PT691985E - Fosfonometildipeptidos - Google Patents

Description

1 1

DESCRIÇÃO “FOSFONOMETILDIPEPTroOS”

Campo da Invenção A presente invenção diz de uma maneira geral respeito a dipeptidos e aos seus análogos tendo um radical fosfonometilo, a composições farmacêuticas que contêm estes compostos, a processos para a preparação de tais compostos, aos intermediários utilizados nesses processos e aos métodos para inibir a produção de Endotelina. Estes compostos inibem a Enzima Conversora da Endotelina e são deste modo úteis no tratamento de estados responsivos à inibição da produção de Endotelina.

Antecedentes da Invenção O péptido Grande Endotelina, que se encontra nas células do endotélio, é cindido pelo Enzima Conversora da Emdotelina (“Endotelin Converting Enzyme” (ECE)) para produzir o péptido Endotelma. A Endotelina é um vasoconstritor com 21 aminoácidos e é produzido pelas células do endotélio, por células mesangiais, dos rins e epiteliais e por diversas linhas de células do cancro humano e ainda por macrófagos humanos.

Biologicamente, a endotelina exerce efeitos sobre o músculo liso vascular, sobre o músculo liso não vascular, sobre o coração, sobre o tecido nervoso, sobre os rins e sobre as glândulas adrenais. A Endotelina contrai as artérias e as veias, aumenta a tensão arterial média, reduz a saída cardíaca, aumenta a 2 2

contractilidade cardíaca in vitro, estimula a mitogenese em células do músculo liso vascular in vitro, contrai o músculo liso vascular incluindo a traqueia da cobaia, escama a bexiga unnária humana e o útero do rato in vitro, aumenta a resistências das vias aéreas in vivo, induz a formação de úlceras gástricas, estimula a libertação do factor natriurético atrial in vitro e in vivo, aumenta os níveis de plasma de vasopressina, aldosterona e catecolaminas, inibe a libertação de renina in vitro e estimula a libertação de gonadrotropina in vitro. Veja-se, por exemplo, a publicação do pedido de patente de invenção PCT com o número WO 92/13545.

Indicações possíveis para o uso de inibidores da produção de endotelina incluem o tratamento de doenças cardiovasculares (por exemplo, isquémia miocárdica, colapso cardíaco congestivo, arritmia, angina instável e hipertensão); broncoconstricção (hipertensão pulmonar e asma); perturbações da acção neuronal (vasoespamo cerebral e hemorragia subaracnóide); perturbações endócrinas (pré-eclampsia); doença renal (colapso renal agudo/crónico); perturbações vasculares (aterosclerose, doença de Buergers, artrite de Takayasu, fenómeno de Raynaud e complicações na diabetes); cancro (especialmente o carcinoma pulmonar); danos na mucosa gástrica (perturbações gastro-intestinais); e choque endotóxico e septicémia. Veja-se J. Med. Chem. 35(9): 1493-1508 (1992), Neurology 42 : 25-31 (1992); e Dnig Development Research 26 : 361 - 387 (1992).

Foram já descritos inibidores da Enzima Conversora da Endotelina em Journal of Medicinal Chemistry (1993, 36, 173 - 176) que descreve N-fosfono-Leu--Trp e alguns análogos de substituição. Contudo, descobriu-se agora novos compostos que diferem dos que foram previamente citados pela presença de um 3

grupo metileno entre o átomo de fósforo e o átomo de azoto da leucina.

Sumário da Presente Invenção Um composto com a fórmula geral:

estereoisómeros, hidratos, sais internos ou os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, na qual os símbolos Ri ou R2 representam, cada um, independentemente, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo Ci-C6, (CH2)m-arilo, R4-C(0)0-CH(R5)- ou não têm qualquer significado quando se forma o sal interno, com a condição de quando um dos símbolos Ri ou R2 representa um átomo de hidrogénio, um grupo alquilo C\-C6 ou um grupo de fórmula geral (CH2)m-arilo, então o outro representa um átomo de hidrogénio ou não tem qualquer significado quando se forma o sal interno; o símbolo R3 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo Q-Cé, (CH2)m-cicloalquilo ou (CH2)m-arilo; o símbolo R4 representa um grupo alquilo C1-C10, (CH2)m-cicloalquilo ou (CH2)m--arilo; o símbolo R5 representa um grupo alquilo CrC6, (CH2)m-cicloalquilo ou hidrogénio; o símbolo R<s representa um átomo de hidrogénio ou H2, quando um dos símbolos Ri ou R2 não tem qualquer significado formando-se assim o sal interno; o símbolo R7 representa CH3 ou H; o símbolo R8 representa H, Br, CH3 ou OCH3, com a condição de um dos símbolos R7 ou R8 representar um átomo de hidrogénio; o símbolo Z representa um grupo (CH2)m-arilo ou alquilo CrCi2; o símbolo X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo Ci-C6; cada um dos símbolos m representa independentemente um número igual a 0, 1,2 ou 3; e o símbolo n representa o número 1, 2 ou 3. em que “cicloalquilo” na definição dos símbolos R! - R5 é um anel saturado em C3-C8 e “arilo” significa fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo ou indanilo, sendo os referidos grupos cicloalquilo ou arilo substituídos ou insubstituídos por um, dois ou três substituintes escolhidos independentemente de entre grupos alquilo CrC6, haloalquilo, alcoxi, tioalcoxi, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxi, halo, mercapto, nitro, carboxaldeído, carboxi, carboalcoxi e carboxamida. A presente invenção engloba igualmente composições do composto de fórmula geral I e a sua utilização para o tratamento de estados melhorados pela inibição da Enzima Conversora da Endotelina (“Endothelin Converting Enzyme”). Descrição Pormenorizada da Presente Invenção Tal como utilizados na presente memória descritiva, certos termos têm 5

significados específicos tais como os que se seguem. “Alquilo Ci-C6” significa grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada contendo entre 1 e 6 átomos de carbono incluindo, mas não ficando limitados a, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, t-butilo, n-pentilo, 1-metilbutilo, 2,2-dimetilbutilo, 2-metilpentilo, 2,2-dimetilpropilo, n-hexilo e similares. Outros números de átomos de carbono indicados desta maneira tais como CM0 representam igualmente grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada com o número de átomos de carbono indicado.

O radical indolilo de fórmula geral I

T H pode ser substituído na posição 5 por H, Br, CH3 ou OCH3, (representado na fórmula geral I pelo símbolo R8), e pode ser substituído nas posições 4, 5, 6 ou 7 por H ou CH3 (representado na fórmula geral I pelo símbolo R7). Contudo, um dos símbolos R7 ou Rg deve representar um átomo de hidrogénio. “Sal interno” também conhecido como ião anfotérico, é uma molécula que comporta uma carga positiva e uma carga negativa, um exemplo dos quais é o exemplo 1 na presente memória descritiva. “Estereoisómero” é um termo geral para todos os isómeros de moléculas individuais que diferem apenas na orientação dos seus átomos no espaço. Inclui isómeros de imagem no espelho (enantiómeros), isómeros geométricos (cis/trans) e 6 isómeros de compostos com mais do que um centro de quiralidade que não são imagens no espelho um do outro (diastereoisómeros). Por amino-ácidos, podem utilizar-se as designações L/D, ou R/S conforme descritas em IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature, Enr. J. Biochem. 138 : 9-37 (1984). “Sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico” significa tanto sais de adição de ácido como sais de adição de metal e de amina os quais são conhecidos como sendo derivados não tóxicos e úteis na preparação de formulação farmacêuticas apropriadas para aplicações de utilização final.

