DE60001745T2

DE60001745T2 - Verwendung von langkettigen n-alkyl derivaten von deoxynojirimycin mit glucocerebrosidase enzyme zur herstellung eines medikaments zur behandlung von mit glykolipiden akkumulation zusammenhängenden krankheiten

Info

Publication number: DE60001745T2
Application number: DE60001745T
Authority: DE
Inventors: S. Gary JACOB; A. Raymond DWEK
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1999-07-26
Filing date: 2000-07-24
Publication date: 2004-03-04
Anticipated expiration: 2020-07-25
Also published as: EP1196190A1; WO2001007078A1; CA2378776A1; US6696059B2; US20020127213A1; US6495570B2; DE60001745D1; EP1196190B1; ATE234626T1; AU6050600A; JP2003505430A; US20010044453A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Kombinations-Medikament-Therapie zur Behandlung der Gaucher-Krankheit und anderer Glykolipid-Speicherkranheiten.
Die Gaucher-Krankheit ist eine glykolytische Speicherkrankheit, die durch eine genetische Defizienz in der Aktivität des katabolischen Enzyms beta-Glucocerebrosidase verursacht wird. Beutler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 5384-5390 (1993). Erscheinungsformen dieser Krankheit sind gestörte Hämtopoese, Knochenbrüche, Ausdünnung des Knochen-Cortex und massive Vergrößerung der Milz und Leber.
In den letzten Jahren wurden mehrere Therapien für die Behandlung der Gaucher-Krankheit vorgeschlagen. Ein früher therapeutischer Ansatz umfasste den Ersatz des fehlerhaften Enzyms. Siehe beispielsweise Dale und Beutler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 4672–4674 (1976); Beutler et al., Blood 78, 1183–1189 (1991); und Beutler, Science 256, 794–799 (1992).
Führende kommerzielle Produkte für den Enzymersatz sind CEREDASE (Glucocerebrosidase), welches von humanen Plazenta-Geweben stammt, und CEREZYME (humane rekombinante Glucocerebrosidase); diesen beiden werden von der Genzyme Corp. hergestellt. Siehe beispielsweise U.S. Patente Nrn. 3 910 822, 5 236 838 und 5 549 892. Siehe auch U.S. Patente Nrn. 5 879 680 und 6 074 684 für clonierte DNA zur Synthese von humaner Glucocerebrosidase.
Es wurden auch Konjugate des Glucocerebrosidase-Enzyms mit Polyethylenglykol (PEG) für die Behandlung der Gaucher-Krankheit von Enzon Inc. weiterentwickelt. Siehe beispielsweise U.S. Patente Nrn. 5 705 153 und 5 620 884.
Noch ein weiterer Ansatz zur Behandlung der Erkrankung ist die Gentherapie, welche ein ex-vivo-Gentransfer-Protokoll umfasst. Siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 5 911 983.
Ein weiterer jüngerer Ansatz umfasst die Verabreichung der vollständig synthetischen Medikamente, N-Butyldesoxynojirimycin und N-Butyldesoxygalactonojirimycin wie jeweils beschrieben von Platt et al., J. Biol. Chem. 269, 8362–8365 (1994); ebd. 269, 27108–27114 (1994). Siehe auch U.S. Patente Nrn. 5 472 969, 5 786 368, 5 798 366 und 5 801 185.
N-Butyldesoxynojirimycin (N-ButyI-DNJ) und verwandte N-Alkyl-Derivate von DNJ sind bekannte Inhibitoren der N-Oligosaccharid-prozessierenden Enzyme α-Glucosidase I und II. Saunier et al., J. Biol. Chem. 257, 14155–14161 (19829; Elbein, Ann. Rev. Biochem. 56, 497–534 (1987). Als Glucose-Analoga besitzen sie ein Potential, Glykosyltransferasen zu inhibieren. Newbrun et al., Arch. Oral Biol. 28, 516–536 (1983); Wang et al., Tetrahedron Lett. 34, 403–406 (1993). Ihre gegenüber den Glykosidasen inhibitorische Aktivität hat zu der Entwicklung dieser Verbindungen als antihyperglykämische Agentien und als antivirale Agentien geführt. Siehe z. B. Internationale Patentanmeldung PCT WO 87/030903 und U.S. Patente Nrn. 4 065 562, 4 182 767, 4 533 668, 4 639 436, 5 011 829, 5 030 638 und 5 264 356.
