JP2020176063A - ライソゾーム病の治療または予防のための医薬組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、ライソゾーム病の治療または予防のための医薬組成物に関する。【解決手段】本発明の医薬組成物は、６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリンを含む。【選択図】なし

Description

本発明は、ライソゾーム病の治療または予防のための医薬組成物に関する。

ライソゾーム病
ライソゾームは、細胞中で糖質や糖脂質の分解を行っており、この分解には約６０種類の加水分解酵素が関与していると考えられている。加水分解酵素の欠損・異常によって、ライソゾームの分解機能が発揮されなくなり、本来分解されるべき物質が細胞内に異物として蓄積する疾患が、ライソゾーム病である。ライソゾーム病には、欠損している酵素により病名や症状が異なり、現在約３０種類の疾患が知られている。ライソゾーム病の例として、スフィンゴリピドが蓄積するタイプであるスフィンゴリピドーシスが含まれ、スフィンゴリピドーシスの例には、ニーマンピック病、ＧＭ１ガングリオドーシス、ＧＭ２ガングリオドーシス等が含まれる。

ニーマンピック病は、先天的な遺伝子の変異によって引き起こされる酵素の異常によって、本来分解されるはずの不溶性の代謝物が細胞内に蓄積する先天性代謝異常である。変異する遺伝子によって、Ａ型・Ｂ型と、Ｃ型の大きく二つに分類される。ニーマン・ピック病Ａ型・Ｂ型は、ＳＭＰＤ１と呼ばれる遺伝子の変異によって生じる。Ａ型・Ｂ型では酸性スフィンゴミエリナーゼの異常により、おもに、スフィンゴ脂質の一種であるスフィンンゴミエリンがおもに蓄積する。

ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）は、ＮＰＣ１またはＮＰＣ２遺伝子の変異により生じる劣性遺伝子病である。通常、リソソーム内の遊離型コレステロールはＮＰＣ１やＮＰＣ２の働きにより小胞体に運ばれ、エステル型コレステロールに変換される。ＮＰＣ細胞では、ＮＰＣタンパク質の機能不全のため、遊離型コレステロールの蓄積およびエステル型コレステロールの減少（即ち、コレステロールバランスの不均衡）が生じる。その結果、遊離型コレステロールを含有するライソゾームが停滞・沈着した状態となり、生命活動を維持する上で重要なオートファジーなどの細胞機能が著しく低下した状態となる。ＮＰＣ病変は特に中枢神経で顕著に見られ、運動機能の破綻が見られ生命予後も悪い。

ニーマンピック病Ｃ型の治療
近年までＮＰＣに著効を示す治療薬は見出されていなかった。２００９年以来、環状オリゴ糖である２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）が、人道的使用としてＮＰＣ患者に投与され、一定の治療効果を有することが証明され、現在、米国では第ＩＩＩ相臨床試験が進行中である。特開２０１８−１２３１５３（特許文献１）は、ＨＤＬコレステロール値を上昇させることによって疾病を治療かつ／または予防する、メチルシクロデキストリンをベースとする組成物を記載している。当該文献に記載の発明は、対象とする疾患に、ライソゾーム病（「リソソーム病」と呼称する場合もある）を含む。特許文献１には、メチルシクロデキストリンをベースとする組成物は、ヒドロキシプロピル基で置換されているシクロデキストリン、特に、β−シクロデキストリン、即ち、ＨＰＢＣＤを含んでもよい、と記載されている（特許文献１の請求項１０、請求項１２等段落００８４、００８６）。

しかしながら、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）の投与により、ＨＰＢＣＤ投与により肺障害などの重篤な有害事象が見られることが報告されている。さらに、臨床試験において聴覚障害が複数の患者で見られ問題視されている。現時点において、ＨＰＢＣＤがＮＰＣの最も有望な治療薬の候補の１つではあるが、同等の治療効果を有し、さらに、より安全性に優れた治療薬の開発が望まれている。

再表２０１５／０８３７３６は、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）を有効成分として含むことを特徴とする、ライソゾーム病の治療または予防のための医薬組成物を記載している。しかしながら、例えば、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１６、３（５）、ｐ．３６６−３８０において、ＨＰＧＣＤもＨＰＢＣＤと同様に聴覚毒性が生じ得ることが報告されている。また、ＨＰＧＣＤは、高濃度溶液における粘性が高い、ヒドロキシプロピルへの置換度を均一にするために、難度の高い高度な合成技術が必要である、という問題がある。

「科学研究費助成事業 研究成果報告 機関番号３４５１７ 基板研究（Ｃ）（一般） 課題番号２６５０５０１２」は、マルトシル−β−シクロデキストリンのニーマンピックＣ型病治療への展開の研究成果報告を記載している。当該研究成果報告では、ＮＰＣ１が欠損した細胞の、マルトシル−β−シクロデキストリン（Ｇ２ＢＣＤ）処理により、細胞内コレステロールがＧ２ＢＣＤの濃度依存的に減少し、リソソームコレステロールも時間依存的に減少したことが報告されている。しかしながら、Ｇ２ＢＣＤの生体への適用の効果や安全性については報告されておらず不明である。 安全性が高く、実用的なＮＰＣを含むライソゾーム病の治療薬の開発が望まれている。

特開２０１８−１２３１５３ 再表２０１５／０８３７３６ Ａａｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１６、３（５）、ｐ．３６６−３８０ Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９、５３（５）、ｐ．２１８１−２１８８ Ａｂｅら、Ｃｒａｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，１９８８，１７６、ｐ．８７−９５ Ｏｋａｄａら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．１９８８、３６（６）、ｐ．２１７６−２１８５ Ｃｏｍｐｒｅｇｅｎｓｉｖｅ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌｕｍｅ ３ ＣＹＣＬＯＤＥＸＴＲＩＮＳ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９６、ｐ．１２７−１３８ 科学研究費助成事業 研究成果報告 機関番号３４５１７ 基板研究（Ｃ）（一般） 課題番号２６５０５０１２

本発明は、ライソゾーム病の治療または予防のための、新規の医薬組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記問題解決のため、種々のシクロデキストリン誘導体の生体適合性、および、ライソゾーム病（特にＮＰＣ）に対する治療効果を評価した。その結果、６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリン（Ｇ２ＧＣＤ）が、ＮＰＣモデル細胞において、細胞内コレステロール転送障害（遊離型コレステロールの蓄積およびエステル型コレステロールの枯渇）を改善することを明らかにした。また、Ｇ２ＧＣＤをＮＰＣモデルマウスの脳室内に投与した場合、ＨＰＢＣＤと同様に顕著な延命効果を示すことが見出された。本発明者らはさらに、Ｇ２ＧＣＤは、ＨＰＢＣＤ、Ｇ２ＢＣＤと比較して、細胞傷害性が低いこと、そして、聴覚毒性が低いことを見出した。本発明者らは鋭意研究の結果、上記発見に基づき本発明を想到した。

限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリンを含む、ライソゾーム病の治療または予防のための医薬組成物。
［態様２］
ライソゾーム病が、ニーマンピッック病である、態様１に記載の医薬組成物。
［態様３］
ライソゾーム病が、ニーマンピック病Ｃ型である、態様１または態様２に記載の医薬組成物。
［態様４］
リソソーム蓄積および／またはオートファジー経路の障害を抑制する、６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリンを含む医薬組成物。
［態様５］
非経口投与される、態様１−４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［態様６］
注射剤として投与される、態様１−５のいずれか１項に記載の医薬組成物。

６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリン（Ｇ２ＧＣＤ）を含む、本発明の組成物は、ライソゾーム病の治療または予防、特に、ニーマンピック病Ｃ型の治療または予防に効果を奏する。Ｇ２ＧＣＤは、ＨＰＢＣＤ、Ｇ２ＢＣＤ等の従来のシクロデキストリン誘導体と比較して、細胞障害性、聴覚毒性が低く、有用である。

図１は、ＮＰＣモデル細胞の細胞内コレステロール転送異常に対する各種シクロデキストリン誘導体の効果を調べた結果を示す。図１Ａは、細胞の１ｍｇタンパク質当たりの遊離型コレステロール量、図１Ｂは、細胞の１ｍｇタンパク質当たりのエステル型コレステロール量を示す。 図２は、ＮＰＣモデル細胞のリソソーム容積およびオートファゴソーム容積異常に対する各種シクロデキストリン誘導体の効果を調べた結果を示す。縦軸は、野生型細胞（ＣＨＯ細胞）のリソソーム容積（図２Ａ）およびオートファゴソーム容積（図２Ｂ）を１００とした場合の％である。 図３は、野生型細胞およびＮＰＣモデル細胞の細胞生存率に対する各種シクロデキストリン誘導体の影響を調べた結果を示す。縦軸は、各種シクロデキストリン誘導体を添加しない場合の細胞生存率を１００％とした場合の、各種シクロデキストリン誘導体を横軸の濃度で添加した場合の％を示す。図３Ａは野生型細胞の結果、図３ＢはＮＰＣ１モデル細胞の結果である。▲：Ｇ２ＧＣＤ、■：Ｇ２ＢＣＤ、●：ＨＰＢＣＤ 図４は、ＮＰＣモデルマウスにおける、各種シクロデキストリン誘導体の生命予後改善効果を調べた結果を示す。△：Ｇ２ＧＣＤ、■：ＨＰＢＣＤ 図５は、マウス内耳有毛細胞モデル細胞ＨＥＩ―ＯＣ１の細胞生存率に及ぼす各種シクロデキストリン誘導体の添加の影響を調べ、各種シクロデキストリン誘導体の耳毒性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した結果を示す。縦軸は、各種シクロデキストリン誘導体を添加しない場合の細胞生存率を１００％とした場合の、各種シクロデキストリン誘導体を横軸の濃度で添加した場合の％を示す▲：Ｇ２ＧＣＤ、■：Ｇ２ＢＣＤ、●：ＨＰＢＣＤ 図６は、野生型マウスの聴覚閾値に対するＧ２ＧＣＤ及びＨＰＢＣＤ投与の影響を調べた結果を示す。図６の横軸は周波数（ｋＨｚ）、縦軸は各周波数における音圧閾値（ｄｂ）を示す。▲：Ｇ２ＧＣＤ、●：ＨＰＢＣＤ

