DE69401658T2 - Verwendung von deoxygalactonojirimycin derivaten zu hemmung der glycolipid synthese - Google Patents
Verwendung von deoxygalactonojirimycin derivaten zu hemmung der glycolipid syntheseInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft N-Alkylderivate von Deoxygalactonojirimycin (DGJ), worin die Alkylgruppen 3 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten und die sich zur selektiven Inhibierung von Glycolipidsynthese eignen. N-Alkylderivate von Deoxynojirimycin (DNJ) sind bekannt, Inhibitoren zu sein der N-gekoppelten oligosacchariderzeugenden Enzyme, alpha-Glucosidase I und II. Saunier et al., J. Biol. Chem. 257, 14155-14166 (1982); Elbein, Ann. Rev. Biochem. 56, 497-534 (1987). Als Glucoseanaloge haben sie außerdem das Potential, Glucosyltransferasen zu inhibieren. Newbrun et al., Arch. Oral Biol. 28, 516-536 (1983); Wang et al., Tetrahedron Lett. 34, 403-406 (1993). Ihre inhibierende Wirksamkeit gegen die Glucosidasen hat zur Entwicklung dieser Verbindungen als antihyperglykämische Mittel und antivirale Mittel geführt. Siehe z.B. PCT Int. 1. Anm. WO 87/03903 und U.S. Patente 4, 065, 562; 4, 182, 767; 4, 533, 668; 4, 639, 436; 4, 849, 430; 5, 011, 829 und 5, 030, 638. N-Alkylderivate von DGJ sind bekannt, Inhibitoren von β-Galaktosidase zu sein (EP-A-0536 402).
- Erfindungsgemäß werden N-Alkylderivate von Deoxygalactonojirimycin (DGJ) verwendet, worin das Alkyl 3 bis 6 Kohlenstoffatome und vorzugsweise 4 bis 6 Kohlenstoffatome enthält zur selektiven Inhibierung von Glycolipidsynthese. Die Länge der N-Alkylkette erwies sich als wichtig für diese inhibierende Wirksamkeit, da das nichtalkylierte DGJ und die N-Methyl- und N-Ethyl-Derivate von DGJ sich als inaktiv für eine solche Inhibierung erwiesen. Die N-Propylderivate von DGJ waren teilweise wirksam. Somit erwies sich eine minimale Alkylkettenlänge von 3 Kohlenstoffatomen als wesentlich für die Wirksamkeit. Beispielsweise kann die Biosynthese von Glycolipiden in Fällen, die in der Lage sind Glycolipide zu produzieren, selektiv inhibiert werden durch Behandlung dieser Zellen mit einer glycolipidinhibierenden wirksamen Menge irgend einer dieser neuen Verbindungen.
- Die wirksamen N-Alkylderivate von DGJ besitzen einen wesentlichen Vorteil, da sie, im Gegensatz zu den vorstehend beschriebenen N-Alkylderivaten von DNJ, selektiv Biosynthese von Glycolipiden inhibieren, ohne auf die Reifung von N-gekoppelten Oligosacchariden oder Lysosomalglucocerebrosidase einzuwirken. Beispielsweise im Gegensatz zu N-Butyl DNJ, inhibiert das N-Butyl DGJ der vorliegenden Erfindung überraschenderweise nicht die Weiterverarbeitung von alpha-Glucosidasen I und II oder Lysosomal-β-Glucocerobrosidase. Gleicherweise zeigt der einzige bisher veröffentlichte experimentelle Versuch unter Verwendung von Deoxygalactonojirimycin an, daß N-Alkylierung (N-Heptyldeoxygalactonojirimycin) eine mäßige Steigerung in der Affinität in Richtung gewisser β-Glucosidasen liefert. [Legler & Pohl, Carb. Res. 155, 119 (1986)]. Die hier beschriebenen inhibierenden Ergebnisse für die N-alkylierten Deoxygalactonojirimycinanalogen, worin das Alkyl 3 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, waren unerwartet im Hinblick auf die entsprechende Wirkung von vewandten Iminozuckerverbindungen.
- Eine weitere Einzigartigkeit der vorliegenden Erfindung wird gesehen durch die Entdeckung, daß die beispielhaften N-Butyl- und N-Hexylderivate von DGJ vollständig die Glycolipidbiosynthese verhindern, während die N-Butylderivate von Mannose, Fructose und N-Acetylglucosamin ohne Wirkung auf die Glycolipidbiosynthese waren.
- Die inhibierende Wirkung dieser Verbindungen auf die Biosynthese von Glycolipiden wird im Vorliegenden veranschaulicht in der Myeloidzellinie HL-60 und in der Lymphoidzellinie H9. Dies sind wohlbekannte, weit verbreitete und leicht erhältliche menschliche Zellinien. Beispielsweise sind HL-60 Zellen promyelozytische Zellen, beschrieben durch Collins et al., Nature 270, 347-349 (1977). Sie sind außerdem leicht erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, U.S.A., unter der Hinterlegungsnummer ATCC CCL 240. H9 Zellen sind von lymphoidem Ursprung, beschrieben durch Gallo und Popovic, Science 224, 497-500 (1984). Sie sind ebenfalls leicht erhältlich von der gleichen Hinterlegungsstelle unter Hinterlegungsnummer ATCC HTB 176.
- Die Inhibierung der Glycolipidbiosynthese durch diese N-Alkylderivate von DGJ wird weiterhin im Vorliegenden demonstriert durch die Reduktion der Bindung von Choleratoxin an die veranschaulichende Zellinie H9, wenn sie in Gegenwart von N-Butyl DGJ gezüchtet wird. Diese Verbindungen sind somit auch geeignet als antimikrobielle Mittel durch Inhibieren der Oberflächenexpression auf Glycolipidrezeptoren für Bakterien und bakterielle Toxine, wie nachstehend in Tabellen 1 bzw. 2 erläutert wird.