Insbesondere wurde N-Butyl-DNJ als ein Inhibitor von HIV ("human immunodeficiency virus") humaner Immunodefizienz-Virus, wie beschrieben von Fleet et al., FEBS Lett. 237, 128–132 (1988) und von Karpas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9229–9233 (1988), U.S. Patent 4 849 430; und als ein Inhibitor des Hepatitis-B-Virus (HBV), wie beschrieben von Block et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2235–2239 (1994), Internationale PCT-Anmeldung WO 95/19172 und U.S. Patent Nr. 6 037 351 beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Übereinstimmend mit der vorliegenden Erfindung wird eine Verwendung und eine Zusammensetzung zur Verfügung gestellt für die Behandlung eines Patienten, der an der Gaucher-Krankheit oder an einer anderen derartigen Glykolipid-Speicherkrankheit leidet. Die Verwendung umfasst die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von sowohl einem N-Alkyl-Derivat von 1,5-Didesoxy-1,5-imino-D-sorbitol, welches 2 bis 20 Kohlenstoffatome in der Alkylkette hat, als auch einem Glucocerebrosidase-Enzym an den Patienten. Der N-Alkyl-Substituent kann eine kurzkettige Alkylgruppe, wie beispielsweise Ethyl, Butyl oder Hexyl, oder eine langkettige Alkylgruppe, wie beispielsweise Nonyl, Decyl, Undecyl, Dodecyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Octadecyl und Eicosyl sein.
Mit einer therapeutisch wirksamen Menge ist eine Menge gemeint, die bei der Linderung oder Verhinderung der Gaucher-Krankheit oder einer anderen derartigen Glykolipid-Speicherkrankheit bei dem Patienten wirksam ist. Die Glucocerebrosidase bietet einen Enzymersatz gegen den Nicht-Abbau von Glucocerebrosiden und das N-AlkyI-DNJ bietet zusammenwirkend eine Glykolipid-inhibierende Wirkung. Durch die Anwendung der erfindungsgemäßen Kombinations-Medikamenten-Therapie sollten die medizinischen Vorteile beider Arten von Medikamenten für den Patienten erwachsen, mit reduzierten Mengen von entweder einem oder beiden Medikamenten als sonst notwendig um Äquivalente oder verstärkte therapeutische Ergebnisse zu erzielen. D. h. ein additiver oder synergistischer Effekt kann die Häufigkeit der Verabreichung des Glucocerebrosidase-Enzyms verringern und die Dosis des langkettigen N-Alkyl-DNJ, die sonst für die Einzeltherapie der Krankheit erforderlich ist, senken.
Die Alkylgruppe in den kurzkettigen N-AlkyI-DNJ-Verbindungen enthält bevorzugt vier bis sechs Kohlenstoffatome (z. B. Butyl oder Hexyl). Eine in hohem Maße bevorzugte Verbindung ist N-Butyl-1,5-didesoxy-1,5-imino-D-sorbitol, auch als N-Butyl-Derivat von Desoxynojirimycin (DNJ) bekannt, welches hierin auch als N-ButyI-DNJ abgekürzt wird.
Die Alkylgruppe in den langkettigen N-AlkyI-DNJ-Verbindungen enthält bevorzugt neun bis zehn Kohlenstoffatome (d. h. Nonyl und Decyl). Eine in hohem Maße bevorzugte Verbindung ist N-Nonyl-1,5-didesoxy-1,5-imino-D-sorbitol, auch bekannt als das N-Nonyl-Derivat von Desoxynojirimycin (DNJ), welches hierin auch N-Nonyl-DNJ abgekürzt wird.
Im Gebiet der allgemeinen organischen Chemie sind die langkettigen Alkylgruppen dafür bekannt, dass sie Verbindungen hydrophobere Eigenschaften verleihen als die kurzkettigen Alkylgruppen. D. h. die Löslichkeit in Wasser nimmt mit einem Anstieg in der Kettenlänge und Abnahme der Temperatur ab. Zum Beispiel löst bei 46°C Capronsäure (eine kurzkettige Hexylgruppe) 10 Gew.-% Wasser, während Stearinsäure (eine langkettige Octadecylgruppe) sogar bei der höheren Temperatur von 69°C nur 0,92% löst. Bailey's Industrial Oil and Fat Products, Hrsg. Daniel Swern, 3. Aufl. 1964, S. 126.
Die langkettigen N-Alkyl-Derivate von DNJ sind bekannte Aminozucker-Verbindungen. Sie wurden ursprünglich als Mitglieder einer Gruppe kurzkettiger und langkettiger N-Alkyl-Derivate von DNJ beschrieben, die sowohl Glucosidase-I-Inhibitor-Aktivität als auch antivirale Aktivität besitzen, obwohl bezüglich der langkettigen N-Alkyl-Derivate keine Daten offenbart wurden. Siehe z. B. DE 3 737 523 , EP 315 017 und U.S. Patente Nrn. 4 260 622, 4 639 436 und 5 051407.
