HU217621B - Eljárás új glioxaloil-pipekolinsav-észterek, származékaik és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents

Eljárás új glioxaloil-pipekolinsav-észterek, származékaik és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU217621B
HU217621B HU9303184A HU9303184A HU217621B HU 217621 B HU217621 B HU 217621B HU 9303184 A HU9303184 A HU 9303184A HU 9303184 A HU9303184 A HU 9303184A HU 217621 B HU217621 B HU 217621B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
phenyl
pipecolate
butyl
glyoxaloyl
trimethoxyphenyl
Prior art date
Application number
HU9303184A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT68332A (en
Inventor
David M. Armistead
Original Assignee
Vertex Pharmaceuticals Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vertex Pharmaceuticals Inc. filed Critical Vertex Pharmaceuticals Inc.
Publication of HUT68332A publication Critical patent/HUT68332A/hu
Publication of HU217621B publication Critical patent/HU217621B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/16—Carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D409/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D473/00—Heterocyclic compounds containing purine ring systems

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
  • Superconductors And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás új, immunszuppresszív hatású, (I) általánosképletű – ahol B (hidroxi-cikloalkil)-alkenil-csoport; fenil-,naftil-, piridil-, N-oxi-piridil- vagy purinilcsoporttal szubsztituáltalkil- csoport; vagy fenoxi-fenil-csoport; D fenil-, naftil- vagyindolilcsoporttal szubsztituált alkilcsoport; L alkilcsoport vagyalkoxi-fenil-csoport; m=0, 1, 2 vagy 3; n=1, 2 vagy 3; és az 1 és 2jelű szénatomok egymástól függetlenül (R)- vagy (S)-konfigurációjúaklehetnek – vegyületek,[előnyösen (I’) általános képletű (S)]sztereoizomereik vagy ezek keverékei és gyógyszerészetileg elfogadhatósóik, és hatóanyagként ezeket tartalmazó gyógyszerkészítményekelőállítására. ŕ

Description

A találmány új típusú immunszuppresszív hatóanyagokkal, nevezetesen az (I) általános képlettel jellemezhető vegyületcsaláddal - beleértve a gyógyszerészetileg elfogadható sókat is -, e vegyületek előállításával és gyógyszerkészítmények hatóanyagaiként való alkalmazásával foglalkozik.
A műtétet követően a beültetett szövet kilökődése a legszámottevőbb komplikáció, amely döntően befolyásolja a csontvelő-átültetés vagy egyéb szervátültetés sikerét. Ma már tudjuk, hogy immunszuppresszív hatóanyagokkal a szervátültetés esetleges következményét, a beültetett idegen szövet kilökődését befolyásolni, illetve a kilökődés veszélyét jelentősen csökkenteni lehet.
Az „autoimmun betegség” összefoglaló néven ismert betegségek - ezek száma meglehetősen nagy és megjelenési formájúk igen változatos - esetében hasonló jelenséggel állunk szemben, azzal a különbséggel, hogy a szövetkilökődést okozó, illetve ahhoz nagyon hasonló immunválaszt ezeknél a betegségeknél a szervezet saját anyagai váltják ki. Magától értetődő tehát, hogy az immunszuppresszív terápia ezekben az esetekben is alkalmas lehet a helytelen, mondhatnánk téves immunválaszt elfojtására.
Széles körben elfogadott immunszuppresszív hatóanyag a beültetett idegen szövet kilökődésének megakadályozására a ciklosporin A (CsA). A ciklosporin A egy gombák által termelt, természetes eredetű, szerves anyag, amelynek jelentős immunszuppresszív hatékonyságát a szervátültetések kapcsán a klinikai gyakorlatban igazolták [R. Y. Calne et al.: Br. Med. J. 282, 934-936 (1981); D. J. C. White: Drugs 24, 322-334 (1982)]. Annak ellenére, hogy a ciklosporin A alkalmazása immunszuppresszív terápiás szerként meglehetősen elterjedt, egyáltalán nem nevezhető a kérdés megoldottnak, mivel ez a hatóanyag - különösen nagyobb dózisokban - gyakran okoz mellékhatásokat, melyek közül elsőként említhetjük a vese- és májkárosító hatást, valamint a központi idegrendszer különböző rendellenességeit kiváltó hatásokat.
Az elmondottak alátámasztására az alábbiakban felsoroljuk azokat a betegségeket, amelyek kezelésében a ciklosporin A eredményesnek bizonyult. Ezek az adatok egyfelől az autoimmun folyamatok jelentőségére irányítják a figyelmet ezeknél a betegségeknél, másfelől viszont alátámasztják, hogy ezek a betegségek hatékonyan kezelhetők szelektíven a T-sejtekre kiterjedő immunszuppressziót kiváltó - ilyen módon fejti ki hatását a ciklosporin A is - hatóanyagokkal.
1. Oftalmológia (szemészet): uveagyulladás, Behcet-betegség és Graves-betegség (hyperthyreosis expohthalmica). A. P. Weetman et al.: Láncét, 486-489 (1982). Graves-betegség.
R. B. Nussenblatt el al.: Láncét, 235-238 (1983). Uveagy gyulladás.
C. French-Constant el al.: Láncét, 454 (1983). Behcet-betegség.
M. Sanders et al.: Láncét, 454-455 (1983). Behcetbetegség.
Megjegyzés: a ciklosporin A a Behcet-betegség kezelésére Japánban az engedélyezett gyógyszerek közé tartozik, ez a jóváhagyás mostanában történt, és ez az első eset, hogy autoimmun betegség kezelésére engedélyezték ezt a vegyületet.
2. Dermatológia (bőrgyógyászat): különböző autoimmun bőrbetegségek, köztük a pszoriázis.
P. Zabéi et al.: Láncét, 343 (1984). Akut dermatomyositis.
T. van Joost et al.: Arch. Dermatol. 123, 166-167 (1987). Atópiás bőrbetegség.
T. Appleboom et al.: Amer. J. Med. 82, 866-867 (1987). A scleroderma néven ismert, a bőr keményedésével járó, az egész szervezetet érintő kollagénbetegség. R. A. Logan és R. D. R. Camo: J. Roy. Soc. Med. 81, 417-418(1988). Ekcéma.
C. E. M. Griffiths et al.: Brit. Med. J. 293, 731-732 (986). Pszoriázis.
C. N. Ellis et al.: J. Amer. Med. Assoc. 256, 3110-3116 (1986). Pszoriázis.
3. Hematológia: különböző betegségek, köztük a vérszegénység (anémia). T. H. Toetterman et al.: Láncét, 693 (1984). Vörösvérsejt-aplázia (pure red cell aplasia, PRCA).
P. A. Stryckmans et al.: New Engl. J. Med. 310, 655-656 (1984). Aplasztikus anémia.
E. Gluckman et al.: Boné Marrow Transplant 3, Suppl.
I, 241 (1988). Aplasztikus anémia.
4. Gasztroenterológia/hepatológia: primer cirrózis, autoimmun májgyulladás (hepatitis), fekélyes vastagbélgyulladás (colitis ulcerosa), Crohn-betegség és más, a gyomor-bél csatornát érintő autoimmun betegségek.
R. H. Wiesner et al.: Hepatology 7, 1025, Abst. 9, (1987). Primer biliáris cirrózis.
J. S. Hyams et al.: Gastroenterology 93, 890-893 (1987). Autoimmun májgyulladás.
M. C. Allison et al.: Láncét, 902-903 (1984). Crohnbetegség.
J. Brynkov et al.: Gastroenterology 92, 1330 (1987). Crohn-betegség.
G. B. Porro et al.: Ital. J. Gastrolenterol. 19, 40-41 (1987). Fekélyes vastagbélgyulladás.
5. Neurológia (ideggyógyászat): izomsorvadással járó lateralschlerosis (ALS, Lou-Gehring-betegség), myasthenia gravis és sclerosis multiplex.
S. H. Appel et al.: Arch. Neurol. 45, 381-386 (1988). ALS. R. S. A. Tindall et al.: New Eng. J. Med. 316, 719-724 (1987).
Myasthenia gravis; Ann. Neurol. 24, No. 1, p. 169,m Abstract Pl74 (1988). Sclerosis multiplex.
D. Dommasch et al.: Neurology 38, Suppl. 2, 28-19 (1988). Sclerosis multiplex.
6. A vesével kapcsolatos betegségek: vesebetegségek, membranoproliferatív glomerulonephritis (MPNG) és hasonlók.
A. R. Watzon et al.: Clin. Nephrol. 25, 273-274 (1986). Vesebetegségek.
A. Tejani et al.: Kidney Int. 33, 729-834 (1988). Vesebetegségek.
A. Meyrier et al.: Transplant Proc. 20, Suppl. 4 (Book III), 259-261 (1988). Vesebetegségek.
G. LaGrue et al.: Nephron, 44, 382-382 (1986). MPGN.
HU 217 621 Β
7. Reumatoid arthritis (RA):
J. I. Harper et al.: Láncét, 981-982 (1984). Reumatoid arthritis.
A. W. Van Rijthoven et al.: Ann. Rheum. Dis. 45, 726-731 (1986). Reumatoid arthritis.
M. Dougados et at.: Ann. Rheum. Dis. 47, 127-133 (1988). Reumatoid arthritis.
8. Inzulindependens cukorbetegség (diabetes mellitus, IDDM)
C. R. Stiller et al.: Science 223, 1362-1367 (1984).
R. Assan et al.: Láncét, 67-71 (1985).
P. F. Bougneres et al.: New. Engl. J. Med. 318, 663-670 (1988). Diabetes 37, 1574-1588 (1988).
Számos állatbetegséget szintén az autoimmun betegségek kategóriájába sorolhatunk, például az imént felsoroltakat megfigyelték már emlősállatokban is [F. O. Papa et al.: Infertility of autoimmune origin in the stallion, Equine Vet. J. 22, 145-146 (1990); N. T. Gorman and L. L. Wemer: Immuné mediated diseases of cats and dogs, Brit. Vet. J. 142, 403-410, 491-497 and 498-505 (1986); L. W. George and S. L. White: Autoimmune skin diseases in large mammals, Vet. Clin. North. Amer. 6, 203-213 (1984); D. Bennett: Autoimmune diseases in dogs, In. Pract. 6, (1984); R. E. Halliwell; Autoimmune diseases in domesticated animals, J. Amer. Vet. Assoc. 181, 1088-1096 (1982)].
Ma már a mechanizmus, melynek révén a ciklosporin A kifejti immunszuppresszív hatását, jól ismert. In vitro körülmények között a ciklsporin A gátolja a limfokinek, köztük az interleukin 2 (IL-2) szabaddá válását [D. Bunjes et al.: Eur. J. Immunoi. 11, 657-661 (1981)], és megakadályozza a helper és citotoxikus Tsejtek klonális elszaporodását [E. Larsson: J. Immunoi. 124, 2828-2833 (1980)]. Azonfelül azt is kimutatták [G. Rischer et al.: Natúré 337, 476-478 (1989)]; N. Takahashi et al.: Natúré 337, 473-475 (1989)], hogy a ciklosporin A kötődik egy ciklofílinnek nevezett, a citoszolban található fehérjéhez, és a kötődés által gátolja ennek a fehérjének a peptidil-prolil-izomeráz (PPI-áz) aktivitását, ez a fehérje ugyanis maga a PPI-áz enzim. Valószínűleg a peptidil-prolil-izomeráz oly módon szabályozza a T-sejtek aktiválódását, hogy katalizálja a prolilcsoportok peptidkötéseinek rotamerizációját, ezért ezt a cisz-transz-izomeráz enzimet rotamáz enzimnek is nevezik.
Mostanában izoláltak Streptomyces fajokból egy másik, bizonyítottan jelentős immunszuppresszív hatású, természetes anyagot, amely FK-506 néven vált ismertté [H. Tanaka et al.: J. Am. Chem. Soc. 109, 5031-5033 (1987)]. Az FK-506 gátolja az IL-2 termelődését, valamint in vitro körülmények között, mintegy százszor kisebb koncentrációban, mint a ciklosporin A, kevert limfocitatenyészetben gátolja a limfociták reakcióját és a citotoxikus T-sejtek képződését [T. Kinő et al.: J. Antibiot. 15, 1256-1265 (1987)]. Az FK-506 bár szerkezetileg különbözik a ciklosporin A hatóanyagtól, a PPI-áz inhibitoraként viselkedik, és kötődik egy fehérjéhez - ezt a fehérjét a következőkben az angol nyelvű szakirodalomból átvett rövidítéssel FKBP-nek nevezzük -, amely azonban nem azonos a ciklofilinnel [M. W. Harding et al.: Natúré 341, 758-760 (1989); J.
J. Siekierka: Natúré 341, 755-757 (1989)].
A találmány tárgyát (I) általános képletű, új immunszuppresszív vegyületek és gyógyszerészetileg elfogadható sóik előállítása képezi, amelyek kifejezett affinitással bírnak az FK-506 jelű vegyületet kötő fehérjével (FKBP) szemben. Ehhez a fehérjéhez kötődve e vegyületek gátolják a FKBP peptidil-prolil-izomeráz vagy más néven rotamáz aktivitását, és ez a hatás a Tsejt aktiválódás gátlását is eredményezi, következésképpen a találmány szerinti vegyületek immunszuppresszív hatású gyógyszerkészítmények hatóanyagaiként hasznosíthatók, és ily módon fontos szerepük lehet csontvelő- vagy más szervátültetés esetén a kilökődési reakció elfojtásában vagy jelentős visszaszorításában, valamint embernél vagy más emlősfajoknál az autoimmun betegségek kezelésében.
Az (I) általános képletű vegyületekhez hasonló szerkezetű vegyületeket ismertetnek az EP-A 0384341 számú európai szabadalmi bejelentésben, azonban ezek a vegyületek a prolin oldalláncában levő karboxicsoport helyén egy aldehidcsoportot tartalmazó vegyületekből származtathatók, mivel az oldalláncban egy -CH(OR)2 általános képletű acetálcsoportot (ahol R jelentése alkilcsoport) tartalmaznak. A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek ezzel szemben a megfelelő helyzetben egy karboxioldalláncból származtatható karboxilátcsoportot tartalmaznak.
Az (I) általános képletben
B jelentése hidroxi-(3-8 szénatomos cikloalkil)-csoporttal szubsztituált 2-6 szénatomos alkenilcsoport; fenil-, naftil-, piridil-, N-oxi-piridil- vagy purinilcsoporttal szubsztituált 1-6 szénatomos alkilcsoport; vagy fenoxi-fenil-csoport;
D jelentése fenil-, naftil- vagy indolilcsoporttal szubsztituált 1-6 szénatomos alkilcsoport;
L jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport vagy egy vagy több, 1-6 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált fenilcsoport;
m értéke 0, 1, 2 vagy 3; és n értéke 1, 2 vagy 3.
A találmány szerint az (I) általános képletű vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy egy (X) általános képletű védett aminosavat - ahol n értéke az (I) általános képletnél megadott, és P jelentése egy amino-védőcsoport egy (XI) általános képletű alkohollal - ahol B és D jelentése és m értéke az (I) általános képletnél megadott észteresítve egy (XII) általános képletű vegyületté alakítunk, majd eltávolítjuk a P amino-védőcsoportot, és a kapott (XIII) általános képletű aminosav-észter szabad aminocsoportját egy (XIV) általános képletű savval - ahol L jelentése az (I) általános képletnél megadott vagy annak valamilyen aktivált származékával acilezve jutunk a kívánt (I) általános képletű vegyülethez.
A sztereokémiái vonatkozásokat tekintve előnyös, ha az (I) [illetve a (X), (XII) és (XIII)] általános képletben az 1-es számmal jelölt szénatom (S)-konfigurációjú, bár egyaránt lehet (R)- vagy (S)-konfigurációjú, és a 2-es számmal jelölt szénatom ugyancsak lehet (R)vagy (S)-konfigurációjú.
HU 217 621 Β
Kiemelkedő jelentőségűek a (3), (4), (7), (8), (11), (16), (21), (22) és (25) képletű vegyületek, amelyek előállítását a példáknál teljes részletességgel megadjuk.