- Die inhibierende Wirkung auf die Biosynthese von Glycolipiden wird weiterhin erläutert durch die Fähigkeit der N-Butyl- und N-Hexylderivate von DGJ, die Glucoceramidakkumulierung in einem zum Stand der Technik gehörigen Standard-in-vitro-Modell von Gaucher's Krankheit auszugleichen. In diesem Modell wurde die Mausmakrophagenzellinie WEHI-3B gezüchtet in Gegenwart eines irreversiblen Glucocerebrosidaseinhibiters, Conduritol-β-Epoxid (CBE), um die erbliche Störung, die in der Gaucher'schen Krankheit vorliegt, nachzuahmen. WEHI-3B-Zellen werden in Cancer Res. 37, 546-550 (1977) beschrieben und sind leicht erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter der Hinterlegungsnummer ATCC TIB 68. Die erfindungsgemäßen Verbindungen verhindern lysosomal Glycolipidanlagerung, was für die Bewältigung von Gaucher's Krankheit und anderen Glycolipidanlagerungsstörungen geeignet ist, wie nachstehend in Tabelle 3 erläutert wird. Gaucher's Krankheit ist eine autosomale rezessive Störung, die gekennzeichnet ist durch eine beeinträchtigte Fähigkeit, Glucocerebrosid (Glucosyl-Ceramid- Glc-Cer) abzubauen, aufgrund von Mutationen im Gen, das β-Glucocerebrosidase (β-D-Glucosyl-N-acylsphingosin Glucohydrolase, EC 3.2.1.45) kodiert. Dieser Defekt resultiert in der Lysosomalakkumulierung von Glc-Cer in Zellen des makrophagen Monocytsystems [Barranger and Ginns, in The Metabolic Basis of Inherited Diseases, ed. Scriver et al., Seiten 1677-1698, Mc Graw-Hill, New York, (1989); Beutler, Science 256, 794-799 (1992)]. Durch Verlangsamung der Glycolipidsynthesegeschwindigkeit kann der beeinträchtigte Katabolismus von Glc-Cer ausgeglichen werden und dadurch zur Aufrechterhaltung eines ausgeglichenen Glc-Cer-Spiegels führen.
- Die klinische Bewältigung von Gaucher's Krankheit hängt häufig von entweder symptomatischer Behandlung des Patienten ab oder Enzymersatztherapie [Beutler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5384-5390 (1993)]. Im Hinblick auf die erschwinglichen Kosten einer Enzymersatztherapie und dem Erfordernis der intravenösen Verabreichung von Glucocerebrosidase, stellt eine oral verfügbare alternative Therapie, basierend auf Substratentzug, eine brauchbare Alternative dar. Da NB-DGJ weniger komplizierte Enzyminhibierungseigenschaften zeigt als alpha- und β-Glucosidaseinhibitoren, stellt es eine bevorzugte Alternative zu NB-DNJ zur therapeutischen Bewältigung von Gaucher's Krankheit und anderen Glycolipidablagerungsstörungen dar.
- Während die Beschreibung mit den Ansprüchen abschließt, insbesondere auf den Gegen stand hinweist und genau beansprucht, der die Erfindung bildet, wird die Erfindung offensichtlich besser verstanden werden aus der nachstehenden, erläuternden detaillierten Beschreibung der Erfindung, zusammen mit den anliegenden Zeichnungen worin:
- Figur 1 zeigt durch eine dimensionale Dünnschichtchromatographie. (1D-TLC) einen Vergleich von N-alkylierten Iminozuckern als Inhibitoren von Glycolipidbiosynthese. 1D-TLC- Trennung wurde gemacht von HL-60 Gesamtzellularlipiden, markiert mit [¹&sup4;C]-Palmitinsäure. Die Zellen wurden jeweils behandelt mit 0,5 mM N-Butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ), N-Butyldeoxymannojirimycin (NB-DMJ), N-Butyldeoxygalactonojirimycin (NB-DGJ) oder N-Butyl-2-acetamido-1,2,5-trideoxy-1,5-imino-D-glucitol (NB-NAG) oder unbehandelt (UT). Die Glycolipidbiosyntheseinhibierung wurde ermittelt durch das Fehlen von Glc-Cer, Gangliosiden und einer unbekannten Spezies (bezeichnet mit Pfeilen). Glc-Cer-Migration wurde bestätigt durch Einschluß eines [¹&sup4;C]-Glc-Cer-Standards auf der TLC. Die radiomarkierten Lipidspezies wurden sichtbar gemacht durch Autoradiographie.
- Figur 2 zeigt in 3 Teilen, A, B und C, 2D-TLC-Analyse von HL-60-Zellen, behandelt mit entweder NB-DNJ oder NB-DGJ. 2-D-TLC-Trennung erfolgte von den Gesamt-HL-60- Lipids, die mit [¹&sup4;C]-Palmitinsäure markiert waren. Die Zellen wurden behandelt mit entweder 0,5 mM NB-DNJ oder NB-DGJ oder unbehandelt (UT). Die Lipide wurden wie folgt bezeichnet (unbehandelte Zellen, linkes Feld, Figur 2A): 1, Ganglioside; 2, Lysophosphatidylcholin; 3, Ceramidphosphorylcholin; 4, Ceramidphosphorylethanolamin; 5, Phosphatidylcholin; 6, Phosphatidylinositol; 7, Phosphatidylethanolamin; 8, Phosphatidylglyzerin; 9, Diglycosylceramid; 10, Monoglycosylceramid; 11, Cholesterin/Fettsäuren/neutrale Lipide; N und N* sind Unbekannte und 0 ist die Ursprungsprobe. Da nach NB-DNJ- und NB-DGJ-Behandlung (mittlerer und rechter Block, Figuren 2B bzw. 2C) Spezies 1 Ganglioside); 9 (Diglycosylceramid); 10 (Monoglycosylceramid) und N* (unbekannt) waren nicht vorhanden. Die radiomarkierten Lipide wurden sichtbar gemacht durch Autoradiographie.
- Figur 3 zeigt die dosisabhängigen Wirkungen von NB-DNJ und NB-DGJ auf Glycolipidbiosynthese. 1D-TLC-Analyse erfolgte für die gesamtzellulären Lipide. HL-60-Zellen wurden markiert mit [¹&sup4;C]-Palmitinsäure in Gegenwart oder Abwesenheit (UT) von NB-DNJ oder NB-DGJ in den angezeigten Konzentrationen (µM). Die Migrationsstelle von [¹&sup4;C]-Glc-Cer wird als Pfeil angezeigt. Die Lipide wurden sichtbar gemacht durch Autoradiographie.
- Figur 4 zeigt in 2 Teilen, A und B, die Wirkungen von steigender DNJ und DGJ- Alkylkettenlänge auf die Inhibierung von Glycolipidbiosynthese. 1D-TLC-Analyse erfolgte für die gesamtzellulären Lipide. HL-60-Zellen wurden behandelt mit [¹&sup4;C]-Palmitinsäure in Gegenwart oder Abwesenheit (UT) von jeweils DNJ, oder den N-Ethyl-, N-Methyl-, N-Propyl-, N-Butyl- und N-Hexylderivaten von DNJ (linker Block, Figur 4A) oder DGJ oder den N-Ethyl-, N-Methyl-, N-Propyl-, N-Butyl- und N-Hexylderivaten von DGJ (rechter Block, Figur 4B) bei einer 0,5 mM Konzentration. Die Migrationsstelle von [¹&sup4;C]-Glc-Cer ist angezeigt mit Pfeilen. Die Lipide wurden sichtbar gemacht durch Autoradiographie.