Os sais de adição de ácido aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico incluem os sais de adição de ácido orgânico ou inorgânico não tóxicos conhecidos dos compostos básicos de fórmula geral I. Ilustrativos de ácidos orgânicos que formam sais apropriados incluem ácidos mono-, di- e tricarboxilicos. Ilustrativos de tais ácidos são, por exemplo, os ácidos acético, glicólico, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fúmárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, hidroximaleico, benzóico, hidroxibenzóico, fenilacético, cinâmico, salicíclico e 2-fenoxibenzóico. Outros ácidos orgânicos que formam sais apropriados são os ácidos sulfónicos tais como o ácido metano-sulfónico e o ácido 2-hidroxietano-sulfónico. Preparam-se tanto os sais de mono- ou di-ácidos mediante técnicas convencionais tais como mediante dissolução da base livre no seio de uma solução aquosa ou aquosa-alcoólica ou de outro solvente apropriado que contenha o ácido apropriado e isolando por evaporação a solução, ou fazendo reagir a base livre no seio de um solvente orgânico, caso esse em que o sal se separa directamente ou pode ser obtido mediante concentração da solução. De uma maneira geral, os sais de adição de ácido dos compostos de acordo com a presente invenção constituem materiais cristalinos que são solúveis em água em várias formas hidrófilas, o que demonstra pontos de fusão elevados e uma estabilidade aumentada.

Sais de metal e de amina aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico são os sais que são estáveis nas condições ambiente, e em que o catião não contribui significativamente para a actividade biológica do sal. Sais de metal apropriados incluem os sais de sódio, potássio, cálcio, bário, zinco e alumínio. Preferem-se os sais de sódio e de potássio. Preparam-se os sais de amina apropriados a partir de aminas que possuem uma basicidade suficiente para formar um sal estável e incluem de preferência as aminas que são utilizadas frequentemente em química medicinal devido à sua toxicidade reduzida e capacidade de aceitação para uso clínico. Estas incluem as trialquilaminas tais como a trietilamina e outras incluem procaína, dibenzilamina, N-benzil-betafenetilamina, N-etil-piperidina, benzilamina e diciclo-hexilamina. “Hidrato” é uma molécula que tem água sob a forma de moléculas de H20 associadas com a mesma. “Para Tratar” ou “Tratamento” de uma doença ou estado significa prevenir ou aliviar a doença ou estado do paciente. “Paciente” refere-se a um animal de sangue quente, tal como por exemplo ratos, murganhos, cães, gatos, cobaias, primatas e seres humanos. δ

Pode preparar-se os compostos de acordo com a presente invenção mediante aplicação de reacções químicas análogas conhecidas na especialidade, utilizando reagentes que já são conhecidos ou que podem ser preparados utilizando processos convencionais e técnicas conhecidas da especialidade. Na sua essência, o método geral para a preparação dos compostos de fórmula geral I pode ser delineado pelos esquemas reaccionais que se seguem. Nesses esquemas, os termos seguintes têm estes significados: “L” significa um grupo eliminável. Grupos elimináveis apropriados incluem triflatos, sulfonatos de alquilo ou de arilo (v.g., CF3S020, tosilato, mesilato) e halogenetos (Br, Cl ou I). “Pg” significa um grupo protector apropriado. O termo aplica-se aos grupos protectores para átomos tais como átomos de azoto ou de oxigénio que são susceptíveis de sofrer reacções químicas indesejáveis. Podem encontrar-se grupos protectores apropriados, por exemplo, em Protective groups in Organic Syníhesis, 2a ed., Theodora W. Greene, John Wiley & Sons, Inc., New York 1991, que se incorpora na presente memória descritiva como referência.

Os símbolos Ri, R2, R3, X e Z têm os significados definidos antes. Os símbolos Ri’, R2\ R3’ e R4’ representam, cada um, grupos protectores (Pg). Deve salientar-se que Pg pode ser Rb R2 ou R3 com excepção do átomo de hidrogénio. 9

Esquema A

Esquema B

alternativa ao esquema A

R2,0 (5)

(7) 10 (continuação do Esquema B) HO'''/

N (CH^nVNH

Desprotecção Parcial ou Total

1 - Cisão do éster 2 - Acoplamento com (8) (1.3) HO 2 X 0 (1.4)

Constroi-se a estrutura de cadeia dipeptídica utilizando uma estratégia bem conhecida que consiste em formar uma ligação peptídica por acoplamento de 11 um aminoácido, com grupo ou grupos protector(es) apropriado(s) tais como terc-butiloxicarbonilo (BOC), com um éster peptídico utilizando um reagente de acoplamento apropriado. Inclui a activação de carboxilato com diciclo-hexil-carbodiimida (DCC) ou, como alternativa, de acordo com o método do anidrido misto. A desprotecçao selectiva do BOC para gerar a amina livre pode ser conseguida utilizando uma solução etérea de ácido clorídrico, ácido trifluoroacético ou ácido fórmico. Exemplos da formação da ligação peptídica podem ser encontrados em, por exemplo, PEPTIDE CHEMISTRY, A PRACTICAL TEXTBOOK, de Miklos Bodansky Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1988, que se incorpora na presente memória descritiva como referência. Os compostos iniciais encontram-se disponíveis no comércio a partir de, por exemplo, Aldrich que pode fornecer fosfito de dibenzilo, fosfito de dietilo, fosfíto de dipropilo e fosfito de dibutilo. Disponíveis a partir de Bachem of Switzerland encontram-se BOC-Leu; Leu-OMe, HC1; BOC-Phe-OH; BOC-HomoPhe-OH, BOC-D-Leu, H20; e Trp-OBz, HC1.

Podem preparar-se os dipeptidos comportando um radical indolilo em que um dos símbolos R7 ou Rg não representa um átomo de hidrogénio utilizando os aminoácidos obtidos a partir de Aldrich Chemical Co. de Milwaukee, Wisconsin, (5-bromotriptofano, 5-metoxitriptofano ou 5-metiltriptofano), Sigma Chemical Co. of the USA, (4-metiltriptofano ou 7-metiltriptofano), e Fluka Chemical Co. of Switzerland (6-metiltriptofano).

Com referência ao Esquema A, a introdução do radical fosfonometilo utilizou ésteres hidroximetilfosfónicos de fórmula geral (2) preparados pelo método 12

de A. Foucaud [Synthesis 916 (1982)]. Activa-se a função hidroxilo como um grupo eliminável (L) (3), de preferência como o sulfonato de tnfluorometilo, e substitui-se pelo terminal amino de um dipeptido de fórmula geral (4) cujo terminal carboxi foi protegido, habitualmente sob a forma de éster representado como R3\

Por exemplo, activa-se o éster hidroximetilfosfónico de fórmula geral (2) como o sulfonato de trifluorometano, mediante reacção com anidrido difluorometano-sulfónico ou cloreto de triflouorometano-sulfonilo a uma temperatura baixa compreendida entre -60°C e 0°C no seio de um solvente aprótico, por exemplo CH2CI2, tetra-hidrofurano, éter dietílico ou dimetilformamida, ou misturas destes solventes. Neutraliza-se os protões com uma base estericamente impedida, por exemplo, 2,6-lutidina, ou com um hidreto metálico, por exemplo, hidreto de sódio.

Faz-se reagir o dipeptido de fórmula geral (4) com o fosfonoéster activado de fórmula geral (3) mediante adição de uma solução do composto de fórmula geral (4) no seio de um solvente aprótico a uma temperatura compreendida entre 0°C e 40°C durante um tempo de reacção compreendido entre uma hora e três dias. Utiliza-se uma base similar para a formação do sulfonato de trifluorometilo. Os rendimentos podem ser melhorados pela adição de hexametilfosforamida, dimetilformamida ou similares.