A találmány szerinti vegyületeket rendszerint szerves vagy szervetlen savakkal, illetve bázisokkal képzett sók formájában hasznosítjuk. A savakkal képzett sók közül kiváltképpen alkalmasak például a következők: acetát, adipát, alginát, aszparaginát, benzoát, benzolszulfonát, hidrogén-szulfát, butirát, citrát, kámforszulfonát, kámforilát, ciklopentán-propionát, diglukonát, dodecil-szulfát, etánszulfonát, fumarát, glukoheptanoát, glicerofoszfát, hemiszulfát, heptanoát, hexanoát, hidroklorid, hidrobromid, hidrojodid, 2-hidroxi-etánszulfonát, laktát, maleát, metánszulfonát, 2-naftalinszulfonát, nikotinát, oxalát, pamoát, pektinát, perszulfát, 3fenil-propionát, pikrát, pivalát, propionát, szukcinát, tartarát, tiocianát, p-toluolszulfonát és undekanoát; míg a bázisokkal képzett sók közül elsősorban az ammóniumsókat, az alkálifémsókat, így a nátrium- és káliumsókat, az alkálifoldfémekkel képzett sókat, például a kalcium- és magnéziumsókat, továbbá a szerves bázisokkal, például a diciklohexil-aminnal vagy N-metil-Dglükaminnal, illetve bizonyos aminosavakkal, például az argininnel vagy lizinnel képzett sókat említhetjük, de még folytathatnák a sort. Számításba kell vennünk továbbá azokat a vegyületeket is, amelyek a bázikus nitrogénatomot tartalmazó csoportok kvatemerezésével keletkeznek. Ilyen kvatemerező reagensek lehetnek például a rövid szénláncú alkil-halogenidek, többek között a metil-, etil-, propil- és butil-klorid, -bromid vagy -jodid; a dialkil-szulfátok, elsősorban a dimetil-, dietil-, dibutil-, és dipentil-szulfát; a hosszú szénláncú szénhidrogénekből származtatható halogénvegyületek, így a decil-, dodecil-, tetradecil- vagy oktadecil-klorid, illetve -bromid vagy -jodid; az aralkil-halogenidek, így a benzil-bromid és fenetil-bromid, valamint más, hasonló reagensek. Ilyen módon vízben vagy olajban oldódó, illetve diszpergálható vegyületeket állíthatunk elő.
A találmány szerinti vegyületek előnyös képviselői azok, amelyek relatív molekulatömege 750 körüli vagy még előnyösebben az alatti, mintegy 500 körüli vagy az alatti érték.
Az 1. táblázatban felsorolunk néhány (I) általános képletű vegyületet, amelyek közös jellemzője, hogy a képletben 1-es számmal jelzett szénatom (S)konfigurációjú. Ezeket a vegyületeket az (Γ) általános képlettel írhatjuk le, a szimbólumok jelentését pedig az 1. táblázatban adjuk meg.
1. táblázat
Sorszám n m B D L
2 1 0 3-(2-piridil)-propil 3-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
3 2 0 3-fenil-propil 3-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
4 2 0 2-fenoxi-fenil 3-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
7 2 0 2-(3-piridil)-etil 3-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
8 2 0 (E)-3-(transz-4-hidroxi-ciklo- hexil)-2-metil-2-propenil 2-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
9 2 0 3-(3-piridil)-propil 3-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
10 2 0 benzil 3-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
11 2 0 benzil 3-(3-indolil)-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
12 2 0 fenetil 3-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
16 2 1 benzil 3-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
20 2 0 3-(2-piridil)-propil 3-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
21 2 0 3-(2-piridil)-propil 3-fenil-propil terc-butil
22 2 0 3-( 1 -oxido-piridín-3-il)-propiI 3-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
25 2 0 3-(7-purinil)-propil 3-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
29 2 0 3-(3-piridil)-propil 3-fenil-propil 3-izopropoxi-fenil
32 2 0 4-fenil-butil 3-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
41 2 0 5-feníl-pentil 3-fenil-propil 3,4,5-trimetoxi-fenil
A felsorolt vegyületekkel végzett vizsgálatok eredményeit a 2. táblázat tartalmazza.
2. táblázat
Sorszám Ki (nM) Kd (nM) PMA (μΜ) OKT3 (μΜ) LB (μΜ) JVM (μΜ) CTLL (μΜ)
2 95 na 3,5 1,5 8,0 7,0 4,0
3 1,0 20 >8 2,25 10 8,5 8,0
HU 217 621 Β
2. táblázat (folytatás)
Sorszám Ki (nM) Kd (nM) PMA (μΜ) OKT3 (μΜ) LB (μΜ) JVM (μΜ) CTLL (μΜ)
4 220 na >10 >10 >10 >10 >10
7 3,0 29 2,0 2,0 5,0 5,0 2,0
8 27 30 4,0 5,0 10 10 4,0
9 1,0 4,0 1,8 1,2 6,0 6,0 2,5
10 32 na 5,5 4,0 5,5 8,0 6,0
11 24 na 2,7 2,0 3,5 6,5 10
12 83 na 7,0 5,0 10 10 8,1
15 na na 3,0 3,0 6,0 8,0 5,0
16 57 na 5,0 7,0 9,0 >10 6,0
20 1,0 4,0 1,7 2,0 2,0 2,5 2,0
21 36 na 7,0 3,0 6,0 7,0 4,0
22 na na 1,5 1,6 2,2 2,5 2,3
25 9,0 na na 2,0 2,5 2,0 3,0
29 2,0 3,0 10 8,0 >10 >10 4,0
32 20 na 9,0 8,0 >10 >10 7,5
41 45 na 7,0 >10 >10 10 >10
A 2. táblázatban felsorolt vegyületek nagyobb koncentrációnál mutattak toxikus hatást, mint amelynél az immunszuppresszív hatás jelentkezett, tipikus esetben ez a koncentráció 10 μΜ felett volt.
Kj=az FKBP rotamáz aktivitásának gátlását mutató érték. Kd=az FKBP-hez való kötődést kifejező érték.
PMA (forbol-mirisztát-acetát) és OKT3=mitogén anyagok, amelyeket az emberi perifériás vérlimfociták (PBL) proliferációjának stimulálására használnak.
A vegyületek kiértékelésénél a proliferációt gátló képességet vesszük figyelembe.
LB és JVM=emberi, vírus által transzformált limfoblasztoid B-sejtvonal; kevert limfocitareakcióban a sejtek proliferációja figyelhető meg, és ennek a proliferációnak a gátlása alapján történik a vegyületek hatékonyságának értékelése.
CTLL=az IL-2 által stimulált citotoxikus T-sejtek proliferációját gátló hatás mérőszáma. na=nincs adat.
Amint már korábban mondottuk, a találmány szerinti vegyületek kifejezett affinitást mutatnak a limfociták, elsősorban a T-limfociták citoszoljában található, az FK-506 jelű vegyületet kötő fehérjékkel szemben. Amikor az immunszuppresszív hatóanyag az FKBPhez kötődik, gátolja annak peptidil-propil-izomeráz aktivitását, és egyúttal útját állja a FKBP által közvetített limfocitaaktiválódásnak. Egy bizonyos, az FK-506 jelű vegyületet kötő fehérjét M. W. és munkatársai [Natúré 341, 758-760 (1989)] írtak le, és ez a fehéije standard vizsgálatokhoz használható a vegyületek FKBP-vel szemben mutatott affinitásának kiértékeléséhez. Mindazonáltal a találmány szerinti vegyületek más, az FK506 jelű anyagot kötő fehérjékkel szemben is mutathatnak affinitást. A cisz-transz peptidil-prolin-izomeráz gátlása egyben az FK-506 jelű anyagot kötő fehérjékhez való kötődést is jelzi.
Emberi, az FK-506 jelű anyagot kötő fehérjékhez
M. W. Harding és munkatársai eljárásával [Natúré 341, 758-760 (1989)] juthatunk. Az úgynevezett látszólagos Kd-értékeket kétféle módon is meghatározhatjuk: az egyik esetben Harding és munkatársai szerint 32([l-14C]benzoil)-FK-506, jelű vegyületet használunk referenciavegyületként, a másik módszernél [J. J. Siekierka et al.: Natúré 341, 755-757 (1989)] a jelzett ligand [3H]dihidro-FK-506, mindkét eljárás során Sephadex LH-20 (Pharmacia) oszlopon történik a fehérjeffakciók elválasztása, ezért a vizsgálat az angol nyelvű szakirodalomban „LH-20 assay” néven van leírva. Néhány találmány szerinti vegyületre vonatkozóan ez utóbbi módszerrel mért adatokat tüntettünk fel a 2. táblázatban. A vizsgálat során a jelzetlen anyag és a [3H]dihidro-FK-506 kompetitív kötődését mérték az
FK-506 jelű anyagot kötő fehéqéhez.
Az FKBP PPI-áz vagy más néven rotamáz aktivitását gátló képességet - ez a látszólagos Kj-érték - szintén meghatározhatjuk akár az M. W. Harding és munkatársai [Natúré 341, 758-760 (1989)], akár a J. J.
Siekierka és munkatársai [Natúré 341, 755-757 (1989)] által leírt módszert követve. A prolin-alanin peptidkötés cisz-transz izomerizációjának mértékét az N-szukcinilAla-Al-Pro-Phe-p-nitro-anilid modellvegyület segítségével állapíthatjuk meg, amikor is spektrofotometriás mérési módszert alkalmazva, valamint kimotripszinnel kezelve a szubsztrátot, a transz-módosulatból szabaddá váló Phe-(4-nitro-anilid) koncentrációjának változását követhetjük [G. Fischer et al.: Natúré 337, 476-478 (1989)]. Ha különböző koncentrációban enziminhibitort adunk a reakcióelegyhez, annak gátló hatását regisztrál5
HU 217 621 Β hatjuk, és megállapíthatjuk, hogy a változás az inhibitor koncentrációjának függvényében elsőrendű sebességi állandót eredményez, és ez a sebességi állandó a látszólagos K,-érték. Az enzimreakció gátlásának mértékét kifejező Kj-értékeket néhány kiemelkedő jelentőségű találmány szerinti vegyületre vonatkozóan a 2. táblázatban adtuk meg.
Vizsgáltuk továbbá a találmány szerinti vegyületeket különböző sejtbiológiai kísérletekben, és megállapítottuk, hogy az ismert hatóanyagok közül a ciklosporin A és az FK-506 jelű vegyület bizonyultak olyan5 nak, amelyekkel mind funkcionálisan, mind az alkalmazhatóságot tekintve a találmány szerinti vegyületek hasonlóságot mutatnak (lásd a 3. táblázat adatait).
3. táblázat
Az elvégzett vizsgálat és a mért IC50-értékek
Ciklosporin A Rapamicin FK-506
1. Humán PBL + OKT3 <1 pg/ml < 1 pg/ml <1 pg/ml
2. T-sejt hibridóma + TCR/CD2 <1 pg/ml <1 pg/ml < 1 pg/ml
3. Apoptózis < 1 pg/ml koncentrációban blokkol < 1 pg/ml koncentrációban hatástalan < 1 pg/ml koncentrációban blokkol
4. CTLL-proliferáció >>1 pg/ml = 0,01 pg/ml >>1 pg/ml
1. A vizsgálati módszer lényegében az N. Yoshimura és munkatársai által leírttal azonos [Transplantation 47, 356-359(1989)].
Ficoll-Hypaque gradiens centrifugálással humán perifériás vérlimfocitákat különítünk el, amelyeket 0KT3 antitestekkel (anti-CD3), a CD3-receptorokkal való kölcsönhatásra alapozva stimulálunk. A frissen izolált limfocitákon a stimuláló hatást a sejtproliferáció révén beépülő radioaktív timidin ([3H]TdR) meghatározásával mérjük. Ha semmiféle gátló hatást nem lép fel, akkor ez az alapérték mintegy 48 000-75 000 cpm. Az IC50értéket a hatóanyag különböző koncentrációival kapott, a proliferációt gátló hatás mértékéből állapítjuk meg.
2. A vizsgálat menete a fentihez hasonló, azonban Tsejt receptor antitestekkel (TCR) és CD2-antitestekkel stimulált T-sejt kiónt használunk a méréshez. A stimulálás mértékét a sejtek proliferációja közben beépülő radioaktív timidin ([3H]TdR) mennyiségéből tudjuk, és az enzimgátló anyag nélkül kapott 23 000 cpm kontrollértékhez viszonyítva állapítjuk meg a gátló hatás erősségét. Az IC50-értékeket a proliferáció gátlásának különböző hatóanyag-koncentráció mellett mért adataiból számítjuk.
3. A vizsgálatot Y. Shi és munkatársai [Natúré 339, 626-626 (1989)] szerint, T-sejt hibridóma segítségével végezzük. A módszer lényege, hogy az anti-CD3 jelenlétével kiváltott aktiválódást követve a sejtelhalást követjük nyomon, mégpedig úgy, hogy a leírt festési eljárást alkalmazva teszünk különbséget az élő és elhalt sejtek között, és az előbbieket megszámoljuk. Az így kapott effektus az éretlen timuszsejtek esetén jelentkező ismert folyamat egyféle utánzásának felel meg. A ciklosporin A és FK-506 jelű hatóanyagoknak az a képessége, hogy ezt a sejthalált gátolni tudják, érzékenyjelzőrendszerként szolgál arra nézve, hogy kiszűrjük azokat a vegyületeket, amelyek ciklosporinszerű és/vagy FK-506-szerű hatásmechanizmus szerint fejtik ki hatásukat. Figyelemre méltó tény, hogy a kémiailag rokon szerkezetű, de hatásmechanizmusában eltérő tulajdonságú rapamicin ebben a vizsgálatban hatástalannak bizonyult.
4. A vizsgálatot, amelynek során az IL-2 által stimulált citotoxikus T-sejtek reagálását követjük nyomon, F. DuMont és munkatársai szerint végezzük [J. Immunoi. 144, 251-258 (1990)]. A sejtek proliferációját itt is a beépült [3H]TdR mennyisége mutatja. Azok az immunszuppresszív anyagok, amelyek hatásmechanizmusa hasonló a ciklosporin A és FK-506 esetében megállapítottal, nem gátolják ezt az IL-2 által kiváltott folyamatot, mivel működésük alapja éppen az endogén IL2 termelésének gátlása, itt pedig az IL-2 külső forrásból származik, tehát magától értetődően a gátló hatás nem érvényesülhet. Fel kell hívnunk a figyelmet arra, hogy a kémiailag rokon szerkezetű, de más mechanizmus szerint ható rapamicin ebben a vizsgálatban hatékonynak mutatkozott.
Mindezek a vizsgálatok, valamint a példáknál ismertetendő továbbiak is, alkalmasak arra, hogy a találmány szerinti vegyületek celluláris hatásprofilját megállapítsuk. Világosan látható az eredményekből, hogy a találmány szerinti vegyületek e tekintetben mind a ciklosporin A-val, mind az FK-506 jelű hatóanyaggal hasonlóságot mutatnak, ellentétben a rapamicinnel, amelyről viszont ismeretes, hogy más mechanizmus szerint ható immunszuppresszív anyag. A 2. táblázat adatainak tanulmányozása során megállapítható továbbá, hogy a megfigyelt celluláris hatékonyság az FKBP-hez való kötődés, valamint a PPI-áz (rotamáz) aktivitásának gátlása alapján várható mértékkel jó azonosságot mutat. Az eddig elmondottakat figyelembe véve azt mondhatjuk, hogy a találmány szerinti vegyületek immunszuppresszív hatóanyagként alkalmasak lehetnek a szervátültetéseknél fellépő kilökődés megelőzésére, illetve a szövetkilökődési reakció krónikus elfojtására irányuló kezelésre vagy az autoimmunbetegségek kezelésére.
A találmány szerinti immunszuppresszív hatóanyagokat megfelelő időközönként rendszeresen adhatjuk csontvelő-átültetésen vagy más szervátültetésen átesett pácienseknek, illetve bármely más esetben, amikor kívánatos, hogy az immunválaszt elfojtsuk, például különböző autoimmun betegségeknél. A találmány szerinti vegyületek egyébként az emberen kívül emlősál6
HU217621 Β latoknak is adhatók, különböző, az emlősöknél előforduló autoimmun betegségek kezelésére.