- Figuren 5 und 6 zeigen die Analyse von NB-DNJ und NB-DGJ in einem in vitro Gaucher's Krankheitsmodell. Insbesondere zeigt Figur 5 die 1D-TLC-Analyse von Glycolipiden aus WEHI-3B-Zellen, die entweder mit NB-DNJ oder NB-DGJ behandelt wurden, bei den angegebenen Konzentrationen (µM) und sichtbar gemacht wurden durch chemische Ermittlung (siehe nachstehende Methoden).
- Figur 6 zeigt in 8 Teilen, A bis H, die Transmissionselektronenmikroskopie von WEHI-3B-Zell-Lysosomen: Figur 6A, unbehandelt; Figur 6 B, mit Conduritol-β-Epoxide (CBE) behandelt; Figur 6C, CBE und 500 µM NB-DNJ; Figur 6E, CBE und 50 µm NB-DNJ; Figur 6G, CBE und 5µm NB-DNJ; Figur 6D, CBE und 500 µm NB-DGJ; Figur 6F, CBE und 50µM NB-DGJ; Figur 6H, CBE und 5 µM NB-DGJ. Der Skalenstrich in der unteren rechten Ecke von Figur 6H ist anwendbar auf alle Figuren 6A bis H und stellte 0.1 µM dar.
- Figur 7 zeigt die Wirkung von NB-DGJ auf N-gekoppelte Oligosaccharidweiterverarbeitung. Insbesondere zeigt sie Endo-H-Empfindlichkeit von GP120, exprimiert in chinesischen Hamsterovarium-(CHO)-Zellen in Gegenwart und Abwesenheit (-) von entweder NB-DNJ oder NB-DGJ (0,5 µm und 5 µM). Die Pfeile zeigen das Molekulargewicht des unbehandelten GP120 (120 kDA) und der Postendo-H-Digestion (60 kDa). Ein weiteres Band von niedrigem Molekulargewicht (etwa 60 kDA) war in einigen Durchgängen vorhanden und ist ein nicht spezifisches Protein, das durch die Festphasenmatrix ausgefallen ist.
- Figur 8 ist eine graphische Darstellung, die in drei Teilen, A, B und C die Wirkung von Iminozuckeranalogen auf Glycolipid- und Glycoproteinstoffwechselenzymaktivität zeigt. Die Enzymaktivität wurde bestimmt in Gegenwart der folgenden Testverbindungen: DNJ, ( ); NB-DNJ ( ); DGJ, ( ); NB-DGJ, ( ) bei den gezeigten Konzentrationen (siehe nachstehende Methoden). Figur 8A, UDP-Glucose: N-Acylsphinogosinglucosyltransferase; Figur 8B, β-Glucocerebrosidase; Figur 8C, Weiterverarbeitung alpha- Glucosidase. Die enzymatische Aktivität wird ausgedrückt als Prozentsatz der Kontrollreaktionen die keine Testverbindung enthalten.
- Figur 9 zeigt die Laserdesorptionsmassenspektrometrie von N-Butyldeoxygalactonojirimycin mit einem Molekulargewicht von 220 (M+H), erhalten in über 95%iger Reinheit.
- Figur 10 zeigt das ¹H NMR-Spektrum von N-Butyldeoxygalactonojirimycin.
- Figur 11 ist eine graphische Darstellung eines Choleratoxinbindungsversuchs und zeigt auf der Y-Achse die prozentuale Reduktion von Choleratoxinbindungsstellen je Zelle für H9-Zellen, worin das Choleratoxin Fluorescein gebunden war und worin die Bindungsmengen an die Zelloberflächen von unbehandelten (UT) Zellen und Zellen, die mit N-Butyldeoxygalactonojirimycin (NB-DGJ) oder zum Vergleich N-Butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) bei verschiedenen auf der X-Achse gezeigten Mengen (mg/ml) durch Fließzytometrie gemessen wurden.
- Nachstehende detaillierte Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, jedoch wird darauf hingewiesen, daß die Erfindung nicht an diese spezifischen Beispeile oder darin enthaltenen Details gebunden ist.
- N-Butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) wurde erhalten von Searle/Monsanto (St. Louis, Mo, U.S.A.). Deoxygalactonojirimycin (DGJ), Deoxyfuconojirimycin (DFJ), Deoxymannojirimycin (DMJ) und 2-Acetamido-1,2,5-trideoxy-1,5-imino-D-glucitol (NAG) wurden erhalten von Cambridge Research Biochemicals (Northwich, Cheshire, U.K.). DGJ, DFJ, DMJ und NAG wurden reduktiv N-alkyliert in Gegenwart von Palladium schwarz unter Wasserstoff unter Verwendung des geeigneten Aldehyds durch übliche Verfahren wie sie beschrieben werden durch Fleet t al., FEBS Lett. 237, 128-132 (1988). Das Reaktionsgemisch wurde filtriert durch Celit und das Lösungsmittel durch Verdampfung unter Vakuum entfernt. Die dabei entstehenden N-alkylierten Analogen wurden gereinigt durch Ionenaustauschchromatographie (Dowex AG50-X12, H+ from) in 2M NH&sub3; (wässrig) und das Lösungsmittel durch Verdampfen entfernt. Diese Verbindungen wurden lyophilisisert und analysiert durch 1D 1H NMR bei 500 MHz auf einem Varian Unity 500 Spektrophotometer und durch von Matrix unterstützte Laserdesorpition (Finnegan). Alle synthetisierten Verbindungen besaßen eine über 95%ige Reinheit. Das Nachstehende sind repräsentative Beispiele der Synthese der vorstehenden N-alkylierten Verbindungen, wie sie im Nachstehenden verwendet werden.
- In einem repräsentativen Beispiel der Herstellung von N-Butyldeoxygalactonojirimycin, wurden 30 mg (184 µmol) Deoxygalactonojirimycin gelöst in 1 ml 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 5,0, dem 20 mg Palladium schwarz zugesetzt wurden. Eine Wasserstoffatmosphäre wurde im Reaktionsgefäß aufrecht erhalten und 100 µl (1,1 mmol) Butyraldehyd wurden zugesetzt. Die Reaktion wurde 16 Stunden lang bei Raumtemperatur (ca. 20ºC) gerührt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Filtration durch ein Bett (1 g) von Celit (30-80 mesh) und die Reaktionsprodukte wurden durch Chromatographie getrennt, unter Verwendung einer Säule, enthaltend 4 ml gepacktem Dowex AG 50-X12 (H+ Form) Herz. Das N-Butyldeoxygalactonojirimycin wurde eluiert von der Chromatographiesäule mit 2M Ammoniak. Seine Molekularmasse betrug 220 (M+H), wie durch Laserdesorptionsmassenspektrometrie bestimmt wurde, und seine chemische Struktur wurde bestätigt durch 1D ¹H NMR, wie in Figuren 9 bzw. 10 gezeigt wird.
- Das Syntheseverfahren und die Produktanalyse von Beispiel 1 wurden wiederholt, außer, daß Caproaldehyd verwendet wurde an Stelle eines Äquivalentes von Butyraledehyd zur analogen Herstellung von N-Hexyldeoxygalactonojirimycin. Seine Molekularmasse betrug 248 (M+H), wie durch Laserdesorptionsmassenspektronomie bestimmt wurde, und seine chemische Struktur wurde bestätigt durch 1D ¹H NMR.
- Das Syntheseverfahren und die Verbindungsanalyse von Beispiel 1 wurde wiederholt, außer, daß Propanolaldehyd verwendet wurde an Stelle eines Äquivalentes Butyraldehyd für die analoge Herstellung von N-Propyldeoxygalactonojirimycin. Seine Molekularmasse betrug 206 (M+H), wie durch Laserdesorptionsmassenspektronomie bestimmt wurde, und seine chemische Struktur wurde durch 1D ¹H NMR bestätigt.
- Die N-alkylierten Deoxygalactonojirimycinverbindungen, die in den vorstehenden erläuternden Beispielen 1 bis 3 hergestellt wurden, wurden in Gesamtausbeuten von 68 bis 74 % erhalten, auf der Basis des Ausgangs Deoxygalactonojirimycins und waren mehr als 95 % rein.
- Schweineleber alpha-Glucosidase I und Rattenleber alpha-Glucosidase II wurden bis zur Homogenität gereinigt und durch übliche Verfahren untersucht, unter Verwendung eines [¹&sup4;C]-glucosemarkierten Glc&sub3;Man&sub9;GlcNAc&sub2;-Substrat, wie vorstehend beschrieben, durch Karlsson et al., J. Biol. Chem. 268, 570-576 (1993). β-D-Glucosyl-N-Acylsphingosinglucohydrolase (Glucocerebrosidase) wurde isoliert von menschlicher Plazenta und bis zur Homogenität gereinigt, gemäß veröffentlichten Standardmethoden [Furbish et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 3560-3563 (1977); Dale und Beutler, Ibid. 73, 4672-4674 (1976)]. Glucocerebrosidasewirksamkeit wurde gemessen durch Zugabe von Enzym (5-50 µl) zu einer mit Schall behandelten Suspension von Puffer (50 µl 50 mM Natriumcitrat/Natriumphosphatpuffer, pH 5,0), enthaltend Glucosylceramid (1 mM)-Triton X-100 nicht ionischer oberflächenaktiver Stoff (0,25% v/v) und Natriumtaurodeoxychalate (0,6% v/v), das vorher unter Stickstoff auf Chloroform:Methanol-(2:1 v/v)-Lösungen getrocknet worden war. Nach Inkubierung bei 37ºC, 15-60 Minuten lang, wurde die Reaktion durch Zugabe von 500 µl Chloroform:Methanol gestoppt und die Phasen durch Zentrifugierung getrennt. Die obere Phase wurde 2 x mit Folch theoretischer unterer Phase gewaschen [Folch et al., J. Biol. Chem. 226, 497-509 (1957)], entsalzen, unter Verwendung von AG50-X12-Ionenaustauscherharz und unter Vakuum getrocknet. Die Reaktionsprodukte wurden durch Hochleistungsanionenaustauschchromatographie getrennt(Dionex BioLC System) und durch pulsierende Amperometrie festgestellt. Die Menge an Enzym freigesetzter Glucose wurde berechnet von Peak-Bereichen durch Anwendung von experimentell bestimmten Antwortfaktoren für Glucose im Vergleich zu einem eingeschlossenen Referenzmonosaccharid (Buttes et al, Biochem. J. 279, 189-195 (1991)].
- UDP-Glucose:N-Acylsphinogosineglucosyltransferase-(EC 2.4.1.80)-Aktivität wurde gemessen in Rattenhirnhomogenaten und mausmakrophagen Gewebekulturzellhomogenaten (WEHI-3B), unter Anwendung einer Methode, die wie folgt an veröffentlichte übliche Verfahren angepasst war [Vunnam und Radin, Chem. & Phys. of Lipids 26, 265-278 (1980); Shukla und Radin, Arch. Biochem. Biophys. 283, 372-378 (1990)]: Dioleoylhosphatidylcholin und cerebroside Liposome, enthaltend 200 nmol Ceramide Typ IV (Sigma) wurde einem Reaktionsgemisch zugesetzt (100 µl), das zusammengesetzt war aus 40 mM 2-[N-Morpholino]-ethansulfonsäure-(MES)-Puffer, pH 6,5, 5 mM MnCl&sub2;, 2,5 mM MgCl&sub2;, 1 mM NADH und 8 µM UDP-[¹&sup4;C)-Glucose (318 mCi/mmol, Amersham International, Amersham, U.K.). Nach Inkubierung bei 37ºC, 1-2 Stunden lang, wurde die Reaktion gestoppt durch Zugabe von EDTA (25 mM) und KCl (50 mM). Radiomarkierte Glycolipide wurden extrahiert mit 500 µl Chloroform:Methanol (2:1 v/v) 10 Minuten lang und die Phasen getrennt. Die untere Phase wurde 2 x mit Folch theoretischer Oberphase gewaschen und Portionen für die Scintillationszählung entnommen. Wenn Iminozucker für inhibierende Wirksamkeit getestet wurden, wurden diese in geeigneten Konzentrationen zu den Homogenaten zugesetzt und 10 Minuten lang vorinkubiert vor der Beschallung mit ceramidhaltigen Liposomen. Kontrollreaktionen wurden durchgeführt mit Liposomen, die kein Ceramid enthielten, um die Aktivität des Transfers zu den endogenen Akzeptoren zu messen.
- HL-60-Zellen wurden durch übliche Verfahren kultiviert, wie sie vorstehend beschrieben wurden durch Platt et al., Eur. J. Biochem. 208, 187-193 (1992). HL-60-Zellen bei 5 x 10&sup4; Zellen/ml wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von Aminozuckern 24 Stunden lang kultiviert. Zur Markierung folgte man der üblichen zweidimensionalen Dünnschichtchromatographie-(2D-TLC)-Methode von Butters and Hughes [In Vitro 17, 831-838 (1981)]. Kurz gesagt, [¹&sup4;C]-Palmitinsäure (56,8 mCi/mmol, ICN/Fluß) wurde zugesetzt als ein beschalltes Präparat in fötalem Kalbsserum (FCS, Techgen, London, U.K., 0,5 µCi/ml) und die Zellen weitere 3 Tage kultiviert, wobei die Iminozucker im Medium behalten wurden. Die Zellen wurden geerntet, 3 x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen (PBS), extrahiert in 1 ml Chloroform:Methanol (2:1 v/v) und durch eindimensionale TLC getrennt, wobei mit gleichen Zählungen beladen wurde (1D-TLC, Chloroform: Methanol:Wasser (65:25:4)). Zur zweidimensionalen Trennung erfolgte die eindimensionale Trennung, wie vorstehend beschrieben, die Platte wurde über Nacht unter Vakuum getrocknet und in der zweiten Dimension getrennt, unter Verwendung eines Lösungsmittels aus Tetrahydrofuran: Dimethoxymethan:Methanol:Wasser (10:6:4:1). Die Platten wurden luftgetrocknet und einem Hyperfilm-MP-Hochleistungsautoradiographiefilm (Amersham) ausgesetzt.
- Die Kultur von CHO-Zellen, die die lösliche Rekombinante gp120 exprimieren (von Dr. P. Stevens, MRC AIDS Directed Programme Reagent Project) und die Radiomarkierung dieser Zellen erfolgte durch übliche Verfahren, wie sie beschrieben wurden durch Karlsson et al., J. Biol. Chem. 268, 570-576 (1993). Kurz gesagt, CHO-Zellen wurden mechanisch geerntet, 3 x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, 0,1M pH 7,2 (PBS) und in methionin- und cysteinfreiem RPMI-1640 Medium resuspendiert (ICN-Flow Laboratories, High Wycombe, Bucks, U.K.), das mit 1 prozentigem dialysiertem FCS ergänzt worden war. Die Zellen (10&sup7;/ml) wurden vorinkubiert in Gegenwart oder Abwesenheit von NB-DNJ oder NB-DGJ 1 Stunde lang vor der Zugabe von 100 µCi/ml Tran³&sup5;S-Label (ICN-Flow) 4 Stunden lang. Die Überstände wurden gesammelt und 10-fach eingeengt, unter Verwendung einer 30 kDA Cutoffmembran (Amicon,, Danvers, MA, U.S.A.).
- Immunprezipitationen erfolgten durch übliche Verfahren, wie durch Karlsson vorstehend beschrieben. Überstände wurden inkubiert mit dem mAb ABT 1001 monoclonalem Antikörper (American Biotechnologies Inc., Cambridge, MA, U.S.A.) bei 0,5 µg/100 µl des Überstandes 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, gefolgt durch Schaf-Anti-Maus-IgG1 beschichteten magnetischen Kügelchen (Dynal Ltd., Wirral, Merseyside, U.K., 1,2 x 10&sup7; Kügelchen je Probe) 1 Stunde lang bei 4ºC. Die Kügelchen wurden 3 x mit 2% Triton X-100 in PBS und 3 x mit PBS gewaschen. Gp 120 wurde eluiert in 100 µl reduzierendem SDS-PAGE-Probepuffer, unter Erhitzen (95ºC, 5 Minuten). Jede Probe wurde in zwei gleiche Aliquote aufgeteilt und 25 µl dH&sub2;O wurde zugesetzt unter Bildung eines Endvolumens von 50 µl. Zu der einen Hälfte jeder Probe wurden 2 µl Endoglycosidase H (Endo H, 1 Einheit/ml, Boehringer Mannheim Ltd., Lewes, Sussex, U.K.) zugesetzt und die andere Hälfte unbehandelt gelassen. Die Digestion erfolgte bei 37ºC 18 Stunden lang und wurde beendet durch die Zugabe von 50 µl SDS-PAGE-reduzierendem Probepuffer (95ºC, 5 Minuten).
- HL-60 und BW5147-Zellen wurden kultiviert in RPMI-1640 und 10 % FCS. Die Zellen wurden 30 Minuten lang inkubiert in Gegenwart und Abwesenheit von 2 mM NB-DNJ oder NB-DGJ in reduziertem Glucose-RPMI-1640 Medium (Flow), das durch 1% dialysierten FCS ergänzt war. [³H]-Mannose (16,5 Ci/mmol, Amersham) wurde zugesetzt bei 200 µCi/ml und die Zellen weitere 3 Stunden kultiviert. Die gewaschenen Pellets wurden in 50 mM TrisHCl-Puffer resuspendiert, pH 7,5, enthaltend 10 mM CaCl² und 0,02% Natriumazid und auf 100ºC 5 Minuten lang erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden Pronase -Enzyme bis zu einer Menge von 0,04% (w/v Endkonzentration) zugesetzt und 96 Stunden bei 37ºC unter Toluol inkubiert, wobei aliquote Mengen von Pronase alle 24 Stunden zugesetzt wurden. Die Digestion wurde gestoppt durch 5-minütiges Kochen und die Glycopeptide durch Zentrifufugierung bei 13000 g 10 Minuten lang gewonnen. Die Proben wurden fraktioniert durch Con A-Sepharose -Chromatographie, gemäß den üblichen Verfahren von Foddy et al., Biochem. J. 233, 697-706 (1986).
- Das Gaucher's Krankheitsmodell in Vitro wurde wie folgt hergestellt; WEHI-3B-Zellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD, U.S.A.) wurden in logarhythmischem Phasenwachstum 14 Tage lang gehalten in RPMI-1640-Medium 10% FCS, in Gegenwart oder Abwesenheit von 50 µm Conduritol-beta-Epoxid (CBE, Toronto Research Chemicals, Downsview, Canada) mit oder ohne NB-DNJ oder NB-DGJ. Die Zellen wurden alle 3 Tage in ein frisches Medium überführt und die Verbindungskonzentrationen währenddessen aufrecht erhalten. Gleiche Anzahl von Zellen (5 x 10&sup6;) wurden geerntet, in 1 ml Chloroform: Methanol (2:1 v/v) über Nacht bei 4ºC extrahiert, die Extrakte zentrifugiert, der Chloroform:Methanolextrakt beibehalten und die Pellets wie vorstehend 2 Stunden lang bei Raumtemperatur nochmals extrahiert. Die gepoolten Extrakte wurden unter Stickstoff getrocknet, in 10 µl Chloroform: Methanol (2:1 v/v) wiedergelöst und durch 1D-TLC in Chloroform:Methanol-Wasser (10:6:4:1) getrennt. Die Platten wurden luftgetrocknet und sichtbar gemacht, unter Verwendung von alpha-Naphthol (1% w/v in Methanol) gefolgt durch 50% (v/v) Schwefelsäure.
- Zellen zur Elektronenmikroskopie wurden geerntet (1 x 10&sup7; Zellen je Behandlung), 3 x in serumfreiem RPMI-1640-Medium gewaschen und fixiert in einem Medium, enthaltend 2% Glutaraldehyd (v/v) und 20 mM Hepes (v/v) auf Eis 2 Stunden lang. Die Zellen wurden gewaschen in 0,1 M Cacodylatpuffer, enthaltend 20 mM Calziumchlorid (w/v). Die Zellen wurden danach fixiert mit 1% Osmiumtetroxid in 25 mM Cacodylatpuffer (w/v), enthaltend 1,5% Kaliumferrocyanid (w/v) 2 Stunden lang auf Eis. Die Proben wurden dehydratisiert durch eine Etanolreihe, auf Propylenoxid übertragen und eingebettet in Embed 800 (Electron Microscopy Sciences, PA, U.S.A.). Die Abschnitte wurden gefärbt mit Uranylazetat/Bleizitrat und beobachtet mit einem Hitachi 600 Mikroskop bei 75 kv.
- Methoden: Zellen wurden in logarhythmischem Phasenwachstum in RPMI-1640-Medium gehalten. Choleratoxin-B-Kette (Sigma) wurde an Flouresceinisothiocyanat konjugiert (Sigma) und die fließzytometrische Analyse erfolgte durch übliche Verfahren, wie sie beschrieben werden durch Platt et al., Eur. J. Biochem. 208, 187-193 (1992). Die Analyse erfolgte auf einem FACScan Cytometer (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA, USA). Daten auf lebenden Zellen wurden gesammelt auf einer Vier-Dekade-Log&sub1;&sub0;-Skala von steigender Floureszenzintensität. Die Daten wurden präsentiert als prozentuale Reduktion von Choleratoxinbindungsstellen je Zelle auf der Y-Achse gegen die Verbindungskonzentration auf der X-Achse. Die Spezifität von Choleratoxin zu Zelloberflächenbindung wurde ermittelt durch Inhibierung dieser Reaktion mit einem einhundertfachen molaren Überschuß von GMI stammenden Oligosaccharid, GalβGalNAcβ4 (NeuAcalpha3) Galβ4Glcβ3Cer.
- Das Glucoseanalog NB-DNJ und vier pyranose Analoge (NB-DMJ, Mannoseanalog; NB- DFJ; Fucoseanalog; NB-DGJ, Galactoseanalog; und NB-NAG, N-Acetylglucosaminanalog) wurden durch obige Methoden untersucht auf ihre Kapazitäten, die Stoffwechseleinververleibung von radiomarkiertem Palmitat in Glycolipiden in HL-60-Zellen bei 500 µM Verbindungskonzentration, unter Anwendung der 1D-TLC-Analyse (Fig. 1). Außer NB-DNJ war NB-DGJ das einzige Analog, das Glycolipidbiosynthese spezifisch inhibierte. Alle anderen Analoge waren ohne Wirkung. Beide NB-DNJ und NB-DGJ inhibierten die Biosynthese von Glc-Cer, Gangliosiden und einer unbekannten Lipidspezies in Übereinstimmung mit den vorstehenden Beobachtungen mit NB-DNJ, wie sie in der gleichzeitig eingereichten Anmeldung Serien Nr. 08/061, 645 beschrieben wurden. Zur Bestätigung, daß NB-DNJ und NB-DGJ vergleichbare Wirkungen auf das Gesamtspektrum von Glycolipiden in dieser Zelllinie aufweist, wurde 2D-TLC durchgeführt, um die einzelnen Glycolipidspezies weiter aufzulösen (Figur 2). Eine totale Verarmung an Glycolipidspezies wurde erzielt, sowohl mit 500 µm NB-DNJ als auch NB-DGJ. Insbesondere waren Ganglioside, das unbekannte Lipid (N*) und die mono- und die dihexaside Spezies nicht vorhanden nach der Behandlung mit jeder der Verbindungen. Phospholipidzusammensetzung und relative Menge waren vergleichbar, unbeachtet der Behandlung, übereinstimmend mit den vorhergehenden Beobachtungen in der gleichzeitig eingereichten Anmeldung Serien Nr. 08/061, 645, das N-alkylierte Iminozucker keine Wirkung auf Sphingomyelin oder Phosholipidbiosynthese haben. Beim Vergleich der beiden Analogen in einem Konzentrationsbereich durch 1D-TLC (Figur 3) zeigten beide Analogen vollständige Glykolipidinhibierung zwischen 50 µM und 500 µM Konzentrationen, obgleich teilweise Inhibierung erfolgte mit beiden Verbindungen bei Konzentrationen, die nur 0,5-5 µM betrugen. Beide Analogen waren nicht zytotoxisch in dem getesteten Dosierungsbereich.
- Eine Reihe von N-alkylierten DNJ- und DGJ-Derivaten wurden auf ihre Fähigkeit verglichen, Glycolipidbiosynthese zu inhibieren (Figur 4A bzw. 4B) durch 1D-TLC. Die nichtalkylierten Iminozucker und das N-Methyl DNJ, N-Ethyl DNJ, N-Methyl DGJ und N-Ethyl DGJ hatten keine Wirkung auf die Glycolipidbiosynthese. Die N-Propylanalogen von beiden Stammverbindungen zeigten teilweise inhibierende Wirksamkeit, während die N-Butyl- und N-Hexylderivte von DNJ und DGJ vollständig die Glycolipidbiosynthese inhibierten wie durch den Verlust von feststellbarem Glc-Cer bestimmt wurde. Diese Daten waren somit in Übereinstimmung mit den Daten aus der vorhergehenden Anmeldung Serien Nr.08/061, 645, wo das N-Methylderivat mit N-Butyl und N-Hexyl DNJ verglichen wurde. Es ist eine Mindest- N-Kettenlänge erforderlich, um eine volle Inhibierung der Glycolipidbiosynthese zu erzielen, wobei Butyl und Hexyl optimal sind.
- Die WEHI-3B-Maus-Makrophagen-Zellinie kann induziert werden, um Gaucher's Zellen zu gleichen durch Behandlung mit dem irreversiblen Glucocerebrosidaseinhibitor CBE. NB-DNJ und NB-DGJ wurden verglichen auf ihre Fähigkeit, die Akkumulierung von Glc-Cer in diesem System zu verhindern (Figur 5). Beide Analogen verhinderten CBE- induzierte Glycolipidanlagerung in dem 5-50 µm Dosisbereich. Diese Daten demonstrieren somit, daß NB-DGJ so wirksam ist wie NB-DNJ bei der Verhinderung von Glyclipidanlagerung in diesem in vitro Gaucher's Krankheitsmodell. Der Status der Lymosomen aus mit NB-DNJ oder NB-DGJ behandelten Zellen wurde ermittelt durch Transmissionselektronenmikroskopie (Figur 6). Man stellte fest, daß beide Analogen die Glycolipidakkumulierung verhinderten, die in den Limosonen der mit CBE behandelten Zellen beobachtet wurde.
- Die CHO-Zellinie ist dahingehend einzigartig, daß sie keine signifikanten Spiegel der Golgiendomannosidase enthält, die die Wirkung hat, die alpha-Glucosidase I und II-Inhibierung zu umgehen [Karlsson et al., J. Biol. Chem. 268, 570-576 (1993); Hiraizumi et al., J. Bio. Chem. 268, 9927-9935 (1993)]. Folglich bietet sie ein unzweideutiges Zellularsystem an, worin alpha-Glucosidaseinhibierung zu testen ist. NB-DNJ war vorher in dieser Zellinie getestet worden, die die Rekombinante gp120 exprimiert und man fand, das es resultiert in der Beibehaltung von glucosilierten Hochmannoseoligosacchariden auf gp120, die voll empfindlich gegenüber Endo H sind [Karlsson et al., supra].
- Analyse der N-gekoppelten Oligosaccharide von gp120, exrimiert in CHO-Zellen erfolgte in Gegenwart oder Abwesenheit von NB-DNJ oder NB-DGJ (Figur 7). Behandlung von CHO-Zellen mit 0,5 mM oder 5 mM NB-DNJ resultierte in voll endo-H-empfindlichen gp120 N-gekoppelten Glycanen im Gegensatz zum unbehandelten gp120, das teilweise empfindlich gegenüber Endo-H war. Diese Teilempfindlichkeit von unbehandeltem gp120 gegenüber Endo-H besteht, weil gp120 etwa 50% hochmannose N-gekoppelte Oligosaccharide je Molekül trägt [Mizuochi et al., Biochem. J. 254, 599-603 (1988); Mizuochi et al., Biomed. Chrom. 2, 260-270 (1988)]. Wenn jedoch das Galactoseanalog, NB-DGJ, in diesem System bei 0,5 mM und 5 mM Konzentrationen getestet wurde, blieb gp120 teilweise empfindlich gegenüber Endo-H und war von den nicht behandelten gp120-Molekülen nicht zu unterscheiden. Dies legt nahe, daß das Galactoseanalog nicht als ein Inhibitor von alpha-Glucosidasen I und II wirkt.
- Um die Wirkung auf endogene Glycoproteinsynthese zu prüfen, wurden radiomarkierte Glycopeptide isoliert von behandelten HL-60- und Maus-BW5147-Zellen und auf ihre Affinität gegenüber Con-A-Sepharose analysiert. Dieses Verfahren spaltet wirksam tetra- und tri-antennige komplexe N- Glycane von bi-antennigen und hochmannose/hybrid N-Glycanen [Foddy et al., Biochem. J. 233, 697-706 (1986)]. Die Zugabe von NB-DNJ verändert die Affinität von Glycopeptiden, die von der Con-A-Sepharose -Säule isoliert wurden (Tabelle 4) als ein Ergebnis der Weiterbehandlung von Glucosidaseinhibierung. Somit verringert sich die Proportion von ungebundenen Glycanen (tetra- und tri-antennige Spezies) und ein entsprechendes Ansteigen wird in der Proportion von Hochmannose/Hybrid-Glycane gefunden, die fest an Con-A-Sepharose gebunden sind und mit 500 mM Mehylmannosid eluiert wurden. Ähnliche Veränderungen großen Stils in Glycopeptidzusammensetzungen nach der Behandlung mit alpha-Glucosidaseinhibitoren sind festgestellt worden. [Moore und Spiro, J. Biol. Chem. 265, 13104-13112 (1990)]. Das Galactoseanalog, NB-DGJ, zeigte ein unverändertes Glycopeptidprofil durch Con-A-Sepharose -Chromatographie (Tabelle 4). Um diese Daten zu bestätigen, wurde die Glucosidaseinhibierung direkt in vitro gemessen, unter Verwendung eines Gemisch aus gereinigten alpha-Glucosidasen I und II (Figur 8). Während NB-DNJ Glucosidase I und II mit einem IC&sub5;&sub0; von 0,36 µM inhibierte, war NB-DGJ nur schwach inhibierend (IC &sub5;&sub0; von 2,13 mM, Tabelle 5). Diese Daten liefern den wesentlichen Beweis, daß sowohl in in vitro alpha-Glucosidaseversuchen als auch in intakten Zellularsystemversuchen, NB-DGJ N-gekoppelte Oligosaccharidweiterverarbeitung nicht inhibiert.
- DNJ und deren N-alkylierte Derivate sind Inhibitoren des gereinigten Lysosomal Glucocerebrosidaseenzyms, das für die Aufspaltung von Glc-Cer zu Glucoe und Ceramid erforderlich ist [Osiecki-Newman et al., Biochim. Biophys. Acta. 915, 87-100 (1987)]. In jüngsten Versuchen mit dem in vitro Gaucher's Krankheitsmodell in der gleichzeitigen Anmeldung Serien Nr. 08/061, 645 wurde beobachtet, daß WEHI-3B-Zellen, die in Abwesenheit von CBE jedoch in Gegenwart von NB-DNJ inkubiert wurden, Glc-Cer akkumulierten. Es war insofern offensichtlich, daß die N-Butylderivate von DNJ ebenfalls als ein Inhibitor von Glucocerebrosidase in einer zellulären Umgebung wirkt. Diese inhibierende Wirksamkeit von NB-DNJ und NB-DGJ wurde somit direkt gemessen, um quantitativ ihre Kapazitäten zu ermitteln, menschliche plazentale Glucocerebrosidase zu inhibieren (Tabelle 5). NB-DNJ lieferte eine mäßige Inhibierung der Katalyse mit einem IC&sub5;&sub0; von 0,52 mM, während NB-DGJ die Enzymaktivität nicht inhibierte, selbst bei der höchsten getesteten Konzentration (1 mM). Ausgedrückt als prozentuale Enzyminhibierung, die mit den beiden Anabgen erzielt worden war, resultierte 1 mM NB- DNJ in 90%iger Inhibierung, während 1 mM NB-DGJ nicht inhibierend war (Figur 8), wodurch die vorteilhafte und unerwartete selektive inhibierende Wirkung von NB-DGJ, verglichen mit derjenigen von NB-DNJ bestätigt wurde.
- Die Bestimmung der Transferasewirksamkeit, unter Verwendung von kultivierten Zellen aus Rattenhirn oder Mäusemakrophagengewebe erfolgte nach den Sättigungskenetiken für exogen zugesetzten Ceramidaccepter und UDP-Glucosedonor. Unter diesen Bedingungen waren N-butyliertes DNJ und DGJ mäßige Inhibitoren für den Glucosetransfer, (IC&sub5;&sub0; 2,95 mM und 60,88 mM, Tabelle 5), während ihre nicht modifizierten Stammhomologen nicht inhibierend wirkten bei der höchsten getesteten Konzentration, 6,1 bzw. 5,0 mM, (Figur 8).