Como uma alternativa indicada no Esquema B, pode ser também conveniente fazer reagir o intermediário protegido de fórmula geral (5) com um éster de aminoácido de fórmula geral (6) para produzir o éster de fosfonometilaminoácido de fórmula geral (7). Desesterifica-se o éster de fórmula 13 geral (7) e acopla-se com um aminoéster de fórmula geral (8) para produzir um fosfonometildipeptido de fórmula geral (1.1).

Por exemplo, faz-se reagir o intermediário protegido de fórmula geral (5) com o éster de aminoácido de fórmula geral (6) sob condições análogas tal como a reacção entre os compostos de fórmula geral (3) e (4) para produzir o éster do fosfonometilaminoácido de fórmula geral (7). Desesterifica-se o éster de fórmula geral (7) utilizando uma base, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou hidróxido de lítio em metanol aquoso, metoxi-etanol aquoso ou tetra-hidrofurano à temperatura ambiente entre 1 hora e 24 horas.

Acopla-se o amino-éster de fórmula geral (8) com o éster desesterificado derivado do composto de fórmula geral (7) para produzir o fosfonometildipeptido protegido de fórmula geral (1.1) mediante activação do carboxilato com diciclo-hexilcarbodiimida, pela formação de um anidrido misto (por exemplo, utilizando cloroformato de isobutilo) ou mediante formação de uma acilazida utilizando difenilfosforil-azida (DPPA). Dependendo da natureza do éster activado assim formado, a reacção com o aminoéster ocorre a uma temperatura compreendida entre -20°C e 40°C. A acilazida reage a uma temperatura compreendida entre -10°C e 10°C. O tempo da reacção varia entre uma hora e três dias. O fosfono-metildipeptido protegido de fórmula geral (1.1) pode então ser parcial ou totalmente desprotegido. Quando todos os grupos protectores são grupos benzilo, obtêm-se convenientemente os compostos completamente desprotegidos de fórmula geral I (1.3) mediante hidrogenólise sob condições básicas num sistema bifásico. A desprotecção parcial dos compostos de fórmula geral I (1.1 ou 1.4) pode

14 ser conseguida mediante hidrogenólise, pela acção de ácido ou base diluída ou pela reacção com halogenetos de trimetilsililo.

No seguimento proporcionam-se exemplos específicos dos compostos preferidos de acordo com a presente invenção bem como métodos para a preparação dos mesmos. Contudo, deve entender-se que a presente invenção não fica limitada de qualquer modo por estas exemplificações e que podem ser utilizados outros métodos para a preparação de compostos conhecidos na especialidade. EXEMPLO 1

O N-lN-Fosfonometil-L-leuciD-L-triptofano

Fase A : Éster benzílico do N-fN-dibenziloxifosfimlmetil-L-leuciD-L-tnptofano

Adiciona-se lentamente dibenziloxifosfmilmetanol (372 mg) em 5 ml de cloreto de metileno anidro a 10 ml de uma solução de cloreto de metileno de 0,36 ml de 2,6-lutidina recentemente destilada e 0,25 ml de anidrido tríflico arrefecido até à temperatura de -50°C. Agita-se a mistura durante 10 minutos à temperatura de -50°C e deixa-se subir a temperatura até 0°C no decurso de uma hora.

Sem isolamento, ao éster dibenziloxifosfinilmetílico do ácido trifluorometano-sulfónico assim formado, adiciona-se então à temperatura de 0°C 500 mg do éster benzílico do L-leucil-L-triptofano, sob a forma da amina livre em 5 ml de cloreto de metileno anidro. Agita-se a mistura durante uma hora à temperatura de 0°C e durante a noite à temperatura ambiente. A evaporação da mistura reaccional sob vazio proporciona 1,60 g de um óleo laranja que se purifica mediante cromatografia intermitente sobre gel de sílica (55 g, 230 - 400 Mesh). Elui-se o composto do título com uma mistura de acetato de etilo e heptano com uma razão compreendida entre 1/1 e 1/0. A evaporação do solvente proporciona um óleo incolor (240 mg). RMN 13P : CDC13 δ (relativo a ext. H3PO4) multipleto (8 linhas) (J = 9 Hz) a 27,0 ppm.

Fase B . N-fN-Fosfonometil-L-leucil)-L-tnptofano

Agita-se à temperatura ambiente sob atmosfera de hidrogénio à pressão normal durante 3 horas 240 mg do éster benzílico de N-(N-dibenziloxifosfínilmetil--L-leucil)-L-triptofano e 40 g de paládio a 10 % sobre carvão em uma mistura heterogénea de 10 ml de acetato de etilo e 10 ml de uma solução aquosa de 89 mg de hidrogenocarbonato de potássio. Desgasa-se a mistura e elimina-se o catalisador mediante filtração. Separa-se a camada aquosa, lava-se com acetato de etilo, filtra-se e liofiliza-se para se obter 192 mg de um pó branco. Volta a dissolver-se este material em 10 ml de água e neutraliza-se mediante adição lenta de ácido clorídrico aquoso (N/10, 11 ml). Isola-se o precipitado resultante e seca-se sob vazio para se obter o composto do título sob a forma de um pó branco (115 mg). RMN 13P : DMSO δ (relativo a ext. H3P04) multipleto a 14 ppm.

Análise calculada para CigH26N306P, 1,2 H20 16 C :49,93 H : 6,61 N : 9,70 Encontrada C : 49,91 H. 6,53 N: 9,65

Ponto de fusão : endotérmico a 232°C por DSC. EXEMPLO 2

Éster benzílico do N-(N-benziloxi-hidroxifosfinilmetil-L-leucin-L-triptofano

Hidrogena-se éster benzílico de N-(N-dibenziloxifosfínilmetil-L-leucil--L-triptofano (100 mg) (Exemplo 1, Fase A) dissolvido em 5 ml de acetato de etilo sobre paládio sobre carvão (10 %, 15 mg) à pressão normal e à temperatura ambiente durante 8 horas. Filtra-se a mistura e extrai-se o sólido assim obtido com metanol para se obter após evaporação do solvente 70 mg do composto do título sob a forma de um sólido branco. RMN 13P : CD3OD δ (relativo a ext. H3P04) multipleto a 9,6 ppm.

Análise calculada para C23H38N3O6P, 0,5 H20 C : 63,99 H : 6,54 N : 7,00

Encontrada C : 64,06 H : 6,32 N : 6,98 17 EXEMPLO 3 17

ΝΉ N-(N-Benziloxi-hidroxifosfinilmetil-L-leucil)-L-triptofano

Trata-se uma solução de éster benzílico de N-(N-dibenziloxifosfinilmetil--L-leucil)-L-triptofano (100 mg) (Exemplo 1, Fase A) em 5 ml de etanol com 0,30 ml de uma solução aquosa de hidróxido de potássio IN. Mantém-se a agitação durante 4 dias à temperatura ambiente. Uma vez terminada a reacção evapora-se a mistura sob vazio e volta a dissolver-se o resíduo em água e precipita-se mediante adição de ácido clorídrico diluído permitindo o isolamento do composto do título. EXEMPLO 4

NH iH N-lN-Fosfonometil-L-leucilí-DL-homotriptofano

Fase A :

18 Éster etílico do L-Leucil-DL-homotriptofano

Dissolve-se 4-(P-indolil)-2-cetobutirato de etilo em etanol, e em seguida adiciona-se amónia concentrada aquosa em excesso e paládio a 10 % sobre carvão. Hidrogena-se a mistura num aparelho sob pressão a 5 bars. Filtra-se o catalisador e evapora-se o filtrado sob vazio para se obter um material bruto que se acopla a N-terc.-butiloxicarbonil-leucina utilizando diciclo-hexilcarbodiimida com hidroxibenzotriazol em cloreto de metileno. Elimina-se a diciclo-hexilureia mediante filtração e purifica-se o péptido bruto obtido após evaporação do solvente mediante cromatografia sobre gel de sílica para se obter o éster etílico do N-(N-terc.--butiloxicarbonil-L-leucil)-DL-homotriptofano. A reacção com ácido fórmico e a extracção da base livre com carbonato de sódio aquoso/acetato de etilo proporciona o composto do título.