A találmány szerinti vegyületek jelentős hatékonyságot mutatnak a T-sejtek, különösen a helper T-sejtek antigének által stimulált felszaporodásának és új T-sejt kiónok ki alakulásának visszaszorításában. E vegyületek tehát aktivitásuk révén alkalmasak arra, hogy primer megelőző faktorként szolgáljanak az átültetett szerv kilökődésének megakadályozásban, alkalmasak arra, hogy csökkentsük az átültetett szövet kilökődésének kockázatát, továbbá alkalmasak arra is, hogy kezeljük velük azokat a betegségeket, amelyekről ismeretes, hogy a szervezet helytelen immunválaszának következményei - ilyenek például az uveagyulladás, a Behcetbetegség és a Graves-betegség (hyperthyreosis exophthalmica), a pszoriázis, az akut dermatomyositis, az atópiás bőrbetegségek, a scleroderma, az ekcéma, a vörösvérsejt-aplázia, az aplasztikus anémia, a primer cirrózis, az autoimmun eredetű májgyulladás, a fekélyes vastagbélgyulladás, a Crohn-betegség, az izomsorvadással járó lateralsclerosis, a myasthenia gravis, a sclerosis multiplex, különböző vesebetegségek, így a membranoproliferatív glomerulonephritis, a reumatoid arthritis és az inzulindependens cukorbetegség -, vagyis az úgynevezett autoimmun betegségeket. A felsorolt betegségek esetében a kezelés egyrészt a tünetek súlyosságának csökkenését, másrészt a betegség progressziójának lassítását eredményezi. Az inzulindependens cukorbetegség esetében a kezelés sokkal hatékonyabb, ha már akkor megkezdődik, mielőtt a természetes inzulin termelődése teljesen megszűnne, és a beteg teljes mértékben a külső inzulinbeviteltől függővé válna.
A felsorolt betegségek kezelésére a találmány szerinti vegyületeket alkalmazhatjuk orálisan, parenterálisan, inhalációs készítmények, például permet formájában, továbbá helyileg, rektálisan, nazálisán, bukkálisan vagy vaginálisan, valamint a bőr alá beültetett, lassan felszívódó, úgynevezett depókészítmény formájában. A különböző gyógyszerformák előállítása a szokásos, általánosan ismert, nem toxikus, gyógyszerészetileg elfogadható vivő-, hígító- és/vagy egyéb segédanyagok, például különböző hatásjavító anyagok felhasználásával történhet. Parenterális alkalmazás alatt itt a leírásban a szubkután, intravénás, intramuszkuláris, intrasztemális és intrakranális injekciót vagy infúziót értjük.
A találmány szerinti vegyületeket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények lehetnek steril, injekció formájában beadható gyógyszerformák, például steril, vizes vagy olajos szuszpenziók. Ezeket a szuszpenziókat általában a szakterület művelői előtt jól ismert technológiai folyamatok során, alkalmas diszpergáló-, nedvesítő- és/vagy szuszpendálószerek alkalmazásával állíthatjuk elő. A steril, injekciós készítmények akár oldat, akár szuszpenzió formájában, nem toxikus, parenterálisan alkalmazható oldószerekkel vagy hígítószerekkel, például 1,3-butándiollaI készülhetnek. Az alkalmasvivőanyagok és oldószerek közül említhetjük még a vizet, a Ringer-féle oldatot és az izotómiás nátrium-klorid-oldatot. A steril, állandó összetételű olajokat ugyancsak alkalmazhatjuk oldószerként. Bármely, a szervezet számára elviselhető olajat, például a szintetikus monovagy diglicerideket is, használhatjuk gyógyszerkészítmények összetevőiként, és ide sorolhatjuk a zsírsavakat, például az olaj savat, vagy azok gliceridszármazékait, továbbá a természetes, gyógyszerészetileg elfogadható olajokat, köztük az olívaolajat és a ricinusolajat, de különösen ezek polioxietilezett formáit. Az olajos oldatok vagy szuszpenziók tartalmazhatnak azonfelül hígítószerként vagy oldószerként hosszú szénláncú alkoholokat is.
A találmány szerinti vegyületeket orálisan kapszula, tabletta, valamint vizes szuszpenziók vagy oldatok formájában adhatjuk a betegeknek. A orális készítményeket, például a tablettákat a szokásos vivőanyagokkal, így laktózzal és kukoricakeményítővel készíthetjük, és tipikus estben más segédanyagokat, például síkosítóanyagként magnézium-sztearátot is alkalmazunk. A kapszula készítésénél ugyancsak megfelelő vivőanyag lehet a laktóz vagy a szárított kukoricakeményítő. Az orális adásra szánt vizes szuszpenziók esetében a hatóanyagot emulgáló- vagy szuszpendálószerekkel kombinálhatjuk, és kívánt esetben bizonyos édesítőszereket és/vagy ízjavító anyagokat és/vagy színezőanyagokat is használhatunk.
A találmány szerinti vegyületeket végbélkúp formájában rektálisan is alkalmazhatjuk. Ezeket a készítményeket úgy állíthatjuk elő, hogy a hatóanyagot alkalmas, nem irritáló tulajdonságú, szobahőmérsékleten szilárd, de a végbél hőmérsékletén cseppfolyós halmazállapotú vivőanyagokkal keverjük össze, aminek következtében az így kapott gyógyszerforma a végbélben megolvad, és a hatóanyag szabaddá válik. Az e célra alkalmas gyógyszerészeti vivőanyagok közül említhetjük például a kakaó vajat, a méhviaszt és a polietilénglikolokat.
A találmány szerinti vegyületeket azonfelül helyileg is alkalmazhatjuk, kiváltképpen azokban az esetekben, amikor a körülmények olyanok, hogy a kezelendő terület vagy szerv, például autoimmun betegségeknél a szem, a bőr vagy az emésztőcsatorna alsó traktusa, helyileg alkalmazandó gyógyszerformákkal könnyen elérhető. A felsorolt testrészek helyi kezelésére alkalmas készítményeket minden nehézség nélkül készíthetünk a találmány szerinti vegyületekből.
A szemészeti alkalmazásra szánt készítmények esetében például úgy járhatunk el, hogy a mikronizált hatóanyagot izotóniás oldatban, például beállított pH-jú, izotóniás nátrium-klorid-oldatban szuszpendáljuk, akár kondenzálószerek, például valamilyen benzalkóniumkloriddal együtt, akár anélkül. Egy másik lehetőség a találmány szerinti vegyületek szemészeti alkalmazására a szemkenőcs, amely például finomított paraffinolajjal készülhet.
A bőrre helyileg például kenőcs formájában alkalmazhatjuk a találmány szerinti vegyületeket. Kenőcs készítésénél a hatóanyagot feloldjuk vagy szuszpendáljuk egy vagy több, például az alábbiak közül választott vivőanyagban: ásványolaj, folyékony paraffin, azaz paraffinolaj, fehér paraffin, propilénglikol, polifoxi7
HU 217 621 Β etilén)-poli(oxi-propilén) kondenzációs termékek, emulgeáló viasz és víz. A találmány szerinti vegyületekből készíthetünk azonfelül borogatószereket vagy krémeket is, ezek a hatóanyagon kívül gyógyszerészeti vivőanyagként például ásványolajat, szorbitán-monosztearátot, poliszorbát 60 emulgálószert, cetil-észter viaszt, benzil-alkoholt és vizet tartalmazhatnak, amelyek valamelyikében, vagy több ilyen elegyében a hatóanyagot feloldjuk vagy szuszpendáljuk.
Az emésztőcsatorna alsó traktusának helyi kezelésére alkalmas lehet a fentebb már említett végbélkúp, de készíthetünk beöntéshez megfelelő gyógyszerformát is a találmány szerinti vegyületekből.
Az itt tárgyalt körülmények között a hatóanyagokat 0,01 és 100 mg/kg közötti napi dózisban alkalmazhatjuk. Az egyszeri dózisnak megfelelő hatóanyag mennyiségét az alkalmazandó vivőanyagok és a kezelendő egyed, valamint az alkalmazási mód figyelembevételével kell megválasztani.
Mindazonáltal fontosnak tartjuk tisztázni, hogy egy bizonyos páciens esetében a megfelelő dózisokat számos tényező, például a kiválasztott hatóanyag, a beteg kora, testtömege, általános állapota, neme és étrendje, a kiválasztás sebessége, a különféle hatóanyagok kombinációja és az adott betegség súlyossága ugyancsak befolyásolhatja.
A találmány szerinti vegyületeket alkalmazhatjuk szteroidokkal, például metil-prednizolon-acetáttal kombinációban, amikor is a két hatóanyag immunszuppresszív hatása összegeződik. A szteroid komponenst is adhatjuk orálisan, intravénásán vagy rektálisan, illetve helyileg alkalmazandó vagy inhalációs készítmény formájában. A megfelelő dózisok, például prednizolonacetát esetében 0,1 és 5 mg között lehetnek naponta és testtömeg-kilogrammonként. Rendszerint kezdetben lökésterápiát alkalmazunk 100-500 mg-os dózisokkal, majd később a szteroidok adagolását a beteg állapotától függően a megfelelő szintre csökkenthetjük.
A találmány szerinti vegyületeket más immunszuppresszív hatóanyagokkal - ilyen többek között a rapamicin, az azatioprin, a 15-dezoxi-spergalin, a ciklosporin és az FK.-506 jelű vegyület -, valamint azok kombinációival együttesen is alkalmazhatjuk az immunszuppresszív hatás fokozása céljából. A ciklosporin és az FK.-506 jelű vegyület együttes adását azonban kerülnünk kell, mivel ezeknek az immunszuppresszív hatóanyagoknak az egyidejű alkalmazása során tapasztaltak ellene szólnak az ilyen gyógyszerezésnek. A felsorolt immunszuppresszív hatóanyagok dózisait általában a fentebb tárgyalt tényezők figyelembevételével, valamint az adott vegyülettel kapott gyógyszerkombináció hatékonyságával számolva kell megállapítani.
Az OKT3, amely a humán T-limfociták CD3 felületi antigénjével kölcsönhatásra képes, egértől származó, monoklonáris antitest, ugyancsak együtt adható intravénásán a találmány szerinti vegyületekkel abból a célból, hogy megállapítsuk és visszafordítsuk az allograft kilökődésének akut folyamatát. Ilyen alkalmazásra elsősorban veseátültetésnél kerülhet sor.
A találmány további illusztrációjaként szolgálnak az itt következő részben megadott példák, amelyekről azonban fontos tudni, hogy semmiképpen nem jelenthetik a találmány oltalmi körének korlátozását.
Az itt következő előiratokban található 'H-NMRspektrumokat 500 MHz-nél, Bruker AMX 500 készüléken vettük fel. A kémiai eltolódásokat ppm-ben kifejezve (δ), terametil-szilánra vonatkoztatva adjuk meg. Az analitikai célú nagynyomású folyadékkromatogramok Waters 600E vagy Hewlett Packard 1050 folyadékkromatográfon készültek.
A példákban részletesen leírjuk néhány találmány szerinti vegyület előállítását, ezek szerkezeti képlete szerepel a leíráshoz tartozó mellékletben.
1. példa (S)-[4-Feml-l-(3-fenil-propil)-butil]-{N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát} [(3) képletű vegyidet] előállítása
a) 4-Fenil-butiraldehid ml metilén-dikloridban feloldunk 3,2 ml (20,8 mmol) 4-fenil-bután-l-olt (Aldrich), az oldatot lehűtjük 0 °C-ra, azután előbb 3,2 g elporított 3Á molekulaszitát, majd 5,37 g (24,9 mmol) piridinium-(klórkromát)-ot adunk hozzá. A keletkezett szuszpenziót 0 °C-on keverjük 1 óra hosszáig, ekkor további 2,16 g (10,0 mmol) piridinium-(klór-kromát)-ot adunk az elegyhez, majd hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. További 0,5 órányi kevertetés után a reakcióelegyet dietil-éterrel meghígítjuk és Celite-rétegen átszűrjük, aminek eredményeképpen 2,5 g nyersterméket kapunk. A nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, 5% etil-acetátot tartalmazó hexánnal eluálva az oszlopot, amikor is 700 mg tiszta aldehidet tudunk kinyerni a megfelelő frakciókból. A termék Ή-NMRspektruma a várt szerkezetet igazolja.
b) (3-Fenil-propil)-magnézium-bromid
736 mg (30,3 mmol) magnéziumforgácsot 50 ml tetrahidrofuránnal szobahőmérsékleten keverünk, és közben beadagolunk 50 pl etilén-dibromidot, valamint
5,5 g (25,1 mmol) l-bróm-3-fenil-propánt (Aldrich Chemical Co.). A reakcióelegyet 0,5 órán át szobahőmérsékleten keveijük, azután a leülepedett oldatot egy fecskendő segítségével átszívatjuk egy tárolóedénybe. Az így tárolt Grignard-reagenst 0,5 M tetrahidrofürános oldatként használjuk fel a következő reakciólépéshez.
c) 1,7-Difenil-heptán-4-ol
Bemérünk 700 mg (4,7 mmol) 4-fenil-butiraldehidet és 5,0 ml tetrahidrofuránt, majd 0 °C-on beadagolunk 10,0 ml (5,0 mmol) tetrahidrofürános (3-fenil-propil)-magnézium-oldatot. A reakcióelegyet 30 percig 0 °C-on keverjük, azután cseppenként adagolva telített ammónium-klorid-oldattal megbontjuk, végül dietiléterrel összerázzuk. A nem elegyedő fázisokat elválasztjuk, a szerves fázist vízzel és telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, majd bepároljuk. A visszamaradó 1,12 g olaj a címben megnevezett alkohol, amelynek Ή-NMR-spektruma alátámasztja a várt szerkezetet.
HU 217 621 Β
d) (S)-[4-Feml-l-(3-fenil-propil)-butil]-(N-Boc-pipekolát)
164,2 mg (0,72 mmol) (S)-N-Boc-pipekolinsavat feloldunk 5,0 ml metilén-dikloridban, azután az oldathoz szobahőmérsékleten egymást közvetően 174,7 mg (0,65 mmol), a c) pontban leírtak szerint előállított alkoholt, 140,8 g (0,72 mmol) l-[3-(dimetil-amino)-propil]3-etil-karbodiimid-hidrokloridot, valamint katalitikus mennyiségű 4-(dimetil-amino)-piridint adunk. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten hagyjuk keveredni 0,5 óra hosszáig, azután közvetlenül felvisszük egy szilikagélből készített oszlopra, és az oszlopot 10% etilacetátot tartalmazó hexánnal eluáljuk. Az így kapott 76,2 mg olaj, amint azt az 'H-NMR-spektrum is igazolja, a címben megnevezett észter.
e) (S)-[4-Feml-l-(3-feml-propil)-butil]-pipekolát mg (0,10 mmol) fenti, a d) pontban leírtak szerint kapott észtert feloldunk 1,0 ml metilén-dikloridban, majd szobahőmérsékleten 1,0 ml trifluorecetsavat adunk az oldathoz. A reakcióelegyet 0,5 óra hosszáig szobahőmérsékleten keveredni hagyjuk, majd cseppenként telített kálium-karbonátot adunk hozzá, ilyen módon semlegesítjük, végül a szerves fázist elválasztjuk, vízzel mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk és bepároljuk. Az így kapott 23 mg olaj 'H-NMRspektrummal igazolhatóan a címben megnevezett amin.
f) (3,4,5-Trimetoxi-fenil)-glioxilsav
Bemérünk 9,2 g (43,4 mmol) 3’,4’,5’-trimetoxiacetofenont (Aldrich Chemical Co.), 35 ml piridint és
6,3 g szelén-dioxidot, majd az így kapott oldatot éjszakán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk. A reakcióidő letelte után az elegyet szobahőmérsékletre hűtjük, Celite-rétegen megszűrjük, és a szűrletet bepároljuk. A visszamaradó sötétbarna olajat feloldjuk etil-acetátban, az oldatot 1,0 M sósavval mossuk, majd telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal extraháljuk. A bázikus, vizes oldatot ezt közvetően dietil-éterrel elkeverjük, miközben tömény sósavval meg is savanyítjuk, majd elválasztjuk a nem elegyedő rétegeket. A szerves fázist telített nátrium-klorid-oldattal mossuk és magnézium-szulfáton szárítjuk, aminek eredményeképpen sötétes színű, sárga szilárd anyagot kapunk. Ezt a nyersterméket etil-acetát és hexán elegyéből kristályosítjuk át, ami halványsárga, szilárd terméket eredményez. Az így kapott sav, amelynek a szerkezetét 'H-NMR-spektrummal igazoltuk, 6,8 g.
g) (S)-[4-Fenil-l-(3-fenil-propil)-butil]-{N-[(3,4,5-trimetoxi-fen il)-glioxaloil]-pipekolát}
Bemérünk 23 mg (0,06 mmol) fenti, az e) pontban leírtak szerint előállított vegyületet és 1,0 ml metiléndikloridot, majd oldódás után szobahőmérsékleten beadagolunk 21,8 mg (0,09 mmol) fenti, f) pont szerinti savat és 17,9 mg (0,09 mmol) l-[3-(dimetil-amino)-propil]-3-etil-karbodiimid-hidrokloridot. A keletkezett oldatot 0,5 óra hosszáig szobahőmérsékleten keverjük, majd közvetlenül felvisszük egy szilikagéllel töltött oszlopra, és az oszlopot 15% etil-acetátot tartalmazó hexános oldószereleggyel eluáljuk. Az így kapott 8,4 mg savamid rotamerek keveréke.
