DE69509669T2 - Herstellung von gefrorenen fermentierten nahrungsmitteln mit gefrierschutz-polypeptide expremierenden mikroorganismen - Google Patents

Herstellung von gefrorenen fermentierten nahrungsmitteln mit gefrierschutz-polypeptide expremierenden mikroorganismen

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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren und Reagentien, die zum Aufrechterhalten der Qualität von gefrorenen Nahrungsmittelprodukten während der Lagerung in gefrorenem Zustand, insbesondere für verbesserte Lagerfähigkeit und die Aufrechterhaltung der vom Verbraucher akzeptierten Qualität von Molkereiprodukten, brauchbar sind.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Kühlen, insbesondere Gefrieren, ist ein allgemeines und bevorzugtes Mittel für die Lagerung von biologischen Materialien. Im allgemeinen wird durch die Lagerung in gefrorenem Zustand das Verderben des biologischen Produktes gestoppt oder beträchtlich verlangsamt.
  • Gefrorene oder gekühlte Nahrungsmittel sind heutzutage eine Hauptstütze der menschlichen Ernährung in entwickelten Ländern. Daher wurde und wird von Nahrungsmittelwissenschaftlern umfangreiche Forschung betrieben, um Produkte hoher Qualität für die Verbraucher sicherzustellen. Dies gilt insbesondere hinsichtlich gefrorenem Gemüse und gefrorenen Desserts, wie Eiscreme und Joghurt.
  • Gefrorene Desserts, wie Eiscreme oder Joghurt, werden im allgemeinen im gefrorenen Zustand gegessen. Daher ist den Verbrauchern sowohl die Textur des gefrorenen Produktes als auch dessen Geschmack bzw. Aroma wichtig. Die Textur wird in hohem Maße von der Größe der Eiskristalle bestimmt. Hersteller dieser gefrorenen Desserts haben beträchtliche Anstrengungen und Kosten auf sich genommen, um glatt texturierte Produkte sicherzustellen. Während der Lagerung in gefrorenem Zustand können die Eiskristalle jedoch wachsen und so diese Textur rauh werden lassen und verderben. Das Wachstum von Eiskristallen während der Lagerung in gefrorenem Zustand wird als Rekristallisierung bezeichnet. Dieses Problem tritt insbesondere dann häufig auf, wenn die Bedingungen für die Lagerung in gefrorenem Zustand weniger als ideal sind, wie beispielsweise während des Transports oder der Lagerung in modernen frostfreien Haushaltsgefriervorrichtungen. Gefrorene Nahrungsmittel können nach einer relativ kurzen Zeit bei Temperaturen über Null (d. h. über 0 ºC), oder sogar bei anhaltenden Gefriertemperaturen, aufgrund des Eisrekristallisierungsprozesses weniger attraktiv oder sogar für den menschlichen Konsum ungeeignet werden.
  • Obwohl die Hersteller eine Vielzahl von Techniken einsetzen, um den Schaden in Zusammenhang mit der Rekristallisierung zu vermindern, ist der Erfolg begrenzt, und signifikante Probleme bleiben bestehen. Daher besteht ein Bedürfnis nach neuen Techniken, um den Rekristallisierungsprozeß zu vermindern oder zu verhindern und die Eigenschaften von gefrorenen Nahrungsmitteln zu verbessern. Diese Techniken und Zusammensetzungen sollten preiswert und völlig sicher und geeignet für den menschlichen Konsum sein.
  • Es ist klar gezeigt worden, daß Gefrierschutz-Polypeptide (antifreeze polypeptides, AFP) die Eisrekristallisierung bei niedrigen (ug/ml) Konzentrationen in wäßrigen Lösungen und gefrorenen Nahrungsmittelprodukten wirksam verhindern können (siehe z. B. Knight et al., 1984, Nature 308: 295-296; Knight et al., 1986, Cryobiology, 23: 256-262; Knight et al., 1988, Cryobiology, 25: 55-60; Warren et al., US-Patent Nr. 5,118,792). Warren et al., siehe oben, haben vorgeschlagen, gereinigte Gefrierschutz-Polypeptide den Nahrungsmittelprodukten direkt vor dem Gefrieren zuzugeben, um die Konservierungseigenschaften während der Lagerung in gefrorenem Zustand zu verbessern.
  • Die WO-A-9013571 lehrt Verfahren zur Verbesserung der Gefriertoleranz von Nahrungsmittelprodukten durch Unterdrückung des Wachstums von Eiskristallen oder Verhinderung der Eisrekristallisierung, wobei Gefrierschutz-Polypeptide in isolierter Form verwendet werden. Darüber hinaus wird in der WO-A-9013571 ein Mikroorganismus beschrieben, der Gefrierschutz-Proteine kodiert, die in den genannten Mikroorganismus exprimiert werden, die dazu dienen, dessen Lebensfähigkeit beim Gefrieren und beim Auftauen zu erhalten. Die WO-A-9013571 lehrt nicht die Verwendung eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, das Gefrierschutz-Polypeptid in ein Nahrungsmittelprodukt zu sekretieren.
