PT96283A

PT96283A - Metodos de utilizacao de 2-isopropil-2-fenilaminovaleronitrilos como imunossupressores e vasodilatadores

Info

Publication number: PT96283A
Application number: PT96283A
Authority: PT
Inventors: Chi-Dean Liang; Richard August Mueller; John P Mckearn; Terry B Strom; Kenneth J Wieder
Original assignee: Searle & Co
Priority date: 1989-12-21
Filing date: 1990-12-20
Publication date: 1991-09-30
Also published as: ES2054207T3; DE69001240D1; EP0434094B1; CA2033038A1; JPH04210632A; GR3008320T3; DE69001240T2; EP0434094A1; IE64870B1; DK0434094T3; ATE87614T1; IE904627A1

Description

Fundamento do Invento 0 presente invento proporciona novos métodos de utilização de novos compostos e composições, sendo estes compostos farmacolosicamente úteis como anti-hipertensivos e para a imunos-supressão de um mamífero e sendo especialmente úteis para a imu-nossupressão num mamífero em conjunção com a administração de outros medicamentos de imunossupressão, especialmente a ciclospo-r i na (também c onheci da por c i c1ospori na A >.

Mais especificamente, o método do presente invento ê causar a imunussupressão pela administração de uma classe de 2--isopropi 1-2-f eni 1-5--( f eneti 1 arnino>va 1 eroni tr i 1 os, sendo substituídos na porção feneti lamino.

Us compostos do presente invento estão estruturalmente relacionados com o verapam.il, que é conhecido por ser um bloquea-dor de canal de ião misto para os canais de cálcio e de potássio. 4

Campo do Invente· A imunossupressão é uma técnica necessária nos campos da transplantação de órgão e de medula óssea. Os agentes de imu-nossupressSo são utilizados para a profilaxia e tratamento da rejeição do órgão ern transplantes alogeneicos (transplantes entre indivíduos da mesma espécie, mas não geneticamente idênticos.'». Uma tal terapia ajuda a prolongar a sobrevivência dos transplantes do rim, fígado e coração, bem como dos transplantes de extensão inferior do pâncreas, transplantes de coração-pulmão e transplantes de medula óssea. Esta imunossupressão é necessária de modo a alterar as reacçóes do sistema imune à presença do órgão ou do tecido estranho, gue resultará normalmente na rejeição e destruição indiscriminada pelo sistema imune do hospedeiro do órgão ou do tecido transplantado. A ciclosporina A é um agente imunossupressor particular-mente eficaz na profilaxia e tratamento da rejeição do órgão. A ciclosporina A é um elemento de uma família de compostos e é um undecapeptídeo hidrofôbico produzido pelo fungo Tolypocladium inflatum gams. Outras ciclosporinas incluem a ciclosporina B e a ciclosporina G. A ciclosporina A suprime a imunidade humural assim como as reacçóes mediadas por célula. A ciclosporina A está indicada para a rejeição de órgão em transplantes de rim, fígado, coração, pâncreas, medula óssea e coração-pulmão. A ciclosporina A é também útil no tratamento da doença de Crohn, oftalmopatia de Graves, psoríase severa, anemia aplástica, escle-rose múltipla, alopecia areata, e pênfigus e penfigóide, dermato— mi os .1 te, pol i mi os i te, doença d© Bechet, uveíte, sarcocidiose pul-munar, cirrose biliar, miastenia gravis e dermatite atôpica.

Inf©lizmente, a ciclosporina A pode provocar toxicidade renal e hepática, causando significativos danos no rim e fígado 5 dos pacientes que recebem transplantes de órgãos, incluindo danos para o próprio fígado transplantado se o processo for um transplante de rim. Por conseguinte, é um objectivo do presente invento proporcionar um método de administração de uma classe de compostos que, quando administrados a um mamífero, efectivem a imu-riossupressão e exibam ainda uma toxicidade significativamente inferior do que a da administração da ciclosporina. é" um outro objectivo do presente invento proporcionar uma classe de compostos que, quando administrados a um mamífero simultaneamente com uma cdclosporina ou outros imunossupressores, actuern de uma maneira sinergística para baixar a dosagem de uma ciclosporina ou outro imunossupressor necessária para se alcançar um dado nível de imunossupressão, diminuindo desta maneira a possibilidade de causar toxicidade pela ciclosporina ou outro imunossupressor. Os outros imunossupressores incluem levamisol, corti-costerôides, drogas não-esterôides anti—inflamatórias (NSAIDSi, certas prostaglandinas e o macrólido FK-506 ÍFujisawa). 0 presente invento proporciona um novo método de administração de novos 2-isopropil-2-fenil-5-Cfenetilamino)valeronitri-los substituídos, que se mostram eficazes como agentes de ireunos-supressão em virtude da sua capacidade em inibir a produção de interleucina, inibindo em consequência disso os 1infobiastos T e, por conseguinte, a proliferação da célula T. A inibição da proliferação da célula T bloqueará por sua vez a activação dos limfó-eitos citotóxicos T, um passo chave na resposta imune de um mamífero normal. 0 presente invento ainda proporciona o facto de que os compostos têm aqui actividade e utilidade como anti-hipertensivos sistémicos, actividade vasodilatadora selectiva do local útil no tratamento da isquemia renel e isquemia cerebral. 0 mecanismo de

acçáo para as actividades imunolôgicas dos compostos do presente invento é pensada no sentido de ser independente da actividade de bloqueamento do canal de cálcio dos compostos.