'H-NMR-spektrum (500 MHz, CDC13, δ): 7,35-7,06 (m); 5,32 (széles s); 5,00 (széles s); 4,88 (széles s); 4,58 (d); 4,31 (széles s); 3,95 (s), 3,90 (s); 3,89 (s); 3,85 (s); 3,44 (d); 3,21 (t); 3,04 (t); 2,54 (széles s); 2,51 (széles s); 2,42 (széles s); 2,30 (d); 2,15 (d); 1,83-1,21 (m).
2. példa (R és S)-[4-Fenil-l-(3-fenoxi-fenil)-butil]-{(S)-N[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát} [(4) képletű vegyület] előállítása
a) 3-Fenoxi-benzaldehid
1,8 ml (10,3 mmol) 3-fenoxi-benzil-alkoholt (Aldrich Chemical Co.) feloldunk 20 ml metilén-dikloridban, majd az oldathoz szobahőmérsékleten 1,5 g finoman elporított 4Á molekulaszitát, valamint 2,5 g aktivált mangán-dioxidot adunk. Az így keletkezett szuszpenziót 0,5 óra hosszáig szobahőmérsékleten keverjük, ekkor újabb 2,5 g aktivált mangán-dioxidot adunk hozzá, és szobahőmérsékleten folytatjuk a kevertetést további 30 percig. A reagáltatás végeztével az elegyet Celite-rétegen megszűrjük, aminek eredményeképpen 1,84 g olajat kapunk. Ez az olaj a címben megnevezett aldehid, és ezt a termék 'H-NMR-spektruma is alátámasztja.
b) (R és S)-4-Fenil-l-(3-fenoxi-fenil)-bután-l-ol
A címben megnevezett alkoholt az 1. példa c) pontjában megadott eljárást követve állítjuk elő, azaz az ott leírtak szerint 2,0 ml tetrahidrofuránban 190 mg (0,96 mmol) fenti, a) pont szerinti aldehidet és 2,0 ml (1,0 mmol), az 1. példa b) pontjában bemutatott eljárással előállított Grignard-reagenst reagáltatunk. A reagáltatást követően flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk a terméket, melynek során az oszlopot 10% etilacetátot tartalmazó hexánnal eluáljuk. Az így kapott 108 mg racém alkohol szerkezetét 'H-NMR-spektrummal is igazoltuk.
c) (S)-N-[(3,4,5-Trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolinsav
953,3 mg (3,4 mmol) (S)-pipekolinsav-tartarát-sót [lásd M. Egbertson és S. J. Danishefsky: J. Org. Chem. 54, 11 (1989)] felszuszpendálunk 7,0 ml metilén-dikloridban, az oldathoz 0 °C-on hozzáadunk 3,9 ml (22,4 mmol) Ν,Ν-diizopropil-etil-amint és 2,4 ml (18,9 mmol) klór-trimetil-szilánt, azután a reakcióelegyet 30 percig 0 °C-on keveredni hagyjuk. Egy másik reakcióedénybe bemérünk 820 mg (3,4 mmol), az 1. példa f) pontjában leírtak szerint előállított savat, feloldjuk 7,0 ml metilén-dikloridban, azután az így kapott oldathoz 450 μΐ (5,2 mmol) oxalil-dikloridot és 3 csepp Ν,Ν-dimetil-formamidot adunk. Miután a gázfejlődés megszűnt, ezt a második reakcióelegyet teljes egészében hozzáadjuk az elsőhöz, majd 1 órányi szobahőmérsékleten folytatott kevertetés után az elegyet bepároljuk. A párlásí maradékot feloldjuk dietil-éterben, 0,5 M sósavval mossuk, majd telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal extraháljuk. Ezt közvetően a bázikus, vizes oldatot tömény sósavval megsavanyítjuk és dietiléterrel extraháljuk, majd az éteres extraktumot vízzel, valamint telített nátrium-klorid-oldattal mossuk,
HU 217 621 Β magnézium-szulfáton szárítjuk és bepároljuk. Ilyen módon 490 mg, a címben megnevezett savat kapunk, amelynek szerkezetét az Ή-NMR-spektrum is igazolja.
d) (R és S)-[4-Fenil-l-(3-fenoxi-feml)-butil]-{(S)-N[(3,4 5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}
29,4 mg (0,88 mmol) fenti, a c) pontban leírtak szerint előállított savat feloldunk 2,0 ml metilén-dikloridban, szobahőmérsékleten hozzáadunk 11 μΐ (0,13 mmol) oxalil-dikloridot és 3 csepp N,N-dimetilformamidot, majd az elegyet 0 °C-on 30 percig keveredni hagyjuk, azután bepároljuk. A párlási maradékot 1,0 ml benzolban felszuszpendáljuk, és a szuszpenzióhoz hozzáadunk 32,0 mg (0,1 mmol) fenti, b) pont szerinti alkoholt, valamint 13,4 mg (0,1 mmol) ezüstcianidot. Ezt közvetően éjszakán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk a reakcióelegyet, majd szobahőmérsékletre hűtjük és bepároljuk. A visszamaradó nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, 10% etilacetátot tartalmazó hexánnal eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen diasztereomerek keverékeként
8,8 mg, a címben megnevezett észtert kapunk.
Ή—NMR-spektrum (500 MHz, CDC13, δ): 7,34-7,19 (m); 7,18-7,03 (m); 7,02-6,84 (m); 6,83-6,72 (m); 5,73 (q); 5,69-5,55 (m); 5,38 (t);
4,55 (széles d); 4,35 (dd); 3,94 (s); 3,92 (s); 3,89 (s); 3,83 (s); 3,73 (s); 3,63 (s); 3,48-3,35 (m); 3,20 (t); 3,10 (t); 2,60 (q); 2,40 (dd); 1,95-1,91 (m); 1,90-1,45 (m).
3. példa (R és S)-{4-Fenil-l-[2-(3-piridil)-etil]-butil}-{(S)-N[(3,4-5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát} [(7) képletű vegyület] előállítása
a) 3-(3-Piridil)-propionaldehid
2,3 g (5,46 mmol) Dess-Martin-féle perjodinán (D. B. Dess és J. C. Martin: J. Org. Chem. 48, 4155 (1983)] 10 ml metilén-dikloriddal készült oldatához 0 °C-on 470 μΐ (3,65 mmol) 3-(3-piridil)-propán-l-olt adunk, az elegyet mintegy 1,5 óra alatt 0 °C-ról szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, majd a keletkezett oldatot telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldatban 6,0 g (38,22 mmol) nátrium-tioszulfát hozzáadása után még 15 percig keverjük. Az elegyet metilén-dikloriddal extraháljuk, az extraktumot magnézium-szulfáton szárítjuk, majd elpárologtatjuk az oldószert. A visszamaradó nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, hexán és aceton 3:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot. Az így kapott olaj a címben megnevezett aldehid, ezt támasztja alá a felvett Ή-NMR-spektrum is.
b) (R és S)-6-Fenil-l-(3-piridil)-hexán-3-ol
A címben megnevezett alkoholt úgy állítjuk elő, hogy 125 mg (0,92 mmol) fenti, a) pont szerinti aldehidet 2,0 ml tetrahidrofuránban 2,0 ml (1,0 mmol), az 1. példa b) pontjában leírtak szerint kapott Grignard-vegyülettel reagáltatunk, követve az 1. példa c) pontjában bemutatott eljárást. Az így kapott 221 mg nyerstermék Ή-NMR-spektruma összhangban van a felírt szerkezettel.
c) (R és S)-{4-Fenil-l-[2-(3-piridil)-etil]-butil}-[(S)N-Boc-pipekolát]
A címben megnevezett vegyületet 125 mg (0,49 mmol) fenti alkoholból és 93 mg (0,41 mmol) (S)-N-Boc-pipekolinsavból állítjuk elő oly módon, hogy a reaktánsokat 1,0 ml metilén-diklorid és 1,0 ml Ν,Ν-dimetil-formamid elegyében, 94 mg (0,49 mmol) l-[3-(dimetil-amino)-propil]-3-etil-karbodiimid-hidroklorid, valamint katalitikus mennyiségű 4-(dimetilamino)-piridin jelenlétében, az 1. példa d) pontjában leírtak szerint reagáltatjuk. A nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, hexán és etil-acetát 2:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot. Az így kapott 105 mg olaj a címben megnevezett diasztereomerek keveréke, a termék Ή-NMR-spektruma összhangban van a megadott szerkezettel.
d) (R és S)-{4-Fenil-l-[2-(3-piridil)-etil]-butil}-[(S)pipekolát]
A címben megnevezett vegyületet úgy állítjuk elő, hogy 95 mg (0,20 mmol) fenti, c) pont szerinti észtert 3,0 ml metilén-dikloridban 1,0 ml trifluor-ecetsawal reagáltatunk, az 1. példa e) pontjában megadottakat követve. Az így kapott 58 mg olaj diasztereomerek keveréke, és Ή-NMR-spektrum alapján a várt szerkezetű.
e) (R és S)-{4-Fenil-l-[2-(3-piridil)-etil]-butil}-{(S)N-[(3,4 5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}
A címben megnevezett észtert úgy állítjuk elő, hogy 54 mg (0,15 mmol) fenti, d) pont szerinti vegyületet 42 mg (0,22 mmol) l-[3-(dimetil-amino)-propil]-3-etilkarbodiimid-hidroklorid jelenlétében, 3,0 ml metiléndikloridban 50 mg (0,22 mmol) (3,4,5-trimetoxi-fenil)glioxilsavval reagáltatunk az 1. példa g) pontjában megadott eljárást követve. A nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, etil-acetát és hexán 1:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot. Az így kapott 73 mg termék diasztereomer észterek és rotamerek keveréke.
'H-NMR-spektrum (500 MHz, CDC13, δ): 8,48-8,42 (m); 7,50-7,41 (m): 7,32 (d); 7,27-7,03 (m); 5,38 (d); 5,31 (d); 5,06-5,01 (m); 4,97-4,93 (m); 4,60 (széles d); 3,92 (s); 3,88 (s); 3,86 (s); 3,84 (s); 3,82 (s); 3,79 (s); 3,46 (széles d); 3,27 (széles t); 2,73-2,68 (m); 2,38-2,29 (m); 1,98-1,76 (m);
I, 75-1,60 (m); 1,56-1,51 (m); 1,38-1,20 (m).
4. példa (R és S)-[4-Fenil-l-{2-[(E)-transz-4-hidroxi-ciklohexil]-l-metil-vinil}-butil]-{(S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát} [(8) képletű vegyület] előállítása
a) cisz- és transz-4-{[(terc-Butil)-dimetil-szilil]-oxi}ciklohexán-l-ol
3,43 g (21,7 mmol) cisz- és transz-metil-(4-hidroxiciklohexán-karboxilát) [D. S. Noyce és D. B. Denney:
J. Am. Chem. Soc. 74, 5912 (1952)] 45 ml metilén-dikloriddal készített oldatához 0 °C-on előbb 3,0 ml (26,0 mmol) 2,6 lutidint, majd 5,5 ml (23,8 mmol) [(terc-butil)-dimetil-szilil]-(trifluor-metán-szulfonát)-ot adunk. Az adagolás végeztével a jeges fürdőt eltávolítjuk, és az elegyet 25 °C-on hagyjuk keveredni 2 óra hosszáig, majd közvetlenül ezután telített nátrium10
HU 217 621 Β hidrogén-karbonát-oldatra öntjük. A nem elegyedő rétegeket elválasztjuk, a szerves fázist mossuk telített rézszulfát-oldattal és vízzel, majd magnézium-szulfáton szárítjuk. Az ilyen módon nyerstermékként kapott metil-észter tömege 5,9 g.
5,72 g (21,0 mmol) fenti metil-észtert feloldunk 45 ml vízmentes tetrahidrofuránban, az oldathoz 400 mg (10,5 mmol) lítium-[tetrahidrido-aluminát]-ot adunk, azután a reakcióelegyet 0,5 óra hosszáig 25 °C-on keverjük, majd Rochelle-só telített oldatát lassan hozzáadva, a reakciót leállítjuk. Ezt közvetően dietil-éterrel meghígítjuk az elegyet, a nem elegyedő rétegeket elválasztjuk, és a vizes részt kétszer egymás után etil-acetáttal összerázzuk. Az egyesített szerves oldószeres extraktumot magnézium-szulfáton szárítjuk, majd elpárologtatjuk az oldószert, aminek eredményeképpen 4,9 g alkoholt kapunk diasztereomerek elegyeként. A diasztereomer formákat flash-kromatográfiás eljárással választjuk szét, etilacetát és hexán 1:5 arányú elegyével eluálva az oszlopot. A cisz-forma tömege 650 mg, a transz-formáé 1,10 g, és keverékként visszakapunk további 2,4 g terméket.
A cisz-módosulat 1H-NMR-spektruma (300 MHz, CDC13, δ): 3,99-3,92 (m); 3,46 (d); 1,72-1,58 (m); 1,57-1,36 (m); 0, 86 (s); 0,08 (s).
A transz-módosulat 'H-NMR-spektruma (300 MHz, CDClj, δ): (dddd); 3,38 (d); 1,86-1,67 (m); 1,47-1,16 (m); 1,05-0,77 (m); 0,72 (s); 0,02 (s).
b) (E)-Etil-{3-[transz-4-{[(terc-butil)-dimetil-szililjoxi}-ciklohexil]-2-metil- propionát}
785 pl (9,0 mmol) oxalil-dikloridot feloldunk 10 ml metilén-dikloridban, az oldatot lehűtjük -78 °C-ra és hozzáadunk 1,3 ml (18,0 mmol) dimetil-szulfoxidot. Az elegyet 5 percig keverjük, azután beadagoljuk 1,1 g (4,5 mmol) fenti, a) pont szerinti transz-alkohol 10 ml metilén-dikloriddal készült oldatát, további 45 percig -78 °C-on folytatjuk a kevertetést, majd 3,8 ml (27,0 mmol) trietil-amin hozzáadása után hagyjuk a reakcióelegyet szobahőmérsékletre melegedni. Ezt közvetően 1,0 M sósavat adunk az elegyhez, a vizes részt elválasztjuk és háromszor egymás után metiléndikloriddal extraháljuk, majd az egyesített szerves oldószeres extraktumot magnézium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk, aminek eredményeképpen köztitermékként 1,0 g aldehidet kapunk.