  • Derzeit sind Gefrierschutz-Proteine für die kommerzielle Verwendung aus zwei Quellen erhältlich: dem Blutserum einer geringen Anzahl Fischspezies, die in kaltem Wasser zu finden sind, und rekombinante DNA-Techniken, wie diejenigen, die beschrieben sind von (jedoch nicht beschränkt auf) Warren et al., siehe oben. Andere Quellen für Gefrierschutz-Protein, wie beispielsweise transgene Pflanzen und Tiere, werden derzeit erforscht. Unabhängig von der Quelle müssen die Gefrierschutz- Polypeptide von dem Medium, in dem sie vorliegen oder erzeugt werden, isoliert und einer umfassenden Reinigung unterzogen werden. Diese Reinigungsvorgänge sind teuer bis zu einem Punkt, wo die Kosten für die Gefrierschutz-Polypeptid-Zugaben den Wert des gefrorenen Produktes übersteigen könnten. Darüber hinaus können durch das Reinigungsprotokoll Schmutzstoffe eingeführt werden, die für den Verzehr gefährlich sind.
  • Angesichts des inhärenten Nutzens, den Hersteller und Verbraucher daraus ziehen, wenn die Eisrekristallisierung in gefrorenen fermentierten Molkereiprodukten verhindert wird, und angesichts der Tatsache, daß Gefrierschutz-Polypeptide in dieser Hinsicht sehr wirksam sind, ist es wünschenswert, Verfahren zu entwickeln, um die Gefrierschutz-Polypeptide mittels des effizientesten und kosteneffektivsten möglichen Verfahrens in die Nahrungsmittelprodukte einzubringen.
  • Ein ideales Verfahren zum Einbringen von Gefrierschutz-Polypeptiden in gefrorene fermentierte Nahrungsmittelprodukte besteht darin, daß man den für den Fermentationsprozeß verantwortlichen Organismus die Gefrierschutz-Proteine erzeugen läßt, während er das Nahrungsmittel fermentiert. Eine Anzahl von Gefrierschutz-Polypeptiden und deren Gene sind gut charakterisiert und sequenziert worden (siehe z. B. Anathanarayanan, 1989, Life Chem. Rep. 7:I-32, und Davies et al., 1990, FASEB Journal 4: 2460-2467). Mehrere dieser Gene sind in Bakterien, transgene Pflanzen, Fisch und Drosophila exprimiert worden (siehe z. B. Fletcher et al., 1988. Can. J. Fish. aquat. Sci 45: 352-357; Rancourt et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2188-2195; Kenward et al., 1993, Plans Mol. Biol. 23: 377-385; Li et al., 1991, Protein Engineering 4: 995-1012; und Sönnichsen et al., 1993, Science 259: 1154-1157).
  • Angesichts der breiten Popularität gefrorener fermentierter Molkereiprodukte, wie Joghurt, wäre es wünschenswert, Verfahren zu entwickeln, um solche Produkte effizienter bei geringeren Kosten und mit besserem Geschmack und Textur zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Erreichen dieser Zielsetzung bereit.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zum Herstellen eines gefrorenen fermentierten Nahrungsmittelproduktes bereit. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte (a) In-Kontakt-Bringen eines Nahrungsmittelproduktes mit einem Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Fisch-Gefrierschutz-Polypeptid zu sekretieren, wobei der Mikroorganismus in der Lage ist, das Nahrungsmittelprodukt zu fermentieren, um das fermentierte Nahrungsmittelprodukt zu erzeugen, (b) Inkubieren des Nahrungsmittelproduktes mit dem Mikroorganismus unter Bedingungen, bei denen Fermentation stattfindet, so daß ein fermentiertes Nahrungsmittelprodukt erzeugt wird, bei dem das Gefrierschutz-Polypeptid in einer Menge vorliegt, die die Rekristallisierung des Produktes wirksam inhibiert; und (c) Gefrieren des fermentierten Nahrungsmittelproduktes bei einer Temperatur unter -5ºC, um ein gefrorenes fermentiertes Nahrungsmittelprodukt zu erzeugen.
  • In einer Ausführungsform ist das Nahrungsmittelprodukt ein Molkereiprodukt (z. B. Milch), das fermentiert werden kann, um Joghurt, Buttermilch oder Käse zu erzeugen.
  • Der erfindungsgemäße Mikroorganismus ist üblicherweise ein Bakterium (z. B. Lactobacillus bulgaricus; Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis; Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum), kann jedoch auch ein Pilz sein, wie z. B. eine Hefe (z. B. Saccharomyces fragilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces lactis, und andere). Erfindungsgemäß werden diese Mikroorganismen gentechnisch hergestellt, so daß sie in der Lage sind, ein Fisch-Gefrierschutz-Polypeptid zu sekretieren (oder ein Peptid mit einer wesentlichen Sequenzähnlichkeit mit einem Fisch-Gefrierschutz-Polypeptid und mit Gefrierschutz-Eigenschaften ähnlich denjenigen eines Fisch-Gefrierschutz-Polypeptids). In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gefrierschutz-Polypeptid ein Tier-Gefrierschutz-Polypeptid, wobei ein Fisch-Gefrierschutz-Polypeptid bevorzugt ist. Am meisten bevorzugt ist ein Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Meeresschellfisch-Gefrierschutz-Polypeptid Typ III zu exprimieren (siehe z. B. Hew et al., 1984, J. Comp. Physiol. B155: 81-85; Li et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 12904-12909).
