DE69735669T2

DE69735669T2 - Deoxynojirimycin derivate und ihre verwendung als glukosesylceramidase-inhibitoren

Info

Publication number: DE69735669T2
Application number: DE69735669T
Authority: DE
Inventors: Johannes Maria Franciscus Gerardus Aerts; Upendra Kumar Pandit; Gerrit Jan Koomen; Herman Steven Overkleeft; Paola Vianello
Original assignee: Macrozyme DNM BV
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1996-07-15
Filing date: 1997-07-14
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2017-07-15
Also published as: CA2260790A1; WO1998002161A1; DE69735669D1; JP2014024857A; ATE322900T1; EP0912179A1; IL128036A0; JP2000516577A; JP2017122133A; US6177447B1; JP2010031062A; JP4564108B2; JP2016056203A; AU732552B2; EP0912179B1; CA2260790C; AU3464797A; IL128036A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Gebiete der Therapie und der pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Behandlung verschiedener Krankheiten, insbesondere Krankheiten, die durch erhöhte Plasma-Chitotriosidase-Spiegel gekennzeichnet sind, wie Morbus Gaucher.
Hintergrund der Erfindung
Ceramid, ein sekundärer Botenstoff
In den letzten Jahren wurde die Bedeutung von Ceramid als sekundärer Botenstoff bei der Signaltransduktion erkannt. Es wurde klar, dass die durch mehrere Cytokine induzierte Signalgebung durch Veränderungen der intrazellulären Konzentration dieses Lipids vermittelt wird [1, 2]. Entscheidend für die Transduktion des von TNF-α (Tumornekrosefaktor α) ausgelösten Signals nach der Bindung an seinen Rezeptor sind lokale Veränderungen der Ceramidkonzentration in speziellen Bereichen oder Einstülpungen der Plasmamembran. Nach der Bindung des Cytokins an seinen Rezeptor katalysiert eine Sphingomyelinase die Umwandlung von Sphingomyelin in Phosphorylcholin und Ceramid. Das auf diese Weise erzeugte Ceramid pflanzt das Signal fort, indem es spezifische Protein-Kinasen und Phosphatasen aktiviert, was zu einer zellulären Reaktion führt. 1 gibt einen Überblick über den Signalgebungsmechanismus von TNF-α und anderer Cytokine, wie Interferon-γ und Interleukin-6.
Es gibt jetzt überzeugende experimentelle Beweise für die Rolle von Ceramid bei der Signalgebung. Es hat sich gezeigt, dass die Wirkungen von TNF-α experi mentell nachgeahmt werden können, indem man ein durchdringungsfähiges Ceramid mit verkürzter Fettacyleinheit verabreicht, oder alternativ dazu, indem man durch die Behandlung von Zellen mit einer bakteriellen Sphingomyelinase Ceramid an der Zelloberfläche erzeugt (siehe z.B. Lit. 2).
Der oben beschriebene Signaltransduktionsvorgang ist höchstwahrscheinlich ein hochgradig lokales Ereignis, das in der Nähe des Cytokinrezeptors stattfindet. Die Konzentration von Ceramid in der Plasmamembran ist unter normalen Bedingungen vermutlich sehr gering. Beträchtliche Mengen an Ceramid sind jedoch in der Plasmamembran als Baustein für Sphingomyelin vorhanden. Die Hydrolyse von Sphingomyelin würde eine beträchtliche lokale Veränderung in der Ceramidkonzentration und anschließenden Signalausbreitung ermöglichen.
Über die Wirkung einer spezifischen Transferase kann Ceramid durch Übertragung der Phosphorylcholin-Einheit von Phosphatidylcholin (PC) in Sphingomyelin zurückverwandelt werden, was zur gleichzeitigen Bildung von Diacylglycerin führt. Der gesamte Weg, der unter dem Strich zu einer Hydrolyse von Phosphatidylcholin zu Phosphorylcholin und Diacylglycerin führt, wird Sphingomyelin-Zyklus genannt [2].
Ceramid und Sphingolipidstoffwechsel
Offensichtlich beeinflussen nicht alle Fluktuationen in der intrazellulären Ceramidkonzentration die Signaltransduktion. Ceramid wird in Zellen in großem Umfang metabolisiert. Das Lipid wird an der Membran des Endoplasmatischen Retikulums aus Acyl-CoA und Sphingosin synthetisiert. Es kann im Golgi-Apparat in Sphingomyelin, Glucosylceramid und verwandte komplexe Ganglioside oder in Galactosylceramid und verwandte Globoside und Sulfatide umgewandelt werden. Sphingomyelin und Glycosphingolipide werden auch im lysosomalen Kompartiment von Zellen zu Ceramid und andere Komponenten katabolisiert. Das intralysosomal gebildete Ceramid kann lokal durch die Wirkung von lysosomaler Ceramidase zu Sphingosin und Fettsäure hydrolysiert werden, oder es kann zum Cytosol exportiert und für die Synthese von Sphingolipiden wiederverwendet werden. Ein schematischer Überblick des Ceramidstoffwechsels ist in 2 gezeigt.
Sphingolipidosen: Morbus Gaucher
Beim Menschen kommen mehrere erbliche Störungen des lysosomalen Sphingolipid-Katabolismus vor, die sogenannten Sphingolipidosen (siehe Tabelle 1). Ein erblicher Mangel der lysosomalen Sphingomyelinase liegt zum Beispiel der Niemann-Pick-Krankheit zugrunde, und eine mangelhafte Aktivität der lysosomalen Ceramidase verursacht die Farber-Krankheit. Die am häufigsten vorkommende Sphingolipidose ist Morbus Gaucher [3]. Die metabolische Grundlage dieser Störung ist ein Mangel der lysosomalen β-Glucosidase Glucocerebrosidase (E.C. 3.2.1.45). Dieses Enzym katalysiert die Hydrolyse von Glucosylceramid (Glucocerebrosid) zu Glucose und Ceramid. Bei Patienten mit Morbus Gaucher sammelt sich Glucosylceramid in röhrenförmigen Aggregaten an, insbesondere in Lysosomen von Makrophagen. Die lipidbeladenen Makrophagen haben eine typische Morphologie und werden gewöhnlich als "Gaucher-Zellen" bezeichnet. Im Verlaufe der klinischen Manifestation des Morbus Gaucher können sich die abnormen Makrophagen in großen Mengen in verschiedenen Stellen des Körpers ansammeln, wie dem Knochenmarkskompartiment, der Milz, der Leber, der Niere und den Lungen. Die am stärksten ausgeprägten klinischen Symptome, die mit Morbus Gaucher einhergehen, sind progressive Splenomegalie, Hepatomegalie und Skelettbeeinträchtigungen. Die meisten Morbus-Gaucher-Patienten entwickeln keine neurologischen Komplikationen. Die häufige nichtneuronopathische Form der Krankheit wird Morbus Gaucher Typ 1 genannt. In sehr schweren Fällen von Morbus Gaucher können auch charakteristische neurologische Abnormitäten auftreten, die im Kindes- (Typ 2) oder Jugendalter (Typ 3) zu letalen Komplikationen führen [3].
Gaucher-Zellen
Die mit Glucosylceramid beladenen Gaucher-Zellen spielen vermutlich eine entscheidende Rolle in der Pathophysiologie. Ihre massive Anwesenheit an verschiedenen Stellen des Körpers führt vermutlich zu einer lokalen Pathologie.
Gaucher-Zellen sollten nicht als inerte Behälter für Glycosphingolipid angesehen werden. Die Speicherzellen sind lebensfähig, und das, es sich um aktivierte Makrophagen handelt, sezernieren sie tatsächlich große Mengen spezifischer Proteine, wie Hydrolasen und Cytokine. Diese Faktoren wirken wiederum als pathogenetische Agentien, die lokale Gewebeschäden und Gewebeerneuerung verursachen. Außerdem fördern von Gaucher-Zellen stammende Faktoren, wie Cytokine, die Rekrutierung von zusätzlichen aktivierten Makrophagen (siehe 3 wegen einer schematischen Übersicht).
Vor kurzem wurde von uns ein empfindlicher Marke für Gaucher-Zellen entdeckt [4]. Unter Verwendung der Technik der in-situ-Hybridisierung beobachteten wir, dass Gaucher-Zellen große Mengen des sekretorischen Enzyms Chitotriosidase, des humanen Analogons von Chitinasen, die in verschiedenen Spezies vorhanden sind, synthetisieren. Dies erklärt die drastische Erhöhung der Plasma-Chitotriosidase-Spiegel bei klinisch betroffenen Gaucher-Patienten. Im Mittel sind die Chitotriosidase-Spiegel im Plasma dieser Patienten etwa 1000mal so hoch wie bei entsprechenden normalen Probanden. Bei präsymptomatischen oder asymptomatischen Individuen mit einem vererbten Glucocerebrosidase-Mangel liegen die Plasma-Chitotriosidase-Spiegel (fast) im normalen Bereich (siehe Tabelle 2). Interessanterweise wurde erhöhte Plasma-Chitotriosidase-Spiegel auch bei Patienten mit anderen Sphingolipidosen festgestellt, insbesondere bei Niemann-Pick-Krankheit [5].
Es wurde beobachtet, dass die Konzentration an Glucosylceramid in kultivierten Makrophagen, die von Monocyten des peripheren Bluts abgeleitet sind, allmählich zunimmt. Die Zunahme des Glycolipids ist stärker ausgeprägt, wenn Zellen in Gegenwart von Condurit-B-epoxid, eines potenten irreversiblen Inhibitors von Glucocerebrosidase, gezüchtet werden. Nach ungefähr 7 Tagen Kultur beginnen die Makrophagen Chitotriosidase-mRNA zu produzieren und das Enzym zu sezernieren [4, 6]. Die Expression des Chitotriosidase-Gens nimmt anschließend drastisch zu: nach etwa drei Wochen bildet Chitotriosidase fast 1% des gesamten synthetisierten Proteins, was sich durch den Einbau von radioaktiv markiertem Methionin zeigt [7]. Die ständige Anwesenheit von Glucosylceramid oder von Condurit-B-epoxid (einem irreversiblen Inhibitor von lysosomaler Glucocerebrosidase) im Kulturmedium fördert die Expression von Chitotriosidase.
Therapeutischer Eingriff bei Morbus Gaucher
Die spärlichen und aus Einzelfällen stammenden Informationen über die natürliche Vorgeschichte von Morbus Gaucher deuten darauf hin, dass sich die klinischen Symptome zwar progressiv entwickeln, die Manifestation der Krankheit jedoch gewöhnlich kein allmählicher Vorgang ist. Im Falle der meisten Patienten entwickeln sich Abnormitäten in einem bestimmten Alter in einem speziellen Gewebe schnell, können sich anschließend für eine beträchtliche Zeit stabilisieren, um danach wieder schnell voranzuschreiten. Mit anderen Worten, der Fortschritt der Krankheit hat ein lokales und chaotisches Merkmal. Höchstwahrscheinlich spielen Gaucher-Zellen eine entscheidende Rolle bei diesen lokalen pathogenetischen Vorgängen. Die Anwesenheit der aktivierten Speicherzellen induziert lokale Gewebeschäden und Gewebeerneuerungen und fördert die Rekrutierung von aktivierten Makrophagen an diesen Stellen, was eine chaotische Kaskade von pathologischen Ereignissen einleitet (siehe 3). Gemäß diesem Konzept sollte die Unterbrechung oder Verhinderung der pathologischen Kaskade eine große günstige Wirkung haben. Die verschiedenen therapeutischen Ansätze für Morbus Gaucher, die in Betracht gezogen wurden, werden im Folgenden diskutiert.
Enzymersatztherapie
Seit mehr als dreißig Jahren wird der Zusatz von humaner Glucocerebrosidase für Makrophagen von Gaucher-Patienten ernsthaft als therapeutische Option in Erwägung gezogen. Bemühungen, eine Therapie für Morbus Gaucher zu entwickeln, waren wegen der Nichtverfügbarkeit ausreichender Mengen an reiner humaner Glucocerebrosidase und der schlechten Zielsteuerung des intravenös verabreichten Enzyms zu Lysosomen von Gewebemakrophagen viele Jahre lang weitgehend erfolglos. Erst seit 1990 steht ein effektiver therapeutischer Eingriff für Morbus Gaucher zur Verfügung, der auf der chronischen Versorgung von Patienten mit humaner Glucocerebrosidase beruht [8]. Durch intravenöse Infusion wird eine humane Glucocerebrosidase verabreicht, die in ihren N-gebundenen Glycanen so modifiziert ist, dass Mannosereste terminal exponiert sind. Die Modifikation begünstigt die Aufnahme über Mannose-Rezeptoren. Die verbesserte Zielsteuerung des modifizierten ("mannoseterminierten") Enzyms zu Lysosomen von Gewebemakrophagen erfolgt über eine Mannoserezeptorvermittelte Endocytose. Zur Zeit werden verschiedene Dosisanweisungen verwendet, die in Bezug auf die Gesamtdosis (15-240 E/kg Körpergewicht/Monat) und die Häufigkeit der Verabreichung (dreimal die Woche bis alle zwei Wochen) variieren (siehe z.B. Lit. 9). Aus humaner Plazenta isolierte Glucocerebrosidase (Ceredase; Alglucerase) und in CHO-Zellen rekombinant produziertes Enzym (Cerezym; Imiglucerase) erwiesen sich als gleich wirksam bei der Umkehrung einiger der klinischen Symptome, die mit der Krankheit verbunden sind [10].
Die am stärksten ausgeprägten günstigen Wirkungen der Enzymersatztherapie sind die Reduktionen des Leber- und Milzvolumens und die Verbesserungen der hämatologischen Parameter, wie Hämoglobin-Konzentration und Thrombocyten- und Leukocytenzahlen. Ausgeprägte interindividuelle Unterschiede gibt es in der Geschwindigkeit und dem Ausmaß der klinischen Reaktion, selbst unter verwandten Patienten, die mit derselben Dosierungsvorschrift behandelt werden [9]. Im Allgemeinen treten die am stärksten ausgeprägten klinischen Verbesserungen innerhalb des ersten Jahrs der Behandlung auf; sie gehen mit einer ausgeprägten Korrektur der biochemischen Serumabnormitäten einher. Eine vollständige Umkehrung der klinischen Symptome und eine vollständige Normalisierung der Serumabnormitäten, wie der erhöhten Konzentrationen des Angiotensin-konvertierenden Enzyms, der tartratresistenten Sauren Phosphatase und Chitotriosidase, werden durch die Enzymtherapie nicht erreicht, nicht einmal im Falle von Patienten, die mehrere Jahre lang eine hohe Glucocerebrosidase-Dosis erhalten [11]. Die partielle Korrektur nach der Enzymtherapie steht im Gegensatz zur vollständigen Korrektur, die bei Patienten festgestellt wird, die einer erfolgreichen Knochenmarkstransplantation unterzogen wurden.
Es gibt noch unvereinbare Ansichten in Bezug auf die optimale Dosierungsvorschrift für die Enzymtherapie. Während Vorschriften mit niedriger Dosierung bei der Erzeugung von hämatologischen Verbesserungen (fast) genauso erfolgreich sein können wie Vorschriften mit hoher Dosierung, ist dies in Bezug auf einen Eingriff bei der Knochenkrankheit noch fraglich.
Zur Zeit erhalten mehr als 1500 Patienten eine Enzymtherapie. Diese neuere Entwicklung hat beträchtliche wissenschaftliche und öffentliche Aufmerksamkeit erregt, auch aufgrund der hohen Kosten und der potentiellen Gefahren, die es dabei gibt. Die mit einer erfolgreichen Therapie verbundenen Kosten waren bisher außergewöhnlich hoch (100 000 $ bis 400 000 $ pro Jahr pro Patient), was zu der Annahme führt, dass die Enzymtherapie bei Morbus Gaucher die teuerste Medikamentenbehandlung für irgendeine Krankheit ist. Es ist zwar bekannt, dass das Alglucerase-Präparat kleinere Mengen an HCG und anderer Verunreinigungen enthält, doch deutet die bisherige Erfahrung darauf hin, dass die Enzymtherapie unbedenklich ist.
Die Enzymtherapie bei Morbus Gaucher gilt als Modellfall für die zukünftige Entwicklung von Behandlungen für andere seltene genetische Störungen, ein Punkt, der vielleicht am besten dadurch veranschaulicht wird, dass im Februar/März 1995 eine Technology Assessment Conference an den National Institutes of Health in Bethesda, USA, organisiert wurde, die speziell Morbus Gaucher gewidmet war. Diese Art von Konferenz wird nur organisiert, wenn es ein außergewöhnlich dringendes Bedürfnis im Gesundheitswesen gibt. Während der Durchführung der Konferenz befragte ein Gremium von 12 unabhängigen Experten führende Wissenschaftler und Ärzte auf dem Gebiet von Morbus Gaucher; das Gremium kam zu dem Schluss, dass die Enzymtherapie eine Umkehrung von mehreren klinischen Symptomen bewirkt, die mit Morbus Gaucher einhergehen. Weiterhin wurde betont, dass eine Reduktion der Kosten und der potentiellen Gefahren, die mit der humanen Proteinersatztherapie verbunden sind, entscheidende Probleme unter dem Gesichtspunkt der Patienten- und Gesundheitsökonomie sind [12].
Andere therapeutische Ansätze
Eine erfolgreiche Behandlung von Morbus Gaucher durch Knochenmarkstransplantation wurde bei einer begrenzten Zahl von jugendlichen Gaucher-Patienten erreicht. Die Einführung der normalen genetischen Information für Glucocerebrosidase in hämatopoetische Stammzellen führt zur Bildung von Blutzellen, die Glucosylceramid mit normaler Geschwindigkeit hydrolysieren können. Die Tatsache, dass klinische Abnormitäten bei Gaucher-Patienten nach einer erfolgreichen Knochenmarkstransplantation verschwinden, weist darauf hin, dass die Anwesenheit von Blutzellen mit normaler Glucocerebrosidase-Aktivität ausreicht, um die Krankheitssymptome zu verhindern. Leider ist die Anwendbarkeit der Knochenmarkstransplantation als Behandlung für Morbus Gaucher aufgrund der beschränkten Verfügbarkeit von Knochenmark von passenden Spendern und der beträchtlichen Morbidität, die mit diesem Eingriff einhergeht, insbesondere im Falle von Erwachsenen, stark eingeschränkt.
In den letzten Jahren wird die Option einer Gentherapie für Morbus Gaucher intensiv untersucht. Im Allgemeinen wird der folgende Ansatz ins Auge gefasst. Pluripotente hämatopoetische Stammzellen werden isoliert und mit einem Vektor transduziert, der humane Glucocerebrosidase-cDNA enthält. Nach der erfolgreichen Transduktion werden die Stammzellen wieder in den Patienten eingeführt. Obwohl mit Tierversuchen erhaltene Daten vermuten lassen, dass Morbus Gaucher ein attraktiver Kandidat für die Gentherapie ist, müssen noch mehrere große Probleme gelöst werden, bevor ein effizienter Eingriff in dieser Art erwartet werden kann. Ein großer Nachteil besteht darin, dass die "genetisch korrigierten" Stammzellen und ihre Nachkommen höchstwahrscheinlich keinen selektiven Vorteil haben. Es wird daher angenommen, dass die Gentherapie, um effektiv zu sein, zu einer stabilen Korrektur eines größeren Anteils der pluripotenten Stammzellen führen muss. Wegen einer kritischen Bewertung des Standes der Technik in Bezug auf die Gentherapie, siehe Lit. 13.
Ein gesonderter therapeutischer Ansatz, der für Morbus Gaucher vorgeschlagen wurde, ist die sogenannte "Substratentzugstherapie" [14–16]. Es wird argumentiert, dass eine merkliche Reduktion der Synthese von Glucosylceramid eine günstige Wirkung haben kann, da die Menge an Glucosylceramid, das durch Makrophagen abgebaut werden muss, geringer wäre. Mehrere Inhibitoren der Glucosylceramid-Synthase wurden entwickelt, z.B. 1-Phenyldecanoylamino-3-morpholino-1-propanol (PDMP) und sein Analogon 1-Phenyl-2-hexadecanoylamino-3-morpholino-1-propanol (PPMP) [14], Butyldesoxynojirimycin [15] und Butyldesoxygalactonojirimycin [16].
Ein Nachteil des "Substratentzugs"-Ansatzes besteht darin, dass von vornherein nicht nur die Synthese von Glucosylceramid, sondern auch die von komplexeren Glycosphingolipiden gehemmt wird. Außerdem ist bekannt, dass die zur Zeit verfügbaren Inhibitoren der Glucosylceramid-Synthase mehrere wichtige biologische Wirkungen haben, die ihre Anwendbarkeit als therapeutisches Mittel einschränken können. Zum Beispiel ist bekannt, dass PDMP bei einigen Zelltypen Apoptose induziert. Von Butyldesoxynojirimycin ist bekannt, dass es auch die lysosomale Glucocerebrosidase und die α-Glucosidase I hemmt, ein ER-Enzym, das eine entscheidende Rolle beim Zurechtschneiden von N-verknüpften Glycanen bei neu gebildeten Glycoproteinen und somit bei der Qualitätskontrolle der Proteinfaltung spielt. Die antivirale Wirkung von Butyldesoxynojirimycin wird vermutlich durch dessen inhibitorische Wirkung auf die Glycoprotein-Modifikation verursacht. Außerdem wurde vor kurzem berichtet, dass Glucosylceramid-Synthase-Inhibitoren die Synthese des Enzyms induzieren. Folglich müssten diese Inhibitoren Gaucher-Patienten chronisch verabreicht: werden, da ihr Entzug einen abnorm hohen Wert der Glucosylceramid-Synthase-Aktivität und eine erhöhte Belastung mit Glucosylceramid zur Folge hätte [14].
Kurzbeschreibung der Erfindung
Diese Erfindung stellt ein Desoxynojirimycin-Derivat mit einer großen hydrophoben, über eine Spacergruppe mit dem Stickstoffatom von Desoxynojirimycin verknüpften Gruppe und dessen Salze bereit, wobei die große hydrophobe Gruppe von einem polycyclischen Alkohol abgeleitet ist, der drei oder mehr Ringe enthält, die je zwei oder mehr Kohlenstoffatome mit einem anderen Ring gemeinsam haben, und in der Lage ist, sich in Lipid-Doppelschichten einzufügen, und wobei die Spacergruppe eine Polyalkylenkette mit drei bis acht Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, am meisten bevorzugt 5 Kohlenstoffatomen, ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht die Spacergruppe aus einer Gruppe mit der Struktur -(CH₂)_n-, wobei n eine ganze Zahl von 3 bis 8, vorzugsweise 3 bis 6, am meisten bevorzugt 5, ist.
Die große hydrophobe Gruppe ist von einem polycyclischen Alkohol abgeleitet, der drei oder mehr Ringe enthält, die jeweils zwei oder mehr Kohlenstoffatome mit einem anderen Ring gemeinsam haben. Die große hydrophobe Gruppe ist in der Lage, sich in Lipid-Doppelschichten einzufügen.
Vorzugsweise ist die große hydrophobe Gruppe von einer Verbindung abgeleitet, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Adamantanmethanol, Cholesterin, β-Cholestanol, Adamantanol und 9-Hydroxyphenanthren besteht.
Diese Erfindung stellt weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die ein solches Desoxynojirimycin-Derivat enthält, und gibt eine Vielzahl von Verwendungen des Desoxynojirimycin-Derivats für die Herstellung eines Medikaments für mehrere therapeutische Verwendungen an.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein schematischer Überblick der Signalgebung über Ceramid. TNF-α (Tumornekrosefaktor α), IL-1 (Interleukin-1), NGF (Nervenwachstumsfaktor), IFN (Interferon-γ) binden an ihre Rezeptoren, woraufhin eine neutrale Sphingomyelinase Ceramid aus Sphingomyelin erzeugt. Ceramid aktiviert Protein-Kinasen und Phosphatase, was zu einer zellulären Reaktion führt.
2 zeigt eine schematische Übersicht des Stoffwechsels von Ceramid. Dort verwendete Abkürzungen: Chol = Cholin; Glc = Glucose; GlcCer = Glucosylceramid; GSL = komplexes Glycosphingolipid; LacCer = Lactosylceramid; SM = Sphingomyelin.
3 zeigt die Pathophysiologie von Morbus Gaucher. Lipidbeladene Makrophagen ("Gaucher-Zellen") sezernieren Hydrolasen und Cytokine, die Gewebeschäden und Gewebeerneuerung verursachen und die die Rekrutierung von Makrophagen fördern und dadurch eine pathologische Kaskade verursachen.
4 zeigt ein hypothetisches Modell für die Pathogenese von Morbus Gaucher und einen Angriffspunkt für einen Eingriff. Aufgrund der lysosomalen Beeinträchtigung des Katabolismus von GC (Glucosylceramid) in den Lysosomen ist die Aktivität der nichtlysosomalen Glucosylceramidase erhöht. Dies führt zu einer erhöhten Produktion von Ceramid (C) und einer damit verbundenen Signalgebung an den Zellkern. Dies führt zu einer Produktion und Sekretion von spezifischen Faktoren, die die pathologische Kaskade fortsetzen. Ein Eingriff in den pathogenetischen Mechanismus sollte möglich sein, indem man die Aktivität von Glucosylceramidase spezifisch hemmt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Ein neuer therapeutischer Ansatz: Hemmung der Makrophagenaktivierung
Zur Zeit sind enorme Kosten mit der Enzymtherapie verbunden, und die Wirksamkeit dieses Ansatzes erweist sich als intraindividuell hochgradig variabel. Die vorliegenden Alternativen für einen therapeutischen Eingriff sind entweder nur auf eine begrenzte Zahl von Fällen anwendbar (Knochenmarkstransplantation), oder es wurde tatsächlich noch nicht gezeigt, dass sie wirksam und unbedenklich sind (Gentherapie und Substratentzug). Dies hat uns dazu bewogen, nach einer neuen Option für den therapeutischen Eingriff zu suchen, die zusätzlich zur Enzymtherapie verwendet werden kann.
Gemäß unserer Ansicht über die Pathogenese von Morbus Gaucher (siehe 3) bildet die Aktivierung von Makrophagen, die zur Freisetzung von Hydrolasen und Cytokinen führt, einen idealen Angriffspunkt für einen Eingriff.
Ein Mittel, das die Aktivierung von Gaucher-Zellen verhindern kann, sollte einen therapeutischen Wert haben und sollte überdies in der Lage sein, die Wirksamkeit der Enzymtherapie zu erhöhen.
Entwicklung eines Eingriffs auf der Basis der Hemmung der Makrophagenaktivierung
Identifizierung des Angriffspunkts für den Eingriff
Um das gewünschte therapeutische Mittel entwickeln zu können, musste zuerst der Mechanismus aufgeklärt werden, nach dem Gaucher-Zellen in ihren charakteristischen aktivierten Zustand getrieben werden.
Im Verlaufe unserer Untersuchungen erhielten wir zwei entscheidende Ergebnisse, die es uns ermöglichten, das ins Auge gefasste Mittel zu entwickeln.
Erstens fanden wir einen empfindlichen Marker für den charakteristischen aktivierten Zustand von Gaucher-Zellen, d.h. die massive Synthese und Sekretion von Chitotriosidase durch diese Zellen (siehe oben). Dabei ist wichtig, dass das Potential von Mitteln zur Verhinderung der relevanten Aktivierung von Makrophagen durch die Analyse ihrer Fähigkeit, die Produktion und Sekretion von Chitotriosidase durch Makrophagen in Zellkultur zu hemmen, empfindlich getestet werden kann.
Zweitens fanden wir heraus, dass humane Zellen neben der lysosomalen Glucocerebrosidase noch ein gesondertes Enzym enthalten, das Glucosylceramid zu Glucose und Ceramid hydrolysieren kann [17].
Nichtlysosomale Glucosylceramidase
Die Glucosylceramidase unterscheidet sich in vielerlei Hinsicht von der lysosomalen Glucocerebrosidase. Das Enzym ist im Gegensatz zu Glucocerebrosidase nicht in Lysosomen lokalisiert; im Gegensatz zu Glucocerebrosidase besteht bei Morbus Gaucher kein Mangel daran; es verhält sich wie ein integrales Membranprotein, während Glucocerebrosidase die Merkmale eines membranassoziierten Proteins zeigt; und schließlich unterscheidet es sich von Glucocerebrosidase durch die Spezifität für künstliche Substrate, Inhibitoren und Aktivatoren. Zum Beispiel kann die Glucosylceramidase im Gegensatz zu Glucocerebrosidase keine künstlichen β-xylosidischen Substrate hydrolysieren. Glucocerebrosidase kann durch Condurit-B-epoxid irreversibel gehemmt werden, im Gegensatz zu Glucosylceramidase, die gegenüber dieser Verbindung unempfindlich ist. Das lysosomale Aktivatorprotein Saposin C stimuliert stark die enzymatische Aktivität von Glucocerebrosidase, ist jedoch ohne Wirkung auf Glucosylceramidase.
Zur Funktion von Glucosylceramidase wurde eine wichtige Beobachtung gemacht. Unter Verwendung einer relativ neuen Technik zur subzellulären Fraktionierung wurde herausgefunden, dass Glucosylceramidase an der Plasmamembran oder in frühen endosomalen Strukturen vorliegt. Mit anderen Worten, die enzymatische Aktivität von Glucosylceramidase führt zur Bildung von Ceramid in der Plasmamembran oder speziellen Ausstülpungen dieser Membran. Es ist bekannt, dass in der Plasmamembran tatsächlich erhebliche Mengen an Glucosylceramid vorhanden sind. Folglich könnte die Aktivität von Glucosylceramidase zu relevanten Änderungen der Ceramidkonzentration in solchen zellulären Membranen führen, die an der Ceramid-vermittelten Signalgebung beteiligt sind.
Unter Verwendung von aus Zellen und Geweben präparierten Membransuspensionen wurde weiterhin beobachtet, dass das durch die Aktivität der lysosomalen Glucocerebrosidase aus Glucosylceramid gebildete Ceramid kaum in Sphingomyelin umgewandelt wird; im scharfen Gegensatz dazu steht die effiziente Umwandlung des durch die Wirkung von Glucosylceramidase gebildeten Ceramids in Sphingomyelin. Anscheinend wird das durch die Glucosylceramidase-Aktivität gebildete Ceramid innerhalb derselben Membranen schnell weiter metabolisiert, wie bei einem Lipid, das als vorübergehender sekundärer Botenstoff wirkt, zu erwarten ist.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse postulieren wir einen neuen Mechanismus für die pathologische Aktivierung von Makrophagen bei Morbus Gaucher. In diesem Modell, wie es in 4 abgebildet ist, wird vorgeschlagen, dass die lysosomale Beeinträchtigung des Abbaus von Glucosylceramid bei Individuen mit Glucocerebrosidase-Mangel auch zu einer erhöhten Konzentration dieses Glycolipids in Membranen, die Glucosylceramidase enthalten, führt. Folglich liegt das Glycolipid dort in einem abnorm hohen Anteil zu Ceramid hydrolysiert vor. Dieses Ceramid aktiviert Protein-Kinasen und Phosphatasen, was zur charakteristischen Aktivierung des Makrophagen und der entsprechenden Produktion und Freisetzung von pathogenetischen Faktoren führt. Ein experimenteller Beweis für dieses Modell, in dem die konstitutiv stimulierte Glucosylceramidase-Aktivität die Makrophagenaktivierung stimuliert, ist im Folgenden beschrieben.
Glucosylceramidase-Aktivität als Angriffspunkt für einen therapeutischen Eingriff
Glucosylceramidase ist ein idealer und neuer Angriffspunkt für die Verhinderung der Aktivierung von Makrophagen bei Morbus Gaucher. Eine spezifische Hemmung der Enzymaktivität würde die weitere Freisetzung von pathogenetischen Faktoren verhindern und die pathologische Kaskade unterbrechen, was zu einer therapeutischen Wirkung führen würde. Man kann hoffen, dass die Kombination dieses Ansatzes mit der Enzymersatztherapie die Wirksamkeit des therapeuti schen Eingriffs merklich verbessern kann und inzwischen zu einer erheblichen Reduktion der damit verbundenen Kosten führt.
Gestaltung eines spezifischen Inhibitors der Glucosylceramidase-Aktivität
Die Eigenschaften der in Membransuspensionen und intakten Zellen vorhandenen Glucosylceramidase wurden sorgfältig analysiert, um einen geeigneten Inhibitor für das Enzym zu identifizieren. In diesem Zusammenhang wurden mehrere wichtige Ergebnisse erzielt.
Es wurde beobachtet, dass das Enzym fest in die Membran integriert ist und sein Substrat Glucosylceramid höchstwahrscheinlich hydrolysiert, während dieses ebenfalls in die Membran eingefügt ist. Die Identifizierung der Lokalisierung von Glucosylceramidase in (Ausstülpungen) der Plasmamembran ist ebenfalls von Bedeutung.
Weiterhin wurden mehrere bekannte Glucosidase-Inhibitoren (D-Gluconolacton, Castanospermin, Desoxynojirimycin und Butyldesoxynojirimycin) auf ihre Fähigkeit getestet, die Glucosylceramidase-Aktivität zu hemmen. Die vielversprechendsten Inhibitoren waren Desoxynojirimycin und insbesondere Butyldesoxynojirimycin. Ihre Spezifität sowie die der anderen getesteten Inhibitoren war jedoch gering. Zum Beispiel ist die lysosomale Glucocerebrosidase ebenfalls sehr empfindlich gegenüber den Inhibitoren, so dass diese für die Verabreichung an Gaucher-Patienten, die bereits an einem Glucocerebrosidase-Mangel leiden, unattraktiv sind. Die Inhibitoren würden überdies aufgrund ihrer inhibitorischen Wirkung auf die verabreichte Alglucerase oder Imiglucerase die Enzymtherapie von Patienten ernsthaft stören.
Es wurde festgestellt, dass die Inkubation von intakten Zellen mit Desoxynojirimycin oder Butyldesoxynojirimycin in ihrer IC₅₀-Konzentration für Glucosylceramidase (20 bzw. 0,3 μM) ebenfalls zu einer signifikanten Hemmung der Glucocerebrosidase-Aktivität (etwa 20 bzw. 10%) und zu einer Hemmung der Glucosyl ceramid-Synthase-Aktivität (etwa 30 bzw. 20%) führte. In demselben Konzentrationsbereich wurde auch eine merkliche Hemmung der Aktivität von ER-α-Glucosidase I (Zurechtschneiden der N-gebundenen Glycane) für mehrere Zelltypen beschrieben [15].
Die negativen Ergebnisse mit bekannten Glucosidase-Inhibitoren bewogen uns dazu, einen neuen, spezifischeren Inhibitor für Glucosylceramidase zu gestalten, wobei wir uns die gewonnenen Informationen über die Merkmale des Enzyms zu Nutze machten.
Wir stellten uns vor, dass der gewünschte starke und spezifische Inhibitor für die Glucosylceramidase die folgenden Merkmale haben sollte:

1) eine Desoxynojirimycin-Struktureinheit; ein erwiesener, relativ starker Inhibitor der enzymatischen Aktivität von Glucosylceramidase.
2) eine N-Alkyl-Spacergruppe; es zeigte sich, dass die N-Alkylierung von Desoxynojirimycin dessen Fähigkeit zur Hemmung von Glucosylceramidase erhöht.
3) an die Spacergruppe gekoppelt eine große hydrophobe Gruppe, die sich leicht in eine Lipid-Doppelschicht, vorzugsweise (Ausstülpungen der) Plasmamembran, einfügt; die präferentielle Einfügung des Inhibitors in Glucosylceramidase enthaltende Membranen sollte die in-vivo-Fähigkeit und Spezifität des Inhibitors erhöhen.

Synthese von Desoxynojirimycin-Analoga
Durch chemische Synthese wurde eine Reihe von Desoxynojirimycin-Derivaten hergestellt, um das Konzept zu testen und den idealen Inhibitor für Glucosylceramidase zu entwickeln. Auf der Grundlage der oben genannten Merkmale wurde eine Reihe von Derivaten von Desoxynojirimycin (DNM) des folgenden Typs synthetisiert (1):
In dieser Struktur ist X eine gesättigte Alkankette, und R ist eine große apolare Gruppe. Verbindungen dieses Typs können synthetisiert werden, indem man DNM·HCl, das leicht in sieben Schritten aus der kommerziell erhältlichen Tetrabenzylglucopyranose [18] erhalten werden kann, in einer reduktiven Aminierungsreaktion [19] mit dem geeigneten Aldehyd umsetzt (Schema 1).
Die Strategie wird beispielhaft anhand der Synthese der folgenden beiden Verbindungen beschrieben: N-(5-Cholesteroloxypentyl)desoxynojirimycin (9) und N-(5-Adamantan-1-ylmethoxypentyl)desoxynojirimycin (10) (Schema 2). Glutaraldehyd (1) wurde also zuerst zum Monoacetal (2) umgesetzt [20], wobei man einen Ionenaustausch-Katalysator verwendete. Nach der Reduktion des Monoacetals zum entsprechenden Alkohol (3) und Umwandlung zum Mesylat (4) lieferte eine Reaktion mit dem geeigneten Alkohol, wobei ROH Cholesterin bzw. Adamantanmethanol ist, unter basischen Bedingungen die Acetate 5 und 6. Nach der Freisetzung der zweiten Aldehydfunktion, d.h. der Bildung der Verbindungen 7 und 8, lieferte eine reduktive Aminierung mit DNM·HCl die Zielverbindungen 9 und 10.
Quantifizierung der inhibitorischen Wirkungen von Desoxynojirimycin-Analoga
Die inhibitorischen Wirkungen der verschiedenen Desoxynojirimycin-Analoga auf die relevanten Enzymaktivitäten wurden in vitro und in intakten Zellen analysiert.
In-vitro-Experimente
Zuerst wurden in-vitro-Experimente mit gereinigten humanen Enzymen und Membransuspensionen von humanem Gewebe durchgeführt. Die Aufmerksamkeit wurde auf die Hemmung der Aktivitäten von lysosomaler Glucocerebrosidase und Glucosylceramidase und derjenigen der lysosomalen α-Glucosidase konzentriert. Als Quelle für Glucosylceramidase wurde eine Membranfraktion aus menschlicher Milz verwendet. Die Glucosylceramidase-Aktivität wurde als hydrolytische Aktivität gegenüber 4MU-β-Glucosid in der Membransuspension gemessen, die mit Condurit-B-epoxid vorbehandelt worden war, um die Aktivität von Glucocerebrosidase zu beseitigen. Als Quelle für Glucocerebrosidase diente humanes Plazentaenzym (Ceredase, Genzyme Corp., Boston, USA), das in der Enzymtherapie verwendet wird. Alternativ dazu wurde die Glucocerebrosidase-Aktivität in einer Membranfraktion aus menschlicher Milz bestimmt. Die Glucocerebrosidase-Aktivität wurde als Hydrolyse von 4MU-β-Glucosid gemessen, die durch Condurit-B-epoxid hemmbar ist. Die Aktivität der lysosomalen α-Glucosidase wurde als hydrolytische Aktivität gegenüber 4MU-α-Glucosidase, die ein gereinigtes α-Glucosidase-Präparat zeigt, gemessen.
Die Tabellen 6 und 7 zeigen die Strukturen der getesteten Verbindungen. Tabelle 3 gibt einen Überblick über die scheinbaren Ki-Werte der Inhibitoren.
Man erkennt in Tabelle 3, dass Glucosylceramidase durch N-Alkyl-Derivate von Desoxynojirimycin stark gehemmt wird. Eine optimale Hemmung wurde für das N-Pentyl-Derivat festgestellt. N-Hexyldesoxynojirimycin war ein weniger starker Inhibitor (nicht in Tabelle 3 gezeigt). Die Anwesenheit einer Carbonylgruppe in der Spacergruppe beeinflusst die Inhibitionsfähigkeit negativ.
Die Kopplung einer großen hydrophoben Gruppe, wie Adamantan (P21) oder Cholesterin (P24), an eine N-Pentyl-Spacergruppe erhöht die Fähigkeit der Verbindung zur Hemmung der Glucosylceramidase-Aktivität drastisch.
Im Falle einiger Inhibitoren wurden auch IC₅₀-Werte bestimmt. Die scheinbaren IC₅₀-Werte für P21 und P24 sind äußerst niedrig, 1 nM bzw. 0,1 μM. Zum Vergleich betragen die IC₅₀-Werte für Desoxynojirimycin und Butyldesoxynojirimycin 20 μM bzw. 0,3 μM.
Tabelle 3 zeigt, dass Glucocerebrosidase im Allgemeinen weniger empfindlich gegenüber Desoxynojirimycin-Derivaten ist als Glucosylceramidase.
Reine Glucocerebrosidase in Lösung (Ceredase) und membranassoziiertes Enzym zeigen eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber den Inhibitoren. Anscheinend unterscheiden sich die kinetischen Eigenschaften des Enzyms in diesen beiden verschiedenen Zuständen, wie auch durch den Unterschied im scheinbaren Km-Wert für 4MU-β-Glucosid nahegelegt wird.
Sowohl die lösliche als auch die membranassoziierte Glucocerebrosidase werden am stärksten durch Desoxynojirimycin-Analoga mit einer N-Pentyl-Spacergruppe mit einer daran gekoppelten großen hydrophoben Gruppe gehemmt.
Für lösliche Glucocerebrosidase (Ceredase) betrug der scheinbare IC₅₀-Wert von P21 0,2 μM, und der von P24 betrug 0,8 μM; für die membranassoziierte Glucocerebrosidase betrugen die scheinbaren IC₅₀-Werte von P21 und P24 0,06 bzw. 0,7 μM.
In Bezug auf die lysosomale α-Glucosidase zeigte sich, dass Substitutionen bei Desoxynojirimycin im Allgemeinen eine relativ geringe Wirkung hatten. Die Verbindungen P4, P11, P16, P9 und P13 waren jedoch sehr schlechte Inhibitoren.
In-vivo-Experimente
Dann wurde die Fähigkeit der Desoxynojirimycin-Analoga zur Hemmung der Aktivitäten von Glucosylceramidase und Glucocerebrosidase in intakten Zellen untersucht. Die Enzymaktivitäten wurden so gemessen, wie es in Lit. 17 beschrieben ist. Kurz gesagt, die Hydrolyse von 4MU-β-Glucosid durch kultivierte Melanomzellen, die mit und ohne Condurit-B-epoxid vorinkubiert wurden, wurde bestimmt. Die gegenüber Condurit-B-epoxid empfindliche Aktivität kann Glucocerebrosidase und die unempfindliche Aktivität Glucosylceramidase zugeschrieben werden. Die Ergebnisse dieser Studie sind in Tabelle 4 gezeigt.
Ein Vergleich von Tabelle 3 und Tabelle 4 zeigt, dass die Hemmung der Glucosylceramidase-Aktivität durch Desoxynojirimycin-Analoga in intakten Melanomzellen ähnlich der Hemmung ist, die man bei in-vitro-Experimenten unter Verwendung von Milzmembranpräparaten beobachtet. Die stärksten Inhibitoren sind P21 und P24 mit IC₅₀-Werten von etwa 0,3 nM und 50 nM. Bei diesen oder zehnmal so großen Konzentrationen ist keine signifikante Hemmung der Glucocerebrosidase-Aktivität nachweisbar, siehe Tabelle 4.
Die inhibitorischen Konstanten von Desoxynojirimycin-Analoga wurden auch durch die Analyse des Stoffwechsels von C6-NBD-Glucosylceramid in Melanomzellen bestimmt, wobei wiederum Condurit-B-epoxid eingesetzt wurde, um zwischen den Aktivitäten der unempfindlichen Glucosylceramidase und der empfindlichen Glucocerebrosidase zu unterscheiden. Die mit C6-NBD-Glucosylceramid als Substrat erhaltenen Ergebnisse waren fast identisch mit denjenigen, die mit dem fluorogenen 4MU-β-Glucosid-Substrat erhalten wurden (nicht gezeigt).
Es wurde untersucht, bis zu welchem Grad andere Reaktionen gehemmt wurden, indem man Zellen mit P21 oder P24 in ihrer IC₅₀-Konzentration für die Glucosyl ceramidase-Aktivität inkubierte. Unter diesen Bedingungen wurde bei Rattenhepatocyten keine Hemmung der Glycogen-Synthase festgestellt; bei kultivierten Melanomzellen wurde keine Hemmung der Glucosylceramid-Synthase-Aktivität oder der lysosomalen α-Glucosidase festgestellt.
Wegen der extremen Empfindlichkeit der Glucosylceramidase gegenüber P21 wurde untersucht, ob die Hemmung durch diese Verbindung irreversibel sein könnte. Um dies zu testen, wurden Melanomzellen mit oder ohne P21 vorinkubiert und anschließend gründlich gewaschen. Dann wurden die Aktivitäten von Glucocerebrosidase und Glucosylceramidase mit 4MU-β-Glucosid als Substrat bestimmt. Es zeigte sich, dass die Vorbehandlung mit Inhibitor keine signifikante Wirkung auf die Glucocerebrosidase-Aktivität hatte, aber zu einem irreversiblen Verlust der Glucosylceramidase-Aktivität führte.
Pilotstudie: Wert von Desoxynojirimycin-Analoga für einen Eingriff in die Makrophagenaktivierung
Die Wirkung von P21 (N-(5-Adamantan-1-yl-methoxypentyl)desoxynojirimycin) und Butyldesoxynojirimycin auf Makrophagen in Kultur wurde untersucht. Die Iminozucker, die in einer Konzentration von 10 mM in DMSO gelöst waren, wurden durch Verdünnung mit Kulturmedium in verschiedenen Konzentrationen zu kultivierten Makrophagen gegeben. Es wurde überprüft, dass die kleineren Mengen an DMSO, die auf diese Weise eingeführt wurden, keine Wirkung hatten.
Tabelle 5 zeigt die Hemmung der Aktivitäten von Glucocerebrosidase und Glucosylceramidase durch die Desoxynojirimycin-Analoga in Makrophagen, gemessen mit C6-NBD-Glucosylceramid als Substrat; die Wirkungen sind mit denjenigen, die für die Enzyme in Melanomzellen festgestellt wurden, ganz gut vergleichbar. Tabelle 5 zeigt weiterhin die Wirkung der Desoxynojirimycin-Analoga auf die Sekretion von Chitotriosidase durch die Zellen. Man erkennt, dass die Chitotriosidase-Sekretion gleichzeitig mit der Hemmung der Aktivität von Glucosylceramidase, aber nicht mit der der lysosomalen Glucocerebrosidase, reduziert wird. Unter Verwendung von C6-NBD-Ceramid als Substrat wurde die Glucosylceramid-Synthase-Aktivität in kultivierten Makrophagen ebenfalls bestimmt. Es wurde festgestellt, dass diese Enzymaktivität durch die Anwesenheit von 5 μM Butyldesoxynojirimycin im Kulturmedium, eine Bedingung, die eine reduzierte Chitotriosidase-Sekretion verursacht, nicht signifikant gehemmt wird. Außerdem zeigte sich, dass die Hemmung der Glucosylceramid-Synthase durch die Gegenwart von PDMP oder PPMP ohne Wirkung auf die Chitotriosidase-Sekretion war.
Die Experimente zeigen also, dass niedrige Konzentrationen von Butyldesoxynojirimycin und insbesondere P21 dank ihrer spezifischen Hemmung der Glucosylceramidase-Aktivität Makrophagen, die massiv Chitotriosidase sezernieren (und gleichzeitig andere Hydrolasen und Cytokine), deaktivieren können. Die Pilotstudie war also erfolgreich.
Anwendungen der Inhibitoren der Glucosylceramidase-Aktivität
Eine Anwendung für die neu entwickelten, hochspezifischen Inhibitoren ist im therapeutischen Eingriff in Morbus Gaucher zu finden. Wie oben diskutiert wurde, kann erwartet werden, dass die Wirkungen der Inhibitoren auf die Makrophagenaktivierung eine günstige Wirkung auf die Pathogenese von Morbus Gaucher hat. Die Verabreichung von Inhibitoren kann die Wirksamkeit der Enzymtherapie verbessern und folglich zu einer verbesserten klinischen Antwort und einer merklichen Reduktion der damit einhergehenden Kosten führen.
Eine günstige Wirkung könnte auch von Inhibitoren der Glucosylceramidase-Aktivität im Falle anderer Krankheitszustände ausgeübt werden, die durch erhöhte Plasma-Chitotriosidase-Spiegel gekennzeichnet sind, wie Niemann-Pick-Krankheit und Sarcoidose [4, 5]. Weiterhin ist uns bekannt, dass Schaumzellen bei Atherosklerose Chitotriosidase überproduzieren.
Wahrscheinlich werden Ceramid-vermittelte Signalgebungsvorgänge direkt oder indirekt durch eine Hemmung der Glucosylceramidase-Aktivität beeinflusst. Die potentiellen Anwendungen für die entwickelten Inhibitoren können daher äußerst vielfältig sein. Von besonderem Interesse sind Entzündungszustände, die durch TNF-α oder andere proinflammatorische Cytokine, die Signale über Ceramid geben, hervorgerufen werden. Beispiele in diesem Zusammenhang sind septischer Schock, rheumatoide Arthritis und Morbus Crohn.
Die Auswahl eines geeigneten Verabreichungswegs und geeigneter Zubereitungen von pharmazeutischen Zusammensetzungen liegt im Bereich des üblichen handwerklichen Könnens. Beispiele für geeignete Verabreichungswege sind parenterale (intravenöse, subkutane, intramuskuläre) Injektionen oder Infusionen, orale Aufnahme und topische Applikation. Besonders attraktiv ist die Verwendung von öligen Trägern, die eine langsame und nachhaltige Freisetzung aus dem Behälterpräparat ermöglichen. Die Verwendung eines öligen Trägers ist im Falle der oralen Aufnahme oder der intravenösen Verabreichung nicht möglich. Im Falle der oralen Aufnahme erfolgt die Resorption der lipophilen Verbindung spontan im Magen-Darm-Trakt nach Solubilisierung der Verbindung in gemischten Micellen und anschließender passiver Diffusion durch die Enterocytenmembran. Im Falle einer intravenösen Verabreichung können Liposomen verwendet werden, in die die lipophile Verbindung zuvor eingearbeitet wurde.
Experimentelles
5,5-Diethoxypentan-1-ol (3)
Ein Gemisch von 5,5-Diethoxypentanal (1; 3 g, 17 mmol) und NaBH₄ (0.65 g, 17 mmol) in 30 ml EtOH wurde 3 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft, und der Rückstand wurde mit 10% NaOH verrieben und mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, getrocknet (Na₂SO₄), und das Lösungsmittel wurde verdampft, was Verbindung 2 ergab, die mit Silicagel-Flash-Chromatographie und Elution mit Petrolether 60–80/Ethylacetat 1:1 gereinigt wurde (Ausbeute 59%).
¹H-NMR(CDCl₃): δ 4.47 (t, 1H, J = 5.7 Hz, C-1), 3.70–3.58 (m, 4H, C-5, CH₂ Acetal), 3.46 (dq, 2H, J = 7.1 Hz, 2.3 Hz, CH₂ Acetal), 1.65-1.50 (m, 4H, C-2, C-4), 1.41 (m, 2H, C-3), 1.18 (t, 6H, J = 7.1 Hz, CH₃ Acetal).
Methansulfonsäure-5,5-diethoxypentylester (4)
Zu einer eisgekühlten Lösung von Verbindung 2 (0,3 g, 1,7 mmol) und Triethylamin (0,21 g, 2,0 mmol) in 3 ml CH₂Cl₂ wurde Methansulfonylchlorid (0,21 g, 1,9 mmol) gegeben. Nach 1 h Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch mit Wasser gewaschen, und nach Trocknen über Na₂SO₄ wurde das Lösungsmittel im Vakuum verdampft, was Verbindung 4 ergab (0,43 g, 1,7 mmol, 100%), die ohne weitere Reinigung für die anschließende Reaktion verwendet wurde.
¹H-NMR(CDCl₃): δ 4.47 (dt, 1H, J = 5.5 Hz, 2.5 Hz, C-1), 4.21 (dt, 2H, J = 6.5 Hz, 2.7 Hz, C-5), 3.63 (m, 2H, CH₂ Acetal), 3.48 (m, 2H, CH₂ Acetal), 3.00 (s, 3H, OSO₂CH₃), 1.77 (m, 2H, C-2), 1.63 (m, 2H, C-4), 1.47 (m, 2H, C-3), 1.20 (t, 6H, J = 7.0 Hz, CH₃ Acetal).
1-(5,5-Diethoxypentyloxymethyl)adamantan (5)
NaH (60% disp., 0,108 g, 2,7 mmol) wurde mit Pentan gewaschen und 1 h lang bei Raumtemperatur mit Adamantanmethanol (0,3 g, 1,8 mmol) in 5 ml DMF gerührt, was eine Suspension des Natriumsalzes ergab. Verbindung 4 (0,4 g, 1,6 mmol) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde 4 h lang bei 70 °C erhitzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit einigen Tropfen MeOH behandelt, in Eis gegossen und mit Diethylether (3 × 15 ml) extrahiert. Nach Trocknen über Na₂SO₄ wurde das organische Lösungsmittel verdampft, und der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie mit Petrolether 60–80/Ethylacetat 7:3 gereinigt, was die gewünschte Verbindung 5 als viskoses Sirup ergab.
5: Ausbeute 34%. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 4.48 (t, 1H, J = 5.7 Hz, C-1 Kette), 3.61 (dq, 2H, J = 7.1 Hz, 2.3 Hz, CH₂ Acetal), 3.49 (dq, 2H, J = 7.1 Hz, 2.2 Hz, CH₂ Acetal), 3.37 (t, 2H, J = 6.5 Hz, C-5 Kette), 2.94 (s, 2H, CH₂ Adamant.), 1.94 (m, 3H, Adamant.), 1.73–1.51 (m, 16H, C-2, C-4 Kette, Adamant.), 1.45–1.35 (m, 2H, C-3 Kette), 1.19 (t, 6H, J = 7.1 Hz, CH₃ Acetal).
1-(5,5-Diethoxypentyloxy)-17-(dimethylhexyl)-10,13-dimetyl-2,3,4,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren (O-5,5-Diethoxypentyl)cholesterin) (6)
NaH (60% disp., 0,12 g, 3 mmol) wurde mit Pentan gewaschen und 45 min lang bei 65–70 °C mit Cholesterin (1,16 g, 3 mmol) in DMF (6 ml) erhitzt, was eine Suspension des Natriumsalzes ergab. 5,5-Diethoxy-O-methansulfonylpentanol (4) (0,508 g, 2 mmol) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde 20 h lang auf 70–75 °C erhitzt. Das DMF wurde verdampft, und der Rückstand wurde mit Ether und Wasser extrahiert. Die Etherextrakte wurden getrocknet (Na₂SO₄), und der Rückstand nach dem Eindampfen wurde durch Flash-Chromatographie (PE 60-80/Ethylacetat 5:1) gereinigt, was das Produkt als viskosen Sirup ergab (0,63 g, 58%).
¹H-NMR(CDCl₃): δ 5.31 (m, 1H, C-6 Chol.), 4.45 (t, J = 5.5 Hz, 1H, C-1 Kette), 3.61 (dq, 2H, J = 7.1 Hz, 2.4 Hz, CH₂ Acetal), 3.45 (m, 4H, CH₂ Acetal, C-5 Kette), 3.10 (m, 1H, C-3 Chol.), 2.34 (m, 1H, Chol.), 2.16 (m, 1H, Chol.), 2.07-1.70 (bm, 4H), 1.70–0.75 (bm, 46H, Chol., CH₃ Acetal), 0.67 (s, 3H, CH₃ Chol.).
5-[17-(Dimethylhexyl)-10 13-dimethyl-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta(a)phenanthren-3-yl-oxylpentanal (5-cholesterylpentanal) (7)
5-(Adamantan-1-yl-methoxy)pentanal (8)
Ein Gemisch des geeigneten Acetals 5, 6 (0,2 mmol) in 3 ml Aceton und 1 ml 5% HCl wurde 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Verdampfen des Acetons, Extraktion des Rückstands mit Ether (3 × 7 ml), Trocknen über Na₂SO₄ und Eindampfen ergab den Aldehyd (quant.), der ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt verwendet wurde.
7: Ausbeute 100%. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 9.77 (s, 1H, CHO), 5.33 (m, 1H, C-6 Chol.), 3.46 (t, 2H, J = 6.1 Hz, C-5 Kette), 3.11 (m, 1H, C-3 Chol.), 2.46 (dt, 2H, J = 7.2 Hz, 1.4 Hz, C-2 Kette) 2.34 (m, 1H, Chol.), 2.16 (m, 1H, Chol.), 2.05–1.75 (bm, 42H, C-3 C-4 Kette, Chol.), 0.67 (s, 3H, CH₃ Chol.).
8: Ausbeute 100%. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 9.76 (t, 1H, J = 1.7 Hz, CHO), 3.38 (t, 2H, J = 6.2 Hz, C-5 Kette), 2.94 (s, 2H, CH₂ Adamant.), 2.46 (dt, 2H, J = 7.2 Hz, 1.7 Hz, C-2 Kette), 1.95 (m, 3H, Adamant.), 1.80–1.45 (m, 16H, C-3, C-4 Kette, Adamant.).
1-{5-[17-(Dimethylhexyl)-10,13-dimethyl-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-yloxy]pentyl}-2-hydroxymethylpiperidin-3 4 5-triol (N-(5-cholesterylpentyl)desoxynojirimycin(9)
Der Aldehyd 7 (0,118 g, 0,25 mmol) wurde in einer kleinen Menge heißem Ethylacetat gelöst, mit Ethanol (etwa 4 ml) verdünnt und zu einer Lösung von DNM gegeben, die durch 1 h Rühren von DNJ·HCl (0,050 g, 0,2 mmol) und Natriumacetat (0,020 g, 0,25 mmol) in Methanol (0,4 ml) bei Raumtemperatur hergestellt wurde. NaCNBH₃ (0,016 g, 0,25 mmol) wurde bei 0 °C hinzugefügt, und die Suspension wurde 18 h lang bei Raumtemperatur und schließlich 1 h lang bei 60 °C kräftig gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Gemisch mit HCl (5%) angesäuert (pH < 1), 1 h lang gerührt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wurde in einem Gemisch von CH₂Cl₂ und Methanol (1/1, 20 ml) suspendiert, und methanolischer Ammoniak (20%, 2 ml) wurde hinzugefügt, gefolgt von Kieselsäure (etwa 5 g). Das Gemisch wurde im Vakuum (vorsichtig) zu einem rieselfähigen Feststoff eingedampft, der auf eine Kieselsäuresäule aufgetragen wurde, die mit dem Eluenten CH₂Cl₂/MeOH/NH₃ in MeOH (20%) = 80/15/5 vorbehandelt worden war. Die Säule wurde mit einem 80/15/5-, 75/20/5- bzw. 70/25/5-Gemisch dieses Eluenten eluiert, was nach dem Eindampfen reine Verbindung 9 ergab (Feststoff, 0,081 g, 0,13 mmol, 65%). Hydrochlorid: Verbindung 9 (0,050 g) wurde in heißem Ethanol (20–30 ml) gelöst und mit 3 Tropfen konz. HCl behandelt.
Abdampfen der Lösungsmittel ergab das Hydrochlorid als kristallinen Feststoff (quant.), Schmp. 235–238 °C (sublimiert ab ca. 190 °C).
¹H-NMR (D₂O): δ 5.36 (m, 1H, C-6 Chol.), 4.10 (d, 1H, J = 12.6 Hz, C-6 DNM), 3.92 (d, 1H, J = 12.6 Hz, C-6 DNM), 3.73 (m, 1H, C-2 DNJ), 3.61 (m, 1H, C-4 DNJ), 3.52 (t, 2H, J = 6.2 Hz, C-5 Kette), 3.47 (dd, JC-1/C-1 = 12.1, JC-1/C-2 = 4.8, C-1 äqu. DNM), 3.39 (m, 2H, C-3 DNM, C-1 Kette), 3.29–3.05 (m, 3H, C-1 Kette, C-3 Chol., C-5 DNM), 3.00 (scheinbares t, 1H, J = 11.6 Hz, C-1 ax. DNM), 2.34 (m, 1H, C-4 äqu. Chol.), 2.15 (m, 1H, C-4 äqu. Chol.), 2.03 (m, 1H, C-2 Chol.), 1.97–0.80 (bm, 43H, C-2 C-4 C-3 Kette, Chol), 0.72 (s, 3H, CH₃ Chol.).
HRMS (FAB) beobachtete Masse 640.4979 (MNa⁺), berechnet für C₃₈H₆₇NO₅Na 640.4917; beobachtete Masse 618.5086 (MH⁺), berechnet für C₃₈H₆₈NO₅ 618.5097.
1-[5-Adamantan-1-ylmethoxy)pentyl]-2-hydroxymethylpiperidin-3,4,5-triol (N-[5-Adamantan-1-yl-methoxy)pentyl]desoxynojirimycin) (10)
Eine Lösung von Desoxynojirimycin-Hydrochlorid (0,030 g, 0,15 mmol) und wenige μl CH₃COOH in MeOH (2 ml) wurden bei 0 °C zu Verbindung 8 (0,056 g, 0,22 mmol) in MeOH (1 ml) gegeben, und dann wurde NaCNBH₃ (0,014 g, 0,22 mmol) hinzugefügt. Nach Rühren bei Raumtemperatur über Nacht wurde die Reaktion konzentriert, mit 5% HCl (2 ml) behandelt, 1. h lang bei Raumtemperatur gerührt, und festes Na₂CO₃ wurde hinzugefügt. Die wässrige Suspension wurde mit CH₂Cl₂ (3 × 7 ml) extrahiert, die Extrakte vereinigt, getrocknet (Na₂SO₄) und im Vakuum eingedampft. Das Produkt wurde durch Silicagel-Flash-Chromatographie (CH₂Cl₂/MeOH/8 N NH₃ in MeOH 70:30:4) gereinigt, was reine Verbindung 10 ergab (0,030 g, 0,08 mmol, 50%). Das resultierende Öl wurde in 5 ml MeOH gelöst, und 1 ml 30% Salzsäure wurde hinzugetropft. Die Lösungsmittel und das überschüssige HCl wurden durch gemeinsames Abdampfen mit Methanol entfernt.
¹H-NMR (D₂O): δ 4.11 (d, 1H, J = 12.5 Hz, C-6 DNM), 3.98 (d, 1H, J = 11.6 Hz, C-6 DNM), 3.82 (m, 1H, C-2 DNM), 3.69 (t, 1H, J = 9.6 Hz, C-4 DNM), 3.62- 3.45 (m, 4H, C-1 äqu., C-3 DNM, C-5 Kette), 3.36 (m, 1H, C-1 Kette), 3.21 (m, 2H, C-5 DNM, C-1 Kette), 3.08 (m, 3H, C-1 ax. DNM, CH₂ Adamant.), 1.95 (m, 3H, Adamant.), 1.90–1.56 (m, 10H, C-2, C-4 Kette, Adamant.), 1.52–1.30 (m, 8H, C-3 Kette, Adamant.). HRMS (FAB) beobachtete Masse 420.2745 (MNa⁺), berechnet für C₂₂H₃₉NO₅Na 420.2726; beobachtete Masse 398.2905 (MH⁺), berechnet für C₂₂H₄₀NO₅ 398.2906. Tabelle 1. Übersicht über vererbte Sphingolipidosen beim Menschen
Tabelle 2. Chitotriosidase-Aktivität in Plasma und Leukocyten
Die Chitotriosidase-Aktivität in Plasmaproben von Kontrollprobanden, asymptomatischen Morbus-Gaucher-Patienten und symptomatischen Morbus-Gaucher-Patienten wurde gemäß der Beschreibung in Lit. 4 bestimmt. Individuen mit Chitotriosidase-Mangel sind in der Tabelle nicht mit enthalten.
Tabelle 3. Scheinbare Ki-Werte verschiedener Glycosidasen
Ki-Werte wurden durch Variation der Substratkonzentration bei fester Inhibitorkonzentration und unter der Annahme einer kompetitiven Hemmung und Michaelis-Menten-Kinetik bestimmt. Alle Konstanten sind in μM ausgedrückt. (–) impliziert, dass bei einer Inhibitorkonzentration von 100 μM keine Hemmung festgestellt wurde. Die Strukturen der getesteten Inhibitoren sind in den Tabellen 6 und 7 abgebildet.
Die Aktivität von Ceredase gegenüber 4MU-β-Glucosid wurde in Anwesenheit von 0,25% (w/v) Natriumtaurocholat und 0.1% (v/v) Triton X-100 in Citrat/Phosphat-Puffer (pH 5.2) bestimmt. Die Aktivitäten von Glucocerebrosidase und Glucosylceramidase in Membransuspensionen gegenüber 4MU-β-Glucosid wurden in Citrat/Phosphat-Puffer (pH 5.2) bestimmt. Condurit-B-epoxid wurde eingesetzt, um zwischen den beiden Enzymen zu unterscheiden. Die Aktivität von lysosomaler α-Glucosidase gegenüber 4MU-α-Glucosid wurde in Citrat/Phosphat-Puffer bei pH 4,0 bestimmt.
Anmerkung:
Die scheinbaren IC₅₀-Werte von P21 und P24 für lösliche Glucocerebrosidase (Ceredase) betrugen 0,2 bzw. 0,8 μM.
Die scheinbaren IC₅₀-Werte von P21 und P24 für Glucocerebrosidase in Membransuspension betrugen 0,06 bzw. 0,7 μM.
Die scheinbaren IC₅₀-Werte von P21 und P24 für Glucosylceramidase betrugen 1 nM bzw. 0,1 μM.
Tabelle 4 In-vivo-Hemmung durch Desoxynojirimycin-Analoga
Melanomzellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von Inhibitoren inkubiert, um ihren IC₅₀-Wert (d.h. die Inhibitorkonzentration, die zu 50% Hemmung führt) zu bestimmen. Aktivitäten von Glucosylceramidase und Glucocerebrosidase wurden gemäß der Beschreibung in Lit. 17 bestimmt. NI = keine signifikante Hemmung bei 1 μM Inhibitor nachweisbar.
Tabelle 5. Wirkung von DNJ-Analoga auf kultivierte Makrophagen
Humane Makrophagen, die gemäß der Beschreibung in Lit. 4 erhalten und kultiviert wurden, wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Butyldesoxynojirimycin (BDNJ) oder N-5-Adamantan-1-yl-methoxypentyl)desoxynojirimycin (P21) inkubiert. Nach 4 Tagen Vorinkubation mit Inhibitor wurden die Aktivitäten von Glucosylceramidase und Glucocerebrosidase mit C6NBD-Glucosylceramid als Substrat bestimmt [17], und gleichzeitig wurde die freigesetzte Chitotriosidase im Medium bestimmt [4]. Die Enzymaktivitäten und die Chitotriosidase-Sekretion in Gegenwart von DNJs werden auf die Werte in Abwesenheit von Inhibitor (100%) bezogen.
Anmerkung:
Die Aktivität der Glucosylceramid-Synthase wird bei 5 μM B-DNJ oder 1 nM P21 nicht signifikant gehemmt. Während die Aktivität der Glucosylceramid-Synthase in Anwesenheit von PDMP oder PPMP stark gehemmt wird, führt letztere nicht zu einer reduzierten Chitotriosidase-Sekretion. Tabelle 6. N-Alkyldesoxynojirimycin-Derivate (Vergleichsbeispiele)
DNJ R = -H
N-Propyl-DNJ R = -(CH₂)₂-CH₃
N-Butyl-DNJ R = -(CH₂)₃-CH₃
N-Pentyl-DNJ R = -(CH₂)₄-CH₃
N-Hexyl-DNJ R = -(CH₂)₅-CH₃
N-Pentanoyl-DNJ R = -CO-(CH₂)₃-CH₃
Tabelle 7. N-Komplex-Desoxynojirimycin-Derivate (siehe nächste Seite)
Namen der großen apolaren Gruppen: 1. Adamantanmethanol; 2. Adamantanol; 3. 9-Hydroxyphenanthren; 4. Cholesterin; 5. β-Cholestanol; 6. Adamantanmethanol; 7. Cholesterin.
In Struktur 1–5 sind die großen apolaren Gruppen durch eine Kette, die zwei Carbonylgruppen trägt, mit DNJ verknüpft. Diese beiden Gruppen sind in Struktur 6 und 7, die Beispiele gemäß der Erfindung darstellen, durch Methylengruppen ersetzt.
Literatur

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Claims

Desoxynojirimycin-Derivat, mit einer großen hydrophoben, über eine Spacergruppe mit dem Stickstoffatom von Desoxynojirimycin verknüpften Gruppe, und dessen Salze, wobei die große hydrophobe Gruppe von einem polycyclischen Alkohol abgeleitet ist, der drei oder mehr Ringe enthält, die je zwei oder mehr Kohlenstoffatome mit einem anderen Ring gemeinsam haben, und in der Lage ist, sich in Lipid-Doppelschichten einzufügen, und dadurch, dass die Spacergruppe eine Polyalkylenkette mit drei bis acht Kohlenstoffatomen ist.
Desoxynojirimycin-Derivat nach Anspruch 1, wobei die Spacergruppe eine Polyalkylenkette mit drei bis sechs Kohlenstoffatomen ist.
Desoxynojirimycin-Derivat nach Anspruch 2, wobei die Spacergruppe eine Polyalkylenkette mit fünf Kohlenstoffatomen ist.
Desoxynojirimycin-Derivat nach Anspruch 1, wobei die Polyalkylenkette aus einer Gruppe besteht, die die Struktur -(CH₂)_n- besitzt, wobei n eine ganze Zahl von drei bis acht ist.
Desoxynojirimycin-Derivat nach Anspruch 4, wobei n eine ganze Zahl von drei bis sechs ist.
Desoxynojirimycin-Derivat nach Anspruch 5, wobei n fünf ist.
Desoxynojirimycin-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die große hydrophobe Gruppe von einer Verbindung abgeleitet ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Adamantanmethanol, Cholesterin, beta-Cholestanol, Adamantanol und 9-Hydroxyphenanthren besteht.
Desoxynojirimycin-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung als Inhibitor der Glucosylceramidase.
Desoxynojirimycin-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung in der Behandlung einer Krankheit, an der ein von Ceramid vermittelter Signalprozess beteiligt ist, insbesondere dank einer Störung der von Ceramid vermittelten Signalisierung in Entzündungskrankheiten.
Desoxynojirimycin-Derivat nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Behandlung einer Krankheit, bei der erhöhte Glucosylceramidspiegel in Membranen, die Glucosylceramidase enthalten, beteiligt sind, wobei die erhöhten Glucosylceramidspiegel durch beeinträchtigten Glucosylceramidase-Abbau in den Lysosomen bedingt sind.
Desoxynojirimycin-Derivat nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Behandlung einer lysosomalen Lipidspeicherstörung.
Desoxynojirimycin-Derivat nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung von Morbus Gaucher.
Pharmazeutische Zusammensetzung, ein Desoxynojirimycin-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassend.
Verwendung eines Desoxynojirimycin-Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Inhibitors der Glucosylceramidase.
Verwendung eines gemäss Anspruch 14 hergestellten Glucosylceramidase-Inhibitors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Morbus Gaucher oder anderer Krankheiten, insbesondere von Entzündungskrankheiten, bei denen ein von Ceramid vermittelter Signalprozess beteiligt ist.
Verwendung eines Desoxynojirimycin-Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung bei der Behandlung von Morbus Gaucher oder anderer Krankheiten, insbesondere von Entzündungskrankheiten, bei denen ein von Ceramid vermittelter Signalprozess beteiligt ist.
Verwendung eines Desoxynojirimycin-Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in der Behandlung einer lysosomalen Lipidspeicherstörung.
Verwendung eines nach Anspruch 14 hergestellten Glucosylceramid-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Individuums, das an Morbus Gaucher leidet.
Verwendung eines Desoxynojirimycin-Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Individuums, das an Morbus Gaucher leidet.