Fase B Éster etílico do N-ÍN-dibenziloxifosfinilmetil-L-leucil)-DL-homotriptofano

Obtém-se o composto do título por um processo análogo ao descrito para a preparação do éster benzílico de N-(N-dibenziloxifosfínilmetil-L-leucil)-L--triptofano (Exemplo 1.

Fase C : N-(N-Dibenziloxifosfinilmetil-L-leucin-DL-homotriptofano

Trata-se uma solução do éster etílico de N-(N-dibenziloxifosfinilmetil-L--leucil)-DL-homotriptofano em 2-metoxietanol com uma solução aquosa de hidróxido de lítio (1 equivalente, 2 metoxietanol/água : 9/1 em vol ). A evaporação do solvente e a acidificação proporcionam o composto do 19 título.

Fase D : Ν-ΓΝ-fosfonometil-L-leucin-DL-homotriptofano

Obtém-se o composto do título mediante hidrogenação de N-(N-dibenzil-oxifosfmilmetil-L-leucil)-DL-homotriptofano seguindo um processo descrito para a preparação deN-(N-fosfonometil-L-leucil)-L-triptofano (Exemplo 1). EXEMPLO 5

w

Ester etílico do N-rN-(di-fpivaloiloximetil)-fosfonin-leucill-L-tríptofano

Fase A :

Ester etílico do N-(N-fosfonometil-L-leucil)-L-triptofano

Trata-se uma solução de éster etílico do N-(N-dimetilfosfonometil)-L--leucil)-L-triptofano com brometo de trimetilsililo em cloreto de metileno à i temperatura ambiente. Concentra-se a mistura e trata-se o resíduo com água, filtra-se e seca-se para se obter o composto do título.

Fase B : 20 20

Éster etílico do N-rN-fdi-fpivaloiloximetiD-fosfoniD-leuciU-L-triptofano

Arrefece-se à temperatura de 0°C e trata-se com bis-trimetilsililamida de potássio (2 equivalentes) uma solução de éster etílico de N-(N-fosfonometil-L--leucil)-L-triptofano e 18 coroa-6 em tolueno. Faz-se reagir a mistura durante 18 horas com pivalato de iodometilo (2 equivalentes). Adiciona-se acetato de etilo, lava-se a mistura com água, seca-se, concentra-se e cromatografa-se sobre gel de sílica para se obter o composto do título. EXEMPLO 6

Éster etílico do N-fN-pivaloiloximetiloxi-hidroxifosfinil-L-leuciO-L-triptofano

Arrefece-se à temperatura de 0°C uma solução de éster etílico de N-[N-(di-pivaloiloximetil)-fosfonil)-leucil]-L-triptofano em etanol e adiciona-se gota a gota 1 equivalente de hidróxido de sódio. Prossegue-se a agitação durante 15 minutos e neutraliza-se a mistura reaccional com 1 equivalente de ácido clorídrico IN. Concentra-se a mistura sob pressão reduzida, distribui-se o resíduo entre cloreto de metileno e água fria. Seca-se a camada orgânica e concentra-se sob vazio. Purifica-se finalmente o monoéster do ácido fosfónico mediante cromatografia intermitente sobre gel de sílica.

I EXEMPLO 7

Sal tripotássico do N-fN-fosfonometil-L-leucil)-DL-5-metiltriptofano

Fase A :

Ester benzilico do DL-5-metiltriptofano. cloridrato

Faz-se reagir 2,03 g de DL-5-metiltriptofano dissolvido em metanol com 2,17 g de dicarbonato de di-terc.-butilo e 1,02 g de trietilamina à temperatura ambiente durante 4 horas. Evapora-se a mistura reaccional e extrai-se com acetato de etilo/água. A acidificação até pH 2 da camada aquosa com ácido clorídrico diluído, a extracção com acetato de etilo, a secagem sobre sulfato de magnésio e a evaporação do solvente permitem obter o N-(terc-butoxicarbonil)-DL-5-metiltriptofano sob a forma de um sólido branco.

Faz-se reagir 2,72 g deste último composto solubilizado em uma mistura de cloreto de metileno e acetonitrilo (1/1, 100 ml) à temperatura de 0°C com diciclo--hexilcarbodiimida (1,80 g) e hidroxibenzotriazol, hidrato (1,31 g). Agita-se a mistura durante meia hora à temperatura de 0°C antes da adição de 0,97 g de álcool benzilico e 96 mg de 4-dimetilaminopiridina. Prossegue-se a agitação durante uma 22 semana à mistura ambiente e dilui-se a mistura com acetato de etilo após o que se filtra. A extracção com acetato de etilo e com ácido cítrico aquoso a 5 % seguindo-se uma lavagem da camada orgânica com bicarbonato de sódio aquoso e salmoura, secagem sobre sulfato de magnésio e evaporação do solvente permitiu obter um material bruto que se purifica sobre gel de sílica (230 - 240 Mesh, 90 g). A eluição com acetato de etilo/heptano : V« permitiu isolar o éster benzílico do N-terc--butoxicarbonil)-DL-5-metiltriptofano sob a forma de um sólido branco (1,08 g). Suspende-se este material em ácido fórmico e agita-se durante 5 horas à temperatura ambiente. Retoma-se o resíduo resultante a partir da evaporação do ácido fórmico numa mistura de metanol e ácido clorídrico diluído e evapora-se para se obter o composto do título sob a forma de um sólido branco.

Fase B :

Ester benzílico do N-rN-fterc.-butoxicarbomD-L-leucill-DL-S-metiltnptofano

Acopla-se hidrato de N-(terc.-butoxicarbonil)-leucina (249 mg) com éster benzílico do D-L-5-metiltriptofano, cloridrato (344 mg) utilizando trietilamina (152 mg) como base e diciclo-hexilcarbodiimida (209 mg) como reagente de acoplamento de acordo com o processo descrito no Exemplo 13, Fase A. Isola-se o material bruto sob a forma de um sólido branco (472 mg) que se recristaliza em 329 mg de uma mistura de acetato de etilo/heptano.

Fase C : N-L-leucil-DL-5-metiltriptofano

Cinde-se 321 mg de éster benzílico do N-[N-(terc.-butoxicarbonil)-L--leucil]-DL-5-metiltriptofano em ácido fórmico conforme descrito anteriormente. 23

Extrai-se o produto bruto com acetato de etilo e com carbonato de sódio aquoso. Lava-se a camada orgânica com salmoura e seca-se sobre sulfato de sódio. A evaporação do solvente permitiu obter 241 mg do composto do título sob a forma de um óleo.

Fase D :

Ester benzílico do N-rN-(dibenziloxifosfmilmetilVL-leucin-DL-5-metiltriptofano

Acopla-se dibenziloxifosfinilmetanol (171 mg) a éster benzílico do N-L-Ieucil-DL-5-metiltriptofano (240 mg) conforme descrito no Exemplo 1 para se obter um óleo amarelo que se purifica mediante cromatografia sobre gel de sílica (85 g). A eluição com acetato de etilo/heptano : 1/1 e acetato de etilo puro forneceu, após evaporação do solvente, 136 mg de um óleo amarelo. RMN 31P : CDCI3 δ (relativo a ext. H3PO4) multipletos a 26,9 e 26,7 ppm.

FaseE ,

Sal trinotássico de N-(N-fosfonometil-L-leucil)-DL-5-metiltriptofano A 113 mg do éster benzílico de N-[N-(dibenziloxifosfinilmetil)-L-leucil]--DL-5-metiltriptofano, dissolvido em 5 ml de acetato de etilo adiciona-se uma solução de 41 mg de bicarbonato de potássio em 5 ml de água e 30 mg de paládio a 10 % sobre carvão. Agita-se a mistura sob hidrogénio à pressão atmosférica e à temperatura ambiente durante a noite. Filtra-se a mistura e liofiliza-se para se obter o composto do título sob a forma de um sólido de cor bege (81 mg). RMN 31P : D20 δ (relativo a ext. H3P04)

Multipletos a 12,2 e 9,8 ppm.

24

Análise calculada para C19H25N3O6P3K, 2H20 C : 39,64 H : 5,08 N : 7,30

Encontrada C: 39,39 H: 5,30 N: 7,09 EXEMPLO 8 A fim de mostrar a eficácia dos presentes compostos como agentes anti--hipertensores, pode utilizar-se o seguinte protocolo.

Anestesiam-se ratos machos Sprague-Dawley (250 - 300 g) com uretano (1,25 g/kg, í.p ), suplementados conforme necessário. Inserem-se cateteres Tygon na artéria carótida direita principal e na veia femoral direita para controlar a pressão arterial e fornecer injecções de fármaco por via intravenosa, respectivamente. Deixa-se estabilizar a preparação durante 30 minutos antes de se iniciar o protocolo experimental. Controla-se continuamente a tensão arterial com um registador TA2000 Gould acoplado a um sistema de aquisição de dados (Datafíow de Crystal Biotech, U.S.A.).

Distribuem aleatoriamente os ratos para serem tratados previamente com uma injecção de uma pílula grande por via i.v. (100 μ.1/100 g, descarregada com 0,3 ml de soro fisiológico) de ou soro fisiológico ou uma dose (compreendida entre 1 e 100 pmol/kg) de fosforamido, ou dos compostos de acordo com a presente invenção. Cinco minutos mais tarde, administra-se Pro-ETl (1 nmol/kg) sob a forma de uma injecção de pílula grande intravenosa (10 μΙ/100 g, descarregada com 0,3 ml de soro fisiológico) e registam-se as alterações na pressão arterial no decurso de 30 minutos. Para evitar qualquer artefacto, cada rato recebe apenas um tratamento e apenas uma dose de Pro-ETl. A Pro-ET-1 faz salientar a resposta hipertensiva e o

fosforamido inibe a mesma. Mede-se o composto da presente invenção contra a inibição do fosforamido.

Pode obter-se Pro-ETl humana/porcina a partir de Peptide Institute (Osaka, Japão) e dissolve-se em ácido acético a 0,1 % para se obter soluções de armazenagem IO-4 M, cujas concentrações exactas podem ser verificadas mediante espectrometria de absorção a 280 nm utilizando um coeficiente de extinção igual a 7245 M'1 cm'1. Distribui-se então entre alíquotas as soluções de armazenagem, liofilizam-se e armazenam-se à temperatura de -20°C. Volta a dissolver-se o péptido e dilui-se com soro fisiológico no dia da experiência. EXEMPLO 9 A fim de mostrar a eficácia dos compostos de acordo com a presente invenção no tratamento da hemorragia subaracnóide pode seguir-se o processo utilizado em Life Sciences 49 : 841-848 (1991). EXEMPLO 10 A fim de mostrar a eficácia dos compostos de acordo com a presente invenção no tratamento da asma, sensibilizam-se passivamente cobaias Hartley de qualquer sexo por injecção intracardíaca de um anti-soro preparado em coelhos (IgC) ou cobaias (IgC ou IgE) contra um antigénio específico (ovalbumina). Administram-se os compostos às cobaias sensibilizadas com via, dose e tempo de administração do composto dependentes do projecto experimental. Desafiam-se as cobaias mediante aerossolização da solução antigémca. Regista-se o tempo para a prostação a seguir à aerossolização e a incidência de mortalidade após 5 minutos. Os controlos negativos consistem em cobaias sensibilizadas passivamente que não --7^ Ç' 26 receberam qualquer tratamento e a incidência de letalidade neste grupo é geralmente de 90 a 100 %. A clorofeniramina e cipro-heptadina podem servir como controlos positivos.

EXEMPLOU A fim de mostrar a eficácia dos compostos de acordo com a presente invenção no tratamento do colapso cardíaco congestivo, pode seguir-se o processo utilizado em Circulation 82(6) ; 2226 - 2230 (1990). Este processo é modificado mediante tratamento prévio do animal em estudo com os compostos de acordo com a presente invenção. EXEMPLO 12

Para mostrar a eficácia do composto de acordo com a presente invenção no tratamento do colapso renal, pode seguir-se o processo utilizado em European Journal ofPharmacology 22\ : 77-83 (1992). EXEMPLO 13

Ensaio via formação de IP1 in viíro em fatias do cérebro do rato em (Endothelin Converting Enzyme (ECE)). Este ensaio mede a actividade enzimática responsável pela produção de ET-1 funcional a partir de pro-ET-1 mediante medição da estimulação da modificação de fosfatidil-inositol como um marcador dos efeitos de ET-1 :

RACIONAL

Encontra-se bem estabelecido que a endotelina-1 (ET-1) pode estimular, numa maneira dose-dependente, a queda do fosfatidil-inositol via a activaçâo dos receptores ET (Masaki et al,. Circulation, 84:1457, 1991). O precursor de ET-1, i.e.,

proendotelina-1 (pro-ET-1), é incapaz de estimular a queda de fosfatidil-inositol a menos que ele seja cindido por uma protease sensível ao fosfoamido específico, isto é, a enzima conversora da endotelina (ECE). Sabe-se que o tecido do cérebro contém ambos os receptores ET-1 e também ECE (Gulati e Srimal, Drug Devei. Res., 26.361, 1992). Para este ensaio, utiliza-se uma adaptação do processo de Brown et al., J. Neurochem., 42:1379, 1984.

PROCESSO

Preparação do péptido

Obtiveram-se ET-1 e pro-ET-1 humana/porcina a partir de Peptide Institute (Osaka, Japão) e dissolveram-se em uma solução de ácido acético a 0,1 % para se obter uma solução de armazenagem 10‘4 Μ. A concentração exacta destas soluções foi verificada por espectrofotometria de absorção a 280 nm, utilizando a equação C = A / L ε28ο [na qual C representa a concentração do péptido em solução, A a absorção medida, L o trajecto óptico da solução e ε2«ο o coeficiente de extinção do péptido em solução (8370 e 7025 M^cm'1 para pro-ET-1 e ET-1, respectivamente)]. Distribuíram-se por alíquotas as soluções de armazenagem, liofilizaram-se e armazenaram-se à temperatura de -20°C. Voltaram a dissolver-se os péptidos e diluíram em água no dia da experiência (prepararam-se também péptidos para outros ensaios por este método).

Preparação do tecido

Atordoaram-se ratos machos (Charles River, França), 200 - 300 g, decapitaram-se e removeu-se rapidamente o cérebro para uma placa de vidro. Dissecou-se rapidamente o estriato livre de tecido circundante e deixou-se no disco de plástico de um cortador de Mcllwain. Para preparar fatias transversais, cortaram-se os tecidos em fatias com uma espessura de 0,35 mm, rodaram-se de 90° e cortaram-se uma segunda vez. Suspenderam-se as fatias em tampão fisiológico (em mM: NaCL 118, KC1 5,0, CaCl2 1,3, KH2P04 1,0, MgS04 1,2, NaHC03 2, glicose 10, gaseados continuamente com carbogéneo) e utilizaram-se nos ensaios para a formação induzida por pro-ETs e ETs de fosfatos de inositol.

Estimulação da quebra de fosfatidil-inositol por pro-ET-1

Suspenderam-se fatias do cérebro de 6 ratos em tampão gaseado continuamente com carbogéneo. Durante os 60 minutos do período de pré-incubação, mantiveram-se as fatias num conjunto de recipientes num banho de agitação à temperatura de 37°C e agitaram-se suavemente para evitar que as mesmas se depositem. Mudou-se o tampão de 15 em 15 minutos. Durante este intervalo de tempo, colocaram-se 500 μΐ de resina (ver abaixo) numa coluna pequena e lavou-se com água até o pH do efluente ser neutro. Misturou-se o volume apropriado de [3H]-w/o-inositol com um pequeno volume de água e fez-se passar através da coluna. Enxagua-se então a resina com uma quantidade de água suficiente para se obter o volume total eluído de [3H]-/w/o-inositol para a concentração desejada.

Distribuíram-se fatias individuais em frascos de fundo achatado de 5 ml contendo cloreto de lítio 5 mM. Adicionou-se uma alíquota de [3H]-/w/o-inositol purificado a cada frasco até uma concentração final de 0,1 μΜ e incubaram-se os tecidos durante 30 minutos à temperatura de 37°C num banho de agitação. Adicionaram-se antagonistas para se atingir a concentração final de 10° M, nos frascos apropriados, 15 minutos antes da adição de IO"6 M de pro-ET-1, 29 adicionaram-se volumes iguais de tampão/solvente aos frascos de controlo. Após cada adição, agitaram-se no ciclone suavemente os frascos, lavaram-se com descarga de carbogéneo, taparam-se e voltaram ao banho de agitação à temperatura de 37°C. Interromperam-se as reacções após 30 minutos de incubação com pro-ET-1 pela adição de 940 μΐ de clorofórmio/metanol (1:2, v/v) e agitaram-se vigorosamente no ciclone as amostras. Adicionou-se mais clorofórmio e água (310 μΐ cada) a cada frasco e separaram-se as fases mediante centrifugação. Recolheu-se uma alíquota de 750 μΐ da fase aquosa para quantificar a formação de monofosfatos de [3H]-m/o-inositol ([3H]-IP1).

Nestas condições a quebra de estimulação de fosfatidil-inositol pelo pro-ET-1 pode ser controlada pela medição da quantidade de [3H]-IP1 acumulado.

Separou-se o [3H]-IP1 do [3H]-/w/o-inositol mediante cromatografia de permuta aniónica. Instalaram-se uma centena de colunas cromatográficas BioRad Econo-column (0,7 x 15 cm) num suporte de perspex de modo que cada coluna podesse ser eluída directamente numa roda de frascos de contagem de cintilação de 20 ml. Cada coluna continha 1 ml de uma suspensão a 50 % de resina AG 1-X8, 100 - 200 mesh, forma formato. Distribuíram-se os tampões de eluição utilizando uma bomba peristáltica disposta para lavar 20 colunas de uma só vez. Antes da adição da fase aquosa, lavou-se a resina nas colunas três vezes com 10 ml de trisformato 10 mM, pH 7,4. Após adição da fase aquosa, lavou-se cada coluna duas vezes com 10 ml de água destilada seguida por 10 ml de formato de amónio 60 mM com tetraborato de sódio 5 mM; eliminaram-se os diluentes. Elui-se ο IP1 em frascos de cintilação com 8 ml de formato de amónio 0,2 M em ácido fórmico 0,1

M. Subsequentemente, regenerou-se a resina mediante lavagem com 10 ml de formato de amónio 1 M em ácido fórmico 0,1 M seguindo-se por três vezes com 10 ml de ácido fórmico 2M. Taparam-se as colunas e encheram-se com ácido fórmico 2M. Quantificou-se o trítio eluido das colunas utilizando um contador de cintilação líquida (dpm). A resina AG 1-X8 foi lavada descontinuamente antes da utilização tal como descrito por Kakamoto e Armstrong, J Biol. Chenu, 237:208, 1962. Neste processo de lavagem, substitui-se o ácido clorídrico por ácido fórmico e, após lavagem com acetona, secou-se a resina durante alguns minutos e voltou-se a suspender em ácido fórmico 1M, 1:1, peso/volume e armazenou-se à temperatura de 4°C.

ANÁLISE DOS RESULTADOS

Em cada experiência, realizaram-se as medições em triplicado.

Determinaram-se valores em branco (ausência de tecido) e básicos (não estimulados) e subtrairam-se de todas as alterações medidas do IPL A fim de padronizar as observações, calculou-se a actividade de 25 μΐ de [3H]-m/o-inositol (IM, em dpm) para cada experiência e mediram-se as alterações de IP1 que foram multiplicadas pelo factor 106/IM. Os valores finais foram então expressos como percentagem média (de pelo menos 3 observações) da resposta máxima induzida por pro-ET-1 IO-6 M na ausência de inibidor.

Quando um composto, para 10° M induziu mais do que 50 % de inibição do efeito mediado por pro-ET-1, construiu-se então uma curva completa de dose-resposta com este inibidor, e a sua CI50 (concentração que inibe 50 % do efeito 31 317<.f^ --1) . de pro-ETl ÍO^M) foi determinada graficamente. Neste caso, é também importante saber a influência de um tal composto sobre o efeito de ET1, e construiu-se uma curva de dose-resposta do composto contra ET1 ÍO^M, utilizando a mesma técnica experimental descrita para a pro-ET-1. A concentração que reduz de 50 % o efeito de ET1 ÍO^M (RC50) foi então determinada graficamente.

Quando um composto, para a dose de 3 x 10‘5M, não reduziu de mais do que 50 % os efeitos de pro-ET-1 ou ET-1, este composto foi caracterizado com uma CI50 ou RC50 >30 pm e registou-se a percentagem máxima de redução observada.

Por exemplo, para o fosforamido (composto de referência), CI50 = 6,4 ±1,1 μΜ e RC50 > 30 μΜ com 75 ± 9 % de redução máxima.

Para as aplicações farmacológicas de uso final, os compostos de fórmula geral I são administrados de preferência sob a forma dos seus sais de adição de ácido aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Como é evidente, a dose eficaz dos compostos variará de acordo com a indicação para uso, a potência individual de cada composto utilizado, a gravidade e a natureza da doença a ser tratada e o sujeito particular a ser tratado. De uma maneira geral, podem conseguir-se resultados eficazes pela administração de um composto para uma dosagem compreendida entre cerca de 0,01 mg e cerca de 20 mg por quilograma de peso do corpo por dia, administrado sistematicamente. A terapia deve ser iniciada para dosagens mais baixas. A dosagem seguinte pode ser administrada por via oral em formas de dosagem sólidas, por exemplo, cápsulas, comprimidos ou pós, ou em formas líquidas, por exemplo, soluções ou suspensões. Os compostos podem também ser injectados por via parentérica sob a forma de soluções ou suspensões estéreis. 32

Na prática do método de acordo com a presente invenção, incorpora-se de preferência o ingrediente activo em uma composição que compreende o veículo farmacêutico e entre cerca de 5 e cerca de 90 % em peso de um composto de acordo com a presente invenção com um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A expressão “veículo farmacêutico” refere-se a excipientes farmacêuticos úteis na formulação de compostos activos sob o ponto de vista farmacêutico para administração interna a animais e que são substancialmente não tóxicos e não sensíveis nas condições de utilização. Pode preparar-se as composições por técnicas conhecidas para a preparação de comprimidos, cápsulas, elixires, xaropes, emulsões, dispersões e pós molháveis e efervescentes, e podem conter excipientes apropriados conhecidos como sendo úteis na preparação do tipo particular de composição desejada. A via preferida de administração é a administração oral. Para a administração oral pode formular-se os compostos de fórmula geral I em preparações sólidas ou líquidas tais como cápsulas, pastilhas, comprimidos, trociscos, losangos, produtos fundidos, pós, soluções, suspensões ou emulsões. As formas de dosagem unitárias sólidas podem ser uma cápsula que pode ser do tipo de gelatina ordinária dura ou com invólucro macio que contém, por exemplo, agentes tensioactivos, lubrificantes e cargas inertes tais como lactose, sacarose, fosfato de cálcio e amido de milho. De acordo com uma outra forma de realização, os compostos de acordo com a presente invenção podem ser transformados em comprimidos com bases convencionais para comprimidos tais como lactose, sacarose e amido de milho em associação com ligantes tais como acácia, amido de

33 milho ou gelatina, agentes desintegrantes destinados a facilitar a ruptura e a dissolução do comprimido a seguir à administração tais como amido de batata, ácido algínico, amido de milho e goma guar, lubrificantes destinados a melhorar o fluxo das granulações do comprimido e impedir a adesão do material do comprimido às superfícies dos moldes e punções do comprimido, por exemplo, talco, ácido esteárico, ou estearato de magnésio, cálcio ou zinco, corantes, agentes de coloração e agentes aromatizantes destinados a melhorar as qualidades estéticas dos comprimidos e tomá-los mais aceitáveis pelo paciente. Excipientes apropriados para utilização nas formas de dosagem líquidas ou orais incluem diluentes tais como água e álcoois, por exemplo, etanol, álcool benzílico e polietileno-álcoois, quer com ou sem a adição de um agente tensioactivo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, um agente suspensor ou um agente emulsionante.

Os compostos de fórmula geral I de acordo com a presente invenção podem também ser administrados por via parentérica ou seja, por via subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal, sob a forma de dosagens injectáveis do composto em um diluente aceitável sob o ponto de vista fisiológico com um veículo farmacêutico que pode ser um líquido estéril ou uma mistura de líquidos tais como água, soro fisiológico, dextrose aquosa e soluções de açúcar afins, um álcool tal como etanol, isopropano, ou álcool hexadecílico, glicóis tais como propileno-glicol ou polietileno-glicol, glicero-cetais tais como 2,2-dimetil-l,3--dioxolano-4-metanol, éteres tais como polietileno-glicol 400, um óleo, um ácido gordo, um éster ou glicerido de ácido gordo ou um glicerido de ácido gordo acetilado com ou sem a adição de um agente tensioactivo aceitável sob o ponto de

34 vista farmacêutico tal como um sabão ou um detergente, um agente suspensor tal como pectina, carbómeros, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose ou carboximetilcelulose, ou agentes emulsionantes e outros adjuvantes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Ilustrativos de óleos que podem ser utilizados nas formulações parentéricas de acordo com a presente invenção são os que têm origem no petróleo ou são de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo de sésamo, óleo de sementes de algodão, óleo de milho, azeite, petrolato e óleo mineral. Os ácidos gordos apropriados incluem ácido oleico, ácido esteárico e ácido isosteárico. Os ésteres de ácido gordo apropriados são, por exemplo, oleato de etilo e miristato de isopropilo. Os sabões apropriados incluem sais de metal alcalino gordo, de amónio e de trietanolamina e os detergentes apropriados incluem os detergentes catiónicos, por exemplo halogenetos de dimetildialquil-amónio, halogenetos de alquil-piridínio; detergentes aniónicos, por exemplo, sulfonatos de alquilo, arilo e olefina, sulfatos de alquilo, olefina, éter e monoglicerido bem como os sulfossuccinatos respectivos; detergentes não iónicos, por exemplo, óxidos de amina gorda, alcanolaminas de ácido gordo e copolímeros de polioxietilenopolipropileno; e detergentes anfotéricos, por exemplo, beta-amino-propionatos de alquilo e sais de amónio quaternário de 2-alquilimidazolina, bem como as suas misturas. As composições parentéricas de acordo com a presente invenção conterão tipicamente entre cerca de 0,5 e cerca de 25 % em peso dos compostos de fórmula geral I em solução. Podem também utilizar-se com vantagem conservantes e tampões. Com o objectivo de minimizar ou eliminar a irritação no local da injecção, tais composições podem conter um agente tensioactivo não tónico tendo um equilíbrio hidrófilo-lipófilo (HLB) compreendido entre cerca de 12 e cerca de 17. A quantidade de agente tensioactivo em tais formulações varia entre cerca de 5 e cerca de 15 % em peso. O agente tensioactivo pode ser um componente individual tendo o HLB anterior ou pode ser uma mistura de dois ou mais componentes tendo o HLB desejado. Ilustrativos de agentes tensioactivos utilizados em formulações parantéricas são a classe de ésteres de ácido gordo de polietileno-sorbitano, por exemplo, monooleato de sorbitano e os produtos de adição de peso molecular elevado de óxido de etileno com uma base hidrófoba formada a partir da condensação de óxido de propileno com propileno-glicol.

Os compostos de acordo com a presente invenção podem ser administrados igualmente por via tópica. Esta pode ser conseguida mediante preparação simplesmente de uma solução do composto a ser administrado, utilizando de preferência um solvente conhecido como promovendo a absorção transdérmica tal como o etanol ou o sulfóxido de dimetilo (DMSO) com ou sem outros excipientes. A administração tópica de preferência será conseguida utilizando um emplastro quer do tipo reservatório e com membrana porosa ou de uma variedade de matriz sólida.

Alguns dispositivos transdérmicos apropriados encontram-se descritos nas patentes de invenção norte-americanas N° 3 742 951, 3 797 494, 3 996 934 e 4 031 894. Estes dispositivos contêm geralmente um elemento de costas que define uma das suas superfícies, uma camada adesiva permeável ao agente activo que define a outra face superficial e pelo menos um reservatório que contém o agente activo entreposto entre as superfícies das faces. Como alternativa, o agente activo 36 36

pode encontrar-se contido numa pluralidade de microcápsulas distribuídas através da camada de adesivo permeável. Em qualquer caso, o agente activo é fornecido continuamente a partir do reservatório das microcápsulas através de uma membrana para o adesivo permeável ao agente activo que se encontra em contacto com a pele ou com a mucosa do recipiente. Se o agente activo for absorvido através da pele, administra-se um fluxo controlado e pré-determinado do agente activo ao recipiente. No caso de microcápculas, o agente de encapsulação pode também funcionar como membrana.

