DE69424281T2

DE69424281T2 - Phosphonomethyldipeptide

Info

Publication number: DE69424281T2
Application number: DE69424281T
Authority: DE
Inventors: Marc Bigaud; Hugues D'orchymont
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-03-30
Filing date: 1994-02-22
Publication date: 2000-09-21
Anticipated expiration: 2014-02-23
Also published as: NZ262996A; PT691985E; KR100311852B1; DK0691985T3; TW290550B; JP3541230B2; HU217836B; CA2156742A1; AU670866B2; IL109128A0; AU6298994A; NO953877L; FI954656A0; WO1994022908A1; ATE192456T1; DE69424281D1; IL109128A; CN1120844A; EP0691985B1; EP0618224A1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft im allgemeinen Dipeptide und deren Analoga mit einer Phosphonomethyleinheit, pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Verbindungen umfassen, Verfahren zur Herstellung solcher Verbindungen, Zwischenprodukte, die in diesen Verfahren eingesetzt werden, sowie Verfahren zur Hemmung der Endothelin-Produktion. Diese Verbindungen hemmen das Endothelin-umwandelnde Enzym und eignen sich somit zur Behandlung von Leiden, die auf die Hemmung der Endothelin-Produktion reagieren.

Hintergrund der Erfindung

Das in Endothelzellen gefundene Peptid Big Endothelin wird vom Endothelinumwandelnden Enzym (ECE) gespalten, wobei das Peptid Endothelin gebildet wird. Endothelin, ein Vasoconstrictor mit 21 Aminosäuren, wird von den Endothelzellen, Mesangial-, Nieren- und Epithelzellen sowie von verschiedenen menschlichen Krebs- Zellinien und menschlichen Makrophagen gebildet.
Das Endothelin wirkt biologisch auf die vaskuläre glatte Muskulatur, nichtvaskuläre glatte Muskulatur, Herz, Nervengewebe, Niere und Nebenniere. Endothelin verengt die Arterien und Venen, erhöht den durchschnittlichen arteriellen Blutdruck, senkt den Herzausstoß, erhöht die Herz-Kontrahierbarkeit in vitro, stimuliert die Mitogenese in vaskulären glatten Muskelzellen in vitro, kontrahiert die vaskuläre glatte Muskulatur, einschließlich der Luftröhre beim Meerschweinchen, menschlicher Harnblasenstreifen und Ratten-Uterus in vitro, steigert den Luftwegswiderstand in vivo, induziert die Bildung von Magengeschwüren, steigert die Freisetzung von atrialem natriuretischem Faktor in vitro und in vivo, steigert die Plasmaspiegel von Vasopressin, Aldosteron und Catecholaminen, hemmt die Freisetzung von Renin in vitro und stimuliert die Freisetzung von Gonadotropin in vitro. Siehe bspw. die PCT-Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 92/13545.
Mögliche Indikationen für die Verwendung von Hemmstoffen für die Endothelinproduktion umfassen die Behandlung von kardiovaskulären Erkrankungen (z. B. Myocard-Ischämie, Stauungsherzinsuffizienz, Arrythmie, instabile Angina und Hochdruck); Bronchokonstriction (pulmonaler Hochdruck und Asthma); Störungen der Neuronenwirkung (cerebraler Gefäßspasmus und Subarachnoid-Hämorrhagie); endokrine Störungen (Präeklampsie); Nierenerkrankung (akutes/chronisches Nierenversagen); vaskuläre Störungen (Atherosklerose, Bürger-Erkrankung, Takayasu-Syndrom, Raynaud'sches Phänomen und Komplikationen bei Diabetes); Krebs (insbesondere pulmonales Karzinom); Magenschleimhaut-Beschädigung (gastrointestinale Störungen); und endotoxischer Schock und Septikämie. Siehe J. Med. Chem. 35(9) (1992) 1493-1508; Neurology 42 (1992) 25-31; und Drug Development Research 26 (1992) 361-387.
Hemmstoffe des Endothelinumwandelnden Enzyms sind bereis im Journal of Medicinal Chemistry 36 (1993) 173-176 beschrieben, wobei N-Phosphono-Leu-Trp und einige Substitutionsanaloga offenbart sind. Wir haben jetzt aber neue Verbindungen entdeckt, die sich durch das Vorhandensein einer Methylengruppe zwischen dem Phosphoratom und dem Stickstoffatom von Leucin von den vorstehend genannten Verbindungen unterscheiden.

Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung

Verbindung mit der Formel: Formel I,
Stereoisomere, Hydrate, innere Salze oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon, wobei
R&sub1; oder R&sub2; jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, (CH&sub2;)m- Aryl, R&sub4;-C(O)O-CH(R&sub5;)-Rest oder nicht vorhanden sind, wenn das innere Salz gebildet wird, mit der Maßgabe, daß - wenn einer der Reste R&sub1; oder R&sub2; ein Wasserstoffatom, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl- oder (CH&sub2;)m-Arykest ist - der andere dann ein Wasserstoffatom oder nicht vorhanden ist, wenn das innere Salz gebildet wird;
R&sub3; ein Wasserstoffatom, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, (CH&sub2;)m-Cycloalkyl- oder (CH&sub2;)m-Arylrest ist;
R&sub4; ein C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl-, (CH&sub2;)m-Cycloalkyl-, oder (CH&sub2;)m-Arylrest ist;
R&sub5; ein C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, (CH&sub2;)m-Cycloalkylrest oder ein Wasserstoffatom ist;
R&sub6; die Bedeutung H oder H&sub2; hat, wenn einer der Reste R&sub1; oder R&sub2; nicht vorhanden ist und somit das innere Salz gebildet wird;
R&sub7; die Bedeutung CH&sub3; oder H hat;
R&sub8; die Bedeutung H, Br, CH&sub3; oder OCH&sub3; hat, mit der Maßgabe, daß einer der Reste R&sub7; oder R&sub8; die Bedeutung H hat;
Z ein (CH&sub2;)m-Aryl- oder C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Alkylrest ist;
X ein Wasserstoffatom oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest ist;
die Werte m jeweils unabhängig voneinander 0, 1, 2 oder 3 sind; und
n die Bedeutung 1, 2 oder 3 hat, und wobei
"Cycloalkyl" in der Definition von R&sub1;-R&sub5; einen gesättigten C&sub3;-C&sub8;-Kohlenstoffring bedeutet und "Aryl" für Phenyl-, Naphthyl-, Tetrahydronaphthyl- oder Indanylgruppen steht, wobei die Cycloalkyl- oder Arylreste unsubstituiert oder substituiert sind mit ein, zwei oder drei Substituenten, die unabhängig voneinander aus C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, Halogenalkyl-, Alkoxy-, Thioalkoxy-Resten, Aminogruppen, Alkylamino-, Dialkylaminoresten, Hydroxy-, Halogen-, Mercapto-, Nitro-, Carboxaldehyd-, Carboxy-, Carboalkoxy- und Carboxamid-Gruppen ausgewählt sind.
Die Erfindung umfaßt ebenfalls Zusammensetzungen von Verbindungen der Formel I und ihre Verwendung zur Behandlung von Leiden, die durch die Hemmung des Endothelinumwandelnden Enzyms verbessert werden.