Obwohl die N-Alkylierung des Basis-DNJ die Konzentration erniedrigte, die für eine 50%ige Inhibierung von Glucosidase I erforderlich waren, wurde die inhibitorische Aktivität nach einer anderen frühen Studie reduziert, wenn die Länge der N-Alkyl-Kette von N-Methyl auf N-Decyl erhöht wurde, siehe Schweden et al., Arch. Biochem. Biochem. 248, 335–340, S. 338 (1986).
Soweit es die antivirale Aktivität der Aminozucker-Verbindungen gegen einen bestimmten Virus betrifft, kann die Aktivität eines spezifischen Analogons nicht im voraus vorhergesagt werden. Es wurde z. B. in biologischem Test auf inhibitorische Aktivität gegen HIV ("human immunodeficiency virus") gezeigt, dass leichte Veränderungen in der Struktur des N-Substituenten deutliche Auswirkungen auf das antivirale Profil haben, wie berichtet von Fleet et al., FEBS Lett. 237, 128–132 (1988). Wie in dem U.S. Patent Nr. 4 849 430 offenbart, fand man unerwarteterweise heraus, dass das N-Butyl-Derivat von DNJ als Inhibitor von HIV um zwei Größenordnungen effektiver war, als das N-Methyl-Analogon, und um drei Größenordnungen effektiver als das N-Ethyl-Analogon war.
In einer weiteren Untersuchung von N-Alkyl-Derivaten von DNJ in Bezug auf die Aktivität gegen Glykolipid-Biosynthese erforderte das N-Hexyl-Derivat von DNJ eine Dosis von 0,2 mg/ml, während das entsprechende N-Butyl-Analogon eine Dosis von nur 0,01 bis 0,1 erforderte. Andererseits war das N-Methyl-Analogon inaktiv. Es wurde daher vermutet, dass die effektive Kohlenstoffkettenlänge der N-Alkyl-Gruppe für diese Aktivität von 2 bis 8 reichte, entsprechend dem U.S. Patent Nr. 5 472 969. In Bezug auf die N-Nonyl- und andere langkettige N-Alkyl-Derivate von DNJ wurde nichts offenbart.
Von N-Nonyl-DNJ wurde berichtet, dass es ein Inhibitor des Hepatitis-B-Virus (HBV) ist, und zwar basierend auf der Inhibierung von α-Glucosidasen im cellulären endoplasmatischen Retikulum (ER) nach Block et al., Nature Medicine 4(5), 610–614 (1998).
Die Wirksamkeit der langkettigen N-Alkyl-Derivate von DNJ im erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung der Gaucher-Krankheit und anderer solcher Glykolipid-Speicherkrankheiten wird hierin zur Veranschaulichung durch die inhibitorische Aktivität von N-Nonyl- und N-Decyl-DNJs gegenüber der Glykolipid-Biosynthese in CHO-(Chinese hamster ovary = chinesische Hamster-Eierstock)-Zellen und humanen myeloiden (HL-60)-Zellen gezeigt.
CHO-Zellen sind wohlbekannte Glykoprotein-sekretierende Säugerzellen. Eine typische CHO-Zelllinie ist CHO-K1, welche für die Öffentlichkeit von der American Type Culture Collecltion, Bethesda, MD unter der Hinterlegungsnummer ATCC CCL 61 erhältlich ist.
HL-60-Zellen sind humane promyelocytische Zellen, die von Collins et al., Nature 270, 347–349 (1977) beschrieben wurden. Sie sind ebenfalls einfach von der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC CCL 240 erhältlich.
Eine wirksame Aktivität von N-Nonyl-DNJ ist außerdem hierin veranschaulichend in konventionellen Rindernierenzellen (z. B. MDBK, ATCC CCL 22) und Hepatom-Zellen (z. B. HepG2, ATCC HB 8065) gezeigt.
Die Unberechenbarkeit von N-Nonyl-DNJ gegenüber der Glykolipid-Biosynthese ist hierin durch dessen inhibitorische Aktivität in den vorstehenden zwei Zelllinien gezeigt. Man fand unerwarteterweise heraus, dass das N-Nonyl-DNJ in den CHO-Zellen ungefähr zehn- bis ungefähr zwanzigmal, und in den HL-60-Zellen ungefähr 400-mal besser war als N-ButyI-DNJ bei äquivalenten Konzentrationen. Es wurde gezeigt, dass das N-Decyl-DNJ bei 50-mal niedrigeren Konzentrationen als N-ButyI-DNJ ein effektiver Inhibitor in HL-60-Zellen war. Diese Ergebnisse waren darüber hinaus unerwartet im Hinblick auf die erhöhter hydrophobe Natur der langkettigen N-Alkyl-Derivate von DNJ.
Das N-Nonyl-DNJ zeigt auch einen dramatischeren Unterschied bei der Aufnahme als N-ButyI-DNJ, was dessen Verwendung bei einem erheblich geringeren Level erlaubt. In Tests bezüglich der Organ-Verteilung wurde das N-Nonyl-DNJ fünfmal besser ins Gehirn aufgenommen als N-ButyI-DNJ. Daher wird vermutet, dass das N-Nonyl-DNJ eine wesentlich bessere Verbindung als N-ButyI-DNJ zur Behandlung von Glykolipid-Speicherkrankheiten, welche die nicht-systemische Seite umfassen, ist.
N-Nonyl-DNJ und N-Decyl-DNJ können in geeigneter Weise durch N-Nonylierung bzw. N-Decylierung von 1,5-Didesoxy-1,5-imino-D-sorbitol (DNJ) mittels Verfahren, analog zur N-Butylierung von DNJ, wie beschrieben in Beispiel 2 des U.S. Patentes Nr. 4 639 436, hergestellt werden, indem eine äquivalente Menge n-Nonylaldehyd oder n-Decylaldehyd für n-Butylaldehyd eingesetzt wird. Die Ausgangsmaterialien sind aus vielen kommerziellen Quellen einfach erhältlich. Zum Beispiel erhält man DNJ von Sigma, St. Louis, MO, während n-Nonylaldehyd, auch bekannt als 1-Nonanal oder Pelargonaldehyd und n-Decylaldehyd, auch bekannt als Decanal, kommerziell von Aldrich, Milwaukee, WI erhältlich sind. Es wird jedoch anerkannt werden, dass das in dieser Kombinations-Medikamenten-Therapie verwendete N-Alkyl-DNJ nicht auf irgendein bestimmtes Verfahren der Synthese des N-ButyI-DNJ, N-Nonyl-DNJ, N-Decyl-DNJ oder anderer N-Alkyl-Derivate von DNJ beschränkt ist.
Die in der Kombinations-Medikamenten-Therapie verwendete Glucocerebrosidase ist ebenfalls ein bekanntes Medikament, wie oben beschrieben. Zum Beispiel kann sie von huma nem plazentalem Gewebe durch konventionelle Isolations- und Aufreinigungstechniken abgeleitet sein oder durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt werden. Konventionelle Verfahren der Isolation und Aufreinigung aus humanem plazentalem Gewebe sind von Dale und Beutler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 4672–4674 (1976) und in dem U.S. Patent Nr. 3 910 822 beschrieben. Geeignete Verfahren der Herstellung mittels rekombinanter DNA sind in den U.S. Patenten Nrn. 5 236 838, 5 549 892 und 5 879 680 beschrieben. Die Glucocerebrosidase kann auch mit Trägermolekülen, wie beispielsweise Polyethylenglykol (PEG) konjugiert sein, wie beschrieben in den U.S. Patenten Nrn. 5 705 153 und 5 620 884. Es wird jedoch anerkannt werden, dass die in der Kombinations-Medikamenten-Therapie verwendete Glucocerebrosidase nicht auf irgendein bestimmtes Verfahren der Herstellung beschränkt ist.
N-Butyl-DNJ, N-Nonyl-DNJ, N-Decyl-DNJ und andere N-Alkyl-Derivate von DNJ können zur Behandlung von Patienten, die unter der Gaucher-Krankheit und anderen Glykolipid-Speicherkrankheiten leiden, mittels konventioneller Verfahren der Verabreichung von therapeutischen Medikamenten verwendet werden. Daher wird die aktive Verwendung bevorzugt zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln und Trägerstoffen formuliert. Das aktive Medikament kann in der freien Amin-Form oder der Salzform verwendet werden. Pharmazeutisch annehmbare Salzformen werden z. B. durch das HCl-Salz dargestellt. Die Menge des zu verabreichenden aktiven Medikamentes muss eine effektive Menge sein, d. h. eine Menge, welche medizinisch vorteilhaft gegen die Gaucher-Krankheit oder andere Glykolipid-Speicherkrankheiten ist, aber keine nachteiligen begleitenden toxischen Wirkungen hat, welche die Vorzüge aufwiegen. Es ist zu erwarten, dass die tägliche Dosis für einen erwachsenen Menschen normalerweise im Bereich von 0,1 bis 1000 mg der aktiven Verbindung liegt. Der bevorzugte Weg der Verabreichung ist der orale, in Form von Kapseln, Tabletten, Sirupen, Elixieren, Gelen und ähnlichen, obwohl auch parenterale Verabreichung angewandt werden kann.
Das Glucocerebrosidase-Enzym kann gleichermaßen mittels konventioneller Methoden verabreicht werden, bevorzugt durch intravenöse Infusion, z. B. Verabreichung des aktiven Enzyms in einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff, wie physiologischer Kochsalzlösung. Am Anfang wurde eine Dosis von ungefähr 60 Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht alle zwei Wochen empfohlen. Siehe z. B. Beutler, Science 256, 794–799 (1992). Nach 6 bis 12 Monaten der Therapie wurden nach Moscicki et al., New Engl. J. Med. 328, 1564 (1993) Dosen von 7,5 bis 15 Einheiten pro Kilogramm alle zwei Wochen vorgeschlagen.
Zur Erläuterung, die zwei Kombinations-Medikament-Komponenten können zusammen oder getrennt verabreicht werden, z. B. Verabreichung des Enzyms durch periodische Verabreichung (z. B. wöchentlich oder zweimal monatlich) bzw. zweimonatlich ("bimonthly") und orale Verabreichung des N-Alkyl-DNJ täglich.
Durch Verwendung der hierin beschriebenen Kombinations-Medikamenten-Therapie kann ein additiver oder synergistischer Effekt erlangt werden um die oben genannte Häufigkeit der intravenösen Injektion der Glucocerebrosidase herabzusetzen und die Dosis des N-Alkyl-DNJ, die sonst für Monotherapie der Gaucher-Krankheit erforderlich ist, zu verringern.
Geeignete Formulierungen der aktiven Komponenten in pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln und Trägerstoffen in therapeutischer Dosierungsform können vom Fachmann durch Konsultation allgemeiner Texte und Abhandlungen des pharmazeutischen Gebietes, wie z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, Hrsg. Arthur Osol, 16. Aufl., 1980, Mack Publishing Co., Easton, PA, und 18. Aufl., 1990, hergestellt werden.
Andere Glykolipid-Speicherkrankheiten, auf welche die erfindungsgemäße Verwendung gerichtet ist, sind z. B. Tay-Sachs-Erkrankung, Sandhoff-Jatzekewitz-Syndrom, Fabry-Syndrom, GM1-Gangliosidose und Fucosidose.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Während die Patentbeschreibung mit Ansprüchen schließt, die den Gegenstand, der als die Erfindung angesehen wird, im Einzelnen aufzeigen und genau beanspruchen, wird davon ausgegangen, dass die Erfindung anhand der folgenden bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung zusammengenommen mit den begleitenden Figuren besser verstanden wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt eine Dünnschicht-Chromatographie von behandelten (a) CHO- und (b) NL-60-Zellen. Die Zellen wurden für vier Tage in Anwesenheit von radioaktiv markierter Palmitinsäure und der folgenden Konzentrationen von Verbindungen:

a) Kontrolle, ohne Verbindung
b) 50 μM NB-DNJ
c) 5 μM NB-DNJ
d) 2,5 μM NB-DNJ
e) 0,25 μM NB-DNJ
f) 0,025 μM NB-DNJ
g) 50 μM NN-DNJ
h) 5 μM NN-DNJ
i) 2,5 μM NN-DNJ
j) 0,25 μM NN-DNJ
k) 0,025 μM NN-DNJ

Nach Extraktion wurden die radioaktiv markierten Glykolipide durch TLC abgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht. NB-DNJ ist N-ButyI-DNJ. NN-DNJ ist N-Nonyl-DNJ.
2 zeigt doppelt reziproke Darstellungen der Inhibierung der Ceramid-Glucosyltransferase durch N-ButyI-DNJ (NB-DNJ). Die Ceramid-Glucosyltransferase-Aktivität von HL-60-Zellen wurde unter Verwendung von (a) Ceramid-Konzentrationen von 5 bis 20 μM und (b) UDP-Glucose-Konzentrationen von 0,59 bis 5,9 μM gemessen. NB-DNJ- Konzentrationen von 5 bis 100 μM wurden verwendet. Die Inhibitionskonstanten (K_i) wurden errechnet, indem die Lineweaver-Burk-Steigungen gegen die Inhibitor-Konzentration aufgetragen wurde, wie in den Einschüben gezeigt ist.
3 zeigt die Inhibierung der Ceramid-Glucosyltransferase-Aktivität von HL-60-Zellen durch N-Butyl-DNJ (offene Kreise) und N-Nonyl-DNJ (ausgefüllte Kreise). Die Aktivität wurde als prozentualer Anteil der Kontrolle ohne Inhibitor ausgedrückt und die IC₅₀-Werte wurden aus den gezeigten Raten-Kurven errechnet. N-ButyI-DNJ = 27,1 μM, N-Nonyl-DNJ = 2,8 μM.
4 zeigt die strukturelle Verwandtschaft zwischen NB-DNJ und dem Ceramid-Glucosyltransferase-Substrat.

(a) Ceramid-Struktur nach der Kristallstruktur von Glucosylceramid. Das Akzeptor-Wasserstoffatom liegt am C1¹.
(b) Die Struktur NB-DNJ (N-Alkyl) basiert auf NMR-Studien und molekularer Modellierung.
(c) Eine mögliche Überlagerung von Ceramid und NB-DNJ.

5 ist eine Balkengraphik mit geschätzter Radioaktivität. Radioaktiv markiertes N-Butyl-DNJ und N-Nonyl-DNJ wurden für die angegebenen Zeiten (Stunden) zu kultivierten CHO-, MDBK- und HepG2-Zellen gegeben. Die Zellen wurden gründlich gewaschen und säurepräzipitiert. Nach Lösung in NaOH wurde die Zell-assoziierte Radioaktivität als prozentualer Anteil der hinzugefügten radioaktiv markierten Verbindung bestimmt.
6 ist eine Balkengraphik, die die Organverteilung von radioaktiv markiertem N-Butyl-DNJ (NB-DNJ) und N-Nonyl-DNJ (NN-DNJ) zeigt. Maus-Körperflüssigkeiten und – Organe wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten (30, 60, 90 Minuten) nach der Magensondengabe einer radioaktiv markierten Verbindung entnommen. Die Radioaktivität in jeder Probe wurde bestimmt und als prozentualer Anteil der wiedergewonnenen Radioaktivität ausgedrückt. Ausgefüllte Balken, NN-DNJ, schraffierte Balken, NB-DNJ.
Um die Erfindung in größerem Detail darzustellen, werden die folgenden spezifischen Labor-Beispiele ausgeführt. Obwohl daher spezifische Beispiele hierin dargestellt sind, wird dies so eingeschätzt, dass die Erfindung nicht auf diese spezifischen, veranschaulichenden Beispiele oder die Details darin beschränkt ist.
BEISPIEL I
Es wurde ein Vergleich zwischen N-Butyl-DNJ und N-Nonyl-DNJ bezüglich der Glykolipid-Biosynthese-Inhibierung vorgenommen, der zeigte, dass die Wirksamkeit Zellen- und Kettenlängen-abhängig ist. CHO("Chinese Hamster Ovary")- und humane myeloide (HL-60)-Zellen, die in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Inhibitor zusammen mit einem Vorläufer (radioaktiv markierter Palmitinsäure) der Glykolipid-Biosynthese gezogen wurden, wurden mit Lösungsmitteln behandelt um die Glykolipide mittels des Verfahrens, das von Platt et al., J. Biol. Chem. 269, 8362–8365 (1994) beschrieben wurde, zu extrahieren.
Die radioaktiv markierten Lipide wurden durch TLC abgetrennt (1) und Banden, die Glucosylceramid und Lactosylceramid entsprachen, wurden durch Scanning-Densitometrie quantifiziert um den Rückgang der Glykolipid-Biosynthese abzuschätzen. Diese Daten wurden graphisch aufgetragen um Inhibitionskonstanten (IC₅₀) für beide Zelllinien und Verbindungen zu erhalten (Tabelle 1).
Diese Daten zeigen, dass Zelllinien unterschiedliche Sensitivitäten gegenüber sowohl N-Butyl- als auch N-Nonyl-DNJ aufweisen. HL-60-Zellen sind mehr als 10mal sensitiver gegenüber N-Butyl-DNJ und 100mal sensitiver gegenüber N-Nonyl-DNJ als CHO-Zellen. Diese Zellspezifität ist unerwartet. Zusätzlich ist N-Nonyl zwischen 10- und 365mal effektiver als N-Butyl-DNJ.
