle jiného výhodného provedení způsobu mikroorganismem je Streptomyces clavuligerus.

Dále se uvádí podrobnější popis tohoto vynálezu.

Kdekoliv v tomto popise se uvádí v souvislosti s provedením nárokovaného způsobu výraz organismus, vždy tím je míněn mikroorganismus.

Podle předloženého vynálezu je tedy poskytnut způsob přípravy klavamů fermentaci klavam-produkujícího mikroorganismu ve vhodném médiu, při kterém množství amoniaku ve fermentaci je udržováno na nízké hladině během fermentace za účelem vyloučení potlačení (represe) jednoho nebo více klíčových enzymů amoniakem.

Nízkou hladinou je míněno asi 50 pg/ml. Hladina amoniaku by měla být udržována pod 50 pg/ml po dostatečnou dobu, vhodně mezi 1 a 10 hodinami, aby se umožnila, dereprese a biosyntéza klíčových enzymů potlačitelných amoniakem. Za běžných fermentačních podmínek (s hladinou amoniaku přesahující 100 pg/ml) bylo zjištěno, že amoniak působí potlačení mnoha enzymů zahrnutých v metabolismu dusíku včetně ureázy, která katalyzuje konverzi močoviny na amoniak a oxid uhličitý (viz V. Bascaran a spol., J. Gen. Microbiol. 1989, sv.135, str. 2465 až 2474). Nicméně pozdější studie nebyly spojeny s antibiotickým titrem a neposkytují náznak jakéhokoliv spojení se zlepšením produkce klavamů nebo klavulanové kyseliny.

S překvapením bylo zjištěno v pracech, které vedly až k předloženému vynálezu, že se močovina akumuluje ve fermentačních půdách klavulanové kyseliny. Močovina je produkována z klavulanového biosyntetického procesu, ale stejně tak mohou existovat jiné zdroje této močoviny.

Nyní bylo nalezeno v souladu s dalším aspektem předloženého vynálezu, že je-li močovina, která se vytváří během produkuje kyseliny klavulanové, přinucena reagovat s enzymem ureázou, jsou titry kyseliny klavulanové výrazně zlepšeny, například řádově o 10 %.

V souladu s tím je dalším aspektem vynálezu poskytují způsobu přípravy klavamů fermentaci klavam produkujícího mikroorganismu ve vhodném médiu, vyznačujícího se tím, že močovina produkovaná během fermentačního procesuje přinucena reagovat s enzymem ureázou.

Ureáza může být buď vnitřní (endogenní) nebo vnější (exogenní), to znamená buď je produkována mikroorganismem, produkujícím kyselinu klavulanovou (vnitřní ureáza) nebo je přidávána k systému (vnější ureáza).

>

t

Je-li žádoucí používat vnější ureázu, může být enzym získán z jakéhokoli vhodného zdroje a přidán k fermentační reakci. Je-li ureáza vnitřní, může podle jednoho z aspektů vynálezu, být uvolněna derepresí exprese ureázy mikroorganismem, produkujícím kyselinu klavulanovou.

Taková dereprese může být způsobena, například, úpravou pH jakoukoliv vhodnou bází jinou než amoniak. V tomto způsobu je koncentrace amoniaku ve fermentaci výhodně snížena až do objevení se dereprese. Taková dereprese může být sledována studováním změn v profilu pH reakčního média (viz příklady dále).

Ve výše uvedeném způsobu může být pH kontrolním činidlem jakákoliv vhodná báze jiná než amoniak, například hydroxidy alkalických kovů jako je hydroxid sodný. Jakmile se objeví dereprese a ureáza začne být exprimována, je výhodné kontrolovat pH obvyklým způsobem za účelem zajištění dostatečného přívodu dusíku. Popřípadě však může být jiná látka, regulující pH než amoniak, použita v průběhu celé fermentace.

Amoniak je obecně preferován jako živina v typické fermentaci, protože má dvojí účel-reguluje pH a zavádí do fermentace dusík. Působí také jako iontové vyrovnání klavulanátové akumulace. I když je výhodou dosáhnout dereprese amoniak represibilními enzymy, může jí být dosaženo použitím alternativního regulantu pH během části fermentace, je jí možno dosáhnout použitím alternativního regulantu pH a pak zavedením požadovaného dusíku do fermentace ve vsázce nebo napájením solí amoniaku.

V dalším způsobu dereprese ureázy může být úprava provedena množstvím komplexu zdroje dusíku vsazeného nebo napájeného do fermentace. Amoniak uvolněný deaminací komplexu zdroje dusíku bude potlačovat ureázu. Proto úprava množství zahrnutého ve fermentaci nebo jeho uvolňovací charakteristiky budou ovlivňovat derepresi ureázy.

Další způsob zvýšení titru klavulanové kyseliny je přidání k fermentační reakci jakéhokoli vhodné sloučeniny, která přímo nebo nepřímo ovlivňuje koncentraci amoniaku nebo močoviny ve fermentaci.

Jedním ze způsobů, jak tohoto dosáhnout, je přidání sloučeniny jako je zeolit, schopné adsorbovat a tak snižovat jako koncentraci, λ/hodná amoniak adsorbující činidla zahrnují ta, která jsou schopna vysrážet amoniak jako komplexní sůl, například jako fosforečnan hořečnatoamonný.

Další cestou jak může být snížena koncentrace močoviny, je přidání sloučeniny, která přímo nebo nepřímo zvyšuje expresi ureázy z organismu, produkujícího kyselinu klavulanovou, k fermentačnímu médiu.

Genetické manipulace nebo způsoby,zlepšující kmen mohou být také použity pro zvýšení hladin vnitřní ureázy produkované mikroogranismem, produkujícím kyselinu klavulanovou. Například zlepšení kmene /např. mutagenezí a následným výběrem specifického média jako jsou ta, která zahrnují methylamonium (Microbial Reviews; 1989; 53, 85-108)/ může být použito pro přípravu mutantního kmene organismu, produkujícího kyselinu klavulanovou, který je podstatný pro expresi ureázy, tj. ureáza není podrobena významné represi za přítomnosti amoniaku. Podobné výsledky mohou být získány při cílené genetické manipulační technice, zahrnující manipulaci ureázového genu tak, že se ovlivní jeho regulace, například vyvoláním souladné exprese s enzymem zahrnutým ve dráze biosyntézy, kyseliny klavulanové.

Výše uvedené metody mají tu výhodu, že podstatně zvyšují titr klavulanové kyseliny, kterého může být dosaženo. Kyselina klavulanová může být oddělena a čištěna standardními technikami.

Následující příklady ilustrují vynález. V případech, pokud není uvedeno jinak, jsou použité metody a standardní techniky ty, které jsou uvedeny v práci Sambrooka a spol. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání.

-3 CZ 292673 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Vliv úpravy pH regulantem na titr kyseliny klavulanové

Ve fermentaci Streptomyces v 100 litrovém měřítku (5 % očkovacího fermentačního inokula, protein sójové moučky mezi 20 a 60 g/1, dextrin mezi 1 až 3 %, rostlinný olej 1 až 5 % plus koktejl stopových prvků s pH udržovaným na 6,8) byl výstup kyseliny klavulanové zlepšen o 8 % úpravou pH regulantem.

Jestliže se použije 2,5N NaOH místo amoniaku pro udržování pH na 6,8 na počátku fermentace jsou pozorovány dva píky vpH profilu. První odpovídá deaminaci sójového proteinu, která uvolňuje amoniak a zvyšuje tak pH. Druhý je způsobem derepresí ureázy, která také uvolňuje amoniak. Poté, co je pozorován druhý pík (toto může být potvrzeno detekcí močoviny kolorimetrickým způsobem) je pH regulant převeden na amoniak pro zajištění dostatečného dodávání dusíku do reakčního média.

Příklad 2

Příprava organismů podstatných pro ureázu

Mohou být produkovány mutagenizované kmeny S.clavuligerus, které podstatně exprimují ureázu. Sporu, které byly podrobeny mutagenu (jako je UV záření nebo vystavení nitrosoguanidinu) se umístí na agarovou plotnu, obsahující methylamonium a močovinu. V agaru je močovina jediným zdrojem uhlíku a dusíku. Methylamonium nemůže být metabolizováno, aleje rozpoznáno organismem jako amoniak a proto má represivní vliv na expresi ureázy.

Mutantní spory schopné růst na tomto médiu mohou být vybrány a shledány jako exprimující ureázu podstatným způsobem ve fermentaci a poskytující vynikající výstup kyseliny klavulanové.

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy klavamů fermentaci mikroorganismu produkujícího klavam ve vhodném médiu, vyznačující se tím, že podmínky ve fermentoru jsou takové, že hladiny amoniaku jsou udržovány nízké během fermentace za účelem vyloučení potlačení ureázy.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hladiny amoniaku jsou menší než asi 50 gg/ml.
3. 3. Způsob přípravy klavamů fermentaci mikroorganismu produkujícího klavam ve vhodném médiu, vyznačující se tím, že močovina produkovaná během fermentačního procesu se nechá reagovat s enzymem ureázou.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že ureáza je vnější, to znamená přidaná k fermentaci.

   -4CZ 292673 B6 i
5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že hodnota pH při fermentaci se upraví jakoukoliv vhodnou bází jinou než amoniak.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že bází je hydroxid sodný.
7. 7. Způsob podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že poté, co se objeví dereprese a je exprimována ureáza, pH se pak řídí amoniakem k zajištění dostatečného dodávání dusíku.
8. 8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že amoniak se získává z komplexního zdroje dusíku.
9. 9. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že do fermentace se přidává sloučenina, která přímo nebo nepřímo ovlivňuje koncentraci amoniaku nebo močoviny ve fermentaci nebo zvyšuje expresi ureázy.
10. 10. Způsob podle nároku9, vyznačující se tím, že sloučeninou je amoniak adsorbující sloučenina nebo srážející sloučenina.
11. 11. Způsob přípravy klavamů fermentaci mikroorganismu produkujícího klavam ve vhodném médiu, vyznačující se tím, že užívá geneticky manipulovaný zlepšený kmen mikroorganismu produkující hladiny vnitřní ureázy.
12. 12. Způsob přípravy klavamů fermentaci mikroorganismu produkujícího klavam ve vhodném médiu, vyznačující se tím, že se užívá mikroorganismus podstatný pro expresi ureázy.
13. 13. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že klavamem je kyselina klavulanová.
14. 14. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že mikroorganismem je Streptomyces clavuligerus.