450 g (1,86 mmol) fenti aldehid oldatához 5,0 ml metilén-dikloridban oldva közvetlenül hozzáadunk 710 mg (1,95 mmol) [(etoxi-karbonil)-etilidén]-trifenilfoszforánt. Az elegyet éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, másnap vízre öntjük, elválasztjuk a nem elegyedő rétegeket, és a vizes fázist egymást közvetően kétszer metilén-dikloriddal extraháljuk. Az egyesített szerves oldószeres extraktumot magnézium-szulfáton szárítjuk és bepároljuk, aminek eredményeképpen a címben megnevezett terméket kapjuk kevés (Z)-izomerrel szennyezett formában. Az 'H-NMR-spektrum összhangban van a várt szerkezettel.
c) (E)-3-[transz-4-{[(terc-Bittil)-dimetil-szilil]-oxi}ciklohexil]-2-metil-2-propén-l-ol
860 mg (2,6 mmol) fenti, b) pont szerinti észtert feloldunk 5,0 ml vízmentes tetrahidrofuránban, az oldathoz 25 °C-on 50 mg (1,3 mmol) lítium-[tetrahidroaluminát]-ot adunk, majd 30 percig hagyjuk az elegyet keveredni. A reakcióidő leteltével lassú ütemben Rochelle-só telített vizes oldatát adjuk az elegyhez, majd etil-acetáttal meghígítjuk. A nem elegyedő rétegeket elválasztjuk, és a vizes részt kétszer egymás után etil-acetáttal extraháljuk. Az egyesített szerves fázist vízzel és telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, bepároljuk, majd a párlási maradékot flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, 15% etil-acetátot tartalmazó hexánnal eluálva az oszlopot. Az így kapott 370 mg termék a címben megnevezett telítetlen alkohol, az Ή-NMR-spektrum összhangban van a megadott szerkezettel.
d) (E)-3-[transz-4-{[(terc-Butil)-dimetil-szilil]-oxi}ciklohexil]-2-metil-2-propenal
105 pl (1,2 mmol) oxalil-diklorid 1,0 ml metiléndikloriddal készült és -78 °C-ra hűtött oldatához 170 pl (2,4 mmol) dimetil-szulfoxidot adunk. Az így kapott oldatot 5 percig keverjük, azután hozzáadunk 170 mg (0,6 mmol) fenti, a c) pontban leírtak szerint előállított alkoholt 1,0 ml metilén-dikloridban oldva. A reakcióelegyet további 45 percig -78 °C-on keverjük, majd hozzáadunk 500 pl (3,6 mmol) trietil-amint, és hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. Ezt közvetően 1,0 M sósavval megsavanyítjuk az elegyet, a vizes részt háromszor egymás után metilén-dikloriddal extraháljuk, majd az egyesített szerves oldószeres extraktumot magnézium-szulfáton szárítjuk és szárazra pároljuk. Az ilyen módon nyerstermékként kapott aldehidet, amelynek a szerkezetét Ή-NMR-spektrummal igazoltuk, közvetlenül felhasználjuk a következő reakciólépéshez.
e) (R és S)-(E)-l-[transz-4-{[(terc-Butil)-dimetil-szilil]-oxi}-ciklohexil]-6-fenil-2-metil-l-hexén-3-ol
A címben megnevezett alkoholt úgy állítjuk elő, hogy a fenti nyerstermékként kapott aldehidet 2,0 ml tetrahidrofuránban 1,5 ml (0,75 mmol), az 1. példa b) pontjában leírtaknak megfelelően előállított Grignardreagenssel reagáltatjuk. Az 1. példa c) pontjában leírtak szerint kivitelezve a reakciót 220 mg nyersterméket kapunk, amely diasztereomerek keveréke. A nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, 20% etilacetátot tartalmazó hexános oldószereleggyel eluálva az oszlopot. A tisztított termék olaj, amelynek a tömege 146 mg, és a szerkezetét Ή-NMR-spektrum alapján igazolni lehet.
f) (R és S)-(E)-[l-{2-[transz-4-{[(terc-Butil)-dimetilszilil]-oxi}-ciklohexil]-vinil}-4-fenil-butil]-{(S)-N[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil] -pipekolát]} Bemérünk 75,7 mg (0,22 mmol) (S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolinsavat, feloldjuk
2,5 ml metilén-dikloridban, azután szobahőmérsékleten hozzáadunk 30 pl (0,34 mmol) oxalil-dikloridot, valamint 3 csepp Ν,Ν-dimetil-formamidot. Az elegyet 30 percig szobahőmérsékleten hagyjuk keveredni, majd bepároljuk, és a maradékot 1,0 ml benzolban felszuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 43,4 mg (0,11 mmol), az
e) pontban leírtak szerint előállított alkoholt és 28,8 mg (0,22 mmol) ezüst-cianidot adunk, éjszakán át visszafolyató hűtő alatt forraljuk, majd szobahőmérsékletre hűt11
HU 217 621 Β jük és bepároljuk. A párlási maradékot flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, 4% acetont tartalmazó hexánnal eluálva az oszlopot. Az így kapott 17,5 g cím szerinti észter diasztereomerek keveréke, az •H-NMRspektrum megfelel a kémiai szerkezetnek.
g) (R és S)-[4-Fenil-l-{(2-[(E)-transz-4-hidroxi-ciklohexil]-l-metil-vinil}-butil]-{(S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}
17,5 mg (0,02 mmol) fenti, í) pont szerinti észtert feloldunk 1,0 ml acetonitrilben, majd szobahőmérsékleten acetonitril és 5%-os hidrogén-fluorid 95:5 arányú elegyéből 10 cseppet adunk az oldathoz. Az így kapott elegyet 0,5 óra hosszáig szobahőmérsékleten keverjük, azután telített kálium-karbonát-oldattal semlegesítjük és dietil-éterrel extraháljuk. Az éteres extraktumot vízzel mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk és bepároljuk. A visszamaradó 7,2 mg nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, az eluens 15% acetont tartalmazó hexán. A tisztított termék, amelynek a tömege 4,9 mg, a címben megnevezett diasztereomer alkoholok rotamerjeinek keveréke.
•H-NMR-spektrum (500 MHz, CDC13, δ):
7,38-7,02 (m); 5,35-5,01 (m); 4,62-4,53 (m); 4,28 (t); 3,95 (s); 3,89 (s); 3,87 (s); 3,86 (s); 3,85 (s); 3,81 (s);
3,55 (m); 3,45 (m); 3,20 (m); 3,10-2,90 (m); 2,60-2,45 (m); 2,32 (t); 2,10 (t); 1,95 (d); 1,85-1,40 (m); 1,39-1,02 (m).
5. példa (R és S)-[l-Benzil-4-(3-indolil)-butil]-{(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát} [(11) képletű vegyület] előállítása
a) 4-(3-Indolil)-N-metil-N-metoxi-vajsavamid
1,75 g (8,61 mmol) 4-(3-indolil)-vajsav (Aldrich Chemical Co.) acetonitrillel készült oldatához szobahőmérsékleten hozzáadunk 7,0 ml (40,2 mmol) N,Ndiizopropil-etil-amint, 1,0 g (10,3 mmol) N,N-dimetilhidroxil-ammónium-kloridot és 4,19 g (9,5 mmol) [(benzo-triazol-1 -il)-oxi]-trisz(dimetil-amino)-foszfónium-[hexafluoro-foszfát]-ot (BOP-reagens). Az elegyet éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, másnap szárazra pároljuk, majd a párlási maradékot etil-acetátban oldjuk és egymást közvetően vízzel, 0,5 M sósavval, telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, valamint telített nátrium-klorid-oldattal mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk, majd elpárologtatjuk az oldószert, és a visszamaradó nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk. A kromatografálásnál grádienselúciót alkalmazunk, melynek során a kezdetben 2%-os dietil-éter-metilén-diklorid elegyben a dietil-éter arányát 10%-ra növeljük. Ilyen módon 2,0 g, a címben megnevezett savamidot kapunk, amelynek az •H-NMR-spektruma összhangban van a kémiai szerkezettel.
b) Benzil-[3-(3-indolil)-propil]-keton
147 mg (0,60 mmol) fenti, az a) pontban leírtak szerint előállított savamidot feloldunk 4,0 ml tetrahidrofuránban, majd -78 °C-on hozzáadunk 1,31 ml (1,31 mmol) dietil-éterrel készült 1,0 M benzil-magnézium-klorid-oldatot. A reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, majd 3 óra hosszat keverjük, azután 5%-os kálium-hidrogén-szulfát-oldatot adunk hozzá és dietil-éterrel extraháljuk. Az egyesített dietiléteres oldatot telített nátrium-klorid-oldattal mossuk és magnézium-szulfáton szárítjuk, azután a terméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, 25% dietilétert tartalmazó hexános oldószereleggyel eluálva az oszlopot. Ilyen módon 108 mg, a címben megnevezett ketont kapunk, amelynek az 'H-NMR-spektruma alátámasztja a kémiai szerkezetet.
c) (R és S)-l-Fenil-5-(3-indolil)-pentán-2-ol
105 mg (0,38 mmol) fenti, b) pont szerinti keton 3,0 ml metanollal készített és 0 °C-ra hűtött szuszpenziójához 30 mg (0,79 mmol) szilárd nátrium-[tetrahidrido-borát]-ot adunk, azután 3 óra hosszáig keveredni hagyjuk az elegyet. A reakcióidő leteltével 5%-os kálium-hidrogén-szulfát-oldatot adunk az elegyhez, majd dietil-éterrel extraháljuk, a szerves oldószeres extraktumokat egyesítjük, telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, végül magnézium-szulfáton szárítjuk. A nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, az eluens 4% dietil-étert tartalmazó metilén-diklorid. Az így kapott 81 mg fehér, szilárd termék a címben megnevezett vegyület, az 'H-NMR-spektrum összhangban van a kémiai szerkezettel.
d) (R és S)-[l-Benzil-4-(3-indolil)-butil]-[(S)-N-Bocpipekolát]
A címben megnevezett észtert úgy állítjuk elő, hogy 80 mg (0,29 mmol) fenti, c) pont szerinti alkoholt, 82 mg (0,36 mmol) (S)-N-Boc-pipekolinsavat, 66 mg (0,34 mmol) l-[3-(dimetil-amino)-propil]-3-etil-karbodiimid-hidrokloridot és katalitikus mennyiségű 4-(l-pirrolidínil)-piridint 2,0 ml metilén-dikloridban az 1. példa
d) pontjában leírtaknak megfelelően reagáltatunk. A nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, dietil-éter, metilén-diklorid és hexán 4:10:26 arányú elegyével eluálva az oszlopot. Az így kapott 108 mg fehér hab a várt diasztereomer észterek keveréke, ezt támasztja alá a termék Ή-NMR-spektruma is.
e) (R és S)-[l-Benzil-4-(3-indolil)-butil]-[(S)-pipekolát]-monohidroklorid
103 mg (0,21 mmol), a d) pontban leírtak szerint előállított észtert feloldunk 10 ml etil-acetátban, majd -20 °C-on 10 percen át száraz sósavgázt buborékoltatunk át az oszlopon. A sósavgáz-bevezetés leállítását közvetően az oldatot nitrogéngázzal átöblítjük és bepároljuk. A visszamaradó 108 mg nyerstermék a címben megnevezett hidrokloridsó, amelynek az Ή-NMRspektruma összhangban van a kémiai szerkezettel.
f) (R és S)-[l-Benzil-4-(3-indolil)-butil]-[(S)-N[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil] -pipekolát}
108 mg fenti e) pont szerinti nyers hidrokloridsó acetonitrillel készült szuszpenziójához egymás után 91 μΐ (0,52 mmol) N,N-diizopropil-etil-amint, 76 mg (0,31 mmol) (3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxilsavat és 11 mg (0,25 mmol) BOP-reagenst adunk. A reakcióelegyet két napon át szobahőmérsékleten keveijük, utána szárazra pároljuk, majd a párlási maradékot ismét feloldjuk, ezúttal 75 ml etil-acetátban. Az etil-acetátos oldatot egymást közvetően vízzel, 5%-os kálium-hid12
HU 217 621 Β rogén-karbonát-oldattal és telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, végül elpárologtatjuk az oldószert. A visszamaradó nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, 4% dietilétert tartalmazó metilén-dikloriddal eluálva az oszlopot. Ilyen módon 56,7 g tisztított terméket kapunk, amely a címben megnevezett diasztereomer savamidok rotamerjeinek a keveréke, és amelynek a vékonyréteg-kromatográfiás Rrértéke: 0,51, 10% dietil-étert tartalmazó metilén-dikloridban kifejlesztve a kromatogramot.
Ή-NMR-spektrum (500 MHz, CDC13, δ): 7,98 (d);
7,56 (t); 7,38-6,73 (m); 5,38-5,14 (m); 3,90 (m); 3,38 (széles t); 3,10 (széles t); 2,97-2,60 (m); 2,31 (d); 2,10 (d); 1,98-1,17 (m); 0,8 (m).
6. példa (R és S)-(2-Benzil-4-fenil-butil)-{(S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát} [(16) képletű vegyület] előállítása
a) (R és S)-2-Benzil-4-fenil-vajsav
1,06 g (6,43 mmol) 4-fenil-vajsav 20 ml tetrahidrofuránnal készített és 0 °C-ra hűtött oldatához 193 mg (6,43 mmol) 80%-os, ásványolajban diszpergált, szilárd halmazállapotú nátrium-hidridet adunk. Félórányi 0 °Con folytatott kevertetés után 3,2 ml (6,43 mmol) 2,0 M lítium-diizopropilamid-tetrahidrofurán-komplex-oldatot adunk az elegyhez, és az így kapott vörös oldatot további 45 percig 0 °C-on hagyjuk keveredni. Ezt közvetően beadagolunk 765 pl (6,43 mmol) benzil-bromidot, majd engedjük, hogy a reakcióelegy felmelegedjen szobahőmérsékletre, és folytatjuk a kevertetést éjszakán át. Másnap kis részletekben, lassú ütemben telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot adunk az elegyhez, majd éterrel mossuk, azután a bázikus vizes részt szilárd kálium-hidrogén-szulfáttal megsavanyítjuk és etilacetáttal extraháljuk. A szerves oldószeres extraktumokat egyesítjük és telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, végül bepároljuk. Az így kapott 484 mg sav azonos a címben megnevezettel, ezt az Ή-NMR-spektrum is alátámasztja.
b) (R és S)-2-Benzil-4-fenil-bután-l-ol
469 mg (1,84 mmol) fenti, a b) pontban leírtak szerint előállított savat feloldunk 3,0 ml tetrahidrofüránban, majd -78 °C-on beadagolunk 2,03 ml (2,3 mmol) tetrahidrofuránnal készült 1,0 M lítium-[tetrahidro-aluminát]-oldatot, azután a reakcióelegyet éjszakán át szobahőmérsékleten keveijük. Másnap Rochelle-só vizes oldatát adjuk lassan az elegyhez, majd dietil-éterrel extraháljuk a terméket, és a szerves oldószeres extraktumot vízzel, valamint telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, végül bepároljuk. A párlási maradékot flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, 2% dietil-étert tartalmazó metilén-dikloriddal eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen 264 mg, a címben megnevezett alkoholt kapunk. A termék Ή-NMRspektruma összhangban van a kémiai szerkezettel.
c) (R és S)-(2-Benzil-4-fenil-butil)-[(S)-N-Boc-pipekolát]
A címben megnevezett észtert úgy állítjuk elő, hogy 264 mg (1,10 mmol) fenti alkoholt, 302 mg (1,32 mmol) (S)-N-Boc-pipekolinsavat, 253 mg (1,32 mmol) l-[3(dimetil-amino)-propil]-3-etil-karbodiimid-hidrokloridot és katalitikus mennyiségű 4-(l-pirrolidinil)-piridint reagáltatunk 2,0 ml metilén-dikloridban az 1. példa d) pontjában megadottak szerint. A nyersterméket flashkromatográfiás eljárással tisztítjuk, dietil-éter, metiléndiklorid és hexán 1:5:14 arányú elegyével eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen 375 mg diasztereomer észterkeveréket kapunk. A termék Ή-NMRspektruma megfelel a kémiai szerkezetnek.
d) (R és S)-(2-Benzil-4-fenil-butil)-[(S)-pipekolát]hidroklorid mg etil-acetátban feloldunk 375 mg (0,83 mmol) fenti, a c) pontban leírtak szerint előállított észtert, az oldatot lehűtjük -20 °C-ra, majd ezen a hőmérsékleten 10 percig száraz sósavgázt buborékoltatunk át rajta, azután nitrogéngázzal átöblítjük a rendszert. A reakcióelegyet bepárolva 352 mg nyers hidrokloridsót kapunk, amelynek Ή-NMR-spektruma összhangban van a feltétélezett kémiai szerkezettel.
e) (R és S)-(2-Benzil-4-fenil-butil)-(S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát mg (0,14 mmol) fenti, d) pont szerinti nyers hidrokloridsót felszuszpendálunk 2,0 ml acetonitrilben, majd szobahőmérsékleten egymás után hozzáadunk 60 pl (0,35 mmol) N,N-diizopropil-etil-amint, 50 mg (0,21 mmol) (3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxilsavat és 73 mg (0,16 mmol) BOP-reagenst. A reakcióelegyet éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük és másnap szárazra pároljuk. A párlási maradékot ismét feloldjuk, ezúttal 75 ml etil-acetátban, az oldatot egymás után vízzel, 5%-os kálium-hidrogén-szulfát-oldattal, telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és telített nátriumklorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, végül elpárologtatjuk az oldószert. A visszamaradó nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, 4% dietil-étert tartalmazó metilén-dikloriddal eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen a címben megnevezett diasztereomer savamidok rotamerjeinek keverékét kapjuk. A termék tömege: 52,7 mg; vékonyrétegkromatográfiás Rrértéke: 0,9 (metanol:dietil-éter:metilén-diklorid = 1:3:26).