  • In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform umfaßt die Erfindung das Inkubieren von Milch mit den Bakterienspezies Lactobacillus bulgaricus und Streptococcus lactis, die in der Lage sind, Milch zu fermentieren, um Joghurt zu erzeugen, und die in der Lage sind, ein Meeresschellfisch-Gefrierschutz- Polypeptid Typ III zu sekretieren; Inkubieren der Bakterien und der Milch unter Bedingungen, bei denen Joghurt erzeugt wird; und Gefrieren des Joghurts bei einer Temperatur unter -5ºC, um gefrorenen Joghurt zu erzeugen.
  • Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die Joghurt und einen Mikroorganismus umfaßt, wobei der Mikroorganismus ein Gen umfaßt, das ein Fisch-Gefrierschutz-Polypeptid kodiert.
    • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG Definitionen
  • Der hier verwendete Begriff "Fermentation" bedeutet die chemische Umwandlung von Kohlenhydraten oder Proteinen in Nahrungsmitteln durch die Verwendung von Mikroorganismen. Bei diesem Prozeß werden die Kohlenhydrate häufig in Milchsäure umgewandelt.
  • Der hier verwendete Begriff "Nahrungsmittelprodukt" bedeutet ein Nahrungsmittel (eine Substanz, die als Nahrung verwendet oder für die Verwendung als Nahrung zubereitet werden kann), das durch die Wirkung eines fermentierenden Mikroorganismus in ein fermentiertes Nahrungsmittelprodukt umgewandelt werden kann.
  • Der hier verwendete Begriff "fermentiertes Nahrungsmittelprodukt" bedeutet ein eßbares Nahrungsmittel, das durch einen Prozeß hergestellt wird, der Fermentation durch einen Mikroorganismus umfaßt.
  • Der hier verwendete Begriff "Joghurt" bedeutet ein Molkereiprodukt, das durch Milchsäurefermentation von Milch durch die Wirkung von Mikroorganismen erzeugt wird.
  • Der hier verwendete Begriff "Gefrierschutz-Polypeptide" (AFPs) bedeutet Makromoleküle, die in den Körperflüssigkeiten einiger Tiere und Pflanzen vorkommen, die die allgemein bekannte Eigenschaft aufweisen, daß sie den Gefrierpunkt von Wasser nicht-kolligativ herabsetzen. Gefrierschutz-Polypeptide sind auch als "thermische Hysterese-Proteine" bekannt. Der hier verwendete Begriff "Gefrierschutz-Polypeptide" umfaßt Glycoproteine sowie chemisch synthetisierte und rekombinant erzeugte Polypeptide, die eine Proteinsequenz mit wesentlicher Ähnlichkeit mit einem natürlich vorkommenden AFP aufweisen und die die Eigenschaften eines Gefrierschutz-Polypeptids beibehalten.
  • Der hier verwendete Begriff "Fisch-Gefrierschutz-Polypeptid" bedeutet ein AFP, das in der Natur in einem Fisch vorkommt, sowie chemisch synthetisierte und rekombinant erzeugte Polypeptide, die eine Proteinsequenz mit wesentlicher Ähnlichkeit mit einem natürlich vorkommenden Fisch-AFP aufweisen und die die Eigenschaften von Gefrierschutz-Polypeptiden behalten.
  • Der hier verwendete Begriff "rekombinant erzeugte Polypeptide" bedeutet Polypeptide, die unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken erzeugt wurden. Rekombinante DNA- Techniken sind gut bekannt und sind charakterisiert durch das Verbinden mindestens zweier DNA-Segmente, die in der Natur auf natürliche Weise nicht verbunden sind (z. B. ein Bakterienpromotor und eine ein Fisch-Polypeptid codierende Sequenz).
  • Der hier verwendete Begriff "wesentliche Ähnlichkeit" bezeichnet eine Eigenschaft einer Polypeptidsequenz oder Nukleinsäuresequenz, wobei die Polypeptidsequenz eine Sequenzidentität von mindestens 70 Prozent, vorzugsweise eine Sequenzidentität von 80 Prozent, und am meisten bevorzugt eine Sequenzidentität von 90% aufweist, verglichen mit einer Referenzsequenz (z. B. einem natürlich vorkommenden Gefrierschutz-Polypeptid), und wobei die Nukleinsäuresequenz eine Sequenzidentität von mindestens 80 Prozent und vorzugsweise eine Sequenzidentität von 90% aufweist, verglichen mit einer Referenzsequenz. Die Referenzsequenz kann kürzer sein als die natürlich vorkommende Polypeptid- oder Nukleinsäuresequenz in ihrer Gesamtlänge, ist jedoch im Falle eines Polypeptids mindestens 12 Reste lang und im Falle einer Nukleinsäuresequenz mindestens 36 Basen lang.