Num outro dispositivo para a administração transdérmica dos compostos de acordo com a presente invenção, o composto activo sob o ponto de vista farmacêutico encontra-se contido numa matriz a partir da qual ele é fornecido com a velocidade gradual desejada, constante e controlada. A matriz é permeável à libertação do composto mediante difusão ou fluxo microporoso. A velocidade de libertação é controlada. Um tal sistema, que não requer qualquer membrana encontra-se descrito na patente de invenção norte-americana N° 3 921 636. São possíveis pelo menos dois tipos de libertação nestes sistemas. A libertação por difusão ocorre quando a matriz é não porosa. O composto eficaz sob o ponto de vista farmacêutico dissolve-se e difunde-se através da matriz propriamente dita. A libertação por fluxo microporoso ocorre quando o composto eficaz sob o ponto de vista farmacêutico é transportado através de uma fase líquida nos poros da matriz.

Os compostos de acordo com a presente invenção podem ser incorporados numa preparação de aerossol por meios vulgarmente conhecidos dos especialistas na matéria. A preparação de aerossol pode ser preparada para uso como

« 37 « 37 \ um aerossol tópico ou pode ser preparada para inalação. A preparação de aerossol pode encontrar-se sob a forma de uma solução ou de uma suspensão e pode conter outros ingredientes tais como solventes, agentes propulsores e/ou agentes dispersantes. Exemplos típicos de preparações de aerossol encontram-se ilustrados em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania, pp. 1694 - 1712 (1990).

Como acontece com a maior parte das classes de compostos apropriados para utilização como agentes terapêuticos, preferem-se alguns subgrupos genéricos e alguns compostos específicos. Neste caso aqueles compostos que são preferidos têm o símbolo Rt a representar um átomo de hidrogénio, o símbolo R2 sem qualquer significado e o símbolo Rg a representar uma molécula de hidrogénio, o símbolo R3 a representar um átomo de hidrogénio ou um grupo (CH2)-anlo, o símbolo Z a representar um grupo iso-butilo e o símbolo n a representar 0 número 1.

Lisboa, 1 de Junho de 2000

Rua do Salitre, 595, r/c-Drt 1250 LISBOA

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula geral :

H Fórmula I estereoisómeros, hidratos, sais internos ou os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, na qual os símbolos Ri ou R2 representam, cada um, independentemente, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo Ci-C6, (CH2)m-arilo, R4-C(0)0-CH(R5)- ou não têm qualquer significado quando se forma o sal interno, com a condição de quando um dos símbolos Rj ou R2 representa um átomo de hidrogénio, um grupo alquilo CrC6 ou um grupo de fórmula geral (CH2)m-arilo, então o outro representa um átomo de hidrogénio ou não tem qualquer significado quando se forma o sal interno; o símbolo R3 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo Ci-C6, (CH2)m-cicloalquilo ou (CH2)m-arilo; o símbolo R4 representa um grupo alquilo Ci-C10, (CH2)m-cicloalquilo ou (CH2)m-arilo; o símbolo R5 representa um grupo alquilo Ci-C6, (CH2)m-cicloalquilo ou hidrogénio; o símbolo Ré representa um átomo de hidrogénio ou H2, quando um dos símbolos Ri ou R2 não tem qualquer significado formando-se assim o sal interno; o símbolo R7 representa CH3 ou H; o símbolo Rg representa H, Br, CH3 ou OCH3, com a condição de um dos símbolos R7 ou R8 representar um átomo de hidrogénio; o símbolo Z representa um grupo (CH2)m-arilo ou alquilo CpCi2; o símbolo X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo Ci-C6; cada um dos símbolos m representa independentemente um número igual a 0, 1,2 ou 3, e o símbolo n representa o número 1, 2 ou 3. em que “cicloalquilo” na definição dos símbolos R! - R5 é um anel saturado em C3-Cg e “arilo” significa fenilo, naftilo, tetra-hidronaftilo ou indanilo, sendo os referidos grupos cicloalquilo ou arilo substituídos ou insubstituído por um, dois ou três substituintes escolhidos independentemente de entre grupos alquilo CrC6, haloalquilo, alcoxi, tioalcoxi, amino, alquilamino, dialquilamino, hidroxi, halo, mercapto, nitro, carboxaldeído, carboxi, carbalcoxi e carboxamida.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o símbolo Ri representar um átomo de hidrogénio.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o símbolo R2 não ter qualquer significado e o símbolo R$ representar H2.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o símbolo R3 representar um átomo de hidrogénio ou um grupo (CH2)-arilo.

5. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto i de o símbolo Z representar um grupo iso-butilo.

6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o símbolo X representar um átomo de hidrogénio.

7. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o composto ser o N-(N-fosfonometil-L-leucil)-L-triptofano.

8. Composição farmacêutica que compreende o composto de acordo com a reivindicação 1 com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

9. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de uma composição farmacêutica para inibir a Enzima Conversora da Endotelina (“Endothelin Converting Enzyme”) em um paciente com necessidade de uma tal terapia.

10. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o composto ser o éster benzílico de N-(N-benziloxi-hidroxifosfmilmetil-L-leucil)--L-triptofano.

11. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o composto ser o N-(N-benziloxi-hidroxifosfmihnetil-L-leucil)-L-triptofano.

12. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o composto ser o N-(N-fosfonometil-L-leucil)-DL-homotriptofano.

13. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o composto ser o éster dietílicodoN-[N-(di-(pivaloiloximetil)-fosfonil)-L-leucil]-L--triptofano.

14. Composto de acordo com a reivindicação l, caracterizado pelo facto

4 de o composto ser o éster etílico do N-(N-pivaloiloximetiloxi-hidroxifosfinil-L--leucil)-L-triptofano.

15. Processo para a preparação de um composto de fórmula geral I de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de compreender as fases que consistem em : substituição do grupo eliminável (L) do composto fosfónico de fórmula geral (3) pelo dipeptido de fórmula geral (4)

(3) Z X O (4) em que os símbolos Rr e Rr representam, cada um, um grupo alquilo CrC6, (CH2)m-arilo, R4-C(0)0-CH(R5)-, ou qualquer outro grupo protector apropriado se subsequentemente desprotegido, e o símbolo R3’ representa um grupo alquilo Ci-C6, (CH2)m-cicloalquilo, (CH2)m-arilo ou qualquer outro grupo protector apropriado se subsequentemente desprotegido, para produzir o dipeptido de fórmula geral (1.1), R,

(1.1) ?iA 5 e a desprotecção eventual em qualquer de R/, R2’ ou R3’ de modo que Ri’ = Ri, R2’ = R2 e R3’ = R3, em que os símbolos Z,Xen têm os significados definidos antes; ou, altemativamente, a desesterificação do éster de fórmula geral (7) na presença de uma base na qual os símbolos Z, Ri’ e R2’ têm os significados definidos antes e o símbolo R4’ representa qualquer grupo protector apropriado,

(7) e o acoplamento com o aminoéster de fórmula geral (8) na qual os símbolos R3\ X e n têm os significados definidos antes

X O (8) para se obter o fosfonometil-dipeptido protegido de fórmula geral (11) 6

e a desprotecção eventual em qualquer de Rj-, R2· e R3·, de modo que Ri — Ri, R2’ - R2 6 R3’ ~ R3. Lisboa, 1 de Junho de 2000

1 RESUMO “FOSFONOMETILDIPEPTIDOS” Dipeptidos e os seus análogos tendo um radical fosfonometilo ligado aos mesmos que inibem a Enzima Conversora da Endotelina e são assim úteis no tratamento de condições responsivas das mesmas. Lisboa, 1 de Junho de 2000