１．医薬組成物
本発明は、ライソゾーム病の治療または予防のための医薬組成物に関する。

医薬組成物は、６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリン（Ｇ２ＧＣＤ）を含む。

６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリン（Ｇ２ＧＣＤ）は、以下の構造を有する。

Ｇ２ＧＣＤは分岐されたシクロデキストリン類であり、例えば、マルトースおよびγ−シクロデキストリンから、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のプルラナーゼまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓのイソアミラーゼの逆反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって、合成することができる（例えば、Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９、５３（５）、ｐ．２１８１−２１８８；Ａｂｅら、Ｃｒａｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，１９８８，１７６、ｐ．８７−９５等を参照）。Ｇ２ＧＣＤはマルトシル基の置換数を容易に制御することができ、単離も容易である。一方、ＨＰＢＣＤ及びＨＰＧＣＤは、ヒドロキシプロピル基の置換数を制御すること及び単離精製を行うことは困難であり、ヒドロキシプロピル基の置換数が異なる混合物として用いざるを得ない。

Ｇ２ＧＣＤの化学的性質については、例えば、Ｏｋａｄａら、Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．１９８８、３６（６）、ｐ．２１７６−２１８５；Ｃｏｍｐｒｅｇｅｎｓｉｖｅ Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌｕｍｅ ３ ＣＹＣＬＯＤＥＸＴＲＩＮＳ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９６、ｐ．１２７−１３８等に記載されている。Ｇ２ＧＣＤの水溶液は、界面活性および粘性がＨＰＢＣＤと比較して顕著に低い。

「ライソゾーム病」は、ライソゾームに関連した加水分解酵素が欠損しているために、分解されるべき物質が細胞内に蓄積する疾患の総称である。ライソゾーム病には、欠損している酵素により病名や症状が異なり、現在約３０種類の疾患が知られており、特定疾患として難病指定されている。ライソゾーム病の例として、スフィンゴリピドが蓄積するタイプであるスフィンゴリピドーシス、糖原（グリコーゲン）が蓄積するタイプである糖原病ＩＩ型、ムコ多糖が蓄積するタイプであるムコ多糖症、糖蛋白代謝異常症タイプなどが含まれる。その他、正確な分類を調査中のライソゾーム病として、シアリドーシス、ガラクトシアリドーシスなどが含まれる。

スフィンゴリピドーシスの例には、ニーマンピック病、ＧＭ１ガングリオドーシス、ＧＭ２ガングリオドーシス。異染性白質ジストロフィー、ファブリー病、ファーバー病、ゴーシェ病などが含まれる。

糖原病ＩＩ型は、ポンペ病を含む。糖蛋白代謝異常症タイプは、ムコリピドーシスを富含む。

スフィンゴリピドーシスに含まれる、ニーマンピック病は、先天的な遺伝子の変異によって引き起こされる酵素の異常によって、本来分解されるはずの不溶性の代謝物が細胞内に蓄積する先天性代謝異常である。変異する遺伝子によって、Ａ型・Ｂ型と、Ｃ型の大きく二つに分類される。ニーマン・ピック病Ａ型・Ｂ型は、ＳＭＰＤ１と呼ばれる遺伝子の変異によって生じる。Ａ型・Ｂ型では酸性スフィンゴミエリナーゼ酵素の異常により、おもに、スフィンゴ脂質の一種であるスフィンンゴミエリンが蓄積する。Ａ型（急性神経型）は、スフィンゴミエリナーゼ酵素活性が５％以下の重症型である。Ｂ型は、スフィンゴミエリナーゼ酵素活性が５％以上で、神経症状はみられないのが特徴である。

ニーマンピック病Ｃ型（ＮＰＣ）は、ＮＰＣ１またはＮＰＣ２遺伝子の変異により生じる劣性遺伝子病である。ＮＰＣ１の変異が原因のＮＰＣ１型と、ＮＰＣ２の変異が原因のＮＰＣ２型が知られている。通常、リソソーム内の遊離型コレステロールはＮＰＣ１やＮＰＣ２の働きにより小胞体に運ばれ、エステル型コレステロールに変換される。ＮＰＣ細胞では、ＮＰＣタンパク質の機能不全のため、遊離型コレステロールの蓄積およびエステル型コレステロールの減少（即ち、コレステロールバランスの不均衡）が生じる。

非限定的に、一態様において、医薬組成物の対象となるライソゾーム病は、ニーマンピック病である。一態様において、ライソゾーム病は、ニーマンピック病Ｃ型である。

本発明はまた、リソソーム蓄積および／またはオートファジー経路の障害を抑制する、６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリン（Ｇ２ＧＣＤ）を含む医薬組成物、に関する。

「リソソーム蓄積を抑制する」とは、例えば、ＮＰＣモデル細胞に（例えば１ｍＭの濃度で）投与した場合に、投与しない場合と比較して、細胞内における遊離型コレステロールの蓄積が減少する、好ましくは１０％以上減少する、２０％以上減少する、３０％以上減少する、４０％以上減少する、４５％以上減少する、約５０％減少する、ことを意味する。あるいは、「リソソーム蓄積を抑制する」とは、例えば、ＮＰＣモデル細胞に（例えば１ｍＭの濃度で）投与した場合に、投与しない場合と比較して、細胞内におけるエステル型コレステロールが増加する、好ましくは、１．１倍以上増加する、１．３倍以上増加する、１．５倍以上増加する、１．８倍以上増加する、２倍以上増加する、２．２倍上増加する、２．４倍以上増加する、約２．５倍増加することを意味する。あるいはまた、「リソソーム蓄積を抑制する」とは、例えば、ＮＰＣモデル細胞に（例えば１ｍＭの濃度で）投与した場合に、投与しない場合と比較して、リソソーム容積が減少する、好ましくは５％以上減少する、１０％以上減少する、１５％以上減少する、２０％以上減少する、２５％以上減少する、３０％以上減少する、約３３％減少する、ことを意味する。一態様において、医薬組成物は同濃度の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）又はマルトシル−β−シクロデキストリン（Ｇ２ＢＣＤ）を含む医薬組成物の同程度に「リソソーム蓄積を抑制する」機能を奏する。

「オートファジー経路の障害を抑制する」とは、ＮＰＣモデル細胞に（例えば１ｍＭの濃度で）投与した場合に、投与しない場合と比較して、オートファゴソーム容積が減少する、好ましくは５％以上減少する、１０％以上減少する、１５％以上減少する、２０％以上減少する、２５％以上減少する、約３０％減少する、ことを意味する。一態様において、医薬組成物は同濃度の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）又はマルトシル−β−シクロデキストリン（Ｇ２ＢＣＤ）を含む医薬組成物と同程度に「オートファジー経路の障害を抑制する」機能を奏する。

Ｇ２ＧＣＤは、細胞毒性が低く、また、ＮＰＣモデルマウスにおける予後が良いことが示されている。非限定的に、「細胞毒性が低い」とは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＰＢＣＤ、Ｇ２ＢＣＤでは細胞生存率が０％となるような濃度を、野生型細胞又はＮＰＣモデル細胞に投与しても、３０％以上、４０％以上、５０％以上、又は６０％以上の生存率を示すことを意味する。

Ｇ２ＧＣＤは、特に、聴覚毒性が問題となるＨＰＢＣＤ、ＨＰＧＣＤ、Ｇ２ＢＣＤよりも毒性が明らかに低い。非限定的に、「聴覚毒性が低い」とは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＰＢＣＤ、Ｇ２ＢＣＤでは細胞生存率が０％となるような濃度を、野生型の耳のモデル細胞に投与しても、４０％以上、５０％以上、６０％以上又は７０％以上の生存率を示すことを意味する。あるいは、「聴覚毒性が低い」とは、例えば、投与による聴覚閾値に対する影響が、ＨＰＢＣＤ、ＨＰＧＣＤ、Ｇ２ＢＣＤよりも低く、好ましくは広範囲の周波数（低音域〜高音域）において、有意に低い音圧閾値を示すことを意味する。

２．投与態様
本発明の医薬組成物の投与態様は特に限定されない。

６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリン（Ｇ２ＧＣＤ）を、所望により医薬的または薬理学的に許容可能な担体と組み合せて、医薬組成物の形で投与することができる。医薬的または薬理学的に許容可能な担体の種類は１つもそれ以上でもよい。「医薬的に」または「薬理学的に許容可能な担体」は、製剤の他の成分と適合し、被験者に有害ではない、任意の担体、希釈剤または賦形剤を意味する。本明細書の開示に基づき、Ｇ２ＧＣＤを含む医薬組成物を処方することは本技術分野の範囲内である。

例えば、医薬品の分野の標準的技法に従って、医薬組成物を処方することが可能である。例えば、Ａｌｐｈｏｎｓｏ Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，（１９９０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａを参照。

医薬組成物の投与対象は、特に限定されない。非限定的に、一態様において、対象はヒトである。あるいは、対象は非ヒト哺乳類（たとえばウサギ、モルモット、ラット、マウスまたはその他のげっ歯類（げっ歯目に含まれる任意の動物を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ（雌牛、たとえば乳牛またはウシ目に含まれる任意の動物を含む）、ウマ（ウマ目に含まれる任意の動物を含む）、ロバ、および非ヒト霊長類）であってもよい。

投与経路は特に限定されない。静脈内点滴もしくは注射等による静脈内投与、パッチ剤等の経皮投与、腹腔内投与、などの非経口投与を用いてもよい。その他、筋肉内注射等による筋肉内投与、経腸投与、局所投与等による投与も可能である。一態様において、医薬組成物は、注射剤として投与される。

注射剤は、例えば、Ｇ２ＧＣＤを含む医薬組成物を、例えば分散剤、保存剤、等張化剤等と共に水性注射剤として、あるいはオリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油等の植物油、プロピレングリコール等に溶解、懸濁あるいは乳化して油性注射剤として成型することにより製造することができる。

外用剤は、例えば、Ｇ２ＧＣＤを含む医薬組成物を固状、半固状または液状の組成物とすることにより製造される。例えば、上記固状の組成物は、該医薬組成物をそのまま、あるいは賦形剤、増粘剤などを添加、混合して粉状とすることにより製造される。上記液状の組成物は、注射剤の場合とほとんど同様で、油性あるいは水性懸濁剤とすることにより製造される。半固状の組成物は、水性または油性のゲル剤、あるいは軟膏状のものがよい。また、これらの組成物は、いずれも緩衝剤、防腐剤などを含んでいてもよい。外用剤は、例えば、局所投与用のクリーム、ローション、ゲル、軟膏等が含まれる。

Ｇ２ＧＣＤを含む医薬組成物は、所望により、さらに、１またはそれ以上の他の有効成分を含んでもよい。「他の有効成分」は、Ｇ２ＧＣＤと同様に、ライソゾーム病を治療または予防する、あるいは、リソソーム蓄積および／またはオートファジー経路の障害を抑制する、機能を有する成分であってもよい。あるいは、これら以外の機能を有する成分であってもよい。

Ｇ２ＧＣＤを含む医薬組成物は、所望により、さらに、安定化剤、酸化防止剤および保存料が添加されてもよい。適切な酸化防止剤は、例えば、亜硫酸、アスコルビン酸，クエン酸およびその塩、ならびにナトリウムＥＤＴＡを含む。適切な保存料は、例えば、塩化ベンザルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベン、ならびにクロルブタノールを含む。

医薬組成物の投与量および投与期間は、投与対象のサイズ、質量、年齢および性別、治療される疾患の性質および段階、疾患の攻撃性、投与経路、ならびに放射線の特定の毒性を含む個々の患者の特定の状況によって決定される。投与量および投与期間は、また、既知の試験プロトコルを用いて実験的に、または生体内もしくは生体外試験データからの外挿法によって決定されうる。本明細書に記載する濃度範囲は、例示的な目的のみであり、請求される組成物の範囲または実施化を制限するものではない。

例えば、医薬組成物中の投与量は、有効成分であるＧ２ＧＣＤの量で約１から約１００ｍｇ／ｋｇ／日、より好ましくは約５から約８０ｍｇ／ｋｇ／日である。約１５から約５０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約３５ｍｇ／ｋｇ／日（例えば体重６０ｋｇの成人では、２．１ｇ）の用量が特に好適な用量である。医薬組成物は、１日１回で投与されてもよく、または同時にもしくは時間間隔を置いて投与される何回かの低用量に分割されてもよい。投与量は、多数の投与、例えば２０ｍｇ／ｋｇの２回投与で与えられてもよい。より高いまたはより低い用量であってもよい。

本発明の医薬組成物、特にＧ２ＧＣＤを含む医薬組成物は、安全性に優れているので長期間投与可能である。本発明の医薬組成物が対象とするライソゾーム病は遺伝病であり、患者が生存する限り投与が必要となる場合が多い。

本発明の医薬組成物は、安全性に優れているので、そのような使用に特に優れている。本発明の医薬品が投与可能な期間は、特に限定されないが、本発明の医薬品は、例えば、少なくとも数週間以上、好ましくは数ヶ月以上、より好ましくは複数年以上に渡るような、長期間に渡って投与できる。

３．治療または予防方法、医薬組成物の製造のための使用
本発明はまた、６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリン（Ｇ２ＧＣＤ）を、必要とする対象に投与することを含む、ライソゾーム病を治療または予防する方法、に関する。

本発明はさらに、６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリン（Ｇ２ＧＣＤ）の、ライソゾーム病の治療または予防のための医薬組成物の製造のための使用、に関する。

「６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリン（Ｇ２ＧＣＤ）」、「ライソゾーム病」等の定義については上述した通りである。

以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

実施例１ ＮＰＣモデル細胞の細胞内コレステロール転送異常に対する各種シクロデキストリン誘導体の効果
本実施例では、ＮＰＣモデル細胞の細胞内コレステロール転送異常に対する各種シクロデキストリン誘導体の効果を調べた。

シクロデキストリン誘導体の６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリン（Ｇ２ＧＣＤ）および６−Ｏ−マルトシル−β−シクロデキストリン（Ｇ２ＢＣＤ）は、Ｓｈｉｒａｉｓｈｉら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９、５３（５）、ｐ．２１８１−２１８８に記載の方法に基づき、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のプルラナーゼ（天野エンザイム（株）製）を用いて合成した。以下の実施例でも同様である。

ＨＰＢＣＤは、アルカリ条件下にてプロピレンオキサイドとβ−シクロデキストリンを反応させ、β−シクロデキストリンの水酸基に2-ヒドロキシプロピル基を付加して合成した。

再表２０１５／０８３７３６は、ＮＰＣ１変異を有する患者から作製したＮＰＣ−ｉＰＳ細胞株を開示している。ＮＰＣ由来のｉＰＳ細胞はＮＰＣの表現型を示し、ＮＰＣの治療のための薬剤候補をスクリーニングするためのｉｎ ｖｉｔｒｏ系を提供する。ＮＰＣのｉＰＳ細胞由来のＨＬＣｓで極端なコレステロール蓄積が観察されることは、それを用いて、このプロセスにおける様々な薬物治療の効果を調べることを可能とする。ＮＰＣ由来のｉＰＳ細胞をＮＰＣモデル細胞（Ｎｐｃ１欠損ＣＨＯ細胞）として用いた。

ＮＰＣモデル細胞に関し、Ｇ２ＧＣＤ、Ｇ２ＢＣＤおよびＨＰＢＣＤ各１ｍＭを添加し、２４時間後に細胞内の１ｍｇタンパク質当たりの遊離型コレステロールおよびエステル型コレステロールの量ｎｍｏｌを測定した。具体的には、細胞をＧ２ＢＣＤの存在下または非存在下で２４時間処理した後、溶解させた。溶解物中のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．社製）によって測定した。次いで、クロロホルム、２−プロパノールおよびＮＰ−４０混合物（７：１１：０．１）を用いて溶解物からコレステロールを抽出した。試料を遠心分離し（４℃で１０分間１５，０００×ｇ）、クロロホルム層を集めた。クロロホルム層を蒸発させ、残渣を２?プロパノール、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、およびポリオキシラウリルエーテル混合物（８７：１０：３）に溶解した。溶液の一部をエステラーゼと共にインキュベートして総コレステロールを測定し、他の部分をエステラーゼなしでインキュベートして遊離型コレステロールを測定した。総コレステロール量は、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、メンネドルフ、スイス）を用いて、Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｒ Ｌ ＦＣ（協和発酵キリン株式会社、東京、日本）によって測定した。エステル型コレステロールは、総コレステロールレベルから遊離型コレステロールレベルを差し引くことによって計算した。細胞内コレステロール量をｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質で表現した。

結果を図１に示す。ＮＰＣモデル細胞では、野生型細胞（ＣＨＯ細胞）と比較し顕著な遊離型コレステロールの増加およびエステル型コレステロール低下がみられ、細胞内コレステロール障害が生じていることが示された。これに対し、ＨＰＢＣＤ、Ｇ２ＢＣＤおよびＧ２ＧＣＤ（１ｍＭ）は顕著な改善効果を示した。具体的には、ＨＰＢＣＤ、Ｇ２ＢＣＤおよびＧ２ＧＣＤ（１ｍＭ）を投与した場合、いずれも、投与しない場合と比較して、細胞内における遊離型コレステロールの蓄積が約５０％減少した。また、細胞内におけるエステル型コレステロールが、投与しない場合と比較して、約２．４〜２．５倍増加した。

Ｍｅａｎ±ＳＥＭ （Ｎ＝３）
^＊＊ ｐ＜０．０１ Ｎｐｃ１ヌルグループと比較
実施例２ ＮＰＣモデル細胞のリソソームおよびオートファゴソーム容積異常に対する各種シクロデキストリン誘導体の効果
本実施例では、ＮＰＣモデル細胞のリソソームおよびオートファゴソーム容積異常に対する各種シクロデキストリン誘導体の効果を調べた。

ＮＰＣモデル細胞に関し、Ｇ２ＧＣＤ、Ｇ２ＢＣＤおよびＨＰＢＣＤ各１ｍＭ添加し、２４時間後にリソソーム容積およびオートファゴソーム容積を測定した。具体的には、細胞をＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（登録商標） ＤＮＤ−２６で１５分間３７℃で染色し（リソソーム容積測定のため）、もしくはＣｙｔｏ−ＩＤ（登録商標）で２０分間３７℃で染色（オーロファゴソーム容積測定のため）した。４８８ｎｍレーザーを用いてフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランクリンレイクス、米国）で分析した。得られた蛍光を、５３０±３０ｎｍのフィルターを用いてＦＬ１チャンネルで検出された。１０，０００個の細胞からのデータを集めて付属のソフトウェアを用いて分析した。

結果を図２に示す。縦軸は、野生型細胞（ＣＨＯ細胞）のリソソーム容積およびオートファゴソーム容積を１００とした場合の％である。ＮＰＣモデル細胞では、野生型細胞と比較し顕著なリソソームおよびオートフォゴソーム容積の増加が見られ、細胞内のリソソーム蓄積およびオートファジー経路の障害（オートリソソーム形成障害）が示された。これに対し、Ｇ２ＧＣＤ、Ｇ２ＢＣＤおよびＨＰＢＣＤ（１ｍＭ）は顕著な改善効果を示した。具体的には、Ｇ２ＧＣＤ、Ｇ２ＢＣＤおよびＨＰＢＣＤ（１ｍＭ）を投与した場合、いずれも、投与しない場合と比較して、リソソーム容積が約３３％減少した。また、オートファゴソーム容積は、投与していない場合と比較して、約３０％減少した。

Ｍｅａｎ±ＳＥＭ （Ｎ＝３）
^＊＊ ｐ＜０．０１ Ｎｐｃ１ヌルグループと比較
実施例３ 野生型細胞およびＮＰＣモデル細胞の細胞生存率に対する各種シクロデキストリン添加の影響
本実施例では、野生型細胞およびＮＰＣモデル細胞の細胞生存率に対する各種シクロデキストリン添加の影響を調べた。

０ｍＭ−１００ｍＭのＧ２ＧＣＤ、Ｇ２ＢＣＤおよびＨＰＢＣＤを、野生型ＣＨＯ細胞およびＮＰＣモデル細胞に投与し、１２時間後の細胞生存率を、細胞障害性生細胞の指標となるＷＳＴ−８アッセイにより評価した。

テトラゾリウム塩の還元反応は、還元酵素が失活していない時に起こる。そのため、この還元反応は生細胞を測定するためによく用いられる。この反応に使用されるテトラゾリウム塩の一例として、ＷＳＴ（Ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｓａｌｔｓ）、特に、ＷＳＴ−８（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）が知られている。ＷＳＴ−８は細胞内脱水素酵素により還元され、水溶性のホルマザンを生成する。細胞数と生成するホルマザンの量は直線的な比例関係にあるため、ホルマザンの４５０ｎＭ〜４６０ｎＭの吸光度を直接測定することにより、容易に生細胞数を計測することが可能である。本実施例では、同仁化学研究所社のＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８のキットを使用した。

結果を図３に示す。野生型ＣＨＯ細胞およびＮＰＣモデル細胞の双方において、実験した最大１００ｍＭまでのいずれの濃度においても、ＨＰＢＣＤおよびＧ２ＢＣＤと比較して、Ｇ２ＧＣＤの細胞障害性が低いことが示された。

Ｍｅａｎ±ＳＥＭ （Ｎ＝３）
^＊＊ ｐ＜０．０１ Ｎｐｃ１ヌルグループと比較
実施例４ ＮＰＣモデルマウスにおけるＨＰＢＣＤとＧ２ＧＣＤの生命予後改善効果
本実施例では、ＮＰＣモデルマウスにおけるＨＰＢＣＤとＧ２ＧＣＤの生命予後改善効果を調べた。

モデルマウス（ＮＰＣマウス）は、Ｎｐｃ１遺伝子の自然突然変異により、コレステロールのライソゾームからＥＲへの輸送が欠損している。このモデルマウスはまた、肝臓や脳へのコレステロール蓄積を伴うヒト疾患と同様の症状を示す。このモデルマウスは、肝臓損傷と神経機能不全を示し、治療無しには１２週齢で死亡する。

４週齢のＮＰＣマウス（Ｎ＝６）（山陰労災病院 病院長（前鳥取大学医学部脳神経小児科学分野教授） 大野耕策先生、鳥取大学 研究推進機構 研究基盤センター准教授檜垣 克美先生よりご恵与いただいたものを、熊本大学 生命資源研究・支援センターにて繁殖したものを使用）に、ＨＰＢＣＤおよびＧ２ＧＣＤを各々３０および３５ｍｇ／ｋｇ（モル換算でいずれも２１．４μｍｏｌ/ｋｇ）で単回脳室内投与を行い、マウスの生存期間を比較した。

結果を図４に示す。Ｇ２ＧＣＤはＨＰＢＣＤと同程度の予後改善効果を有することが明らかとなった。

実施例５ マウス内耳有毛細胞モデル細胞ＨＥＩ―ＯＣ１の細胞生存率に及ぼす各種シクロデキストリン誘導体の添加の影響
本実施例では、マウス内耳有毛細胞モデル細胞ＨＥＩ―ＯＣ１の細胞生存率に及ぼす各種シクロデキストリン誘導体の添加の影響を調べ、各種シクロデキストリン誘導体の耳毒性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。

マウス内耳有毛細胞モデル細胞ＨＥＩ―ＯＣ１（Ｄａｖｉｄ Ｇｅｆｆｅｎ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， Ｌｏｓ ＡｎｇｅｌｅｓのＦｅｄｅｒｉｃｏ Ｋａｌｉｎｅｃ教授が樹立した細胞を、共同申請者の熊本大学医学部耳鼻咽喉科・頭頸部外科 三輪徹先生を通じて入手）を、３３℃、１０％ＣＯ_２条件下で培養したものを使用した。ＨＥＩ―ＯＣ１細胞にＧ２ＧＣＤ、Ｇ２ＢＣＤおよびＨＰＢＣＤを図５に示した各濃度で添加し、１２時間後の細胞生存率を、細胞障害性生細胞の指標となるＷＳＴ−８アッセイにより評価した。

結果を図５に示す。実験した最大１００ｍＭまでのいずれの濃度においても、ＨＰＢＣＤおよびＧ２ＢＣＤと比較して、Ｇ２ＧＣＤの耳のモデル細胞に対する細胞障害性が低いことが示された。

Ｍｅａｎ±ＳＥＭ （Ｎ＝３）
実施例６ 野生型マウスの聴覚閾値に対するＧ２ＧＣＤ及びＨＰＢＣＤ投与の影響
本実施例では、野生型マウスの聴覚閾値に対するＧ２ＧＣＤ及びＨＰＢＣＤ投与の影響を調べた。Ｇ２ＧＣＤ及びＨＰＢＣＤを８週齢の雄性野生型マウスに５．７ｍｍｏｌ／ｋｇで単回皮下投与を行った。投与７日後に、聴性脳幹反応（Ａｕｄｉｔｏｒｙ Ｂｒａｉｎ−ｓｔｅｍ ｒｅｓｐｏｎｓｅ；ＡＢＲ）を測定した。

結果を図６に示す。Ｇ２ＧＣＤは、ＨＰＢＣＤと比較して、調べたいずれの周波数においても有意に低い音圧閾値を示した。即ち、Ｇ２ＧＣＤはＨＰＢＣＤと比較し、聴覚毒性が低いことが示唆された。

Ｍｅａｎ±ＳＥＭ （Ｎ＝７）
^＊ ｐ＜０．０５１ ＨＰＢＣＤグループと比較
^＊＊ ｐ＜０．０１ ＨＰＢＣＤグループと比較

Ｇ２ＧＣＤを含む、本発明の組成物は、ライソゾーム病の治療または予防、特に、ニーマンピック病Ｃ型の治療または予防に有用である。Ｇ２ＧＣＤの水溶液は、界面活性および粘性がＨＰＢＣＤと比較して顕著に低く、臨床で使用する注射剤を想定する上で優れた化学的性質を有している。Ｇ２ＧＣＤは、マルトシル基が単一置換された化学的に高純度な化合物である。Ｇ２ＧＣＤは、ＨＰＢＣＤおよびＧ２ＢＣＤと比較して、細胞障害性、特に聴覚毒性が低く、有用である。

Claims (6)

1. ６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリンを含む、ライソゾーム病の治療または予防のための医薬組成物。
2. ライソゾーム病が、ニーマンピッック病である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. ライソゾーム病が、ニーマンピック病Ｃ型である、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
4. リソソーム蓄積および／またはオートファジー経路の障害を抑制する、６−Ｏ−マルトシル−γ−シクロデキストリンを含む医薬組成物。
5. 非経口投与される、請求項１−４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 注射剤として投与される、請求項１−５のいずれか１項に記載の医薬組成物。