Su má r i. o do I nven to Q invento refere-se a um novo método de admni straç&o de novos compostos de fórmula de estrutura gerai I;

e dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que

Rj representa hidrogénio; hidroxi;

Ca*'bono Sut>Stityin. alquilo, alcenilo ou alcinilo de 3. até 10 átomos de substituído ou náo substituído, em que o referido te ê hidroxi ou ceio; alquiIcarbonilo de i até 10 átomos de carbono; alcoxicarbonilo de 1 até 10 átomos de carbono; ou alquilamido de 1 até 10 átomos de carbono; R-,/ R~., R_ e R, representam independentemente bidrox 5 “ ”6 de i até 10 átomos de carbono; e ou «Icoí o.vj. alce- **4 e R7 representam independentemente hidrogénio; alqui j,-nilo ou alcinilo de 1 até 10 átomos de carbono; rft ó um inteiro desde 1 até 2, inclusive; e n é um inteiro desde 1 até 5, inclusive. 7

Ufft enc orporamento mais preferido do presente invento refere—se à admnistração de novos compostos de fórmula de estru— tura geral II:

N

e dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, eis gue

Rj representa hidrogénio; hidroxi; alguilo, alcenilo ou alcinilo de i até iO átomos de carbono substituído ou não substituído, em gue o referido sufostituin-te é ceto ou hidroxi; alguilcarbonilo de i até 10 átomos de carbono; ou alguilamido de 1 até 10 átomos de carbono.

Os compostos e as suas composições farmacêuticas são úteis nos métodos de imunossupressão do invento. O invento proporciona também para administração formas unitárias de dosagem para administração oral, tópica e parentérica. Ainda proporcionada neste invento é a administração dos sais farmeceuticamente aceitáveis dos compostos, para a imunossupressão.

Descrição Detalhada do Invento

Quando agui utilizadas, as expressões "alguilo", "alce— nilo" e "alcinilo" são definidas de modo a incluírem ligações j. até 10 átomos de carbono-carbono lineares ou ramificadas de carbono com 1 ou mais graus de insaturação.

Os termos "alquiIcarbonilo" e "alcoxicarbonilo" são definidos de modo a incluírem porções alquilo, alcenilo e alcini-lo como acima se definiram. 0 termo "alqui1amido" é definido de modo a incluir porções alquilo, alcenilo e alcinilo como acima se definiram. 0 termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais não tóxicos dos compostos deste invento que são geralmente preparados pela reacção da base livre com um ácido inorgânico ou orgânico adequado ou pela reacção do ácido com uma base adequada. Os sais representativos incluem os seguintes sais;

Acetato

Benzenossulfonatc

Benzoato

Bicarbonato

Bissulfato

Bi tartarato

Borato

Brometo

Edetato de cálcio

Carnsi lat-o

Carbonato

Cloreto

Clavuianato

Citrato

Di~hidrocloreto

Edetato

Edisilato

Esilato

Estolato

Fumarato

Gluceptato

Sluconato õlutamatc SIicolilarsanilato HexiIresorc inato Hidrabamina

Lac t ob i ona. to Laurato Halato Maleato Mandelato Mesi1ato Meti 1brometo Meti 1nitrato MetiIsulfato Mucato Naps i1ato Ni trato Oleato Oxalato

Pamoato ( Ernbonato >

Pa1mi tato

Pan to t-ena to

Fcsfato/difosfato

Poligaiac turonato

Salácilato

Estearato

Subaceiato

Succinato

Sul fato

Tanato

Tartarato 9 9 Teoclato Tosilato Trietiodeto Vaierato

Hidrobrometo Hidrocloreto Hidroxinaftoato Iodeio Isetionato Lactato

Quando aqui utilizado, o termo "imunossupressSo" significará a diminuição controlada artificial ou a prevenção da resposta imune· de um mamífero. 0 termo "isquem!a" significará deficiência de sangue para uma parte do corpo, devida à consticção de um ou mais vasos sanguíneos. 0 termo "hipertensão" significará pressão sanguínea arterial pers istentemente e1evada. 0 termo "quantidade farmacologicamente eficaz" refrir--se-á àquela quantidade de droga ou agente farmacêutico que eli— citará a resposta biológica ou médica de um tecido, sistema ou animal que está a ser objecto de pesquisa de um investigador ou méd i c o. 0 termo "agente imunossupressor" incluirá ciclospori— nas A, 8 e Θ, corticosteróides, levamisol, drogas não-esteróides anti—inflamatórias e as prostaglandínas que exibem act-ividade imunossupressora.