Eingehende Beschreibung der vorliegenden Erfindung

Bestimmte Ausdrücke - wie sie hier verwendet werden - haben die nachstehenden spezifischen Bedeutungen.
"C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-" steht für gerade oder verzweigtkettige Alkyleinheiten mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, sek.-Butyl-, tert.-Butyl-, n-Pentyl-, 1-Methylbutyl-, 2,2- Dimethylbutyl-, 2-Methylpentyl-, 2,2-Dimethylpropyl-, n-Hexyl-Gruppen und dergleichen. Andere auf diese Weise angegebene Kohlenstoffatom-Zahlen, wie C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;, stehen ebenso für gerade oder verzweigtkettige Alkylreste mit der angegebenen Anzahl an Kohlenstoffatomen.
Die Indolyleinheit der Formel I kann an Position 5:
durch H, Br, CH&sub3; oder OCH&sub3; (dargestellt in Formel I durch R&sub8;), oder an den Positionen 4, 5, 6 oder 7 durch H oder CH&sub3; (dargestellt in Formel I durch R&sub7;) substituiert sein. Einer der Reste R&sub7; oder R&sub8; muß jedoch ein Wasserstoffatom sein.
"Inneres Salz", ebenfalls bekannt als Zwitterion, ist ein Molekül, das eine positive und eine negative Ladung trägt, wofür Beispiel 1 ein Beispiel ist.
"Stereoisomer" ist ein allgemeiner Ausdruck für alle Isomere einzelner Moleküle, die sich nur in der Orientierung ihrer Atome im Raum unterscheiden. Dies umfaßt Spiegelbildisomere (Enantiomere), geometrische (cis/trans) Isomere und Isomere von Verbindungen mit mehr als einem chiralen Zentrum, die keine Spiegelbilder voneinander sind (Diastereomere). Für Aminosäuren lassen sich die Bezeichnungen L/D oder R/S verwenden, wie beschrieben in IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, Eur. J. Biochem 138 (1984) 9-37.
"Pharmazeutisch verträgliche Salze" bedeuten sowohl Säureadditionssalze als auch Metall- und Aminsalze, die bekanntlich nicht-toxisch sind und geeignete Derivate bei der Herstellung pharmazeutischer Formulierungen sind, die sich für Endgebrauchsanwendungen eignen.
Pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze umfassen die bekannten nichttoxischen organischen oder anorganischen Säureadditionssalze der basischen Verbindungen der Formel I. Beispielhafte organische Säuren, die geeignete Salze bilden, umfassen die Mono-, Di- und Tricarbonsäuren. Beispiele für solche Säuren sind u. a. Essig-, Glycol-, Milch-, Brenztrauben-, Malon-, Bernstein-, Glutar-, Fumar, Äpfel-, Wein-, Zitronen-, Ascorbin-, Malein-, Hydroxymalein-, Benzoe-, Hydroxybenzoe-, Phenylessig-, Zimt-, Salicyl- und 2-Phenoxybenzoesäure. Andere organische Säuren, die geeignete Salze bilden, sind die Sulfonsäuren, wie Methansulfonsäure und 2-Hydroxyethansulfonsäure. Die Mono- oder Disäure-Salze werden entweder durch Standard-Verfahren hergestellt, wie durch Lösen der freien Base in einer wäßrigen oder wäßrig-alkoholischen Lösung oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel, das die geeignete Säure enthält, und Isolieren durch Verdampfen der Lösung oder durch Umsetzen der freien Base in einem organischen Lösungsmittel, wobei sich das Salz direkt abtrennt oder durch Einengen der Lösung gewinnen läßt. Gewöhnlich sind die Säureadditionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen kristalline Materialien, die in Wasser löslich sind, und verschiedene hydrophile Formen weisen höhere Schmelzpunkte und eine größere Stabilität auf.
Pharmazeutisch verträgliche Metall- und Amin-Salze sind solche Salze, die unter Umgebungsbedingungen stabil sind und wobei das Kation nicht signifikant zur biologischen Aktivität des Salzes beiträgt. Geeignete Metallsalze umfassen Natrium-, Kalium-, Calcium-, Barium-, Zink- und Aluminiumsalze. Die Natrium- und Kaliumsalze sind bevorzugt. Geeignete Aminsalze werden aus Aminen hergestellt, die zur Bildung eines stabilen Salzes hinreichende Basizität aufweisen, und umfassen vorzugsweise solche Amine, die häufig in der Medizinchemie aufgrund ihrer geringen Toxizität und ihrer Verträglichkeit für den medizinischen Gebrauch verwendet werden. Diese umfassen die Trialkylamine, wie Triethylamin und andere, einschließlich Procain, Dibenzylamin, N-Benzylbetaphenethylamin, N-Ethylpiperidin, Benzylamin und Dicyclohexylanxin.
Ein "Hydrat" ist ein Molekül, das Wasser in Form von H&sub2;O-Molekülen angelagert hat.
"Behandeln" oder "Behandlung" einer Erkrankung oder eines Leidens bedeutet, die Erkrankung oder das Leiden eines Patienten zu verhindern oder zu lindern.
"Patient" betrifft ein warmblütiges Tier, wie bspw. Ratten, Mäuse, Hunde, Katzen, Meerschweinchen, Primaten und Menschen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich durch die Anwendung von im Fachgebiet bekannten analogen chemischen Reaktionen herstellen, bei denen Reaktanten verwendet werden, die bereits bekannt sind oder die unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Standardverfahren und Techniken hergestellt werden können. Das allgemeine Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I kann durch die nachfolgenden Reaktionsschemata im wesentlichen wiedergegeben werden. In diesen Schemata bedeuten die nachstehenden Ausdrücke:
"L" steht für eine Abgangsgruppe. Geeignete Abgangsgruppen umfassen Triflate, Alkyl- oder Arylsulfonate (bspw. CF&sub3;SO&sub2;O, Tosylat, Mesylat) und Halogenide (Br, Cl oder I).
"Pg" steht für eine geeignete Schutzgruppe. Der Begriff betrifft Schutzgruppen für Atome, wie Stickstoff oder Sauerstoff, die für ungewünschte chemische Reaktionen anfällig sind. Geeignete Schutzgruppen lassen sich bspw. in Protective groups in Organic Synthesis, 2. Aufl., Theodora W. Greene, John Wiley & Sons, Inc. New York 1991, finden, welches hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, X und Z haben die vorstehend definierten Bedeutungen. R&sub1;', R&sub2;', R&sub3;' und R&sub4;' sind jeweils Schutzgruppen (Pg). Man beachte, daß Pg R&sub1;, R&sub2; oder R&sub3; sein kann, mit der Ausnahme von Wasserstoff.. Schema A Schema B alternativ für Schema A (Fortsetzung von Schema B)
Das Dipeptid-Gerüst wurde nach der bekannten Strategie aufgebaut, die aus der Bildung einer Peptidbindung durch Kuppeln einer Aminosäure mit (einer) geeigneten Schutzgruppe(n), wie tert.-Butyloxycarbonyl (BOC), mit einem Peptidester unter Verwendung eines geeigneten Kupplungsreagenzes besteht. Sie umfaßt die Aktivierung von Carboxylat mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder erfolgt alternativ nach dem Mischanhydrid-Verfahren. Selektive Entfernung von BOC zur Erzeugung des freien Amins läßt sich unter Verwendung einer etherischen Lösung von Salzsäure, Trifluoressigsäure oder Ameisensäure erzielen. Beispiele für die Bildung der Peptidbindung können bspw. in Peptide Chemistry, A Practical Textbook, von Miklos Bodansky, Springer Verlag Berlin Heidelberg 1988, gefunden werden, welches hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Ausgangsmaterialien sind bspw. von Aldrich kommerziell erhältlich, wo Dibenzylphosphit, Diethylphosphit, Dipropylphosphit und Dibutylphosphit bezogen werden können. Von Bachem, Schweiz, sind bspw. BOC-Leu; Leu-OMe, HCl; BOC-Phe-OH; BOC-HomoPhe- OH, BOC-D-Leu, H&sub2;O; und Trp-OBz, HCl erhältlich.
Die Dipeptide mit einer Indolyleinheit, bei der einer der Reste R&sub7; oder R&sub8; von Wasserstoff verschieden ist, können mit Aminosäuren hergestellt werden, die von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, (5-Bromtryptophan, 5-Methoxytryptophan oder 5- Methyltryptophan), Sigma Chemical Co., USA, (4-Methyltryptophan oder 7- Methyltryptophan), und Fluka Chemical Co, Schweiz (6-Methyltryptophan) erhalten werden.
In Schema A verwendet die Einbringung der Phosphonomethyleinheit Hydroxymethylphosphonsäureester (2), die durch das Verfahren von A. Foucaud [Synthesis 916 (1982)] hergestellt werden. Die Hydroxylfunktion wird als Abgangsgruppe (L) (3), vorzugsweise als das Trifluormethylsulfonat, aktiviert und wird mit dem Aminoterminus eines Dipeptids (4) substituiert, dessen Carboxyterminus gewöhnlich als Ester, wie als R&sub3; gezeigt, geschützt war.
Der Hydroxymethylphosphonsäureester (2) wird bspw. als das Trifluormethansulfonat durch Umsetzen mit Trifluormethansulfonsäureanhydrid oder Trifluormethansulfonylchlorid bei einer niedrigen Temperatur im Bereich von -60ºC bis 0ºC in einem aprotischen Lösungsmittel, bspw. CH&sub2;Cl&sub2;, Tetrahydrofuran, Diethylether oder Dimethylformamid oder Gemischen dieser Lösungsmittel, aktiviert. Die Protonen werden mit einer sterisch gehinderten Base, bspw. 2,6-Lutidin, oder mit einem Metallhydrid, bspw. Natriumhydrid, neutralisiert.
Das Dipeptid (4) wird mit dem aktivierten Phosphonoester (3) umgesetzt, indem eine Lösung von (4) in einem aprotischen Lösungsmittel bei Temperaturen zwischen 0ºC und 40ºC für eine Reaktionszeit von 1 Std. bis zu 3 Tagen zugegeben wird. Eine ähnliche Base wird für die Bildung von Trifluoromethylsulfonat verwendet. Die Ausbeuten können durch Zugabe von Hexamethylphosphoramid, Dimethylformamid oder dergleichen verbessert werden.
Als in Schema B gezeigte Alternative kann es auch geeignet sein, das geschützte Zwischenprodukt (5) mit einem Aminosäureester (6) umzusetzen, um den Phosphonomethylaminosäureester (7) herzustellen. Der Ester (7) wird verseift und mit einem Aminosäureester (8) gekuppelt, um ein geschütztes Phosphonomethyldipeptid (1.1) herzustellen.
Das geschützte Zwischenprodukt (5) wird mit dem Aminosäureester (6) unter ähnlichen Bedingungen wie bei der Umsetzung zwischen (3) und (4) umgesetzt, um den Phosphonomethylaminosäureester (7) herzustellen. Der Ester (7) wird mit einer Base, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Lithiumhydroxid in wäßrigem Methanol, wäßrigem Methoxyethanol oder wäßrigem Tetrahydrofuran bei Raumtemperatur 1 Std. bis 24 Std. verseift.
Der Aminoester (8) wird mit dem verseiften Ester, der von (7) abgeleitet ist, gekuppelt, um das geschützte Phosphonomethyldipeptid (1.1) herzustellen, und zwar durch Aktivierung des Carboxylates mit Dicyclohexylcarbodümid, durch Herstellen eines Mischanhydrides (bspw. durch Verwendung von Isobutylchlorformiat) oder durch Herstellen eines Acylazides mit Diphenylphosphorylazid (DPPA). Je nach der Beschaffenheit des so hergestellten aktivierten Esters erfolgt die Umsetzung mit dem Aminoester zwischen -20ºC und 40ºC. Das Acylazid reagiert von -10ºC bis 10ºC. Die Reaktionszeit reicht von 1 Std. bis zu 3 Tagen.
Die Schutzgruppen des geschützten Phosphonomethyldipeptides (1.1) können dann partiell oder vollständig entfernt werden. Sind alle Schutzgruppen Benzyl, werden die Verbindungen der Formel I (1.3), bei denen die Schutzgruppen vollständig entfernt sind, geeigneterweise durch Hydrogenolyse unter basischen Bedingungen in einem Zweiphasen- System erhalten. Eine partielle Entfernung der Schutzgruppen von den Verbindungen der Formel I (1.2 oder 1.4) läßt sich durch Hydrogenolyse, durch Einwirkung einer verdünnten Säure oder Base oder durch Umsetzung mit Trimethylsilylhalogeniden erzielen.
Nachstehend sind spezifische Beispiele bevorzugter erfindungsgemäßer Verbindungen und Verfahren zu deren Herstellung angegeben. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die vorliegende Erfindung keineswegs durch diese Beispiele beschränkt wird, und daß andere im Fachgebiet bekannte Verfahren zur Herstellung von Verbindungen eingesetzt werden können. BEISPIEL 1

N-(N-Phosphonomethyl-L-leucyl)-L-tryptophan

Schritt A:

N-(N-Dibenzyloxyphosphinylmethyl-L-leucyl)-L-tryptophan-Benzylester

Dibenzyloxyphosphinylmethanol (372 mg) in wasserfreiem Methylenchlorid (5 ml) wurde langsam zu einer Methylenchlorid-Lösung (10 ml) von frisch destilliertem 2,6-Lutidin (0,36 ml) und bei -50ºC gekühltem Triflinsäureanhydrid (0,25 ml) hinzugegeben. Das Gemisch wurde 10 min bei -50ºC gerührt, und man ließ die Temperatur sich 1 Std. auf 0ºC aufwärmen.
Zum so gebildeten Trifluormethansulfonsäure-Dibenzyloxyphosphinylmethylester wurde dann ohne Isolation bei 0ºC L-Leucyl-L-tryptophan-Benzylester (500 mg) als freies Amin in wasserfreiem Methylenchlorid (5 ml) gegeben. Das Gemisch wurde 1 Std. bei 0ºC und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Eindampfen des Reaktionsgemisches unter Vakuum ergab ein oranges Öl (1,60 g), welches durch Flash-Chromatographie auf Silicagel (55 g, 230-400 Mesh) gereinigt wurde. Die Titelverbindung wurde mit einem Gemisch aus Ethylacetat und Heptan in einem Verhältnis von 1/1 bis 1/0 eluiert. Das Eindampfen des Lösungsmittels ergab ein farbloses Öl (240 mg). ³¹P-NMR: CDCl&sub3; δ (relativ zu ext. H&sub3;PO&sub4;) Multiplett (8 Linien) (J = 9 Hz) bei 27,0 ppm.

Schritt B:

N-(N-Phosphonomethyl-L-leucyl)-L-tryptophän

N-(N-Dibenzyloxyphosphinylmethyl-L-leucyl)-L-tryptophan-Benzylester (240 mg) und 10% Palladium auf Kohle (40 mg) in einem heterogenen Gemisch aus Ethylacetat (10 ml) und einer wäßrigen Lösung (10 ml) von Kaliumhydrogencarbonat (89 mg) wurden 3 Std.
bei Raumtemperatur unter einer Wasserstoffatmosphäre bei Normaldruck gerührt. Das Gemisch wurde entgast und der Katalysator abfiltriert. Die wäßrige Schicht wurde abgetrennt, mit Ethylacetat gewaschen, filtriert und lyophilisiert, so daß ein weißes Pulver erhalten wurde (192 mg). Dieses Material wurde in Wasser (10 ml) gelöst und durch langsame Zugabe von wäßriger Salzsäure (N/10, 11 ml) neutralisiert. Der erhaltene Niederschlag wurde aufgefangen und unter Vakuum getrocknet, so daß die Titelverbindung als weißes Pulver (115 mg) erhalten wurde.
³¹P-NMR: DMSO δ (relativ zu ext. H&sub3;PO&sub4;) Multiplett bei 14 ppm.
Anal. berechnet für C&sub1;&sub8;H&sub2;&sub6;N&sub3;O&sub6;P · 1,2 H&sub2;O
Schmelzpunkt: Endotherme bei 232ºC mittels DSC. BEISPIEL 2

N-(N-B enzyloxyhydroxyphosphinylmethyl-L-leucyl)-L-tryptophan-Benzylester

N-(N-Dibenzyloxyphosphinylmethyl-L-leucyl)-L-tryptophan-Benzylester (100 mg) (Beispiel 1, Schritt A), gelöst in Ethylacetat (5 ml) wurde über Palladium auf Kohle (10%, 15 mg) unter Normaldruck bei Raumtemperatur 8 Std. hydriert. Das Gemisch wurde filtriert, und der so erhaltene Feststoff wurde mit Methanol extrahiert, wobei nach Verdampfen des Lösungsmittels die Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten wurde (70 mg).
³¹P-NMR: CD&sub3;OD δ (relativ zu ext. H&sub3;PO&sub4;) Multiplett bei 9,6 ppm.
Anal. berechnet für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub8;N&sub3;O&sub6;P · 0,5 H&sub2;O BEISPIEL 3

N-(N-Benzyloxyhydroxyphosphinyhnethyl-L-leucyl)-L-tryptophan

Eine Lösung von N-(N-(Dibenzyloxyphosphinylmethyl-L-leucyl)-L-tryptophan- Benzylester (100 mg) (Beispiel 1, Schritt A) in Ethanol (5 ml) wird mit einer wäßrigen Kaliumhydroxid-Lösung (0,30 ml, 1 N) behandelt. Das Rühren erfolgt 4 Tage bei Raumtemperatur. Bei Beendigung der Umsetzung wird das Gemisch unter Vakuum eingedampft und der Rückstand in Wasser gelöst und durch Zugabe von verdünnter Salzsäure gefällt, wodurch die Titelverbindung erhalten wird. BEISPIEL 4

N-(N-Phosphonomethyl-L-leucyl)-DL-homotryptophan

Schritt A:

L-Leucyl-DL-homotryptophan-Ethylester

Ethyl-4-(β-indolyl)-2-ketobutyrat wird in Ethanol gelöst, dann wird wäßriger konzentrierter Ammoniak im Überschuß und 10% Pd/C hinzugegeben. Das Gemisch wird in einer Druckvorrichtung bei 5 bar hydriert. Der Katalysator wird filtriert und das Filtrat im Vakuum verdampft, so daß ein Rohmaterial erhalten wird, das unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid mit Hydroxybenzotriazol in Methylenchlorid an N-tert.- Butyloxycarbonylleucin gekuppelt wird. Dicyclohexylharnstoff wird durch Filtration entfernt, und das nach dem Eindampfen des Lösungsmittels erhaltene Rohpeptid wird durch Chromatographie auf Silicagel gereinigt, wobei N-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl)-DL- homotryptophan-Ethylester erhalten wird. Die Umsetzung mit Ameisensäure und Extraktion der freien Base mit wäßrigem Natriumcarbonat/Ethylacetat ergibt die Titelverbindung.

Schritt B:

N-(N-Dibenzyloxyphosphinylmethyl-L-leucyl)-DL-homotryptophan-Ethylester

Die Titelverbindung wird durch ein Verfahren erhalten, das zu dem zur Herstellung von N-(N-Dibenzyloxyphosphinylmethyl-L-leucyl)-L-tryptophan-Benzylester (Beispiel 1) beschriebenen analog ist.

Schritt C:

N-(N-Dibenzyloxyphosphinylinethyl-L-leucyl)-DL-homotryptophan

Eine Lösung von N-(N-Dibenzyloxyphosphinylmethyl-L-leucyl)-DL- homotryptophan-Ethylester in 2-Methoxyethanol wird mit einer wäßrigen Lithiumhydroxid- Lösung (1 Äquivalent, 2-Methoxyethanol/Wasser: 9/1 in Vol.) behandelt. Das Eindampfen des Lösungsmittels und Ansäuern ergibt die Titelverbindung.

Schritt D:

N-(N-Phosphonomethyl-L-leucyl)-DL-homotryptophan

Die Titelverbindung wird erhalten durch Hydrierung von N-(N- Dibenzyloxyphosphinylmethyl-L-leucyl)-DL-homotryptophan, wobei das Verfahren, das zur Herstellung von N-(N-Phosphonomethyl-L-leucyl)-L-tryptophan (Beispiel 1) beschrieben ist, verwendet wird. BEISPIEL 5

N-[N-(Di-(pivaloyloxymethyl)-phosphonyl)-leucyl]-L-tryptophan-Ethylester

Schritt A:

N-(N-Phosphonomethyl-L-leucyl)-L-tryptophan-Ethylester

Eine Lösung von N-(N-Dimethylphosphonomethyl-L-leucyl)-L-tryptophan- Ethylester wird mit Trimethylsilylbromid in Methylenchlorid bei Raumtemperatur behandelt. Das Gemisch wird eingeengt, und der Rückstand wird mit Wasser behandelt, filtriert und getrocknet, um die Titelverbindung zu erhalten.

Schritt B:

N-[N-(Di-(pivaloyloxymethyl)-phosphonyl)-leucyl]-L-tryptophan-Ethylester

Eine Lösung aus N-(N-Phosphonomethyl-L-leucyl)-L-tryptophan Ethylester und 18- Krone-6 in Toluol wird bei 0ºC gekühlt und mit Kalium-bis-trimethylsilyl-amid (2 Äquivalente) behandelt. Das Gemisch wird 18 Std. mit Iodmethylpivalat (2 Äquivalente) umgesetzt. Ethylacetat wird hinzugegeben, das Gemisch mit Wasser gewaschen, getrocknet, eingeengt und auf Silicagel chromatographisch aufgetrennt, um die Titelverbindung zu erhalten. BEISPIEL 6

N-(N-Pivaloyloxymethyloxyhydroxyphosphinyl-L-leucyl)-L-tryptophan-Ethylester

Eine Lösung von N-[N-(Di-pivaloyloxymethyl)-phosphonyl)-leucyl]-L-tryptophan- Ethylester in Ethanol wird bei 0ºC gekühlt, und Natriumhydroxid (1 Äquivalent) wird tropfenweise zugegeben. Das Rühren wird 15 min fortgesetzt, und das Reaktionsgemisch wird mit 1 N Salzsäure neutralisiert (1 Äquivalent). Das Gemisch wird unter vermindertem Druck eingeengt, der Rückstand wird zwischen Methylenchlorid und kaltem Wasser verteilt. Die organische Schicht wird getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Der Phosphonsäuremonoester wird schließlich durch Flash-Chromatographie auf Silicagel gereinigt. BEISPIEL 7

N-(N-Phosphonomethyl-L-leucyl)-DL-5-methyltryptophan-Trikaliumsalz

Schritt A:

DL-5-Methyltryptophan-Benzylesterhydrochlorid

DL-5-Methyltryptophan (2,03 g), gelöst in Methanol, wurde mit Di-tert.-butyldicarbonat (2,17 g) und Triethylamin (1,02 g) bei Raumtemperatur 4 Std. lang umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde verdampft und mit Ethylacetat/Wasser extrahiert. Das Ansäuern bei pH-Wert 2 der wäßrigen Schicht mit verdünnter Salzsäure, Extraktion mit Ethylacetat, Trocknen über Magnesiumsulfat und Lösungsmittel-Verdampfen ergaben N- (tert.-Butoxycarbonyl)-DL-5-methyltryptophan als weißen Feststoff.
Die letztere Verbindung (2,72 g), löslich gemacht in einem Gemisch aus Methylenchlorid und Acetonitril (1/1, 100 ml), wurde bei 0ºC mit Dicyclohexylcarbodümid (1,80 g) und Hydroxybenzotriazolhydrat (1,31 g) umgesetzt. Das Gemisch wurde 1/2 Std. bei 0ºC gerührt, bevor Benzylalkohol (0,97 g) und 4-Dimethylaminopyridin (96 mg) zugegeben wurden. Das Rühren erfolgte 1 Woche lang bei Raumtemperatur, und das Gemisch wurde mit Ethylacetat verdünnt und filtriert. Die Extraktion mit Ethylacetat und 5%iger wäßriger Zitronensäure, gefolgt von Waschen der organischen Schicht mit wäßrigem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung, Trocknen über Magnesiumsulfat und Lösungsmittel-Verdampfen ergaben ein Rohmaterial, das auf Silicagel (230-400 Mesh, 90 g) gereinigt wurde. Die Elution mit Ethylacetat/Heptan: ¹/&sub4; ermöglichte die Gewinnung von N-(tert.-Butoxycarbonyl)-DL-5-methyltryptophan-Benzylester als weißen Feststoff (1,08 g). Dieses Material wurde in Ameisensäure suspendiert und 5 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Der aus der Ameisensäure-Eindampfung erhaltene Rückstand wurde in einem Gemisch aus Methanol und verdünnter Salzsäure aufgenommen und eingedampft, so daß die Titelverbindung als weißer Feststoff erhalten wurde.

Schritt B:

N-[N-(tert.-Butoxycarbonyl)-L-leucyl]-DL-5-methyltryptophan-Benzylester

N-(tert.-Butoxycarbonyl)-leucinhydrat (249 mg) wurde mit DL-5- Methyltryptophanbenzylesterhydrochlorid (344 mg) gemäß dem in Beispiel 13, Schritt A, beschriebenen Verfahren gekuppelt, wobei Triethylamin (152 mg) als Base und Dicyclohexylcarbodümid (209 mg) als Kupplungsreagenz verwendet wurden. Ein Rohmaterial wurde als weißer Feststoff (472 mg) isoliert, der in einem Ethylacetat/Heptan- Gemisch umkristallisiert wurde (329 mg).

Schritt C:

N-L-Leucyl-DL-5-methyltryptophan

N-[N-(tert.-Butoxycarbonyl)-L-leucyl]-DL-5-methyltryptophan-Benzylester (321 mg) wurde wie vorstehend beschrieben in Ameisensäure gespalten. Das Rohprodukt wurde mit Ethylacetat und wäßrigem Natriumcarbonat extrahiert. Die organische Schicht wurde mit Salzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Verdampfen des Lösungsmittels ergab die Titelverbindung als Öl (241 mg).

Schritt D:

N-[N-(Dibenzyloxyphosphinylmethyl)-L-leucyl]-DL-5-methyltryptophanbenzylester

Dibenzyloxyphosphinylmethanol (171 mg) wurde wie in Beispiel 1 beschrieben an N-L-Leucyl-DL-5-methyltryptophan-Benzylester (240 mg) gekuppelt, so daß ein gelbes Öl erhalten wurde, das durch Chromatographie auf Silicagel (85 g) gereinigt wurde. Elution mit Ethylacetat/Heptan : 1/1 und reinem Ethylacetat ergab nach dem Verdampfen des Lösungsmittels ein gelbes Öl (136 mg).
³¹P-NMR: CDCl&sub3; δ (relativ zu ext. H&sub3;PO&sub4;)
Multipletts bei 26,9 und 26,7 ppm.

Schritt E:

N-(N-Phosphonomethyl-L-leucyl)-DL-5-methyltryptophan-Trikaliumsalz

Zu N-[N-(Dibenzyloxyphosphinylmethyl)-L-leucyl]-DL-5-methyltryptophanbenzylester (113 mg), gelöst in Ethylacetat (5 ml), wurde eine Lösung von Kaliumbicarbonat (41 mg) in Wasser (5 ml) und 10% Palladium auf Kohle (30 mg) gegeben. Das Gemisch wurde unter Wasserstoff bei Atmosphärendruck und Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde filtriert und lyophilisiert, um die Titelverbindung als beigen Feststoff zu erhalten (81 mg).
³¹P NMR: D&sub2;O δ (relativ zu ext. H&sub3;PO&sub4;)
Multipletts bei 12,2 und 9,8 ppm.
Analyse, berechnet für C&sub1;&sub9;H&sub2;&sub5;N&sub3;O&sub6;P&sub3;K · 2 H&sub2;O

BEISPIEL 8

Die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen als blutdrucksenkende Mittel läßt sich zeigen, indem das nachstehende Protokoll verwendet wird.
Männliche Spraque-Dawley-Ratten (250-300 g) werden mit Urethan (1,25 g/kg, i. p.), das gegebenenfalls supplementiert ist, anästhesiert. In die rechte Haupt-Carotis-Arterie und die rechte Femurvene werden zur Überwachung des Arteriendrucks bzw. zur intravenösen Medikamenteninjektion Tygon-Katheter eingeführt. Man läßt das Präparat 30 min stabilisieren, bevor das Experimentalprotokoll begonnen wird. Der Arteriendruck wird kontinuierlich mit einem TA2000 Gould-Bandschreiber gemessen, der an ein Datenerfassungssystem (Dataflow von Crystal Biotech, USA) angeschlossen ist.
Die Ratten werden zufallsgemäß ausgewählt und mit einer i. v. Bolusinjektion (100 ul/100 g, mit 0,3 ml Saline gespült) vorbehandelt, und zwar entweder mit Kochsalzlösung oder einer Dosis Phosphoramidon oder der erfindungsgemäßen Verbindungen (die von 1 bis 100 umol/kg reicht). Fünf min später wird Pro-ET1 (1 nMol/kg) als intravenöse Bolusinjektion (10 ul/100 g, mit 0,3 ml Kochsalzlösung gespült) verabreicht, und die Änderungen des Arteriendrucks werden 30 min aufgezeichnet. Zur Vermeidung jeglichen Artefaktes erhält jede Ratte nur eine Vorbehandlung und nur eine Pro-ET1-Dosis. Pro-ET-1 ruft eine Hochdruck-Reaktion hervor, und Phosphoramidon hemmt diese. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden gegen die Hemmung von Phosphoramidon gemessen.
Mensch/Schwein-Pro-ET1 kann vom Peptid-Institut (Osaka, Japan) erhalten werden und in 0,1%iger Essigsäure gelöst werden, so daß 10&supmin;&sup4; M Stammlösungen erhalten werden, deren genaue Konzentrationen durch Extinktionsspektralphotometrie bei 280 nm überprüft werden kann, wobei ein Extinktionskoeffizient von 7245 M&supmin;¹ cm&supmin;¹ verwendet wird. Die Stammlösungen werden dann aliquotiert, lyophilisiert und bei -20ºC aufbewahrt. Das Peptid wird wieder gelöst und am Tag des Experimentes in Kochsalzlösung verdünnt.

BEISPIEL 9

Um die Effizienz der erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Behandlung von subarachnoider Hämorrhagie zu zeigen, kann das in Life Sciences 49 (1991) 841-848 verwendete Verfahren befolgt werden.

BEISPIEL 10

Um die Effizienz der erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Behandlung von Asthma zu zeigen, werden Hartley-Meerschweinchen beiderlei Geschlechts durch intracardiäre Injektion von Antiserum, das in Kaninchen (IgG) oder Meerschweinchen (IgG oder IgE) gegen ein spezifisches Antigen (Ovalbumin) hergestellt wird, passiv sensibilisiert. Die Verbindungen werden an die sensibilisierten Meerschweinchen verabreicht, wobei der Weg, die Dosis und die Dauer der Verabreichung der Verbindung vom Experiment abhängt. Die Meerschweinchen werden durch Zerstäuben der Antigenlösung angeregt. Die Dauer bis zur Erschöpfung nach dem Zerstäuben und das Vorkommen von Mortalität nach 5 min werden aufgezeichnet. Negative Kontrollen bestehen aus passiv sensibilisierten Meerschweinchen, die keine Behandlung erhalten, und das Vorkommen von Letalität in dieser Gruppe beträgt gewöhnlich 90 bis 100%. Chlorpheniramin und Cyproheptadin können als positive Kontrollen dienen.

BEISPIEL 11

Um die Effizienz der erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Behandlung von congestivem Herzversagen zu zeigen, kann das in Circulation 82(6) (1990) 2226-2230 verwendete Verfahren befolgt werden. Dieses Verfahren wird durch Vorbehandeln des Testtieres mit den erfindungsgemäßen Verbindungen modifiziert.

BEISPIEL 12

Um die Effizienz der erfindungsgemäßen Verbindung bei der Behandlung von Nierenversagen zu zeigen, kann das in European Journal of Pharmacology 221 (1992) 77-83 verwendete Verfahren befolgt werden.

BEISPIEL 13

In-vitro-Endothelin-umwandelndes-Enzym-(ECE)-Test über IP1-Bildung in Rattengehirn-Schnitte. Dieser Test mißt die enzymatische Aktivität, die für die Erzeugung des funktionellen ET-1 aus Pro-ET1 verantwortlich ist, indem die Stimulation des Phosphatidylinositol-Durchsatzes als Marker der ET-1-Wirkung gemessen wird.

VERSUCHSPLANUNG

Es steht fest, daß Endothelin-1 (ET-1) den Durchsatz des Phosphatidylinositols über die Aktivierung von ET-Rezeptoren (Masaki et al., Circulation 84 (1991) 1457) in einer dosisabhängigen Weise stimulieren kann. Die Vorstufe von ET-1, d. h. Proendothelin-1 (Pro- ET1), ist unfähig zur Stimulation des Phosphatidylinositol-Durchsatzes, wenn sie nicht durch eine spezifische phosphoramidonempfindliche Protease, d. h. das Endothelin-umwandelnde Enzym (ECE), gespalten wird. Das Gehirngewebe enthält bekanntlich sowohl die ET-1- Rezeptoren als auch das ECE (Gulati und Srimal, Drug Devel. Res. 26 (1992) 361). Für diesen Test wurde eine Modifikation des Verfahrens von Brown et al., J. Neurochem 42 (1984) 1379 verwendet.

VERFAHREN

Herstellung der Peptide

Mensch/Schweine-ET-1 und Pro-ET-1 wurden vom Peptide Institute (Osaka, Japan) bezogen und in 0,1%iger Essigsäurelösung gelöst, so daß eine 10&supmin;&sup4; M Stammlösung erhalten wurde. Die genaue Konzentration dieser Lösungen wurde durch Extinktions- Spektralphotometrie bei 280 nm geprüft, wobei die Gleichung C = A/L &epsi;&sub2;&sub8;&sub0; [wobei C die Konzentration des Peptides in Lösung, A die gemessene Extinktion, L die optische Wegstrecke der Lösung und &epsi;&sub2;&sub8;&sub0; der Extinktionskoeffizient des Peptides in Lösung (8370 bzw. 7025 M&supmin;¹ cm&supmin;¹ für Pro-ET-1 bzw. ET1) ist] verwendet wurde. Die Stammlösungen wurden dann aliquotiert, lyophilisiert und bei -20ºC aufbewahrt. Die Peptide wurden am Tag des Experimentes erneut gelöst und in Wasser verdünnt (die Peptide für andere Tests wurden ebenfalls durch dieses Verfahren hergestellt).

Gewebe-Präparation

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (Charles River, Frankreich) mit 200-300 g Gewicht wurden betäubt, enthauptet und das Gehirn rasch auf eine Glasplatte überführt. Das Striatum wurde schnell ohne umgebendes Gewebe seziert und auf die Kunststoffscheibe eines Mchlwain-Schneidegerätes gelegt. Zur Herstellung von Transversalschnitten wurden die Gewebe in 0,35 mm dicke Scheiben geschnitten, um 90º gedreht und ein zweites Mal geschnitten. Die Schnitte wurden in physiologischem Puffer (118 mM NaCl, 5,0 mM KCl, 1,3 mM CaCl&sub2;, 1,0 mM KH&sub2;PO&sub4;, 1, 2 mM MgSO&sub4;, 2 mM NaHCO&sub3;, 10 mM Glucose, kontinuierlich mit Carbogen begast) suspendiert und in Tests für Pro-ETs- und ETsinduzierte Bildung von Inositolphosphaten verwendet.

Stimulation des Phosphatidylinositol-Durchsatzes durch Pro-ET-1

Gehirnschnitte von 6 Ratten wurden in kontinuierlich mit Carbogen begastem Puffer suspendiert. Die Schnitte befanden sich während der 60minütigen Vorinkubationsdauer in einem Behälter, der in einem Schüttelbad bei 37ºC untergebracht war, und wurden vorsichtigt bewegt, so daß sie sich nicht absetzten. Der Puffer wurde alle 15 min ausgetauscht. Unterdessen wurden 500 ul Harz (siehe unten) in einer kleinen Säule untergebracht und mit Wasser gespült, bis der pH-Wert des Eluates neutral war. Das geeignete Volumen von [³H]-myo-Inositol wurde mit einem kleinen Volumen Wasser gemischt und durch die Säule geleitet. Das Harz wurde dann mit einer hinreichenden Menge Wasser gespült, so daß ein vollständig eluiertes Volumen von [³H]-myo-Inositol in der gewünschten Konzentration erhalten wurde.
Einzelne Schnitte wurden in 5 ml-Flachbodengefäße mit 5 mM Lithiumchlorid verteilt. Ein Aliquot des gereinigten [³H]-myo-Inositols wurde zu jedem Gefäß in einer Endkonzentration von 0,1 uM gegeben und die Gewebe 30 min bei 37ºC in einem Schüttelbad inkubiert. In den entsprechenden Gefäßen wurden 15 min vor der Zugabe von 10&supmin;&sup6; M Pro-ET-1 Antagonisten zugegeben, um 10&supmin;&sup5; M Endkonzentration zu erreichen; es wurden gleiche Volumina an Puffer/Lösungsmittel zu den Kontrollgefäßen gegeben. Nach jeder Zugabe wurden die Gefäße vorsichtig gevortext, mit Carbogen gespült, verschlossen und in das Schüttelbad bei 37ºC zurückgestellt. Die Umsetzungen wurden nach 30 min Inkubation mit Pro-ET-1 durch Zugabe von 940 ul Chloroform/Methanol (1 : 2, Vol./Vol.) beendet, und die Proben wurden stark gevortext. Zusätzliches Chloroform und Wasser (jeweils 310 ul) wurden zu jedem Gefäß zugegeben und die Phasen wurden durch Zentrifugation getrennt. Ein Aliquot von 750 ul der wäßrigen Phase wurde entnommen, um die Bildung von [³H]-myo-Inositolmonophosphaten ([³H]-IP1) zu quantifizieren.
Bei diesen Bedingungen kann die Stimulation des Phosphatidylinositol-Durchsatzes durch Pro-ET-1 durch Messen der angereicherten [³H]-IP1-Menge bestimmt werden.
[³H]-IP1 wurde von [³H]-myo-Inositol durch Anionenaustauschchromatographie getrennt. Einhundert BioRad-Econo-Column-Chromatographiesäulen (0,7 · 15 cm) wurden in einem Perspex-Halter untergebracht, so daß jede Säule direkt in ein Gestell mit 20 ml Szintillations-Zählröhrchen eluiert werden konnte. Jede Säule enthielt 1 ml einer 50%igen Suspension von AG-1-X8-Harz, 100-200 mesh, Formiat-Form. Die Elutionspuffer wurden mit einer peristaltischen Pumpe verteilt, die so eingestellt war, daß 20 Säulen gleichzeitig gewaschen wurden. Vor der Zugabe der wäßrigen Phase wurde das Harz in den Säulen 3mal mit 10 ml 10 mM Tris-Formiat, pH-Wert 7,4, gewaschen. Nach der Zugabe der wäßrigen Phase wurden die Säulen jeweils zweimal mit 10 ml destilliertem Wasser gewaschen, gefolgt von 10 ml 60 mM Ammoniumformiat mit 5 mM Natriumtetraborat, die Eluate wurden verworfen. IP1 wurde in Szintillationsgefäße mit 8 ml 0,2 M Ammoniumformiat in 0,1 M Ameisensäure eluiert. Das Harz wurde anschließend durch Waschen mit 10 ml 1 M Ammoniumformiat in 0,1 M Ameisensäure, gefolgt von dreimal 10 ml 2 M Ameisensäure, regeneriert. Die Säulen wurden verschlossen und mit 2 M Ameisensäure gefüllt. Das aus den Säulen eluierte Tritium wurde unter Verwendung von Flüssig-Szintillationszählung (dpm) quantifiziert.
Das AG-1-X8-Harz wurde vor dem Gebrauch, wie von Kakamoto und Armstrong, J. Biol. Chem., 237 (1962) 208 beschrieben, chargenweise gewaschen. Bei diesem Waschverfahren wurde die Ameisensäure gegen HCl ersetzt, und nach dem Aceton- Waschschritt wurde das Harz einige Minuten getrocknet und dann in 1 M Ameisensäure, 1 : 1, Gew./Vol. resuspendiert und bei 4ºC aufbewahrt.

ANALYSE DER ERGEBNISSE

Die Messungen erfolgten bei jedem Experiment dreifach.
Leer- (ohne Gewebe) und Basal-Werte (nicht stimuliert) wurden bestimmt und von sämtlichen gemessenen IP1-Änderungen subtrahiert. Zur Standardisierung der Beobachtungen wurde die Aktivität von 25 ul [³H]-myo-Inositol (IM, in dpm) für jedes Experiment bestimmt, und die gemessenen IP1-Änderungen wurden mit dem Faktor 10&sup6;/IM multipliziert. Die endgültigen Daten wurden dann als durchschnittlicher Prozentsatz (von mindestens 3 Beobachtungen) der Maximal-Reaktion ausgedrückt, die durch 10&supmin;&sup6; M Pro-ET- 1 in Abwesenheit von Inhibitor induziert wird.
Wenn eine Verbindung bei 10&supmin;&sup5; M mehr als 50% Hemmung der Pro-ET1-vermittelten Wirkung induzierte, wurde eine vollständige Dosis-Wirkungs-Kurve mit diesem Inhibitor erzeugt und sein IC&sub5;&sub0; (diejenige Konzentration, die 50% der Wirkung von 10&supmin;&sup6; M Pro-ET1 hemmt) graphisch bestimmt. In diesem Fall ist es ebenfalls wichtig, den Einfluß einer solchen Verbindung auf die Wirkung von ET1 zu kennen, und eine Dosis-Wirkungs-Kurve der Verbindung wurde gegen 10&supmin;&sup6; M ET1 erzeugt, wobei das gleiche experimentelle Verfahren verwendet wurde, wie für Pro-ET1 beschrieben. Die Konzentration, die 50% der Wirkung von 10&supmin;&sup6; M ET1 hemmt (RC&sub5;&sub0;) wurde dann graphisch ermittelt.
Wenn eine Verbindung in einer Dosis von 3 · 10&supmin;&sup5; M nicht mehr als 50% der Wirkungen von Pro-ET-1 oder ET-1 reduzierte, dann wurde diese Verbindung mit einem IC&sub5;&sub0; oder RC&sub5;&sub0; > 30 uM charakterisiert, und der Prozentsatz der maximalen beobachteten Reduktion wurde aufgezeichnet.
Für Phosphoramidon (Bezugsverbindung) beträgt z. B. der IC&sub5;&sub0; = 6,4 ± 1,1 uM und der RC&sub5;&sub0; > 30 uM bei einer maximalen Reduktion von 75 ± 9%.
Für pharmakologische Endverbrauchsanwendungen werden die Verbindungen der Formel I vorzugsweise in Form ihrer pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalze verabreicht. Die effektive Dosierung der Verbindungen variiert natürlich je nach ihrer beabsichtigten Verwendung, der einzelnen Leistungsfähigkeit der jeweils eingesetzten Verbindung; der Stärke und der Art der behandelten Erkrankung und des jeweils behandelten Individuums. Gewöhnlich lassen sich wirksame Ergebnisse durch systemisches Verabreichen einer Verbindung in einer Dosierung von etwa 0,01 mg bis etwa 20 mg pro kg Körpergewicht pro Tag erzielen. Die Therapie sollte in niedrigeren Dosierungen eingeleitet werden. Die anschließende Dosierung kann oral in einer festen Dosierungsform, z. B. Kapseln, Tabletten oder Pulver, oder in flüssiger Form, z. B Lösungen oder Suspensionen, verabreicht werden. Die Verbindungen können auch parenteral in Form von sterilen Lösungen oder Suspensionen injiziert werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Wirkstoff vorzugsweise in eine Zusammensetzung eingebracht, umfassend einen pharmazeutischen Träger und etwa 5 bis etwa 90 Gew.-% einer erfindungsgemäßen Verbindung oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon. Der Begriff "pharmazeutischer Träger" betrifft bekannte pharmazeutische Exzipienten, die sich bei der Formulierung pharmazeutisch aktiver Verbindungen für die interne Verabreichung an Tiere eignen, und die unter Gebrauchsbedingungen im wesentlichen nicht-toxisch und nicht reizend sind. Die Zusammensetzungen können durch bekannte Techniken zur Herstellung von Tabletten, Kapseln, Elixieren, Sirupen, Emulsionen, Dispersionen und benetzbaren sowie Brausepulver sein, und können geeignete Exzipienten enthalten, von denen man weiß, daß sie bei der Herstellung des jeweiligen Typs der gewünschten Zusammensetzung geeignet sind.
Der bevorzugte Verabreichungsweg ist die orale Verabreichung. Für orale Verabreichung können die Verbindungen der Formel I in feste oder flüssige Präparate formuliert werden, wie Kapseln, Pillen, Tabletten, Pastillen (troches), Pastillen (lozenges) Schmelzen, Pulver, Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Die festen Einheitsdosierungsformen können eine Kapsel sein, bspw. vom Typ einer gewöhnlichen hart- oder weichmanteligen Gelatinekapsel, die bspw. grenzflächenaktive Mittel, Gleitmittel und inerte Füllstoffe, wie Lactose, Saccharose, Calciumphosphat und Maisstärke, enthält.
Bei einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verbindungen mit herkömmlichen Tablettengrundstoffen, wie Lactose, Saccharose und Maisstärke, in Kombination mit Bindemitteln, wie Traganth, Maisstärke oder Gelatine, Sprengmitteln, die das Aufbrechen und das Auflösen der Tablette nach der Verabreichung unterstützen sollen, wie Kartoffelstärke, Alginsäure, Maisstärke und Guar-Gummi, Gleitmitteln, die den Fluß der Tablettengranulate verbessern sollen und die die Anheftung des Tablettenmaterials an die Oberflächen der Tabletten-Matrizen und -Patrizen verhindern sollen, bspw. Talk, Stearinsäure oder Magnesium-, Calcium- oder Zinkstearat, Farbstoffen, farbgebenden Substanzen und Geschmacksstoffen, die die ästethischen Qualitäten der Tabletten verbessern sollen und die Tablette für den Patienten verträglicher machen sollen, tablettiert werden. Geeignete Exzipienten für den Gebrauch in oralen Flüssigdosierungsformen umfassen Verdünnungsmittel, wie Wasser und Alkohole, bspw. Ethanol, Benzylalkohol und die Polyethylenalkohole, entweder mit oder ohne Zugabe eines pharmazeutisch verträglichen grenzflächenaktiven Mittels, Suspendierungsmittels oder Emulgators.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I können auch parenteral verabreicht werden, d. h. subcutan, intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal, wie injizierbare Dosierungen der Verbindung in einem physiologisch verträglichen Verdünnungsmittel mit einem pharmazeutischen Träger, der eine sterile Flüssigkeit oder ein Gemisch von Flüssigkeiten sein kann, wie Wasser, Kochsalzlösung, wäßrige Dextrose und verwandte Zuckerlösungen, ein Alkohol, wie Ethanol, Isopropanol oder Hexadecylalkohol, Glycole, wie Propylenglycol oder Polyethylenglycol, Glycerinketale, wie 2,2-Dimethyl-1,3- dioxolan-4-methanol, Ether, wie Polyethylenglycol 400, ein Öl, eine Fettsäure, ein Fettsäureester oder -glycerid oder ein acetyliertes Fettsäureglycerid mit oder ohne Zugabe eines pharmazeutisch verträglichen grenzflächenaktiven Mittels, wie eine Seife oder ein Detergens, Suspendierungsmittels, wie Pektin, Carbomere, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose oder Carboxymethylcellulose, oder Emulgators und anderer pharmazeutisch verträglicher Hilfsstoffe. Beispielhafte Öle, die sich bei den erfindungsgemäßen parenteralen Formulierungen verwenden lassen, sind Rohöl, Öle tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs, bspw. Erdnußöl, Sojaöl, Sesamöl, Baumwollsamenöl, Maisöl, Olivenöl, Petrolatum und Mineralöl. Geeignete Fettsäuren umfassen Ölsäure, Stearinsäure und Isostearinsäure. Geeignete Fettsäureester sind bspw. Ethyloleat und Isopropylmyristat. Geeignete Seifen umfassen Fett-Alkalimetall-, - Ammonium- und -Triethanolamin-Salze, und geeignete Detergentien umfassen kationische Detergentien, bspw. Dimethyldialkylammoniumhalogenide, Alkylpyridiniumhalogenide; anionische Detergentien, bspw. Alkyl-, Aryl- und Olefinsulfonate, Alkyl-, Olefin-, Ether- und Monoglyceridsulfate und -sulfosuccinate; nichtionische Detergentien, bspw. Fettaminoxide, Fettsäurealkanolamide und Polyoxyethylenpolypropylen-Copolymere; und amphotere Detergentien, bspw. Alkyl-beta-aminopropionate und quartäre 2-Alkylimidazolin- Ammoniumsalze sowie Gemische. Die erfindungsgemäßen parenteralen Zusammensetzungen enthalten gewöhnlich etwa 0,5 bis etwa 25 Gew.-% der Verbindung der Formel I in Lösung. Es lassen sich ebenfalls Konservierungsmittel und Puffer vorteilhaft einsetzen. Zur Minimierung oder Verhinderung von Reizung an der Injektionsstelle können diese Zusammensetzungen ein nichtionisches grenzfläehenaktives Mittel mit einem Hydrophilen-Lipophilen-Gleichgewicht (HLB) von etwa 12 bis etwa 17 enthalten. Die Menge an grenzflächenaktivem Mittel in diesen Formulierungen reicht von etwa 5 bis etwa 15 Gew.-% Das grenzflächenaktive Mittel kann eine Einzelkomponente mit dem vorstehenden HLB oder ein Gemisch von zwei oder mehreren Komponenten mit dem gewünschten HLB sein. Beispiele für die grenzflächenaktiven Mittel, die bei den parenteralen Formulierungen verwendet werden, sind die Klasse der Polyethylen- Sorbitanfettsäureester, bspw. Sorbitanmonooleat und die Hochmolekulargewichtsaddukte von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Base, die durch Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglycol gebildet wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch topisch verabreicht werden. Dies läßt sich durch einfaches Herstellen einer Lösung der zu verabreichenden Verbindung, vorzugsweise unter Verwendung eines Lösungsmittels bewerkstelligen, von dem man weiß, daß es die transdermale Absorption fördert, wie Ethanol oder Dimethylsulfoxid (DMSO), mit oder ohne andere Exzipienten. Die topische Verabreichung erfolgt vorzugsweise unter Verwendung eines Pflasters vom Reservoir- oder porösen-Membran-Typ oder einer Festmatrix-Variante.
Einige geeignete transdermale Vorrichtungen sind in den US-Patenten Nr. 3,742,951, 3,797,494, 3,996,934 und 4,031,894 beschrieben. Diese Vorrichtungen enthalten gewöhnlich ein Verstärkungselement, das eine ihrer Oberflächen definiert, eine für den Wirkstoff permeable Klebeschicht, die die andere Oberfläche definiert und mindestens ein Reservoir, in dem der Wirkstoff zwischen den Oberflächen enthalten ist. Der Wirkstoff kann alternativ in einer Vielzahl von Mikrokapseln enthalten sein, die über die permeable Klebstoffschicht verteilt sind. Der Wirkstoff wird in beiden Fällen stetig aus dem Reservoir oder den Mikrokapseln über eine Membran in den für den Wirkstoff permeablen Klebstoff abgegeben, der mit der Haut oder Schleimhaut des Empfängers in Kontakt steht. Wird der Wirkstoff durch die Haut absorbiert, wird ein kontrollierter und festgelegter Wirkstoffstrom an den Empfänger verabreicht. Bei den Mikrokapseln kann das Einkapselungsmittel ebenfalls als Membran wirken.
Bei einer anderen Vorrichtung zum transdermalen Verabreichen der erfindungsgemäßen Verbindungen befindet sich die pharmazeutisch wirksame Verbindung in einer Matrix, von der sie in der gewünschten allmählichen, konstanten und kontrollierten Geschwindigkeit abgegeben wird. Die Matrix ist für die Freisetzung der Verbindung durch Diffusion oder Mikroporenfluß permeabel. Die Freisetzung ist geschwindigkeitsbestimmend.
Ein solches System, das keine Membran benötigt, ist in US-Patent Nr. 3,921,636 beschrieben. In diesen Systemen sind mindestens zwei Freisetzungstypen möglich. Die Freisetzung durch Diffusion erfolgt, wenn die Matrix nicht-porös ist. Die pharmazeutisch wirksame Verbindung löst sich in der Matrix selbst und diffundiert durch sie hindurch. Die Freisetzung durch Mikroporenfluß erfolgt, wenn die pharmazeutisch wirksame Verbindung durch eine flüssige Phase in den Poren der Matrix transportiert wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können durch Maßnahmen, die dem Fachmann allgemein geläufig sind, in ein Aerosolpräparat eingebracht werden. Das Aerosolpräparat läßt sich zur Verwendung als topisches Aerosol herstellen oder kann zur Inhalation hergestellt werden. Das Aerosolpräparat kann in Form einer Lösung oder Suspension vorliegen und kann andere Inhaltsstoffe enthalten, wie Lösungsmittel, Treibmittel und/oder Dispersionsmittel. Gebräuchliche Beispiele für Aerosolpräparate sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, S. 1694-1712 (1990) beschrieben.
Bestimmte subgenerische Gruppen und bestimmte spezifische Verbindungen sind bevorzugt, was für die meisten Klassen von Verbindungen gilt, die sich als Therapeutikum eignen. In diesem Fall sind Verbindungen bevorzugt, bei denen R, die Bedeutung H, R&sub2; keine Bedeutung, R&sub6; die Bedeutung H&sub2;, R&sub3; die Bedeutung H oder (CH&sub2;)-Aryl, Z die Bedeutung Isobutyl, und n den Wert 1 hat.

Claims

1. Verbindung der Formel:

Formel I,

deren Stereoisomere, Hydrate, inneren Salze oder pharmazeutisch verträglichen Salze, wobei

R&sub1; oder R&sub2; jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, (CH&sub2;)m- Aryl, R&sub4;-C(O)O-CH(R&sub5;)-Rest oder nicht vorhanden sind, wenn das innere Salz gebildet wird, mit der Maßgabe, daß - wenn einer der Reste R&sub1; oder R&sub2; ein Wasserstoffatom, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl- oder (CH&sub2;)m-Arylrest ist - der andere dann ein Wasserstoffatom oder nicht vorhanden ist, wenn das innere Salz gebildet wird;

R&sub3; ein Wasserstoffatom, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, (CH&sub2;)m-Cycloalkyl- oder (CH&sub2;)m-Arylrest ist;

R&sub4; ein C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl-, (CH&sub2;)m-Cycloalkyl-, oder (CH&sub2;)m-Arylrest ist;

R&sub5; ein C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, (CH&sub2;)m-Cycloalkylrest oder ein Wasserstoffatom ist;

R&sub6; die Bedeutung H oder H&sub2; hat, wenn einer der Reste R&sub1; oder R&sub2; nicht vorhanden ist und somit das innere Salz gebildet wird;

R&sub7; die Bedeutung CH&sub3; oder H hat;

R&sub8; die Bedeutung H, Br, CH&sub3; oder OCH&sub3; hat, mit der Maßgabe, daß einer der Reste R&sub7; oder R&sub8; die Bedeutung H hat;

Z ein (CH&sub2;)m-Aryl- oder C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Alkylrest ist;

X ein Wasserstoffatom oder C&sub1;&submin;&sub6;-Alkylrest ist;

die Werte m jeweils unabhängig voneinander 0, 1, 2 oder 3 sind; und

n die Bedeutung 1, 2 oder 3 hat, und wobei

"Cycloalkyl" in der Defmition von R&sub1;-R&sub5; einen gesättigten C&sub3;-C&sub8;-Kohlenstoffring bedeutet und "Aryl" für Phenyl-, Naphthyl-, Tetrahydronaphthyl- oder Indanylgruppen steht, wobei die Cycloalkyl- oder Arylreste unsubstituiert oder substituiert sind mit ein, zwei oder drei Substituenten, die unabhängig voneinander aus C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, Halogenalkyl-, Alkoxy-, Thioalkoxy-Resten, Aminogruppen, Alkylamino-, Dialkylaminoresten, Hydroxy-, Halogen-, Mercapto-, Nitro-, Carboxaldehyd-, Carboxy-, Carboalkoxy- und Carboxamid-Gruppen ausgewählt sind.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R&sub1; die Bedeutung H hat.

3. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R&sub2; keine Bedeutung hat, und R&sub6; die Bedeutung H&sub2; hat.

4. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R&sub3; die Bedeutung H hat oder eine (CH&sub2;)-Aryl- Gruppe ist.

5. Verbindung nach Anspruch 1, wobei Z eine Isobutyl-Gruppe ist.

6. Verbindung nach Anspruch 1, wobei X die Bedeutung H hat.

7. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-(N-Phosphonomethyl-L- leucyl)-L-tryptophan ist.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die Verbindung nach Anspruch 1 mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

9. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung des Endothelinumwandelnden Enzyms bei einem Patienten, der eine solche Therapie benötigt.

10. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-(N- Benzyloxyhydroxyphosphinylmethyl-L-leucyl)-L-tryptophan-Benzylester ist.

11. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-(N- Benzyloxyhydroxyphosphinylmethyl-L-leucyl)-L-tryptophan ist.

12. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-(N-Phosphonomethyl-L- leucyl)-DL-homotryptophan ist.

13. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-[N-(Di-(pivaloyloxymethyl)- phosphonyl)-L-leucyl]-L-tryptophan-Ethylester ist.

14. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung N-(N- Pivaloyloxymethyloxyhydroxyphosphinyl-L-leucyl)-L-tryptophan-Ethylester ist.

15. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, umfassend die Schritte:

Substituieren der Abgangsgruppe (L) der Phosphonverbindung (3) mit dem Dipeptid (4)

wobei R1' und R2' jeweils C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, (CH&sub2;)m-Aryl, R&sub4;-C(O)O-CH(R)- oder eine andere geeignete Schutzgruppe sind, sofern diese anschließend entfernt wird, und R3' C&sub1;&submin;&sub6;- Alkyl-, (CH&sub2;)m-Cycloalkyl-, (CH&sub2;)m-Aryl- oder eine andere geeignete Schutzgruppe ist, sofern diese anschließend entfernt wird, so daß das Dipeptid (1.1) hergestellt wird,

und gegebenenfalls jeweiliges Entfernen der Schutzgruppen von R1', R2', oder R3', so daß R1' = R&sub1;, R2' = R&sub2; und R3' = R&sub3;, wobei Z, X und n die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben;

oder alternativ Verseifen des Esters (7) in Gegenwart einer Base, wobei Z, R1', und R2' wie vorstehend definiert sind und R4' eine geeignete Schutzgruppe ist,

und Kuppeln mit Aminoester (8), wobei R3' und X und n wie vorstehend definiert sind

so daß das geschützte Phosphonomethyldipeptid (1.1) hergestellt wird,

und gegebenenfalls jeweiliges Entfernen der Schutzgruppe von R1', R2' und R3', so daß R1' = R&sub1;, R2' = R&sub2; und R3' = R&sub3;.