Ή-NMR-spektrum (500 MHz, CDC13, δ): 7,21-7,01 (m); 5,41 (széles s); 4,21 (dd); 4,08 (dd); 4,12 (d); 3,88 (d); 3,95 (s); 3,91 (s); 3,49 (d); 3,39 (dt); 2,80-2,62 (m); 2,38 (széles t); 2,09 (széles s); 1,87-1,20 (m).
7. példa (R és S)-{4-Fenil-l-[3-(2-piridil)-propil}-butil)-{(S)-N[(terc-butil)-glioxaloil]-pipekolát} [(21) képletű vegyület] előállítása
a) (E és Z)-2-(l,3-Dioxán-2-il)-l-(2-piridil)-l-propén
4,6 g (10,2 mmol) [2-(l,3-dioxán-2-il)-etil]-trifenilfoszfónium-bromidot (Aldrich Chemical Co.) felszuszpendálunk 50 ml tetrahidrofüránban, lehűtjük a szuszpenziót 0 °C-ra, majd hozzáadunk 6,4 ml (10,2 mmol) 1.6 M hexános butil-lítium-oldatot. Az így keletkezett vörös oldatot még 30 percig 0 °C-on keveijük, ekkor 880 μΐ (9,3 mmol) 2-piridinkarbaldehidet (Aldrich Che13
HU 217 621 Β mical Co.) adunk hozzá, majd szobahőmérsékleten folytatjuk a kevertetést további 1 óra hosszáig. A reakcióidő letelte után a reakcióelegyet vízre öntjük, dietil-éterrel extraháljuk, majd az egyesített éteres extraktumot magnézium-szulfáton szárítjuk és bepároljuk. A párlási maradékot flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, hexán és etil-acetát 3:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen 0,43 g (E)-3-(l,3-dioxán2-il)-l-(2-piridil)-l-propént és 1,12 g (Z)-3-(l,3-dioxán2-il)-1 -(2-piridil)-1 -propént kapunk. A termékek Ή-NMR-spektrumai összhangban vannak a kémiai szerkezettel.
b) 1 -(1,3-Dioxán-2-il)-3-(2-piridil)-propán
Bemérünk 800 mg (4,2 mmol) fenti, az a) pontban leírtak szerint előállított telítetlen vegyületet, feloldjuk, hozzáadunk 100 mg 10%-os csontszenes palládiumkatalizátort, majd állandó sebességgel 10 percig hidrogéngázt áramoltatunk az oldaton át. Ezt közvetően a reakcióelegyet Celite-rétegen megszűrjük, és a szűrletet bepároljuk, aminek eredményeképpen 805 mg színtelen olaj formájában kapjuk a címben megnevezett acetált. A termék Ή-NMR-spektruma összhangban van a kémiai szerkezettel.
c) 4-(2-Piridil)-butiraldehid
420 mg (2,2 mmol) fenti, b) pont szerinti acetált 4,0 ml tetrahidrofurán és 3,0 ml 4 M sósav elegyében oldunk, az oldatot szobahőmérsékleten keverjük
1,5 óra hosszáig, majd kis részletekben szilárd nátriumhidrogén-karbonátot adva hozzá, semlegesítjük. Az elegyet ezután etil-acetáttal extraháljuk, a szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk és bepároljuk. Az így kapott 288 mg párlási maradék Ή-NMR-spektrum alapján a címben megnevezett aldehid.
d) (R és S)-l-Fenil-7-(2-piridil)-heptán-4-ol
A címben megnevezett alkoholt úgy állítjuk elő, hogy az 1. példa c) pontjában leírtakat követve 3,0 ml tetrahidrofuránban 288 mg (1,93 mmol) fenti aldehidet és 2,3 ml (2,3 mmol), az 1. példa b) pontjában megadottak szerint előállított Grignard-vegyületet reagáltatunk. Ilyen módon 520 mg nyersterméket kapunk, amelynek 'H-NMR-spektruma megfelel a várt szerkezetnek.
e) (R és S)-{4-Fenil-l-[3-(2-piridil)-propil]-butil}[(S)-N-Boc-pipekolát]
A címben megnevezett észtert úgy állítjuk elő, hogy az 1. példa d) pontjában megadottak szerint 520 mg (1,93 mmol) fenti alkoholt, 442 mg (1,93 mmol) (S)-NBoc-pipekolinsavat, 370 mg (1,93 mmol) l-[3-(dimetilamino)-propil]-3-etil-karbodiimid-hidrokloridot és katalitikus mennyiségű 4-(dimetil-amino)-piridint reagáltatunk 4,0 ml metilén-diklorid és 4,0 ml Ν,Ν-dimetilformamid elegyében. A nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, hexán és etil-acetát 3:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen 740 mg olajként kapjuk a diasztereomer észterek keverékét. A termék 'H-NMR-spektruma összhangban van a kémiai szerkezettel.
f) (R és S)-{4-Feml-l-[3-(2-piridil)-propil]-butil}[(S)-pipekolát]
A címben megnevezett amint úgy állítjuk elő, hogy az 1. példa e) pontjában leírtakkal azonos módon eljárva, 740 mg (1,54 mmol) fenti észtert 2,0 ml trifluorecetsav és 5,0 ml metilén-diklorid elegyével reagáltatunk. Az így kapott 580 mg diasztereomer elegy olaj, az Ή-NMR-spektruma összhangban van a kémiai szerkezettel.
g) (R és S)-{4-Feml-l-[3-(2-piridil)-propil]-butil}[(S)-N-metoxalil-pipekolát] mg (0,13 mmol) fenti, az f) pontban leírtak szerint előállított vegyület 1,0 ml metilén-dikloriddal készített és 0 °C-ra hűtött oldatához egymás után 33 μΐ (0,19 mmol) Ν,Ν-diizopropil-etil-amint és 14 μΐ (0,15 mmol) metoxalil-kloridot adunk. A reakcióelegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, éjszakán át keveijük, majd másnap etil-acetáttal meghígítjuk, telített ammónium-kloridoldattal és telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, végül bepároljuk. A párlási maradékot flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, 25-30% etil-acetátot tartalmazó hexánnal eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen a címben megnevezett diasztereomerek rotameijeinek keverékét kapjuk. A termék tömege 49 mg, és Ή-NMR-spektruma összhangban van a kémiai szerkezettel.
h) (R és S)-{4-Fenil-l-[3-(2-piridil)-propil]-butil}{(S)-N-[(terc-butil)-glioxaloil]-pipekolát}
A fenti, g) pont szerinti savamid 1,2 ml tetrahidrofuránnal készített és -78 °C-ra hűtött oldatához cseppenként terc-butil-lítium oldatát adjuk, amíg a vékonyréteg-kromatográfiás analízis azt nem mutatja, hogy a kiindulási vegyület elreagált. Ezt követően a reakcióelegyet telített ammónium-klorid-oldattal megbontjuk és etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumokat egyesítjük, telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk és bepároljuk. A párlási maradékot flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, 30% etil-acetátot tartalmazó hexánnal eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen rotamerek keverékeként a címben megnevezett diasztereomer savamid-észtereket kapjuk.
'H-NMR-spektrum (500 MHz, CDC13, Ő): 8,50 (t);
7,57 (t); 7,20-7,05 (m); 5,23 (d); 5,18 (d); 4,56 (d); 4,44 (széles s); 4,13 (d); 3,69 (széles d); 3,37-3,28 (m); 3,13-3,00 (m); 2,85-2,70 (m); 2,65-2,54 (m);
2,38-2,15 (m); 1,82-1,65 (m); 1,56-1,44 (m); 1,55-1,30 (m); 1,27 (s); 1,21 (s).
8. példa (R és S)-{4-Fenil-l-[3-(3-piridil)-propil]-butil}-{(S)-N[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}-N-oxid (22) képletű vegyület] előállítása
a) (E és Z)-3-(l,3-Dioxán-2-il)-l-(3-piridil)-propén
9,9 g (22,4 mmol) [2-(l,3-dioxán-2-il)-etil]-trifenilfoszfónium-bromidot (Aldrich Chemical Co.) felszuszpendálunk 50 ml tetrahidrofuránban, a szuszpenziót lehűtjük 0 °C-ra, majd beadagolunk 14,0 ml (22,4 mmol)
1,6 M hexános butil-lítium-oldatot. Vörös oldat keletkezik, amelyet még 30 percig 0 °C-on keverünk, majd hozzáadunk 1,8 ml (18,7 mmol) 3-piridinkarbaldehidet (Aldrich Chemical Co.), utána szobahőmérsékleten folytatjuk a kevertetést további 1,5 óra hosszáig, végül a reakcióelegyet vízre öntjük és dietil-éterrel extra14
HU 217 621 Β háljuk. Az egyesített éteres extraktumot magnéziumszulfáton szárítjuk és bepároljuk, majd a párlási maradékot flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, hexán és etil-acetát 2:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot. Az így kapott 3,3 g termék a címben megnevezett izomer olefinek keveréke, az 'H-NMR-spektrum összhangban van a kémiai szerkezettel.
b) l-(l,3-Dioxán-2-il)-3-(3-piridil)-propán
Bemérünk 3,2 g (16,7 mmol) fenti, az a) pontban leírtak szerint előállított telítetlen vegyületet, az oldathoz 300 mg 10%-os csontszenes palládiumkatalizátort adunk, azután állandó sebességgel 10 percen át hidrogéngázt buborékoltatunk át rajta. Ezt közvetően Celiterétegen megszűrjük a reakcióelegyet, majd bepároljuk, aminek eredményeképpen 2,8 g, a címben megnevezett acetált kapunk. A termék Ή-NMR-spektruma megfelel a kémiai szerkezetnek.
c) 4-(3-Piridil)-butiraldehid
1,5 g (7,8 mmol) fenti, a b) pontban megadottak szerint előállított acetált feloldunk 10,0 ml tetrahidrofurán és 10,0 ml 4 M sósav elegyében, az oldatot éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, majd másnap lassan, kis részletekben szilárd nátrium-hidrogén-karbonátot adva hozzá, semlegesítjük. Ezt közvetően etilacetáttal extraháljuk az elegyet, az extraktumot magnézium-szulfáton szárítjuk és bepároljuk. Az így kapott
1,1 g maradék a címben megnevezett aldehid, az Ή-NMR-spektrum összhangban van a kémiai szerkezettel.
d) (R és S)-l-Fenil-7-(3-piridil)-heptán-4-ol
A címben megnevezett alkoholt úgy állítjuk elő, hogy az 1. példa c) pontjában leírt eljárást követve
1,1 g (7,4 mmol) fenti aldehidet és 8,1 ml (8,1 mmol), az 1. példa b) pontja szerint előállított Grignard-reagenst reagáltatunk 30 ml tetrahidrofuránban. A kapott alkoholt, amelynek Ή-NMR-spektruma megfelel a kémiai szerkezetnek, tisztítás nélkül, nyerstermékként használjuk fel a következő reakciólépéshez.
e) (R és S)-{4-Fenil-l-[3-(3-piridil)-propil]-butil}[(S)-N-Boc-pipekolát]
A címben megnevezett észtert úgy állítjuk elő, hogy 8,0 ml metilén-diklorid és 8,0 ml Ν,Ν-dimetil-formamid elegyében az 1. példa d) pontjábanmegadott eljárást követve, 1,65 g (6,12 mmol) fenti alkoholt, 1,54 g (6,73 mmol) (S)-N-Boc-pipekolinsavat, 1,29 g (6,73 mmol) l-[3-(dimetil-amino)-propil]-3-etil-karbodiimid-hidrokloridot és katalitikus mennyiségű 4-(dimetil-amino)-piridint reagáltatunk. A nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, hexán és etilacetát 2:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot, így 1,42 g olajként kapjuk a diasztereomer észterek keverékét. Az Ή-NMR-spektrum összhangban van a kémiai szerkezettel.
f) (R és S)-{4-Fenil-l-[3-(3-piridil)-propil]-butil}[(S)-pipekolát]
A címben megnevezett, a védőcsoporttól megszabadított amint úgy állítjuk elő, hogy 1,42 g (2,95 mmol) fenti észtert 2,0 ml trifluor-ecetsav és 8,0 ml metiléndiklorid elegyével reagáltatunk az 1. példa e) pontjában leírtaknak megfelelően. Az így kapott 1,02 g olaj a cím szerinti diasztereomerek keveréke, az 'H-NMR-spektrum összhangban van a kémiai szerkezettel.
g) (R és S)-{4-Fenil-l-[3-(3-piridil)-propil]-butil}{(S)-N-[(3.4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}
A címben megnevezett észtert úgy állítjuk elő, hogy az 1. példa g) pontjában megadottak szerint, 6,0 ml metilén-dikloridban 995 mg (2,61 mmol) fenti amint, 645 mg (2,87 mmol), az 1. példa f) pontjában leírtaknak megfelelően előállított (3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxilsavat és 551 mg (2,87 mmol) l-[3-(dimetil-amino)-propil]-3-etil-karbodiimid-hidrokloridot reagáltatunk. A nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, aceton és hexán 3:1 arányú elegyével eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen rotamerek keverékeként kapjuk a címben megnevezett diasztereomer észtereket. A termék tömege 976 mg, az 'H-NMR-spektrum összhangban van a kémiai szerkezettel.
h) (R és S)-{4-Feml-l-[3-(3-piridil)-propil]-butil}{(S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}-N-oxid mg (0,02 mmol) fenti, a g) pontban leírtak szerint előállított vegyületet feloldunk 2,0 ml metilén-dikloridban, szobahőmérsékleten 9,3 μΐ (0,03 mmol) 55%-os
3-klór-perbenzoesavat adunk az oldathoz, majd éjszakán át szobahőmérsékleten keveredni hagyjuk az elegyet. A nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, acetonnal eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen rotamerek keverékeként 12,6 g, a címben megnevezett N-oxidot kapunk.
'H-NMR-spektrum (500 MHz, CDC13, δ):
8,10 (m); 7,46-7,02 (m); 5,88 (d); 5,80 (d); 5,06-5,00 (m); 4,95-4,89 (m); 4,61 (m); 4,31 (dd); 3,87 (s); 3,84 (s); 3,83 (s); 3,81 (s); 3,78 (s); 3,50 (széles d); 3,27 (ddd); 3,12 (ddd); 3,00 (ddd); 2,67-2,49 (m); 3,32 (széles d); 1,86-1,78 (m); 1,55-1,50 (m);
1,39-1,22 (m).