- Die Wirksamkeit des repräsentativen N-Butyldeoxygalactonojirimycin (NB-DGJ) zur Inhibierung der Oberflächenexprimierung von Glycolipidrezeptoren für Bakterien und bakterielle Toxine wurde erläutert, indem H9-Zellen Choleratoxinbindungsstellen ausgesetzt wurden in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von NB-DGJ. Als eine spezifische Untersuchung bediente man sich des Vorteils der GM1-Bindungsspezifität der Choleratoxin- B-Kette (van Heyningen, Nature 249, 415-417 (1974); Karlsson, Ann. Rev. Biochem. 58, 309-350 (1989)]. Die Bindung des Choleratoxins an H9-Zellen, die in Gegenwart von NB-DGJ kultiviert wurden, wurde zu etwa 70% reduziert (Figur 11). Dies ist übereinstimmend mit dem Verlust von GM1 von der Zelloberfläche und liefert den weiteren Beweis für die Inhibierung der Glycolipidsynthese durch NB-DGJ, obgleich es durch Vergleich weniger war als die ungefähre 90%ige Reduktion (Figur 11), die mit dem En-Butyldeoxynojirimycin (NB-DNJ) erzielt wurde. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß die Iminozuckerderivate sich als antimikrobielle Mittel eigenen durch Inhibierung der Oberflächenexpression von Glycolipidrezeptoren für Bakterien und bakterielle Toxine, wie in Tabellen 1 bzw. 2 gezeigt wird. Tabelle 1 Glycosphingolipidrezeptoren für bakterielle Zellen Tabelle 2 Glycosphingolipidrezeptoren für bakterielle Toxine Tabelle 3 Heriditanische Glycolipidanlagerungsstörungen Tabelle 4 Wirkung von Iminozuckeranalogen auf Oligosaccharidbiosynthese
- Zellen wurden radiomarkiert 4 Stunden lang mit [³H]-Mannose in Gegenwart und Abwesenheit der vorstehend gezeigten Verbindungen. Gewaschene Zellen wurden ausgiebig digestiert mit Pronase -Enzym und die dabei entstehenden Glycopeptide fraktioniert durch Con- A-Sepharose -Chromatographie wie vorstehend beschrieben. Der Prozentanteil an radiomarkierten Glycopeptiden, die nicht gebunden waren (komplexe tetra- und tri-antennäre N-Glycane), eluiert waren mit 10 mM Methylglucosid (komplexe Bi-antennäre N-Glycane) oder weiter eluiert waren mit 500 mM Methylmannosid (Oligomannose und Hybrid N-Glycane) wurden berechnet aus Bewertungen der Radioaktivität, die aus den gepoolten Eluaten gewonnen wurde. Tabelle 5 Konzentrationen von Iminozuckeranalogen, die zur Inhibierung von Glycolipid und Glycoprotein metabolisierenden Enzymen erforderlich sind
- * Nicht inhibierend bei 1 mM Konzentrationen der Verbindung.
- Nicht inhibierend bei der höchsten gestesteten Konzentration (siehe Figur 8).
- nd Nicht bestimmt.
- Die Enzyme wurden untersucht nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren unter Anwendung von Konzentrationen und Analogen, wie sie in Figur 8 gezeigt werden. Die Daten von Figur 8 wurden auf einer logarithmischen Skala abgetragen zur genauen Berechnung von IC&sub5;&sub0;-Werten, wie vorstehend gezeigt.
- Zusätzlich zu ihrer Verwendung als Inhibitoren von Glycolipidbiosynthese in Zellen können die hier beschriebenen inhibierenden Mittel auch verwendet werden zur Verabreireichung an Patienten, die unter Glycolipidablagerungsstörungen leiden durch übliche Maßnahmen, vorzugsweise in Formulierungen mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln und Trägern. Diese Mittel können verwendet werden in Form ihrer freien Amine oder in ihrer Salzform. Pharmazeutisch verträgliche Salzderivate werden erläutert beispielsweise durch HCl-Salz. Die Menge an zu verabreichendem Wirkstoff muß eine wirksame Menge sein, d.h. eine Menge, die medizinisch nützlich ist, jedoch keine toxischen Wirkungen aufweist, die die ihre Verwendung begleitenden Vorteile übersteigen. Es ist zu erwarten, daß die tägliche Dosis für erwachsene Menschen normalerweise von etwa 1 bis etwa 100 mg des Wirkstoffes beträgt. Die bevorzugte Verabreichungsroute ist oral in Form von Kapseln, Tabletten, Sirupen, Elixieren und dergleichen, obgleich parenterale Verabreichung ebenfalls angewandt werden kann. Geeignete Formulierungen der wirksamen Verbindung in pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln und Trägern in therapeutischen Dosierungsformen können hergestellt werden durch Bezugnahme auf allgemeine Texte auf diesem Gebiet wie beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, Et. Arthur Osol, 16. Ausgabe, 1980, Mack Publishing Co., Easten, PA., U.S.A.
Claims (14)
1. Verwendung eines N-Alkylderivates von Deoxygalactonojirimycin, worin dieses Alkyl
von 3 bis 6 Kohlenstoffatome enthält, zur Herstellung eines Medikamentes zur
Inhibierung der Biosynthese von Glycolipiden in Zellen, die Glycolipide zu produzieren
vermögen.
2. Verwendung nach Anspruch 1, worin die Alkylgruppe von 4 bis 6 Kohlenstoffatome
enthält.
3. Verwendung nach Anspruch 2, worin die Alkylgruppe Butyl ist.
4. Verwendung nach Anspruch 2, worin die Alkylgruppe Hexyl ist.
5. Verwendung nach Anspruch 1, worin die wirksame Inhibierungsmenge von 50 µM
bis 500 µM beträgt.
6. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Glycolipid ein Glycosphingolipid auf der Basis
von Glucoceramid ist.
7. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Glycolipid ein lysosomales Glycolipid ist.
8. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Glycolipid ein Glucoceramid ist, das in Zellen
akkumuliert, die von Gaucher's Krankheit befallen sind.
9. Verwendung eines N-Alkylderivates von Deoxygalactonojirimycin, worin dieses Alkyl
von 3 bis 6 Kohenstoffatome enthält, zur Herstellung eines Medikamentes zur
Inhibierung der Oberflächenexpression von Glycolipidrezeptoren für Bakterien und
bakterielle Toxine.
10. Verwendung nach Anspruch 9, worin die Alkylgruppe von 4 bis 6 Kohlenstoffatome
enthält.
11. Verwendung nach Anspruch 10, worin die Alkylgruppe Butyl ist.
12. Verwendung nach Anspruch 10, worin die Alkylgruppe Hexyl ist.
13. Verwendung nach Anspruch 9, worin die wirksame inhibierende Menge von 50 µM
bis 500 µM beträgt.
14. Verwendung nach Anspruch 19, worin das bakterielle Toxin Choleratoxin ist.
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