    • Beschreibung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Herstellung eines gefrorenen fermentierten Nahrungsmittelproduktes durch Zugabe eines Mikroorganismus bereit, der in der Lage ist, das Nahrungsmittelprodukt zu fermentieren, um das fermentierte Nahrungsmittelprodukt zu erzeugen, und der auch ein Fisch-Gefrierschutz-Polypeptid sekretieren kann. Die Verwendung eines Mikroorganismus, der sowohl ein AFP sekretiert, als auch das Nahrungsmittelprodukt fermentiert, weist mehrere Vorteile gegenüber anderen Verfahren zur Beeinflussung der Eiskristallbildung und Gefriertemperatur auf. Beispielsweise wird mit dem beanspruchten Verfahren die kostspielige Notwendigkeit einer Reinigung des AFP vor der Zugabe zu einem Nahrungsmittelprodukt umgangen. Darüber hinaus wird dadurch jede mögliche Kontamination durch das Reinigungsprotokoll und die mit fremden Mikroorganismen in Verbindung gebrachte Pyrogenizität ausgeschaltet.
  • Des weiteren erfordert dieser Prozeß aufgrund der Tatsache, daß das AFP von dem fermentierenden Mikroorganismus der beanspruchten Erfindung sekretiert wird, weniger Schritte als andere Verfahren.
  • Das Nahrungsmittelprodukt der Erfindung ist üblicherweise Milch, es können jedoch auch andere Nahrungsmittel verwendet werden, die zum Erzeugen eines eßbaren fermentierten Nahrungsmittels fermentiert werden. Beispiele umfassen Kohl (der fermentiert werden kann, um Sauerkraut zu erzeugen), Gurken (die fermentiert werden können, um Pickles zu erzeugen) und Sojabohnen (die fermentiert werden können, um Miso und andere Produkte zu erzeugen).
  • In einem Schritt des beanspruchten Verfahrens wird das Nahrungsmittelprodukt mit einem Mikroorganismus, der in der Lage ist, das Nahrungsmittelprodukt zu fermentieren, in Kontakt gebracht oder gemischt. Beispiele für Mikroorganismen, die für die Fermentation von Nahrungsmitteln brauchbar sind, sind gut bekannt (siehe z. B. von de Guchte, 1992, FEMS Microbiology Reviews, 88: 73-92).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Nahrungsmittelprodukt Milch (z. B. von einer Kuh [d. h. bovin], einem Mutterschaf, einer Stute oder Ziege). Durch die Wirkung der fermentierenden Mikroorganismen, typischerweise Bakterien, auf die Milch werden Joghurt, Buttermilch oder bestimmte Käsearten erzeugt, je nach den ausgewählten Bakterien und den Inkubationsbedingungen. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren verwendet, um aus Milch Joghurt zu erzeugen. Joghurt weist auf der ganzen Welt ein breites Namensspektrum auf. Tabelle 1 stellt eine Liste mit den Namen und Ursprungsländern der gängigen Arten bereit.
  • Verfahren zur Erzeugung von Joghurt sind in Functions of Fermented Milk, herausgegeben von Nakazawa und Hosono, 1992, veröffentlicht von Elsevier Applied Science, London-New York, S. 32, angegeben. In den USA wird Joghurt entweder aus Vollmilch oder Magermilch von Kühen erzeugt. Die Milch wird auf 10,5 bis 11,5% Feststoffe standardisiert, auf über 90ºC erwärmt (30 bis 60 Minuten), um jegliche kontaminierenden Mikroorganismen zu zerstören, und dann abgekühlt. Das Material wird dann mit einer gemischten Kultur von Streptococcus thermophilus und Lactobacillus bulgaricus im Verhältnis 1 : 1 geimpft. Die kombinierte Wirkung dieser beiden Organismen ist normalerweise erforderlich, um den gewünschten Geschmack und die gewünschte Säure in den Produkten zu erhalten. In anderen Fällen sind auch andere hochfermentierende Bakterien, einschließlich bulgarischer Bakterien, L. jugarri, L. acidophilus, Bifido bacterium, spp. Hefe und Milchpilze verwendet worden. Beispiele für Bakterien und andere Organismen, die für die Fermentierung von Milch zur Erzeugung von Joghurt verwendet werden, sind in Tabelle 2 angegeben.
  • Erfindungsgemäß werden die Mikroorganismen gentechnisch hergestellt (d. h. unter Verwendung der Techniken der rekombinanten DNA-Technologie), so daß sie in der Lage sind, ein Fisch-Gefrierschutz-Polypeptid zu sekretieren. Beispiele für Fisch-Gefrierschutz-Polypeptide umfassen Winterflunder-AFP Typ I, Seeraben-, Hering- und Stint-AFP Typ II, Meeresschellfisch- und Wolfsfisch-AFP Typ III und AFGP (Gefrierschutz-Glycoprotein) von Kabeljau und Nototheniidae (siehe z. B. Davies et al., 1990 FASEB Journal 4: 2460-2467, und Ewart et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 185: 335-340).
  • Am meisten bevorzugt ist ein Mikroorganismus, der in der Lage ist, ein Meeresschellfisch-Gefrierschutz-Polypeptid Typ III zu exprimieren. Das Meeresschellfisch-Gefrierschutz-Polypeptid Typ III ist bevorzugt, weil es keinen Aminosäure-Überhang aufweist und seine Wirksamkeit bei Expression in E. coli gezeigt worden ist (Li et al., 1991, Protein Engineering 4: 995-1012; Sönnichsen et al., 1993, Science, 259: 1154-1157). Darüber hinaus ist das AFP Typ III bevorzugt, weil das Winterflunder-AFP Typ I bei der Fermentationstemperatur möglicherweise nicht stabil ist und das AFP Typ II in dem bakteriellen System möglicherweise nicht richtig gefaltet wird und es sehr anfällig für Reduktion ist.
  • Die Verfahren für die technische Herstellung von Bakterien und Pilzen, die in der Lage sind, ein heterologes Polypeptid zu exprimieren und zu sekretieren, sind bereits gut etabliert (siehe z. B. Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York; Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology 152 (Academic Press, Inc., San Diego, CA); Simon et al., 1986, Appl. Environ. Microbiol. 52: 394-395; und von Wright et al., 1985, Appl. Environ. Microbiol. 50: 1100-1102.
  • Die Erzeugung von Mikroorganismen, die in der Lage sind, ein AFP zu exprimieren und zu sekretieren, kann mittels einer Vielzahl von verschiedenen Wegen durchgeführt werden, die dem Durchschnittsfachmann offensichtlich sind. Die das AFP kodierende DNA-Sequenz wird vorzugsweise operabel verknüpft mit einem Operon (d. h. so positioniert, daß es die Wirkungsweise mit diesem sicherstellt), der ermöglicht, daß die DNA in dem Mikroorganismus (in ein RNA-Transkript) transkribiert und in ein Polypeptid translatiert wird. Promotoren sowohl für Bakterien als auch für Pilze sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Bevorzugte Operons für die Expression in Milchsäurebakterien umfassen den Lactose-Operon von S. thermophilus oder den lac ABCDFEGX-Operon von L. lactic, da diese erfolgreich verwendet worden sind, um die Expression von fremden Genen in den Wirten zu forcieren (siehe z. B. Simons et al., 1993, J. Bact. 175: 5186-5175; Mollet et al., 1993, J. Bact. 175: 4315-4324).
  • Für eine erhöhte Stabilität oder andere günstige Eigenschaften kann das AFP als ein Fusionspolypeptid exprimiert werden. Darüber hinaus kann das AFP-Folypeptid über eine Modifikation des Gens, das das Polypeptid kodiert, modifiziert werden. Allgemein können Modifikationen der Gene ohne weiteres mittels einer Vielzahl gut bekannter Techniken erreicht werden, wie beispielsweise mittels gerichteter Mutagenese (siehe z. B. Gillman and Smith, 1979, Gene 8: 81-97, und Roberts et al., 1987, Nature 328: 731-734).
  • Die erfindungsgemäßen Mikroorganismen sind in der Lage, das AFP zu sekretieren. Dementsprechend ist das AFP vorzugsweise mit einer Signalpeptidsequenz verbunden. Beispiele für geeignete Signalpeptidsequenzen umfassen diejenigen des usp45-Gens von L. lactis ssp lactis MG 1363 und des mit der Zellhülle assoziierten Proteasegens von L. lactis ssp cremoris SK11 (von Asseldonk et al., 1990, Gene 95: 155-160; De vos et al., 1989, J. Dairy Sci. 72 : 3398-3405). Für Bakterien wie L. lactis ist das usp45-Signalpeptid bevorzugt, da es vom selben Wirt stammt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das AFP-Gen mit einer Transkriptions-Terminationssequenz verbunden, um die richtige Termination der AFP-Transkription in dem Wirtssystem sicherzustellen.
  • Ein AFP-Genkonstrukt, das zuvor beschriebene Elemente umfaßt, wird unter Verwendung von Plasmiden, wie beispielsweise pUC19, pNZ18 und pDBN183, als Vektoren gebaut (Solaiman et al., 1992, Plasmid, 28: 25-36). Das AFP-Genkonstrukt wird unter Verwendung homologer Rekombinationstechniken in das Genom einer Milchsäurebakterien-Spezies eingebaut (Mollet et al., 1993, J. Bact., 175: 4315-4324). Die Milchsäurebakterien- und E. coli- Stämme können wie von Maniatis et al. in Molecular Cloning, A Laboratory Manual, siehe oben; und Chagnand et al., 1992, Can. J. Microbiol. 38: 67-74, empfohlen beibehalten werden.
  • Fisch-Gefrierschutz exprimierende (FAE) Mikroorganismen können den Nahrungsmittelprodukten auf jedem herkömmlichen Weg zugegeben werden. Im Fall von Produkten wie Milch können die Bakterien oder der Pilz mit dem Nahrungsmittel, das fermentiert und gefroren werden soll, gründlich gemischt werden. Es ist dem Fachmann bekannt, daß manchmal Gemische verschiedener Mikroorganismen verwendet werden, um das gewünschte Produkt zu erzeugen. Beispielsweise werden bei der Herstellung von Joghurt häufig S. thermophilus und L. bulgaricus zusammen verwendet.
  • Die Anzahl von zu dem Nahrungsmittelprodukt zugegebenen FAE-Mikroorganismen hängt von den Eigenschaften der Mikroorganismen und des Nahrungsmittels ab. Im allgemeinen werden Milchsäure-FAE-Starterbakterien (10¹&sup0;-10¹¹ pro ml) bei 1-5% in pasteurisierter und gekühlter Milch inkubiert, so daß das Mengenverhältnis eine geeignete Menge an Gefrierschutz-Polypeptid indem Produkt ergibt. Die AFP-Menge in dem Produkt sollte eine Menge sein, die die Eisrekristallisierung wirksam verhindert oder inhibiert (1-100 mg/Liter Milch). Dies kann unter Verwendung des von Knight et al. (1988) Cryobiology, Bd. 25, S. 55-60, beschriebenen "Splat-Cooling-Assays" bestimmt werden.
  • In einem weiteren Schritt des Verfahrens wird das fermentierte Nahrungsmittelprodukt gefroren, wobei herkömmliche Betriebsarten von Gefriervorrichtungen, wie z. B. Gebläsekühler (-20º bis 40ºC) oder Kontaktplattenkühler (-30º bis 40ºC) oder Vakuumgefriertrockner verwendet werden. Es ist dem Durchschnittsfachmann offensichtlich, daß zahlreiche Variationen der zuvor genannten Ausführungsformen möglich sind.
    • Tabelle 1 Zur Beschreibung von Joghurtarten verwendete Namen Produktname Ursprungsland
  • Jugurt/Eyran/Ayran Türkei usw.
  • Busa Turkestan
  • Kissel Mleka Die Balkanländer
  • Urgotnic Der Balkan
  • Leban/Laban Libanon/Arabische Länder
  • Zabady (Zabbady) Ägypten/Sudan
  • Mast/Dough Iran/Afghanistan
  • Roba Irak
  • Dahi/Dadhi/Dahee Indien
  • Mazun/Matzoon/Matsun/Matsoni Armenien
  • Katyk Transkaukasien
  • Tiaourti Griechenland
  • Cieddu Italien
  • Mezzoradu Sizilien
  • Gioddu Sardinien
  • Biokys Tschechoslowakei
  • Karmdinka Polen
  • Tarho Ungarn
  • Tykmaelk/Ymer Ungarn
  • Villi (Fiili) Finnland
  • Filmjolk/Fillbunke/Surmelk/ Skandinavien
  • Taettemjolk/Tettemelk
  • Iogurte Brasilien/Portugal
  • Proghurt Chile
  • Skyr Island
  • Gruzovina Jugoslawien
  • Kefir/Donskaya/Varentes Sowjetunion
  • Kurunga/Koumiss/
  • Ryazhenka/Guslyanka
  • Tarag Mongolei
  • Shosim/Sho/Thara Nepal Tabelle 2 Üblicherweise zur Fermentation von Milch und Milchgetränken verwendete Mikroorganismen
  • a Jetzt Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lac, lactis subsp. lactis und 5. thermophilus.
  • b Jetzt L. mesenteroides subsp. cremoris und L. mesenteroides subsp. mesenteroides.
  • c Jetzt L. acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. casei subsp. casei, L. helveticus biovar. jugurti und L. delbrueckii subsp. lactis.
    • BEISPIELE
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Diese Beispiele sind lediglich zur Veranschaulichung angegeben, nicht zur Einschränkung.
    • Beispiel 1 Konstruktion eines Stammes Milchsäurebakterien, die Gefrierschutz-Polypeptid erzeugen - Verfahren I
  • Für die technische Herstellung eines Milchsäurebakteriums, das Gefrierschutz-Proteine erzeugt, sind mehrere Schritte erforderlich. Der erste Schritt umfaßt die Selektion und Herstellung einer Chromosomenstelle für die Integration des AFP- Gens. Es wird ein nativer Operon eines Stammes Milchsäurebakterien, wie der Lactose-Operon des S. thermophilus- oder L. lacris-Genoms, bestehend aus den lacS (Lactosepermease)- und lacZ (β-Galactosidase)-Genen, für die Integration eines Gefrierschutz-Protein-Gens verwendet. Bei der Integration eines AFP-Gens in einen solchen Operon sollte dessen richtige Funktionsweise erhalten bleiben. Das AFP-Gen sollte ein funktioneller Teil des Operons werden und ähnlich reguliert werden (siehe z. B. Simons et al., 1993, J. Bact., 175: 5186-5175, und Mollet et al., 1993, J. Bact. 175: 4315-4324).
  • Dafür werden die lacS- und lacZ-Gene der Wirtsbakterien mittels PCR-Verfahren oder konventioneller Gen- Klonierungsverfahren kloniert. Es wird mindestens eine Restriktionsenzym-Stelle zwischen den beiden Genen gebildet, indem besondere Primersequenzen für die PCR-Reaktionen konstruiert werden. Die Restriktionsenzym-Stellen werden für eine bequeme Segmentbindung und Insertion des DNA-Fragments gebildet. Ein Antibiotikumresistenz-Markergen, wie ein Ampicillin- oder Erythromycin-Resistenzgen wird in die gebildete Restriktionsenzymstelle eingebracht. Die lacS-Ampr-lacZ-DNA in einem geeigneten Vektor, wie pNZ932, wird in den Milchsäurebakterienstamm transformiert (siehe z. B. Simons et al., 1993, J. Bact. 175: 5186-5175). Ampicillin-resistente Transformanten werden selektiert, und die Genintegration wird unter Verwendung von PCR und DNA-Sequenzierung bestätigt.
  • Der zweite Schritt umfaßt die Konstruktion einer Gefrierschutz-Protein-Genkassette. Unter Verwendung der Nukleotidsequenz, die von einem klonierten Meeresschellfisch-AFP Typ III-Gen stammt, wird ein geeignetes AFP Typ III-Gen aus synthetischen Oligonukleotiden zusammengebaut, wobei die bevorzugten Codons des Wirts verwendet werden (siehe z. B. Mercenier, 1990, FEMS Microbiology Reviews, 87: 61-78, und von Asseldonk et al., 1992, FEMS Microbiology Reviews 88: 73-92). Um ein Bakterium zu veranlassen, AFP zu sekretieren, wird eine Signalpeptidsequenz (SP) aus homologen Genen, wie dem usp45-Gen von L. lactis ssp lactis MG 1363 und den mit der Zellhülle assoziierten Proteasegenen von L. lactis ssp cremoris SK11, an das 5'-Ende der reifes AFP Typ III codierenden Sequenz fusioniert (von Asseldonk et al., 1990, Gene 95: 155-160), und De vos et al., 1989, J. Dairy Sci. 72: 3398-3405). Die AFP-Genkassette, die eine Signalpeptidsequenz und ein AFP-Gen umfaßt, wird in vitro zwischen die lacS- und lacZ-Gene eingebracht, um ein lacS-SP-AFP- lacZ-Konstrukt zu erzeugen.
  • Schließlich wird die lacS-SP-AFP-lacz-DNA in das Genom des Ampicillin-resistenten Bakteriums, das in Schritt 1 mittels homologer Rekombinationstechniken gebildet wurde, eingebaut. Die Ersetzung des Gens lacS-AmpR-lacZ durch lacS-SP-AFPlacZ wird am Anfang durch deren Fähigkeit, in Gegenwart oder Abwesenheit von Ampicillin auf einem Medium zu wachsen, selektiert. Die Integration des AFP-Gens wird mittels inverser PCR, Southern Blot- Analyse und DNA-Sequenzierung bestätigt.
    • Beispiel 2 Konstruktion eines Stammes Milchsäurebakterien, der Gefrierschutz-Polypeptid erzeugt - Verfahren II
  • Ein alternatives Verfahren zum Erzeugen eines Gefrierschutz-Protein erzeugenden Milchsäurebakteriums besteht darin, den Schritt der Integration eines Antibiotikumresistenz- Genkonstrukts in das Bakteriumgenom zu eliminieren. In diesem Fall werden Versuche durchgeführt, wie sie in den Schritten 2 und 3 in Beispiel 1 beschrieben sind. Ein markiertes AFP- Genfragment wird verwendet, um die rekombinanten Klone zu identifizieren, und die AFP-Gen-Integration wird darüber hinaus mittels inverser PCR und DNA-Sequenzierung bestätigt.
    • Beispiel 3 Verwendung von Gefrierschutz-Polypeptid exprimierenden Bakterien bei der Herstellung von Joghurt
  • Das gentechnisch hergestellte Bakterium kann direkt verwendet werden, um Starter für die Erzeugung von gefrorenem Joghurt herzustellen. Kurz gesagt, es wird eine geringe Menge der gentechnisch hergestellten Vorratskultur (gefrorene oder kalt gelagerte Kultur) in 0,5-1 Liter pasteurisierter Magermilch kultiviert, um eine Mutterkultur herzustellen. Dann wird eine Zwischenfermentation durchgeführt, um die Stadien von der Mutterkultur zu dem Bulk-Starter, der direkt zu der vorbehandelten Milch zugegeben werden kann, 10-100 mal zu erhöhen. Alternativ kann der Bulk-Starter direkt aus gefrorenen Vorräten hergestellt werden. Das Milchgemisch wird auf 55-60ºC vorgewärmt und dann homogenisiert (150-200 Kg/cm²) und pasteurisiert (5-10 Minuten lang bei 90-95ºC oder ein paar Sekunden lang bei 120-130ºC) und auf einen Temperaturbereich abgekühlt, in dem die Milchsäurebakterien nicht beschädigt werden (45-48ºC). Die Starterbakterien werden eingebracht, um mit vorbehandelter homogenisierter Milch bei 30-45ºC zu impfen. Wenn die Säure einen bestimmten, vorgeschriebenen Anteil erreicht hat, wie z. B. 0,8%, und wenn die AFP-Menge in dem Produkt die erforderliche Konzentration erreicht hat (1-100 mg/Liter Milch), wird die fermentierte Milch auf 15-20ºC gekühlt, um die Aktivität der Bakterien zu unterdrücken. Diese Produkte werden verwendet, um weichen gefrorenen Joghurt, harten gefrorenen Joghurt und Mousse-Joghurt herzustellen, indem verschiedene Prozentsätze an Fruchtsirup, Zucker, Stabilisatoren, Fruchtsaft und Emulgatoren zu einer kalten fermentierten Milchbasis zugegeben werden.
    • Beispiel 4 Erzeugung von gefrorenem Joghurt
  • Weicher gefrorener Joghurt wird hergestellt durch Zugabe von 20% Fruchtsirup und Stabilisatoren und Emulgatoren zu 80% einer kalten fermentierten Milchbasis und anschließendes Abfüllen in Behälter mit 50-60% Überlauf, wobei eine normale Eiscreme-Gefriervorrichtung verwendet wird. Das Produkt wird bei 0-6ºC gelagert.
  • Harter gefrorener Joghurt wird aus 35% Fruchtsaft hergestellt, der Überlauf beträgt 70-80%, und die Lagertemperatur ist unter -25ºC. Mousse-Joghurt wird hergestellt durch Mischen einer fermentierten Milchbasis mit einer warmen Mousse-Basis (einem homogenisierten Gemisch aus Magermilch, Zucker, Stabilisatoren und Emulgatoren). Das Produkt wird unter 0ºC gelagert.
  • Die zuvor angegebenen Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, ihren Umfang jedoch nicht einschränken. Andere Varianten der Erfindung sind dem Durchschnittsfachmann ohne weiteres ersichtlich und werden von den beigefügten Ansprüchen mit umfaßt.

Claims (17)

1. Verfahren zur Herstellung eines gefrorenen fermentierten Nahrungsmittelproduktes, umfassend die Schritte:
a) in Kontakt bringen eines Nahrungsmittelproduktes mit einem Mikroorganismus, der ein Gefrierschutz-Polypeptid in das Nahrungsmittelprodukt sekretiert und der das Nahrungsmittelprodukt fermentiert;
b) Inkubieren des Nahrungsmittelproduktes mit dem Mikroorganismus unter Bedingungen, bei denen Fermentation stattfindet, so daß ein fermentiertes Nahrungsmittelprodukt erzeugt wird, bei dem das Gefrierschutz-Polypeptid in einer Menge vorliegt, die die Bildung von Eiskristallen in dem Nahrungsmittelprodukt während der Lagerung wirksam verhindert oder inhibiert, und dann
c) Gefrieren des fermentierten Nahrungsmittelproduktes bei einer Temperatur unter -5ºC, um ein gefrorenes fermentiertes Nahrungsmittelprodukt zu erzeugen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nahrungsmittelprodukt ein Molkereiprodukt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Nahrungsmittelprodukt Kuhmilch ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das fermentierte Nahrungsmittelprodukt Joghurt ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das fermentierte Nahrungsmittelprodukt Buttermilch oder Käse ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Bakterium ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Streptococcus cremoris, Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc citrovorum, Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei, Lactobacillus jugurti, Lactobacillus lactis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve und Bifidobacterium longum.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Pilz ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Pilz eine Hefe ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Hefe ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Torulopsis holmil, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces lactis und Candida pseudotropicalis.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gefrierschutz-Polypeptid ein Fisch-Gefrierschutz-Polypeptid ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Fisch-Gefrierschutz-Polypeptid von einem Meeresschellfisch stammt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Fisch-Gefrierschutz-Polypeptid ein Meeresschellfisch-Gefrierschutz-Polypeptid Typ III ist.
14. Zusammensetzung, umfassend ein fermentiertes Nahrungsmittelprodukt und einen Mikroorganismus, wobei der Mikroorganismus ein Gen umfaßt, das ein Gefrierschutz-Polypeptid kodiert und das Gefrierschutz-Polypeptid in das fermentierte Nahrungsmittelprodukt sekretiert.
15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei das fermentierte Nahrungsmittelprodukt Joghurt ist.
16. Zusammensetzung nach Anspruch 14 oder 15, wobei das Gen ein Meeresschellfisch-Gefrierschutz-Polypeptid Typ III kodiert und der Mikroorganismus ein Bakterium, ausgewählt aus der Gruppe umfassend Streptococcus thermophilus und Lactobacillus bulgaricus, umfaßt.
17. Verwendung eines Mikroorganismus, der ein Gen umfaßt, das ein Gefrierschutz-Polypeptid kodiert und der das Gefrierschutz-Polypeptid sekretiert, um ein gefrorenes fermentiertes Nahrungsmittelprodukt herzustellen.
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