9. példa (R és S)-{4-Fenil-l-[3-(7-purinil)-propil]-butil)-{(S)N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát} [(25) képletű vegyület] előállítása
a) 4-Klór-butiraldehid
19,1 g (0,15 mmol) 4-klór-bután-l-ol (Aldrich Chemical Co.) 50 ml metilén-dikloriddal készített oldatához 0 °C-on hozzáadunk 1,0 g finoman elporított 4Á molekulaszitát és 38,7 g (0,18 mmol) piridinium-dikromátot, majd az így keletkezett szuszpenziót még 45 percig 0 °C-on keverjük. A reakcióidő leteltével az elegyet dietil-éterrel meghígítjuk, Celite-rétegen megszűrjük és bepároljuk. A párlási maradékot vákuumdesztillációval tisztítjuk, aminek eredményeképpen 5,0 g, 45-55 °C forráspontú olajként kapjuk a címben megnevezett aldehidet. A termék 'H-NMR-spektruma összhangban van a kémiai szerkezettel.
b) (R és S)-l-Fenil-7-klór-heptán-4-ol
A címben megnevezett alkoholt úgy állítjuk elő, hogy az 1. példa c) pontjában leírt eljárást követve 182 mg (1,7 mmol) fenti aldehidet és 1,9 ml (1,9 mmol), az 1. példa b) pontja szerint előállított Grignard-reagenst
HU 217 621 Β reagáltatunk 20,0 ml tetrahidrofuránban. Az így kapott 128 mg nyersterméket, amelynek >H-NMR-spektruma összhangban van a kémiai szerkezettel, tisztítás nélkül használjuk fel a következő reakciólépéshez.
c) (R és S)-[4-Fenil-l-(3-klór-propil)-butil]-[(S)-N-Bocpipekolát]
A címben megnevezett észtert úgy állítjuk elő, hogy az 1. példa d) pontjában leírtakat követve 128 mg (0,56 mmol) fenti alkoholt, 156 mg (0,68 mmol) (S)-NBoc-pipekolinsavat, 130 mg (0,68 mmol) l-[3-(dimetilamino)-propil]-3-etil-karbodiimid-hidrokloridot és katalitikus mennyiségű 4-(l-pirrolidinil)-piridint reagáltatunk 2,0 ml metilén-dikloridban. A nyersterméket flashkromatográfiás eljárással tisztítjuk, dietil-éter, metiléndiklorid és hexán 1:5:14 arányú elegyével eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen 159 mg diasztereomer keveréket kapunk. Az Ή-NMR-spektrum összhangban van a kémiai szerkezettel.
d) (R és S)-{4-Fenil-l-[3-(7-purinil)-propil]-butil}{(S)-N-Boc-pipekolátj mg (0,28 mmol) purint feloldunk 3,0 ml Ν,Νdimetil-formamidban, szobahőmérsékleten 8,4 mg (0,28 mmol) 80%-os, ásványolajban diszpergált, szilárd halmazállapotú nátrium-hidridet adunk az oldathoz, majd további 10 percig szobahőmérsékleten keveredni hagyjuk. Ezt közvetően az elegyhez hozzáadunk 62 mg (0,14 mmol) fenti, a c) pontban leírtak szerint előállított klórvegyületet és 10 mg nátrium-jodidot, utána éjszakán át szobahőmérsékleten keverjük, majd szárazra pároljuk. A párlási maradékot feloldjuk etil-acetátban, egymás után vízzel, telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, magnézium-szulfáton szárítjuk, végül elpárologtatjuk az oldószert. A visszamaradó anyagot flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, ammónium-hidroxid, metanol és metilén-diklorid 50:10:85 arányú elegyét 15%-os mennyiségben tartalmazó metilén-dikloriddal eluálva az oszlopot. Az így kapott 56 mg olaj a címben megnevezett purinszármazék, az Ή-NMR-spektrum összhangban van a kémiai szerkezettel.
e) (R és S)-{4-Fenil-l-[3-(7-purinil)-propilJ-butil}{(S)-pipekolátj-hidroklorid
53,7 mg (0,10 mmol) fenti, a d) pontban leírtak szerint előállított észter 10 ml etil-acetáttal készített és -20 °C-ra lehűtött oldatán keresztül száraz sósavgázt buborékoltatunk 10 percig, majd nitrogéngázzal megszabadítjuk az elegyet a sósav feleslegétől. Ezt közvetően a reakcióelegyet bepároljuk, aminek eredményeképpen a nyerstermék hidrokloridsót kapjuk. Az •H-NMR-spektrum összhangban van a kémiai szerkezettel.
f) (R és S)-{4-Fenil-l-[3-(7-purinil)-propil]-butil}{(S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}
A fenti, f) pont szerinti nyersterméket felszuszpendáljuk acetonitrilben, a szuszpenzióhoz sorban hozzáadunk 45 μΐ (0,26 mmol) N,N-diizopropil-etil-amint, 37 mg (0,15 mmol) (3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxilsavat és 54 mg (0,12 mmol) BOP-reagenst, majd két napon át szobahőmérsékleten keveredni hagyjuk az elegyet, azután szárazra pároljuk. A párlási maradékot újból feloldjuk, ezúttal 75 ml etil-acetátban, majd egymást közvetően vízzel, 5%-os kálium-hidrogén-szulfát-oldattal, telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és telített nátrium-klorid-oldattal mossuk, a szerves fázist magnézium-szulfáton szárítjuk, végül elpárologtatjuk az oldószert. A visszamaradó nyersterméket flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk, metanol, dietil-éter és metiléndiklorid 1:4:36 arányú elegy ével eluálva az oszlopot, aminek eredményeképpen rotamerek keverékeként 26,5 mg, a címben megnevezett diasztereomer amidot kapunk. A termék vékonyréteg-kromatográfiás Rr értéke: 0,1 (30% dietil-éter metilén-dikloridban).
•H-NMR-spektrum (500 MHz, CDC13, δ):
9,11 (s); 8,95 (m); 7,36-7,05 (m); 5,31 (m); 4,28 (m); 3,90 (m); 3,46 (széles t); 3,20 (m); 2,58 (m); 2,28 (széles d); 2,17-1,18 (m).
10. példa
Biológiai vizsgálatok
A kísérletekhez használt sejtek kiválasztása és tenyésztése
Friss perifériás vérlimfocitákat (PBL) Leukopak sejtekből vagy HÍV- és hepatitis-negatív, közönséges donoroktól vett és véletlenszerűen kiválasztott teljes vérből nyertünk ki Histopaque 1077 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) készüléken végzett grádienscentrifügálással.
Az egér CTLL citotoxikus T-sejtvonal és a humán JURKAT T-sejtvonal az ATCC-től származott (CTLL2 ATCC TIB214, JURKAT CLONE E6-1 ATCC TIBI 52).
A humán allogén B-sejtvonal, amely a friss perifériás vérlimfociták aktiválására szolgált, egészséges, felnőtt, két teljesen különböző HLA-haplotípushoz tartozó donortól származó, Eppstein-Barr-vírus által transzformált limfocitákból állt.
Gibco Mycotect kit segítségével rutinszerűen elvégeztük a vizsgálatot, hogy megállapítsuk az esetleges mikoplazma-fertőzöttséget, azonban minden esetben mikoplazmamentesnek találtuk a sejteket. A sejttenyészetekhez RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY) tápoldatot használtunk, amely 50 E/ml penicillint, 50 μΐ/ml sztreptomicint, 2 mM koncentrációban L-glutamint, 5 χ I0 5 arányban 2-merkapto-etanolt, 10%, hőkezeléssel inaktivált magzati borjúszérumot (FBS) és 10 mM koncentrációban HEPES-puffert tartalmazott. Hatóanyagoldatok és biológiai titrálás
A törzsoldatokat minden esetben dimetil-szulfoxiddal készítettük. A hatóanyagok biológiai titrálása a tápoldatokban történt. Az egyes mérések kivitelezése során például komplett RPMI vagy HB 104 tápoldatokat használtunk, többszöri háromszoros hígításokat készítve az 1 μΜ vagy 10 μΜ koncentrációjú törzsoldatokból.
MTT-módszer
Az MTT-módszer néven ismert mérési eljárás alkalmazása során kolorimetriás technikával határozzuk meg a hatóanyagok limfoid és nem limfoid sejtvonalakra gyakorolt toxikus hatását (T. Mossman: J. Immunoi.
HU 217 621 Β
Methods 65, 55 (1983)]. A mérés azon alapszik, hogy az intakt mitokondriumokban a 3-(4,5-dimetil-tiazol-2il)-2,5-difenil-tetrazólium-bromid (MTT) redukálódik. A sejtek életképességét szérummentes tápoldatban (HB 104, HANA Biologic, Inc.) hatóanyag nélkül, illetve a hatóanyag különböző koncentrációinak jelenlétében mértük MTT segítségével. Eszerint 4 órával a kísérlet kezdete előtt, valamint a toxicitási vizsgálat harmadik napján 20 pl, 5 mg/ml koncentrációjú, 7,2-es pH-jú foszfátpufferben oldott MTT-szinezéket adunk egy mikrotitráló tál kisérlethelyein található tenyészetekhez. Az inkubációs idő leteltével a tápoldatot minden egyes kísérleti helyről leszívatjuk, és 100 pl, sósavtartalomra nézve 0,04 M koncentrációjú, megsavanyított izopropil-akohollal a festéket oldatba visszük, majd egy Molecular Devices Thermomax leolvasóberendezés segítségével, Softmax programot alkalmazva (Menlo Park, CA), 570 nm-nél méljük az optikai sűrűséget, és azonnal levonjuk belőle a 630 nm-nél kapott értékeket. Az eredményeket átlagoljuk és a kontrolikísérletben kapott értékhez - az alatt a hatóanyag nélküli kísérlet adatait értjük - viszonyítva kiszámítjuk az 50%-os toxicitást mutató dózisokat (TC50).
A mitogén hatást („PMA” és „OKT3”) ellensúlyozó képesség mérése
A hatóanyagoknak vizsgáltuk azt a képességét, hogy milyen mértékben képesek a humán perifériás vérlimfociták mitogénekkel kiváltott proliferációját gátolni [W. K. Waithe and K. Hirschhom: Handbook of Experimental Immunology, 3d Ed. Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978); Β. B. Mishell and S. M. Shiigi: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co., San Francisco, CA (1980)]. A vizsgálat során hatóanyag nélkül vagy a hatóanyag különböző koncentrációinak jelenlétében, valamint a kontrollként használt ciklosporin A, FK506 vagy pagamicin jelenlétében 5 χ 104 sejtet stimuláltunk OKT3-mal 104 végső hígításban, illetve phorbol-mirisztát-acetát és ionomicin együttesével, ahol az előbbi koncentrációja 10 ng/ml, az utóbbié 250 ng/ml volt. A kísérleteket legömbölyített fenekű, lyukakkal ellátott mikrotitráló tálcán végeztük, egy-egy kísérleti helyen a végső térfogat 200 pl volt. 49 órányi, 37 °C-on, 5% szén-dioxidot tartalmazó atmoszférában folytatott inkubálás után a sejttenyészetekhez [3H]timidint adtunk, majd 24 órával később a sejteket egy Tóm Tek sejtharveszterrel kinyertük, és LKB Bszcintillációs számlálóberendezésben mértük a radioaktivitást. A cpm-ben kapott eredményeket összevetve a hatóanyag nélkül lefolytatott kontrollkísérletben kapott értékekkel, kiszámíthatjuk azt a koncentrációt (IC50), amely a radioaktivitás 50%-os csökkenését eredményezi.
Kevert limfocitareakción alapuló biológiai mérés („LB és „JVM)
A perifériás vérlimfociták antigének által kiváltott proliferációját vizsgáltuk primer kevert limfocitareakcióban, hatóanyag nélkül, a vizsgálandó hatóanyag különböző koncentrációinak jelenlétében, illetve a kontrollként szolgáló hatóanyagok jelenlétében.
5x1ο4 friss perifériás vérlimfocitát stimuláltunk Mitomycin C-vel kezelt, allogén, Eppstein-Barr-vírus által transzformált, B-limfoblasztoid sejtekkel (LB és JVM), a sejtszám: 5xl03. A vizsgálathoz 96 legömbölyített fenekű kísérleti helyes mikrotitráló tálcát használtunk, egy-egy kísérleti helyen a végső térfogat 200 pl volt [Β. B. Mishell and S. M. Shiigi: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co., San Francisco, CA (1980); P. A. Nelson et al.: Transplantation 50, 286 (1990)]. A sejttenyészetekhez a 6. napon adtuk a radioaktív timidint, majd 24 órával később a sejteket kinyertük, és az imént leírtak szerint mértük a radioaktivitást.
LL-2 mikrovizsgálat („ CTLL ”)
Annak megállapítására, hogy a vizsgálati anyagok gátolják-e a T-sejtek citokinnel összefüggésbe hozható, késői aktiválódását, az IL-2-dependens, egér CTLL20 sejtvonal (ATCC) proliferációját vizsgáltuk [S. Gillis et al.: J. Immunology 120, 2027 (1978)]. A ciklosporin A és az FK-506 jelű vegyület az aktivált Tsejtek IL-2-termelését gátolják, míg a rapamicin más módon fejti ki a hatását, az IL-2 funkciójában okoz zavarokat. Következésképpen a rapamicin gátolja a citotoxikus T-sejtek IL-2 által kiváltott proliferációját, a ciklosporin A és az FK-506 jelű vegyület azonban nem [F. J. Dumont et al.: J. Immunolgy 144, 251 (1990)]. A vizsgálat során 3χ 103 sejtet 1 E/ml humán, rekombináns IL-2 (Genzyme, rIL-2) jelenlétében a vizsgálandó hatóanyagok, illetve az összehasonlító vegyületek különböző koncentrációi hatásának tettünk ki 24 órányi időtartamra. 4 órával a hatóanyag hozzáadása után 1 pCi [3H]timidint adtunk a sejttenyészetekhez, és 20 órányi, 37 °C-on, 5% szén-dioxid jelenlétében folytatott inkubálás után a sejteket az előzőekben ismertetett módon kinyertük, majd megmértük a sejtfrakció radioaktivitását.
Biológiai hozzáférhetőség
Az 1. táblázatban 20-as sorszámmal jelölt vegyület biológiai hozzáférhetőségét vizsgáltuk patkányokon. 50 mg/kg-os egyetlen dózist kaptak az állatok orálisan, szondán keresztül, illetve intraperitoneálisan, injekció formájában, amikor is a vivőanyag 10% etanolt tartalmazó olívaolaj volt. 0,5, 1, 2, 4, 8 és 12 óra múlva az állatokat leöltük, a vért nátrium-heparinnal kezeltük és azonnal lefagyasztottuk. A teljes vért acetonitril és metanol 90:10 térfogatarányú elegyével extraháltuk, és nagynyomású folyadékkromatográfiás módszerrel mértük a vér milliliterenkénti hatóanyag-tartalmát. A mérési adatok szerint intraperitoneális beadás után a vérszint 0,5, 1, 2, 4 és 8 óra múlva ugyanebben a sorrendben: 0,7 pM, 22 pM, 225 pM, 45 pM és 1 pM volt. Orális beadás után 0,5, 1, 2, 4 és 8 óra múlva ugyanebben a sorrendben a következő értékeket mértük: 0,5 pM, 1 pM, 2 pM, 12 pM és 3 pM.
Az intraperitoneális beadás után mért vérszintek azt mutatják, hogy a hasüregből a hatóanyag a biológiailag aktív szerkezet megtartásával szívódik fel és kerül be a keringésbe. A vérszintek elég magasnak bizonyultak ahhoz, hogy immunszuppresszív hatás fejlődjön ki.

Claims (9)

1. Eljárás az (I) általános képletű vegyületek amely képletben
B jelentése hidroxi-(3-8 szénatomos cikloalkil)-csoporttal szubsztituált 2-6 szénatomos alkenilcsoport; fenil-, naftil-, piridil-, N-oxi-piridil- vagy purinilcsoporttal szubsztituált 1-6 szénatomos alkilcsoport; vagy fenoxi-fenil-csoport;
D jelentése fenil-, naftil- vagy indolilcsoporttal szubsztituált 1-6 szénatomos alkilcsoport;
L jelentése 1 -6 szénatomos alkilcsoport vagy egy vagy több 1-6 szénatomos alkoxi-csoporttal szubsztituált fenilcsoport;
m értéke 0, 1, 2 vagy 3;
n értéke 1, 2 vagy 3; és az 1-es és 2-es jelzésű szénatomok egymástól függetlenül (R)- vagy (S)-konfígurációjúak és gyógyszerészetileg elfogadható sóik tiszta sztereoizomerek vagy keverékeik formájában való előállítására, azzal jellemezve, hogy
i) egy (X) általános képletű védett aminosavat - ahol
P jelentése egy amino-védőcsoport; és n értéke az (I) általános képletnél megadott egy (XI) általános képletű alkohollal - ahol B és D jelentése és m értéke az (I) általános képletnél megadott
- észteresítve egy (XII) általános képletű vegyületté alakítunk; majd ii) a (XII) általános képletű vegyületet a védőcsoport eltávolításával egy (XIII) általános képletű aminosav-észterré alakítjuk; és iii) a (XIII) általános képletű vegyületet szabad aminocsoportján egy (XIV) általános képletű savval - ahol L jelentése az (I) általános képletnél megadott vagy annak egy aktivált származékával (I) általános képletű vegyületté acilezzük, és a kapott vegyületet kívánt esetben ismert módon sójává alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás 750-nél kisebb relatív molekulatömegű (I) általános képletű vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás 500-nál kisebb relatív molekulatömegű (I) általános képletű vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás az (I) általános képletű vegyületek körébe tartozó (Γ) általános képletnek megfelelő {4-fenil-1 - [3-(2-piridil)-propil] -butil} - {(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-prolinát}, [4-fenil-l-(3-fenil-propil)-butil]-{(S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}, [4-fenil-l-(2-fenoxi-fenil)-butil]-{(S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}, {4-fenil-l-[2-(3-piridil)-etil]-butil}-{(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}, {4-fenil-1 -[(E)-íran5z-3-(4-hidroxi-ciklohexil)-2metil-allil]-butil}-{(S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)glioxaloilj-pipekolát}, {4-fenil-1 - [3-(3-piridí l)-propí 1] -butil} - {(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}, [ 1 -benzil-4-(3-indolil)-butil]- {(S)-N-[(3,4,5-trimetoxifenil)-glioxaloil]-pipekolát}, (2-benzil-4-fenil-butil)-{(S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)glioxaloilj-pipekolát}, {4-fenil-1 -[3-(2-piridil)-propil]-butil} - {(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}, {4-fenil-1 - [3-(2-piridil)-propil]-butil} - {(S)-N-f(tercbutil)-glioxaloil]-pipekolát}, {4-fenil-1 - [3-(3 -piridil)-propil]-butil} - {(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}-N-oxid, {4-fenil-l-[3-(7-purinil)-propil]-butil}-{(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}, {4-fenil-l-[3-(3-piridil)-propil]-butil}-{(S)-N-[(3izopropoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}, [5-fenil-l-(3-fenil-propil)-pentil]-{(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát} vagy [6-fenil-l-(3-fenil-propil)-hexil]-{(S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát} előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
5. Eljárás hatóanyagként (Γ) általános képletű vegyületeket - ahol a szubsztituensek jelentése az 1. igénypontban megadottakkal azonos - tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerint előállított (Γ) általános képletű hatóanyagot, adott esetben egy vagy több további immunszuppresszáns hatású vegyülettel együtt egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval és adott esetben egyéb segédanyagokkal keverünk, és a kapott keveréket ismert módszerekkel emlősben immunválasz elnyomására alkalmas gyógyszerkészítménnyé formázzuk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy további immunszuppresszánsként szinergista hatást nem okozó ciklosporint, rapamicint, FK-506-ot, 15dezoxi-spergualint, OKT3-at vagy azatioprint is adunk a keverékhez.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy szinergista hatást nem okozó szteroidot is adunk a keverékhez.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy beültetett szövet kilökődésével kapcsolatos immunválasz elnyomására alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.
9. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy (Γ) általános képletű hatóanyagként {4-fenil-1-[3-(2-piridil)-propil]-butil}-{(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-prolinát}-ot, [4-fenil-l-(3-fenil-propil)-butil]-{(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}-ot, [4-fenil-1-(2-fenoxi-fenil)-butil]-{(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}-ot, {4-fenil-1 -[2-(3-piridiI)-etil]-butil}-{(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}-ot, {4-fenil-l-[(E)-Zransz-3-(4-hidroxi-ciklohexil)-2metil-allil]-butil}-{(S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)glioxaloilj-pipekolát} -ot, {4-fenil- l-[3-(3-piridil)-propil]-butil}-{(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}-ot,
HU217 621 Β [l-benzil-4-(3-indolil)-butil]-{(S)-N-[(3,4,5-trimetoxifenil)-glioxaloil]-pipekolát}-ot, (2-benzil-4-fenil-butil)-{(S)-N-[(3,4,5-trimetoxi-fenil)glioxaloil]-pipekolát} -ot, {4-fenil-l-[3-(2-piridil)-propil]-butil}-{(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}-ot, {4-fenil-l-[3-(2-piridil)-propil]-butil}-{(S)-N-[(tercbutil)-glioxaloil]-pipekolát} -ot, {4-fenil-l-[3-(3-piridil)-propil]-butil}-{(S)-N-[(3,4,5trimetoxi-fenil)-glioxaloil] -pipekolát} -N-oxidot, {4-fenil-l-[3-(7-purinil)-propil]-butil}-{(S)-N-[(3,4,5 trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}-ot, {4-fenil-l-[3-(3-piridil)-propil]-butil}-{(S)-N-[(3 izopropoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}-ot,
5 [5-fenil-l-(3-fenil-propil)-pentil]-{(S)-N-[(3,4,5 trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}-ot vagy [6-fenil-l-(3-fenil-propil)-hexil]-{(S)-N-[(3,4,5 trimetoxi-fenil)-glioxaloil]-pipekolát}-ot
HU9303184A 1991-05-09 1992-05-11 Eljárás új glioxaloil-pipekolinsav-észterek, származékaik és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására HU217621B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69778591A 1991-05-09 1991-05-09
PCT/US1992/003913 WO1992019593A1 (en) 1991-05-09 1992-05-11 Novel immunosuppressive compounds

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT68332A HUT68332A (en) 1995-06-28
HU217621B true HU217621B (hu) 2000-03-28

Family

ID=24802529

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9303184A HU217621B (hu) 1991-05-09 1992-05-11 Eljárás új glioxaloil-pipekolinsav-észterek, származékaik és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP0584223B1 (hu)
JP (1) JP3145709B2 (hu)
KR (1) KR100244372B1 (hu)
AT (1) ATE183178T1 (hu)
AU (1) AU1995792A (hu)
CA (1) CA2102180C (hu)
DE (1) DE69229782T2 (hu)
DK (1) DK0584223T3 (hu)
ES (1) ES2137186T3 (hu)
FI (1) FI104967B (hu)
GR (1) GR3031825T3 (hu)
HK (1) HK1013994A1 (hu)
HU (1) HU217621B (hu)
WO (1) WO1992019593A1 (hu)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ314207A (en) * 1992-09-28 2000-12-22 Vertex Pharma 1-(2-Oxoacetyl)-piperidine-2-carboxylic acid derivatives as multi drug resistant cancer cell sensitizers
US5798355A (en) * 1995-06-07 1998-08-25 Gpi Nil Holdings, Inc. Inhibitors of rotamase enzyme activity
US5744485A (en) * 1994-03-25 1998-04-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Carbamates and ureas as modifiers of multi-drug resistance
US5696135A (en) 1995-06-07 1997-12-09 Gpi Nil Holdings, Inc. Inhibitors of rotamase enzyme activity effective at stimulating neuronal growth
GB2325230A (en) * 1995-06-07 1998-11-18 Guilford Pharm Inc Intermediate for Neurotrophic N-glyoxylprolyl esters
US5859031A (en) 1995-06-07 1999-01-12 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule inhibitors of rotamase enzyme activity
US6037370A (en) * 1995-06-08 2000-03-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods and compositions for stimulating neurite growth
US5801197A (en) * 1995-10-31 1998-09-01 Gpi Nil Holdings, Inc. Rotamase enzyme activity inhibitors
KR100257550B1 (ko) * 1996-03-15 2000-07-01 타이도 나오카타 신규 피리딘 유도체 및 이를 유효성분으로 하는 의약
US5717092A (en) * 1996-03-29 1998-02-10 Vertex Pharmaceuticals Inc. Compounds with improved multi-drug resistance activity
US5786378A (en) * 1996-09-25 1998-07-28 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic thioesters
US6218424B1 (en) 1996-09-25 2001-04-17 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic ketone and thioester compounds and uses
US5801187A (en) * 1996-09-25 1998-09-01 Gpi-Nil Holdings, Inc. Heterocyclic esters and amides
EA002401B1 (ru) * 1996-12-31 2002-04-25 Джи Пи Ай Нил Холдингс, Инк. N-связанные мочевины и карбаматы сложных гетероциклических тиоэфиров
US5935989A (en) 1996-12-31 1999-08-10 Gpi Nil Holdings Inc. N-linked ureas and carbamates of heterocyclic thioesters
US5846979A (en) * 1997-02-28 1998-12-08 Gpi Nil Holdings, Inc. N-oxides of heterocyclic esters, amides, thioesters, and ketones
US5945441A (en) 1997-06-04 1999-08-31 Gpi Nil Holdings, Inc. Pyrrolidine carboxylate hair revitalizing agents
US6187784B1 (en) 1998-06-03 2001-02-13 Gpi Nil Holdings, Inc. Pipecolic acid derivative hair growth compositions and uses
US6187796B1 (en) 1998-06-03 2001-02-13 Gpi Nil Holdings, Inc. Sulfone hair growth compositions and uses
US6274602B1 (en) 1998-06-03 2001-08-14 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic thioester and ketone hair growth compositions and uses
US6271244B1 (en) 1998-06-03 2001-08-07 Gpi Nil Holdings, Inc. N-linked urea or carbamate of heterocyclic thioester hair growth compositions and uses
US6852496B1 (en) 1997-08-12 2005-02-08 Oregon Health And Science University Methods of screening for agents that promote nerve cell growth
US5968921A (en) 1997-10-24 1999-10-19 Orgegon Health Sciences University Compositions and methods for promoting nerve regeneration
CA2333997A1 (en) * 1998-06-02 1999-12-09 Bristol-Myers Squibb Company Neurotrophic difluoroamide agents
US6172087B1 (en) 1998-06-03 2001-01-09 Gpi Nil Holding, Inc. N-oxide of heterocyclic ester, amide, thioester, or ketone hair growth compositions and uses
AU770459B2 (en) 1998-06-03 2004-02-19 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic ester and amide hair growth compositions and uses
US6506788B1 (en) 1998-08-14 2003-01-14 Gpi Nil Holdings, Inc. N-linked urea or carbamate of heterocyclic thioesters for vision and memory disorders
US7338976B1 (en) 1998-08-14 2008-03-04 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic esters or amides for vision and memory disorders
US6376517B1 (en) 1998-08-14 2002-04-23 Gpi Nil Holdings, Inc. Pipecolic acid derivatives for vision and memory disorders
US6218423B1 (en) 1998-08-14 2001-04-17 Gpi Nil Holdings, Inc. Pyrrolidine derivatives for vision and memory disorders
US6384056B1 (en) 1998-08-14 2002-05-07 Gpi Nil Holdings, Inc. Heterocyclic thioesters or ketones for vision and memory disorders
US6339101B1 (en) 1998-08-14 2002-01-15 Gpi Nil Holdings, Inc. N-linked sulfonamides of N-heterocyclic carboxylic acids or isosteres for vision and memory disorders
US6335348B1 (en) 1998-08-14 2002-01-01 Gpi Nil Holdings, Inc. Nitrogen-containing linear and azepinyl/ compositions and uses for vision and memory disorders
US6395758B1 (en) 1998-08-14 2002-05-28 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule carbamates or ureas for vision and memory disorders
US6333340B1 (en) 1998-08-14 2001-12-25 Gpi Nil Holdings, Inc. Small molecule sulfonamides for vision and memory disorders
US6399648B1 (en) 1998-08-14 2002-06-04 Gpi Nil Holdings, Inc. N-oxides of heterocyclic ester, amide, thioester, or ketone for vision and memory disorders
AU5555699A (en) * 1998-08-14 2000-03-06 Gpi Nil Holdings, Inc. Compositions and uses for vision and memory disorders
US6337340B1 (en) 1998-08-14 2002-01-08 Gpi Nil Holdings, Inc. Carboxylic acids and isosteres of heterocyclic ring compounds having multiple heteroatoms for vision and memory disorders
US6462072B1 (en) 1998-09-21 2002-10-08 Gpi Nil Holdings, Inc. Cyclic ester or amide derivatives
US6307049B1 (en) 1998-09-30 2001-10-23 The Procter & Gamble Co. Heterocyclic 2-substituted ketoamides
US6300341B1 (en) 1998-09-30 2001-10-09 The Procter & Gamble Co. 2-substituted heterocyclic sulfonamides
US6228872B1 (en) 1998-11-12 2001-05-08 Bristol-Myers Squibb Company Neurotrophic diamide and carbamate agents
US6323215B1 (en) 1999-07-09 2001-11-27 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neurotrophic tetrahydroisoquinolines and tetrahydrothienopyridines, and related compositions and methods
US6544976B1 (en) 1999-07-09 2003-04-08 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neurotrophic 2-azetidinecarboxylic acid derivatives, and related compositions and methods
PL352432A1 (en) 1999-07-09 2003-08-25 Ortho Mc Neil Pharmaceutical Neurothrophic pyrolydines and piperidines, their affinite composition and methods of using them
US6734211B1 (en) 1999-07-09 2004-05-11 Oregon Health & Sciences University Compositions and methods for promoting nerve regeneration
US7253169B2 (en) 1999-11-12 2007-08-07 Gliamed, Inc. Aza compounds, pharmaceutical compositions and methods of use
US6417189B1 (en) 1999-11-12 2002-07-09 Gpi Nil Holdings, Inc. AZA compounds, pharmaceutical compositions and methods of use
US6818643B1 (en) 1999-12-08 2004-11-16 Bristol-Myers Squibb Company Neurotrophic bicyclic diamides
WO2001046195A1 (en) 1999-12-21 2001-06-28 Gpi Nil Holdings, Inc. Hydantoin derivative compounds, pharmaceutical compositions, and methods of using same
EP1125925A1 (en) 2000-02-15 2001-08-22 Applied Research Systems ARS Holding N.V. Amine derivatives for the treatment of apoptosis
RU2457826C2 (ru) 2006-12-20 2012-08-10 Тайсо Фармасьютикал Ко., Лтд. Профилактическое или терапевтическое средство от алопеции
AU2010292148A1 (en) 2009-09-11 2012-04-12 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions of N-benzyl-3-(4-chlorophenyl)-2- [methyl-[2-oxo-2-(3,4,5-trimethoxyphenyl) acetyl]amino]-N- [3-(4-pyridyl)-1-[2-[4-pyridyl)ethy]propyl]propanamide and uses thereof
TWI534142B (zh) 2011-03-15 2016-05-21 大正製藥股份有限公司 Azole derivatives
EP2607352A1 (en) * 2011-12-22 2013-06-26 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pipecolate-diketoamides for treatment of psychiatric disorders

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6137764A (ja) * 1984-07-31 1986-02-22 Suntory Ltd 抗プロリルエンドペプチダ−ゼ活性を有する新規生理活性化合物
JP2691442B2 (ja) * 1989-02-20 1997-12-17 株式会社ヤクルト本社 新規なプロリン誘導体
DE4015255A1 (de) * 1990-05-12 1991-11-14 Hoechst Ag Oxalyl-aminosaeurederivate, verfahren zu ihrer herstellung und ihrer verwendung als arzneimittel zur inhibierung der prolyl-hydroxylase
US5192773A (en) * 1990-07-02 1993-03-09 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Immunosuppressive compounds

Also Published As

Publication number Publication date
FI934925A (fi) 1993-11-08
EP0584223B1 (en) 1999-08-11
KR100244372B1 (ko) 2000-03-02
DE69229782D1 (de) 1999-09-16
ATE183178T1 (de) 1999-08-15
GR3031825T3 (en) 2000-02-29
FI934925A0 (fi) 1993-11-08
CA2102180A1 (en) 1992-11-10
JP3145709B2 (ja) 2001-03-12
DK0584223T3 (da) 2000-03-13
WO1992019593A1 (en) 1992-11-12
DE69229782T2 (de) 2000-04-27
FI104967B (fi) 2000-05-15
HUT68332A (en) 1995-06-28
HK1013994A1 (en) 1999-09-17
EP0584223A1 (en) 1994-03-02
AU1995792A (en) 1992-12-21
CA2102180C (en) 2002-07-23
JPH06508125A (ja) 1994-09-14
ES2137186T3 (es) 1999-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU217621B (hu) Eljárás új glioxaloil-pipekolinsav-észterek, származékaik és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
AU660623B2 (en) Novel immunosuppressive compounds
JP3163104B2 (ja) 新規免疫抑制化合物
JP4759762B2 (ja) 改良された多剤耐性活性を有するｎ―（２―オキソアセチルまたはスルホニル）―ピロリジン／ピペリジン―２―カルボン酸誘導体
WO1992004370A1 (en) Modified di- and tripeptidyl immunosuppressive compounds
JP2001522833A (ja) 多剤耐性を治療するためのアルキル化イミノ糖類の使用
CA2152401C (fr) Association synergisante ayant un effet antagoniste des recepteurs nk1 et nk2
EP0587800B1 (en) Immunomodulatory azaspiranes
US5591748A (en) Immunomodulatory azaspiranes
IE83827B1 (en) Immunomodulatory azaspiranes
AU2004200272B2 (en) Imidazoline Receptor binding compounds
WO1997033583A1 (en) Methods of treating or preventing interstitial cystitis

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees