PL184403B1 - Sposób wytwarzania klawamów - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania klawamów przez fermentacje mikroorganizmów rodzaju Streptomyces wytwarzajacych klawamy w odpowiednim srodowisku, znamienny tym, ze w fermentatorze stosuje sie takie warunki, w których podczas fermentacji utrzymuje sie poziom amoniaku ponizej 50 µg/ml dla unikniecia represji ureazy. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania klawamów. Za pomocą organizmów z odpowiednimi szlakami biosyntezy wytwarza się kwas klawulanowy i inne klawamy, w tym również te, które wykazują silne działanie hamujące aktywność β-laktamazy.

Drobnoustroje, zwłaszcza Streptomyces sp., wytwarzają szereg antybiotyków, w tym kwas klawulanowy i inne klawamy, cefalosporyny i penicyliny

Kwas klawulanowy jest ważnym inhibitorem β-laktamazy, który stanowi podstawowy składnik antybiotyku dostępnego pod nazwą Augmentin (znak towarowy SmithKline Beecham pic). W skali przemysłowej kwas klawulanowy wytwarzany jest przez fermentację

184 403

Streptomyces clavuligerus. Odpowiedni ośrodek fermentacji do wytwarzania kwasu klawulanowego ujawniony jest w brytyjskim opisie patentowym nr 1 508 977

Jakkolwiek kwas klawulanowy i inne klawamy wytwarzać można w zadowalających ilościach znanymi sposobami, istnieje zapotrzebowanie na zwiększenie miana kwasu klawulanowego w bulionie fermentacyjnym, tak aby produkt mógł być wytwarzany w sposób bardziej opłacalny. Jednym ze sposobów, w jaki problem ten można rozwiązać, jest poszukiwanie szczepów mutantowych Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 lub innych drobnoustrojów wytwarzających kwas klawulanowy, zapewniających uzyskanie wyższego miana. Dotychczas opublikowano niewiele danych odnośnie usprawnień procesu umożliwiających uzyskanie wyższego miana kwasu klawulanowego poprzez zmianę warunków reakcji w fermentatorze.

Zazwyczaj jako źródło azotu stosuje się amoniak, gdyż manipulowanie doprowadzaniem azotu do fermentatora wywiera decydujący wpływ na wydajność kwasu klawulanowego. Jednakże stwierdzono, że sposoby wytwarzania kwasu klawulanowego na drodze fermentacji są szczególnie wrażliwe na stężenie amoniaku w układzie.

W związku z tym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania klawamów przez fermentację mikroorganizmów rodzaju Streptomyces wytwarzających klawamy w odpowiednim środowisku, który polega na tym, ze w fermentatorze stosuje się takie warunki, w których podczas fermentacji utrzymuje się poziom amoniaku poniżej 50 pg/ml dla uniknięcia represji ureazy.

W sposobie według wynalazku, korzystnie, stosuje się amoniak pochodzący z kompleksowego źródła azotu.

W sposobie według wynalazku, korzystnie, jako klawam otrzymuje się kwas klawulanowy.

W sposobie według wynalazku, korzystnie, jako mikroorganizm stosuje się Streptomyces clavuligerus.

W sposobie według wynalazku, korzystnie, derepresję powoduje się nastawiając pH fermentacji dowolną odpowiednią zasadą inną niz amoniak, a zwłaszcza wodorotlenek sodowy.

W sposobie według wynalazku, korzystnie, niskie poziomy amoniaku utrzymuje się przez dodanie do fermentacji związku, który bezpośrednio lub pośrednio wpływa na stężenie amoniaku w fermentatorze.

W sposobie według wynalazku, korzystnie, stosuje się związek adsorbujący amoniak, a nie związek adsorbujący mocznik.

Inny sposób wytwarzania klawamów przez fermentację mikroorganizmów rodzaju Streptomyces wytwarzających klawamy w odpowiednim środowisku, polega według wynalazku na tym, że w fermentatorze w odpowiednim środowisku rozmnaża się organizmy produkujące klawamy i do fermentatora ewentualnie dodaje się związek, który bezpośrednio lub pośrednio wpływa na stężenie amoniaku lub mocznika w fermentatorze.

W sposobie według wynalazku, jako związek, który bezpośrednio lub pośrednio wpływa na stężenie amoniaku w fermentatorze, korzystnie, stosuje się zeolit lub fosforan amonowo-mągnezowy.

W sposobie według wynalazku, jako związek, który bezpośrednio lub pośrednio wpływa na stężenie mocznika w fermentatorze, korzystnie, stosuje się zeolit lub fosforan amonowo-magnezowy.

W sposobie według wynalazku, jako mikroorganizm produkujący klawamy stosuje się mikroorganizm, który jest konstytutywny względem ekspresji ureazy.

W sposobie według wynalazku, jako klawam, otrzymuje się kwas klawulanowy.

Tak więc, sposób wytwarzania klawamów na drodze fermentacji organizmów wytwarzających klawam w odpowiednim środowisku, charakteryzuje się tym, ze ilość amoniaku w fermentacji utrzymuje się na niskim poziomie w czasie fermentacji, tak aby uniknąć tłumienia jednego lub więcej z kluczowych enzymów przez amoniak.

Niski poziom oznacza stężenie poniżej 50 pg/ml. Poziom amoniaku poniżej 50 pg/ml należy utrzymywać przez odpowiedni okres czasu, dogodnie przez 1-10 godzin, aby umożliwić derepresję i biosyntezę kluczowych enzymów tłumionych przez amoniak. W przemysłowych warunkach fermentacji (przy poziomach amoniaku powyżej 100 pg/ml) stwierdzono, ze

184 403 amoniak działa w ten sposób iż tłumi szereg enzymów odgrywających rolę w metabolizmie azotu, w tym ureazy, która katalizuje konwersję mocznika do amoniaku i dwutlenku węgla (patrz V. Bascaran i inni, J. Gen. Microbiol. 1989, 135, 2465-2474). Jednakże badania te nie były powiązane z mianem antybiotyku i nie sugerują jakiegokolwiek związku z usprawnieniem wytwarzania klawamu lub kwasu klawulanowego.

W pracach, które doprowadziły do wynalazku, nieoczekiwanie stwierdzono, ze mocznik nagromadza się w bulionach fermentacyjnych przy wytwarzaniu kwasu klawulanowego. Mocznik wytwarzany jest w procesie syntezy klawulanu, z tym ze mogą również istnieć inne źródła mocznika.

W związku z tym stwierdzono, że jeśli spowoduje się, ze mocznik, który nagromadza się podczas wytwarzania kwasu klawulanowego, przereaguje z enzymem ureazą, miano kwasu klawulanowego znacząco wzrośnie, np. o wielkość rzędu 10%.

W związku z tym sposób wytwarzania klawamów na drodze fermentacji drobnoustrojów wytwarzających klawam w odpowiednim środowisku, charakteryzuje się tym, ze powoduje się reagowanie mocznika wytworzonego w procesie fermentacji z enzymem ureazą..

Ureaza może być wewnętrzna (endogenna) lub zewnętrzna (egzogenna), to znaczy może być wytwarzana przez drobnoustroje wytwarzające kwas klawulanowy (ureaza wewnętrzna) lub może być dodawana do układu (ureaza zewnętrzna).

Gdy pożądane jest stosowanie ureazy zewnętrznej, enzym można uzyskać z dowolnego źródła i dodać do reakcji fermentacji. Gdy stosuje się ureazę wewnętrzną może ona, w jednym rozwiązaniu według wynalazku, zostać uwolniona na drodze derepresyjnej ekspresji ureazy przez organizm wytwarzający kwas klawulanowy.

Taką derepresję można spowodować np. nastawiając pH za pomocą dowolnej zasady innej niz amoniak Zgodnie z takim sposobem stężenie amoniaku w fermentacji utrzymuje się korzystnie na niskim poziomie aż do zajścia derepresji. Taką derepresję można dogodnie śledzić obserwując zmiany w profilu pH ośrodka reakcji (patrz przykłady podane poniżej)

Zgodnie z powyższym sposobem środek regulujący pH może stanowić dowolna odpowiednia zasada inna niż amoniak, np. wodorotlenek metalu alkalicznego taki jak wodorotlenek sodowy Po zajściu derepresji i ekspresji ureazy dogodnie pH reguluje się w zwykły sposób, tak aby zapewnić dostarczenie wystarczającej ilości azotu. Wariantowo można jednak zastosować regulator pH inny niz amoniak w całej fermentacji.

Amoniak jest zasadniczo korzystny jako surowiec w typowej fermentacji, gdyż spełnia on podwójną rolę - reguluje pH i dostarcza azotu do fermentacji. Działa on także jako jonowa przeciwwaga w nagromadzaniu się klawulanianu. Jakkolwiek korzyści związane z derepresją enzymów tłumionych przez amoniak osiągnąć można dzięki zastosowaniu wariantowego regulatora pH w części fermentacji, to można to również uzyskać stosując wariantowy regulator pH, a następnie wprowadzając niezbędny azot do wsadu fermentacyjnego lub dodając sól amonową.

Kolejny sposób derepresji ureazy obejmuje nastawianie ilości kompleksowego źródła azotu, które znajduje się lub jest dodawane do fermentacji. Amoniak uwalniany w wyniku odaminowania kompleksowego źródła azotu będzie tłumić ureazę. W związku z tym nastawianie ilości biorących udział w fermentacji łub charakterystyki ich uwalniania będą wpływać na derepresję ureazy.

Kolejny sposób zwiększania miana kwasu klawulanowego polega na dodawaniu do reakcji fermentacji dowolnego odpowiedniego związku, który wpływa bezpośrednio lub pośrednio na stężenie amoniaku lub mocznika w fermentacji.

Jednym ze sposobów, w jaki można to osiągnąć, jest dodawanie związku takiego jak zeolit, który może adsorbować amoniak zmniejszając w ten sposób jego stężenie Do odpowiednich odczynników adsorbujących amoniak należą związki zdolne do wytrącania amoniaku w postaci kompleksowej soli, takie jak fosforan amonowo-magnezowy.

Kolejnym sposobem obniżania stężenia mocznika jest dodawanie do ośrodka farmaceutycznego związku, który bezpośrednio lub pośrednio zwiększa ekspresję ureazy przez organizmy wytwarzające kwas klawulanowy.

Manipulacje genetyczne lub sposoby poprawy szczepów można również zastosować do zwiększenia poziomów wewnętrznej ureazy produkowanej przez drobnoustroje wytwarzające

184 403 kwas klawulanowy. Tak np. poprawę szczepu [np. na drodze mutagenezy, a następnie selekcji na specyficznych ośrodkach, np. takich, które zawierają związek metyloamoniowy (Microbiological Reviews 1989, 53, 85-108)] wykorzystać można do wytwarzania szczepu mutantowego drobnoustroju wytwarzającego kwas klawulanowy, konstytutywnego względem ekspresji ureazy, tak że ureaza nie jest w znaczącym stopniu tłumiona w obecności amoniaku. Podobne wyniki uzyskać można technikami ukierunkowanej manipulacji genetycznej obejmującymi manipulowanie genem ureazy, tak aby wpłynąć na jego regulację, np. powodując wspólną ekspresję z enzymem odgrywającym rolę na szlaku biosyntezy kwasu klawulanowego.

Zaletą powyższych sposobów jest to, ze umożliwiają znaczące zwiększenie miana kwasu klawulanowego. Kwas klawulanowy można oddzielać i oczyszczać standardowymi technikami.

Poniższe przykłady ilustrują wynalazek. W przykładach, o ile nie zaznaczono tego inaczej, wykorzystano sposoby i standardowe techniki opisane w pracy Sambrook i inni (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 wydanie.

Przykład 1. Wpływ doboru regulatora pH na miano kwasu klawulanowego

W fermentacji Streptomyces clavuligerus w skali 1000 litrów (5% inokulum zaszczepiającego fermentację, 20-60 g/litr białka w postaci mączki sojowej. 1-3% dekstryny, 1-5% oleju roślinnego oraz zestaw pierwiastków śladowych z utrzymywaniem pH na poziomie 6,8) wydajność kwasu klawulanowego można zwiększyć o 8% dobierając regulator pH.

Jeśli 2,5N NaOH zastosuje się zamiast amoniaku do utrzymywania pH na poziomie 6,8 na początku fermentacji, na profilu pH zaobserwuje się dwa piki. Pierwszy odpowiada odaminowaniu białka sojowego, w wyniku którego następuje uwolnienie amoniaku i wzrost pH. Drugi spowodowany jest derepresją ureazy, co również powoduje uwalnianie amoniaku. Po zaobserwowaniu drugiego piku (co można potwierdzić nie wykrycie mocznika metodami kolorymetrycznymi) regulator pH ponownie zmienia się na amoniak, aby zapewnić wystarczającą ilość azotu w środowisku reakcji.

Przykład 2. Wytwarzanie drobnoustrojów konstytutywnych względem ureazy

Uzyskać można zmutowane szczepy S. clavuligerus, które konstytutywnie eksprymują ureazę. Spory poddane działaniu mutagenu (takiego jak promieniowanie UV lub wystawienie na działanie nitrozoguanidyny) wysiewa się na agarze zawierającym związek metyloamoniowy i mocznik. W agarze mocznik stanowi jedyne źródło węgla i azotu Związek metyloamoniowy nie może być metabolizowany, ale jest rozpoznawany przez organizm tak jak amoniak, w związku z czym wywiera działanie tłumiące na ekspresję ureazy.

Spory mutantowe zdolne do rozwoju na takiej pożywce można wybrać. Eksprymują one ureazę w konstytutywny sposób w fermentacji i zapewniają doskonałą wydajność kwasu klawulanowego.

184 403

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz Cena 2,00 zł.

Claims (14)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania klawamów przez fermentację mikroorganizmów rodzaju Streptomyces wytwarzających klawamy w odpowiednim środowisku, znamienny tym. ze w fermentatorze stosuje się takie warunki, w których podczas fermentacji utrzymuje się poziom amoniaku poniżej 50 pg/ml dla uniknięcia represji ureazy.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym. ze stosuje się amoniak pochodzący z kompleksowego źródła azotu.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym. ze jako klawam otrzymuje się kwas klawulanowy.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym. ze jako mikroorganizm stosuje się Streptomyces clavuligerus
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym. ze derepresję powoduje się nastawiając pH fermentacji dowolną odpowiednią zasadą inną niz amoniak.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym. ze jako zasadę stosuje się wodorotlenek sodowy.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym. ze niskie poziomy amoniaku utrzymuje się przez dodanie do fermentacji związku, który bezpośrednio lub pośrednio wpływa na stężenie amoniaku w fermentatorze. ,
8. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym. ze stosuje się związek adsorbujący amoniak, a nie związek adsorbujący mocznik.
9. 9. Sposób wytwarzania klawamów przez fermentację mikroorganizmów rodzaju Streptomyces wytwarzających klawamy w odpowiednim środowisku, znamienny tym. że w fermentatorze w odpowiednim środowisku rozmnaża się organizmy produkujące klawamy i do fermentatora ewentualnie dodaje się związek, który bezpośrednio lub pośrednio wpływa na stężenie amoniaku lub mocznika w fermentatorze.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym. że jako związek, który bezpośrednio lub pośrednio wpływa na stężenie amoniaku w fermentatorze korzystnie stosuje się zeolit lub fosforan amonowo-magnezowy.
11. 11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym. ze jako związek, który bezpośrednio lub pośrednio wpływa na stężenie mocznika w fermentatorze korzystnie stosuje się zeolit lub fosforan amonowo-magnezowy.
12. 12. Sposób według zastrz 9, znamienny tym. ze jako mikroorganizmy produkujące klawamy stosuje się mikroorganizm, który jest konstytutywny względem ekspresji ureazy
13. 13. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym. ze jako klawam otrzymuje się kwas klawulanowy.
14. 14. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym. że jako mikroorganizm stosuje się Streptomyces clavuligerus.