Os compostos utilizados na prática do método imunossu-pressor do invento podem ser prontamente preparados de acordo com os esquemas de reacção seguintes, ou as suas modificações, utilizando processos de síntese convencionais e reagentes e materiais de partida prontamente disponíveis. Nestas reacçSes, é também

ΙΟ possível faser uso de variantes que são elas próprias conhecidas, mas não sã'o mencionadas em maior detalhe. η FXEMPLO 1

Es«iuema I

CH3'

Esquema II CH,

/° OHi DH3 ÇH3 -CH3

0·^ CH,

Pd(0Ac)2 CH3 ch.

/° CHf CH3

NaCI CH3'

*CH3 Η20=>γ0Η3 0

N

Esquema III

ch3oh CH3

14 Esquema IV

Pd(OAc)2

CO CH3CH2NH2

- 15 -

Nos esquemas anteriores, Ac indica uma porção COCH,_,; Ph indica uma porção fenilo.

Na realização da imunossupressão, os compostos do presente invento podem ser administrados em formas de dosagem oral como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Semelhantemente., eles também podem ser admnistrados de forma intravenosa, intraperito-neal, subcutânea ou intramuscular, todas formas de utilização conhecidas dos peritos habituais nas técnicas farmacêuticas.

Em geral, a forma preferida de administração é a oral. Uma quantidade eficaz mas não tóxica de um dos compostos reivindicados no novo método pode ser empregue como imunossupressora na .inibição da resposta imune de um mamífero ou no tratamento da hipertensão, isquemia renal ou isquemia cerebral. Um ©ncorpora-mento alternativo do presente invento é um novo método de administração de uma quantidade eficaz mas não tóxica de um ou mais dos referidos compostos em colaboração com quantidades eficazes, mas menores do que as previamente descritas, de uma ciclosporina num regime de terapia imunossupressora. 0 regime de dosagem do presente .invento é escolhido de acordo com uma variedade de factores incluindo o tipo, espécie, idade, peso, sexo e condição médica do paciente,* a severidade da condição a ser tratada] a via de admnis— tração; a função renal © hepática do pacientei e o composto particular ou o seu sal empregue. Um médico ou veterinário com perícia normal pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz da droga requerida para se alcançar a imunossupressão.

As dosagens dos compostos a utilizar nos métodos do presente invento, quando utilizados para os efeitos indicados, situar-se-ão numa gama desde cerca de 0,1 miligrama por quilograma de peso corporal por dia <mg/kg/dia) até cerca de 16 1,000 mg/kg/dia e preferivelmente 1,0-100 mg/kg/dia. Vantajosamente, os compostos utilizados no método do presente invento podem ser administrados numa dose única diária ou a dosagem total diária pode ser admnistrada em doses divididas de 2, 3 ou 4 vezes diárias.

Outrossim, os compostos preferidos utilizados no presente invento podem ser administrados em forma intranasal, via uso tópico de veículos intranasais adequados, ou via transdérmica, utilizando as formas de emplastros para pele transdérmicos bem conhecidas dos peritos habituais nesta técnica. Para serem administrados na forma de um sistema de entrega transdérmico, a adm-nistracêío será, certamente, continua ao longo de todo o regime de dosagem.

Nos métodos do presente invento, os compostos aqui descritos em detalhe podem formar o ingrediente activo e siío tipicamente admnistrados em mistura com diluentes, excipientes ou agentes de suporte Ccolectivamente referidos daqui em diante como materiais "agente de suporte") farmaceuticamente adequados, adequadamente escolhidos em relação à forma pretendida de administração, isto é, comprimidos, cápsulas, tinturas, xaropes e semelhantes orais, e consistentes com as práticas farmacêuticas convenciona i s.

Por exemplo, para admnistração oral na forma de um comprimido ou cápsula, a componente da droga activa pode ser combinada com um agente de suporte oral, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, inerte, tal como lactose, amido, sacarose, glicose, meti 1 celulose, estearato de magnésio, fosfato de dicálcio, sulfato de cálcio, manitol, sorbitol e semelhantes; para admnistração oral na forma líquida, as componentes da droga orais podem ser combinados com qualquer agente de suporte oral, não tóxico, 17 farmaceuticamente aceitável, inerte, tal como etanol, glicerol, água e semelhantes. Além disso, guando desejado ou necessário, podem também ser incorporados na mistura agentes ligantes, lubrificantes, agentes de desintegração e agentes de colorado adequados. Os ligantes adequados incluem amido, gelatina, açúcar natural tal como glicose ou S-lactose, agentes adoçantes de grão de cereal, gomas naturais e sintéticas tais como acácia, iragacanto ou alginato de sódio, carboximeti1celulose, polietileno-glicol, ceras e semelhantes. Os lubrificantes utilizados em tais formas de dosagem incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e semelhantes. Os agentes de desintegração incluem, sem limitação, amido, metiIcelulose, ãgar, benionite, goma xantana e semelhantes.

Os compostos utilizados no presente invento podem também ser administrados na forma de sistemas de entrega de liposso-ma, tais como vesículas uni lamelares pequenas, vesículas uni lamelares grandes e vesículas mui ti lamelares. Os lipossomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolápidos, tais corno colesterol, estearilamina ou fosfatidiIcolina.

Os compostos utilizados no presente invento podem também ser entregues pela utilização d© anticorpos monoclonais como agentes de suporte individuais aos quais as moléculas do composto são acopladas.

Os compostos utilizados no presente invento podem também ser acoplados com polímeros solúveis na forma de agentes de suporte de drogas rotuláveis. Tais polímeros podem incluir poli— viniIpirrolidona, copolímero de pirano, poli—hidroxipropiImeta— cri 1 amida—fenol, poli-hidroxietilaspartim.ida~f enol ou óxido de pol ieti leno—pol i. 1 isina substituída com resíduos de palmitoílo.

18

Além disso, os compostos podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis úteis para se alcançar a libertação controlada de uma droga, por exemplo, ácido poliláctico, ácido poligli-cólico, copolímeros de ácido poliláctico e ácido poliglicôlico, poli-í-caprolactona, ácido poli-hidroxibutírico, poliortoêsteres, poliacetais, polidi-hidropiranos, policianoacrilatos e copolímeros de bloco antipáticos ou de ligação cruzada de hidrogéis.

Os compostos utilizados no método deste invento exibem actividade de imunossupressão útil no tratamento da rejeição de órgãos transplantados. Os processos de teste empregues para medir esta actividade dos compostos são descritos a seguir.

1 q

EXEMPLO tr

Os espectros de RMN foram obtidos quer num espectróme-jh ,, XL—ZOO quer num STE—QE 300 num solvente conforme o *·' idj ^ g^çj __ c^m í,y.i como padrão interno. Os espectros de infra” ft®lho foram registados num espectrómetro Perkin-Elmer 685 em v&rjj. ^ ^ CHCl„

Processo geral para a preparação de; 2-(3,4-d i me tox i f em 1 3 -2- i βοργορ i 1--5-- C 3,4-d i metox i - ( 6--fenetil substituldo3metiiamino3valeronitrilo 250 (II) Esta A uma solução agitada de 2,5 mmoi de verapamil em rt,l de benzeno foi adicionado 30 mmol de acetato de paládio © a mistura de reacçâo foi agitada durante quatro dias. foi em seguida transferida para um aparelho gasométrico CR. P. Heck, J. A. C. 8., 83/ 1097 (196113, borbulhada com monôxido de carbono (00 3 e, à temperatura ambiente, com a adição de nucleó-filos (álcool, amina, reagentes de Srignard). Após quatro horas, a mistura de reacção foi filtrada e o solvente foi removido sob pressão reduzida. 0 resíduo foi cromatografado sobre gel de sílica. 20 EXEMPLO 3

/N/

CH /° CH^'CH3

ch3 CH,

Encontrado; 0 \ ch3 ao c omp1ex o de paládá·: :> tarbonil C - 67,01; H - 8,12; }\J - 5,24; C - 67,95; H — 7,86; N - 5,46. M.N. S 0,79 ( 3H , d, J=S, 6 Hz >; i , 18 < 3H d, J« 6, 6 Hz ) ] t 1 1, .1.9 (IHj , m) t 1,55-2 , 05 ( 3H, m); 2, 23 < 3H, s :>? 2,25-2,75 <7H, m>; 6,5- "6 i 8 < 4H , m') t “7 *T»C / 1 ·«.·© c 1H, CS *) * ’Ξ* » 1 ·-* : ΟΛ f wv <3H, s); 3,78 < 3H, s>; 3, O O o Cl ( 3H i s 3;89 C í 5H; b ) . IV 1718 cm 1 41 %. 21

EXEMPLO 4

OH

0=C \ c O composto em titulo foi preparado a partir da adido de ácido cítrico em éter à solução etérea do produto do Exemplo 3 em éter. 0 precipitado foi filtrado e seco.

Encontrado: ( :: " 60,11; H - 7,10; N - 3,99; requer; ( ”* MM ^ CT * H - 6,86; N ~ 3,97.

Pelo caminho do método acima descrito, um perito vulgar na técnica pode obter o sal do ácido 1,2,3—propanotricarboxí1ico ou o sal do ácido 2,3-di-hidroxifoutanodióico.

EXEMPLO 5

CH3

Pela adieSo de t~buti 1 ar.···ina ao bani lado obteve-se o composto em título, do composto em titulo foi obtido a parti saturado à solução etérea da base livre, foi seco. Gbt i do! 32 %. comp1êxo de paládio car-0 sal do ácido cítrico da adição á c i do c i t· r i c o O p r e c i p i tado r e c o1h i do A1 te r na t .1 vamen te, a adição de meti lamina em vez de t-bu- ti1amina produz i r â a corresponderte meti1amida.

Encontrado ; C - 62,72; H - 7,46; N - 6,08; Ct,,r,Hr.r.M..,0..requer ! o»-» oo ο» I C - 62,03] H - 6, 16; N - 5,71. R.M.N. S 0,75 C3.H, d, ,T=6,6 Hz); •J—6, 6 Hz); 1,46 (. 9H, s); 2,8 3,8 í < 3H , s); 3,83 í 9H, s); 6 1,16 <3H, d, <3H, s, N—me); 97-7,03 <4H, m); 7,36 (1H, s) ppm. XV 1715 t c .i trato ) 1640 2210 cm do c í ác id<

Pelo tricô, o método do Exemplo 4, pode ser obtido sal do ácido 1,23-iricar-boxi 1 ico o sal do ácΙου o sa1 do 2,3-di-hidroxibutanodióico. 24

EXEMPLO 6

Foi adicionado 4 g de verapamil (8,8 mrool} em 100 ml de benzeno a 2,2 g de PdCOAc?^ e a mistura de reacçSo foi agitada durante quatro dias è temperatura ambiente. Uma solução saturada de NaCl em .1.00 ml de 0H._, e 96 ml de acetona foi adicionado à solução resultante, que foi agitada à temperatura ambiente durante 15 minutos. 0 solvente foi em seguida removido sob pressão redu- *s* í Ha >Λ» Λ Ufin »

Em seguida foi adicionado 100 ml de t-olueno e 25 rol de trietilamina e a mistura foi aquecida a 120 °C durante 2 horas e, em seguida, deixada arrefecer até à temperatuira ambiente. A fase orgânica foi filtrada, lavada com água, seca, novamente filtrada e o solvente foi removido.

Depois de uma cromatografia, foi obtido o composto em título ¢3,2 g,' 80 p.f. 119-121 °C <a partir de éter).

Encontrado .* Calculado; C - 71,57; H - 8,30; N - 5,25; ,· N - 5,36. C - 71,24J H - 8,10 25 1. 5' 0, / 3 <3H, d, J=6, 6 Hz); 1,1 <3H, d, ii ÇTi 6 H z 2,2: 2 ( 3.H, s); 2,3 6 ( 3H, s); 6,56 UH, d, j= =15 Hz >; S / 68 C 1H, s) i 6,80 -6,92 í:2h, m > D / & S UH, s>; 7 ; 08 UH, S ) ] 7, 76 UH, d, J=15 Hz ) ) 3,87 C3H , s); 3,88 «: 3H, s); 4,00 (. 3H, s) ; 4,01 (3H, sppm. ch3 EXEMPLO 7

ch3 rti lado.

Foi adicionado isopropanol ao complexo de paládio carbo-Obi.! 40 %. E ncc mirado; c - 68 ,34; H - , í”t / 32; N - 4, 92; C a1c u1ado: c - 68 ,86; H - • 8, 20; N - 5, 18. E . H. N. 6' 0,79 (3H d, J=6 16 Hs :); 1 . 1 8 <3H , d, •7=6,6 Hz); ; i, o o *-»*o 16H, d, •J=6« ê :· Hz ) ; 2,24 <3 H, s); 3,80 C3H,· s); ( ,82 C 3H, s); O OC í*·· v.· ; ·-' ·«' \ *. 3H, s ); 3,90

IV _i 3410 cm ' 1S93 cm ' 2150 cm-1509 cm-1 1659 cm Θ cm-1 / 26

6,73 <1H, C3H, s); -5,24 Í1H, sepieto J=6,6 Hz') i B>; 6,90 (3H, m) 7,05 (ÍH; s) ppm. •i. IV CCuCl-) 1714 cm á EXEMPLO Θ A. Efeitos sobre a proliferação da célula T induzida por mitogéneo.

Utilizando métodos bem conhecidos pelos peritos normais na técnica, verificou-se que os compostos utilizados no presente invento inibem a proliferação da célula T induzida por fito-heraa-glutinina <PHA) num modelo referido à dose, que cobre uma gama desde 10 até 100 ,uM. A ordem relativa de potência testada foi o composto do Exemplo 4 Co sal do ácido 1,2,3—propanotricarfooxí1i — co) > o composto do Exemplo 5 (o sal do ácido 1,2,3-propanotri-carboxílico) > o composto do Exemplo 5 <o sal do ácido 2,3-di~ ~hi droxi butanodi ói co .

Uma semelhante relação dependente da dose e ordem de potência relativa na inibição da proliferação da célula T pôde ser observada utilizando células linfoblasto T induzidas por PHA dependente de interIeucina-2 como rótulos dos vários compostos. A adição de IL-2 recombinante humana exógena quer a células blas-to induzidas por PHA quer a culturas recentes de PHA e leucócitos mononucleares do sangue periférico (PBMC) não supera os efeitos ant i pro1i f era t i vos dos c ompos tos. B. Sinergismo dos compostos utilizados no presente invento com a ciclosporina A <CsA> na inibicão da proliferação da célula T induzida por mitogéneo.

Os compostos utilizados no presente invento sinergizam com a CsA no foloquamento da proliferação da célula T in vitro. Utilizando métodos bem conhecidos pelos peritos normais na técnica, foram feitas culturas de PBMC estimulados por PHA numa dose constante de cada composto testado e com doses decrescentes de CsA, partindo com a dose mínima de CsA que bloqueia totalmente a proliferação ¢12-5 ng/mi). Foram utilizadas doses de CsA tão pequenas como 6 ng/ml. A concentracão do composto do Exemplo 4 (o sal do ácido 1,2,3-propanotricarboxílicol» foi mantida constante a 5 jjM, enquanto as concentrações do composto do Exemplo 5 (o sal do ãcido 1 j ^} 3— propanotricarboxílico) e do composto do Exemplo 5 (o sal do ácido 2,3-di-hidroxibutanodióico) foram mantidas a 25 jjM . o sinergismo foi evidenciado por uma inibição superaditi-va da proliferação da célula T induzida por mitogéneo, pelos efeitos antiproliferativos mediados pela CsA e compostos testados. A adição dos compostos urilizados no presente invento fez variar a 1C|_0 CsA de 3 a 4 vezes.

C. Efeitos dos compostos utilizados no presente invento sobre a expressão do gene de activação da célula T

A CsA tem vários efeitos caracteristicos sobre a expressão de vários eventos transcricionais de novo em culturas estimuladas por PHA. A transcrição do RNA mensageiro (mRNfO da int-er-leucina-2 CIL-2), mas não do mRNA receptor de IL-2, é bloqueada nos PBMCs humanos estimulados por mitogéneo. 0 RNA total foi extraído de PBMCs humanos a partir de culturas tratadas ¢100 jl«M> de droga estimulada por mitogéneo e não estimuladas. A

X

V transcrição foi analisada por técnicas de mancha de Northern; o RNA foi hibridizado para sondas de cDNA radiorrotulado para IL-2 e mRNA receptor de IL.-2 pSS CTAC, CD2S). 0 composto do Exemplo 4 (o sal do ácido 1,2,3—propanotricarboxí1iccO e o composto do Exemplo 5 (o sal do ácido i»2,3—propanotricarboxí lico? a 100 ;jM aboliram a acumulação de mRNA de IL-2.· enquanto o mRNA receptor de IL-2 foi, no máximo, ligeiramente diminuído. A expressão de superfície e transiacção da proteína do receptor de IL-2 pS-5 < CD2-5') foi apenas 1igeiramente inibida por qualquer dos compostos. Apesar da expressão de CD2S ter sido ligeiramente reduzida por con-centraçSes elevadas dos dois compostos, a expressão de superfície da proteína TAC ÍCD25) foi nitidamente detectável pela análise FACS utilizando anticorpos antimonoclonais CD25. Em aditamento, a expressão de superfície induzida por activação de antigenes HL..A-DR não foi inibida por estes agentes. Em contraste, mantendo a ausência de mRNA de IL-2, a proteína da IL-2 não pôde ser de-tectada nos sobrenadantes da cultura pelo uso de um sistema ELISA.

Os compostos utilizados no método do presente invento têm uma inesperada, surpreendente e não óbvia actividad© como imunossupressores. Do mesmo modo, o seu efeito sinergístico com a CsA foi inesperado e não óbvio. 0 seu sinergismo que diminui a dose com a CsA significa que na imunossupressão terapêutica pode esperar-se que eles evitem efeitos laterais de hipotensão, bradi— cardia e nefrotoxicidade. EXEUFLO 3

Ver.ificou-se que o composto produto do Exemplo 1, esquema 1, era selectivo do local para o tecido cerebral e renal ao causar decréscimo na resistência vascular através da actividade de bloqueio do canal de cálcio. 29

Sob anestesia de éter, foram canulados a veia jugular, a artéria f©moral e o ventrículo esquerdo de um 8HR macho adulto. Após um período de recuperação de 3-S horas, os animais foram tratados quer com; o composto de teste quer ccm o placebo. Foram concedidos dez minutos para se alcançarem as condiçSes de estado uniforme. A pressão arterial foi em seguida acompanhada via câ-nula femoral. Imediatamente depois desta medição, foi tomada a amostra de sangue de referência e foram injectadas no ventrículo esquerdo microesferas rotuladas radioactivamente. Foram em seguida sacrificadas ratazanas; foram removidos os órgãos, pesados e contados. 0 sinal de saída cardíaco foi computado. A distribuição do sinal de saída cardíaco percentual por grama de tecido, fluxo por grama de tecido e resistência vezes grama de tecido foram calculados para os seguintes órgãos; cérebro, coração, rins, órgãos esplãncnicos Cfígado mais pâncreas, baço e tracto Θ.Ι.), músculo esquelético e pele. 0 composto testado foi administrado na forma de bolus I.V. de 1,0 mg/kg. As diferenças nos valores médios entre os grupos de tratamento e de controlo foram analisadas por análise de uma variável de via única e teste de diferença significativa mínima. 0 composto sujeito causou uma diminuição da resistência vascular ao cérebro:

Exemplo 1, Esquema 1 149 mmHg min g/ml

Controlo, DMBO 240 mmHg min g/ml p < 0,05 a aos rinsí

Exemplo 1, Esquema 1 Controlo, DM80 p < 0,05 22,4 mmHg min g/ml 37,6 mmHg min g/m1

A utilidade terapêutica de uma tal selectividade do local reside no tratamento da isquemia cerebral ou renal. EXEMPLO 10 A actividad© antagonista do cálcio é medida in vitro medindo o pA... ¢0 logaritmo negativo da constante de dissociação aparente da molécula da droga para o seu receptorl no músculo liso aórtico isolado da ratazana espontaneamente hipertensa.

Quanto maior o pA... maior o antagonismo do cálcio. Um composto é £ considerado activo como antagonista do cálcio se o pA.-, for 6,0 ou maior. 0 ião Ca desempenha um papel essencial na redução e manutenção da contracti 1 idade do músculo liso vascular. No mús- j" culo liso vascular despolarizado com K , os antagonistas de cálcio bloqueiam a entrada de Ca'+ na célula, inibindo em consequên-cia disso as contracções induzidas pelo Ca . A inibição da con- «|·Μ^· tracçâo induzida pelo Ca do músculo liso vascular é utilizada como modelo para testar os compostos em relação ao antagonismo do cálcio vascular.

As doenças cardiovasculares tais como arritmias, angina--pectoris, hipertensão, doença vascular periférica podem ser cau-salmente relacionadas com anormal idades no manuseamento celular dos ides Ca++- 0 segmento aórtico excisado é montado num banho de tecido que contém solução de Krebs modificada. Apôs despola-rização do tecido com K í 100 mM), Ca , em concentraçQes cumulativas de i0*d M, 3,2 x lo“d M e io”^ M, é injectado no banho para produzir a cont-racção do músculo liso vascular. A tensão desenvolvida <g) é medida e obtêm-se os valores de resposta è dose de controlo. Após uma hora de incubação com um composto de teste em 31

concentração 10 M, são repetidas as mesmas doses de Ca . As curvas de resposta á dose de controlo, log, e após o tratamento são analisadas por regressão linear.

Exemp1o pA..., JÍ. 3 6,81 5 6 ; 56 5 (sal do ácido 6, 57 1,2,3-propano-tricarfooxí1ico) EXEMPLO 11

Os efeitos da pressão sanguínea sistémica são determinados in vivo numa ratazana espontaneamente hipertensa anestesia da. 0 composto de teste é administrado intragastricamente a 10 A média inicial da pressão sanguínea arterial (MAPI é medida directamente via um cateter arterial previamente implantado imediatamente antes da administração do composto. As leituras das pressões sanguíneas são normalmente feitas 1, 2, 3 e 4 horas depois da administração do composto de teste. Esta tabela de leituras pode variar a pedido. Uma dose do composto de teste é classificada como activa se a média da pressão sanguínea post-tra-tamento das ratazanas traitadas é significativamente diferente <p<=0,05> da do grupo de controlo placebo concorrente. São feitas comparações estatísticas utilizando o teste do t de Student não emparelhado relativo ao controlo tratado pelo veículo (placebo) .

Exemplo Diminuição na MAP (mm Hg> 5 18 S (sal do ácido 22 1,2,3-propanc<” fcricarboxíl i c o')

Um grupo mais preferido de compostos utilizados nos novos métodos do invento é constituído por gualguer, ou todos, dos seguintes compostos:

34

Ν

36 36

Estes compostos não são, contudo, para serem considerados como constituindo o único agrupamento que é considerado útil no invento e qualquer combinação de tais compostos pode, eia própria, formar um agrupamento.

Ainda que o invento tenha sido descrito e ilustrado com referência a certos encorporamentos dele preferidos, os peritos na técnica apreciarão que várias mudanças, modificações e substituições podem nele ser feitas sem afastamento do espirito e alcance do invento. Por exemplo, dosagens eficazes diferentes das gamas preferidas indicadas anteriormente podem ser aplicáveis, como consequência de variações na susceptibi1 idade do mamífero a ser tratado â severidade da rejeição ao transplante de órgão, efeitos adversos relacionados com a dosagem, se existirem, e considerações análogas. De modo semelhante, as respostas farmacológicas específicas observadas podem variar de acordo com e dependendo dos compostos activos particulares escolhidos ou de estarem presentes alguns agentes de suporte farmacêuticos, bem como do tipo de formulação e modo de administração empregue, e tais vari-çfíes e diferenças esperadas nos resultados são contempladas de acordo com os ohjectivos e práticas do presente invento. Tem-se a intenção, por conseguinte, de que o invento seja apenas limitado pelo âmbito e alcance das suas reivindicações e que essas reivindicações sejam interpretadas tão amplamente quanto seja razoável .

Claims

fieivindicacdes iã. — Método de ίmurtossuprsssão de um mamífero com necessidade dele, caracierizado por compreender o passo de administração ao referido memífero de uma quantidade farmacologicamente eficaz de um composto de fórmula de estrutura:

e dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que representa hidroxi; alquilo, alcenilo ou alcinilo de 1 até 10 átomos de carbono substituído ou nSo substituído, em que o referido substi-tuinte é hidroxi ou ceto; alquilcarbonilo de 1 até 10 átomos de carbono; alcoxicarbonilo de 1 até 10 átomos de carbono; ou alquilamido de 1 até 10 átomos de carbono; ou alcoxi R

R_ e R,- representam independentemente hidroxi 5 o 1 até 10 átomos de carbono; e a.l- e representam independentemente hidrogénio; alquilo, cenilo ou alcinilo de 1 até 10 átomos de carbono; m é um inieiro desde 1 até 2, inclusive 1 e n é um inteiro desde í até 5,- inclusive; sendo a gama de dosagem do composto act-ivo de 0,1 a 1 OOO mg por guilogra.ma de peso corporal por dia, de preferência de 1,0 a 100 mg por quilograma de peso corporal por dia. c ess i dade tração ao eficaz de
21. - Método de imunossupressSo de um mamífero com ne-dele, caracterizado por compreender o passo de adminis-referido memifero de uma quantidade farmacologicamente um composto de fórmula de estrutura geral:

e dos seus sais farmaceuticaroente aceitáveis, em que R1 representa hidroxi; alquilo, alcenilo ou aicinilo de 1 até 10 átomos de carbono substituído ou náo substituído, em que o referido substi-tuinte é ceto ou hidroxi; alquiIcarbonilo de 1 até 10 átomos de carbono; alcoxicarbonílo de 1 até 10 átomos de carbono; ou alquilamido de 1 até 10 átomos de carbono;

sendo a gama de dosagem do composto activo quilograma de peso corporal por dia, de 100 mg por quilograma de peso corporal por 31. — Método de acordo com a rizado por o composto administrado ter de 0,1 a 1 000 mg por preferência de 1,0 a dia. reivindicação 1, caracte-a fórmula de estrutura;

4§. - Método de sicordo com a rJzadn por o composto administrado ter reivindicação 1, caracte-a fórmula de estrutura!

OH
51. - Método de acordo com a rizado por o composto administrado ter reivindicação 1, caracte— a fórmula de estrutura;

ch3 41

SsL - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por o composto administrado ter a fórmula de estrutura;

OH 7iS. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por o composto administrado ter a fórmula de estrutura; 4ϋ
81. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte- fórmula de estrutura; rizado por o composto administrado ter a

OH

j£LlH 9ã. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte-razado por o composto administrado ter a fórmula de estrutura;

lOâ. - Método de acordo com a reivindicação i, caracte-rizado por o composto administrado ter a fórmula de estrutura;

l.1.ã. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por o composto administrado ter a fórmula de estrutura.*

OH 45 12ã. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte rirado por o composto administrado ter a fórmula de estruturai

Í3ã. - Método de tratamento da hipertensão de um mamífero com necessidade dele; caracterizsdo por compreender a administração ao referido memífero de uma quantidade farmacológica-mente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 1/ sendo a gama de dosagem do composto activo de 0,1 a 1 000 mg por quilograma de peso corporal por dia, de preferência de 1,0 a 100 mg por quilograma de peso corporal por dia. J.4ê. - Método de tratamento de isquemia renal de um mamífero com necessidade dele, caracterizado por compreender a administração ao referido memífero de uma quantidade farmacolo-gicamente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 1, sendo a gama de dosagem do composto activo de 0,1 a 1 000 mg por quilograma de peso corporal por dia, de preferência de 1,0 a 100 mg por quilograma de peso corporal por dia. iSâ. - Método de tratamento de isquemia cerebral de um mamífero com necessidade dele, caracterizado por compreender a administração ao referido mamífero de uma quantidade íarmacolo-gicamente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação i, sendo a gama de dosagem do composto activo de 0,1 a 1 000 mg por quilograma de peso corporal por dia, de preferência de 1,0 a. 100 mg por quilograma de peso corporal por dia. Lisboa, 20 de Dezembro de 1330

J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10 -A 3> 1200 US80A