Es wurden detaillierte Arbeiten durchgeführt um die Inhibitionskinetik der Ceramid-Glucosyltransferase, des Enzyms, das durch alkylierte Desoxynojirimycin-Verbindungen inhibiert wird, zu untersuchen. Diese haben gezeigt, dass diese Verbindungen kompetitive Inhibitoren für Ceramid und nicht-kompetitive Inhibitoren für UDP-Glucose sind (2). N-Nonyl-DNJ besitzt eine 10-fach erhöhte Wirksamkeit gegenüber N-Nonyl-DNJ bei der Inhibierung von Ceramid-Glucosyltransferasen in in-vitro-Assays (IC₅₀-Werte von 2,8 μM bzw. 27,1 μM, siehe 3).
Als Wirkmechanismus alkylierter Desoxynojirimycin-Verbindungen wird der des Ceramid-Mimikrie vorgeschlagen und ein Modell, das diese Mimikry auf der molekularen Ebene demonstriert, ist in 4 gezeigt. Ein Energie-minimiertes Molekülmodell von NB-DNJ und Ceramid sagt eine strukturelle Homologie von drei chiralen Zentren und der N-Alkylkette von NB-DNJ mit der trans-Alkenyl- und n-Acylkette von Ceramid voraus. Diese erhöhte Wirksamkeit in vitro erklärt die dramatischen Unterschiede in der Inhibierung der Glykolipid-Biosynthese in cellulären Systemen nicht.
Die Aktivität wird durch die unterschiedliche Aufnahme in die Zellen erklärt. In drei Zelllinien, CHO, MDBK und HepG2, wurden radioaktiv markiertes N-Nonyl-DNJ und N-Butyl-DNJ für 24 Stunden inkubiert und die Menge an Zell-assoziierter Radioaktivität bestimmt. In allen Fällen war N-Nonyl-DNJ 3,5- bis 5,0fach erhöht. Es ist ganz klar die Kombination der inhibitorischen Wirkung und der erhöhten Aufnahme, die für die verstärkte Inhibierung durch N-Nonyl-DNJ wichtig ist.
Weitere Beweise, dass längere Alkylketten viel besser aufgenommen werden als die kürzeren Alkylketten, erhielt man durch in-vivo-Untersuchungen mit Mäusen. Nach Magensondengabe radioaktiv markierten N-Nonyl-DNJ und N-Butyl-DNJ für 30, 60 und 90 Minuten wurden für die Bestimmung der Radioaktivität (5) die Körperflüssigkeiten gesammelt und die Organe entnommen. Die gemessene Radioaktivitätsmenge in der Leber und dem Gehirn war für N-Nonyl-DNJ nach 90 Minuten 10mal höher als für N-Butyl-DNJ (siehe Tabelle 2).
Es wurde der Nachweis erbracht, dass DNJ-Verbindungen mit längeren Ketten (länger als C9) effektivere Ceramid-Glucosyltransferase-Inhibitoren sind. Dies folgt aus den Untersu chungen zum vorgeschlagenen Wirkungsmechanismus, die zeigen, dass erhöhte Wirksamkeit mit der Ceramid-Mimikrie korreliert (4). Genauer gesagt zeigt N-Decyl-DNJ (C10) im oben beschriebenen Assay auf der Basis von HL-60-Zellen eine Inhibierung bei 50mal niedrigeren Konzentrationen als N-Butyl-DNJ. Im Lichte der oben gezeigten Daten sind die langkettigen N-Alkyl-Derivate von DNJ effektiver bei der Behandlung von Glykolipid-Speicherkrankheiten. Tabelle 1
Tabelle 1. Inhibition von Glykolipiden durch N-Butyl- und N-Nonyl-DNJ.
Radioaktiv markierte Glucosylceramid- und Lactosylceramid-Banden aus 1 wurden durch Scanning-Densitometrie quantifiziert und der prozentuale Anteil gegenüber der Kontrolle (keine Behandlung, Spur a, 1) im Vergleich mit der Dosis der Verbindungen dargestellt. Aus der linearen Kurve erhielt man den IC₅₀-Wert. Es ist ein Wertebereich angegeben um die Variabilität der radioaktiv markierten Produkte darzustellen.
Tabelle 2
Tabelle 2. Zurückgewinnung radioaktiv markierter Verbindungen nach Verabreichung an eine normale Maus. Maus-Körperflüssigkeiten und -organe wurden an unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Magensondengabe der radioaktiv markierten Verbindung entnommen. In jeder Probe wurde die Radioaktivität bestimmt und als prozentualer Anteil der zurückgewonnenen Radioaktivität ausgedrückt (Daten von 5).
BEISPIEL II
Wenn das N-Butyl-DNJ, N-Nonyl-DNJ, N-Decyl-DNJ oder ein anderes N-Alkyl-DNJ, wie hierin definiert, in Kombination mit dem Glucocerebrosidase-Enzym zur Behandlung der Gaucher-Krankheit oder einer anderen solchen Glykolipid-Speicherkrankheit verwendet wird, fallen dem Patienten die medizinischen Vorteile beider Arten von Medikamenten zu, und zwar bei verminderten Mengen von entweder einem von beiden oder beiden Medikamenten als es normalerweise bei Monotherapie notwendig ist um Äquivalente oder verbesserte therapeutische Ergebnisse zu erzielen. Diese therapeutischen Vorteile werden mit einer Dosierung von ungefähr 0,1 bis 1000 mg N-Alkyl-DNJ und einer Dosierung von ungefähr 7,5 bis 60 E pro kg Körpergewicht von dem Glucocerebrosidase-Enzym erzielt.
Eine Sorge bezüglich der Kombinationstherapie ist die, dass β-Glucocerebrosidase auch durch NB-DNJ inhibiert wird. Der IC₅₀-Wert ist mit 520 μM in einem in-vitro-Assay 25mal höher als der, der erforderlich ist um die Ceramid-Glucosyltransferase-Aktivität zu inhibieren (IC₅₀, 20,4 μM) (Platt et al., J. Biol. Chem. 269, 27108–27114, 1994). Daher wird das kinetische Gleichgewicht des Glucocerebrosid-Stoffwechsels in Anwesenheit von 5 bis 50 μM NB-DNJ-vermindertes Substrat begünstigen und keine Speicherung durch Inhibition der Glucocerebrosidase verursachen (Platt et al., ebd. 1994). In der Praxis ist es extrem schwierig, Gleichgewichts-Serumkonzentrationen von höher als 50 μM NB-DNJ in oral medikamentierten Tieren aufrechtzuerhalten (Platt, et al., J. Biol. Chem. 272, 19365–19372, 1997). In der klinischen Studie von ND-DNJ wurde eine Gleichgewichts-Plasmakonzentration nach 4 bis 6 Wochen der Behandlung erreicht. Eine Kur mit oraler Dosierung von 100 mg dreimal täglich zeigte eine Peak-Plasma-Konzentration von 6,8 μM (1,6 μg/ml) (Cox et al., Lancet 355, 1481–1485, 2000).
In vivo könnte jedoch die gleichzeitige Verabreichung von NB-DNJ und Glucocerebrosidase zu der Inhibierung der Enzymaktivität führen und so die mögliche Kombinationstherapie gefährden. Es war daher wichtig, die Kinetiken von infundiertem Enzym in Mäusen, die mit NB-DNJ behandelt wurden, zu bestimmen. Nach fünf Wochen oraler Verabreichung von NB-DNJ (4800 mg/kg/Tag), was ausreichte um eine stabile Serumkonzentration von 50 μM aufrechtzuhalten (Platt et al., ebd., 1997), wurde Mäusen über die Schwanzvene 5 bis 10 E/kg Ceredase^® injiziert. Die Glucocerebrosidase-Aktivität wurde nach der Injektion unter Verwendung von 4-Methylumbelliferyl-β-glucosid als Substrat gemessen und die Peak-Serumaktivität und die Halbwertszeit des Enzyms wurden errechnet (Tabelle 3). Tabelle 3
Tabelle 3. Serum-β-Glucocerebrosidase-Aktivität in unbehandelten Mäusen oder mit 4800 mg/kg/Tag NB-DNJ-behandelten Mäusen. Der Studenten-t-Test wurde verwendet um die P-Werte für Aktivität und Halbwertszeit des Enzyms in den zwei Gruppen zu bestimmen; diese waren 0,076 bzw. 0,064.
Diese Daten zeigen auch, dass die Aktivität der infundierten -β-Glucocerebrosidase-Aktivität in Anwesenheit von NB-DNJ nicht inhibiert wurde. Es wurde eine apparente Erhö hung beobachtet, aber aufgrund der Variabilität in der Untersuchung zeigte diese keine statistische Signifikanz. Eine mögliche Erklärung für den apparenten Aktivitätsanstieg ist die, dass das Aussetzen an niedrige Konzentrationen von Iminozucker die Hydrolyse stimulierte, indem das aktive Zentrum stabilisiert wurde. Es ist von anderen lysosomalen Enzymen bekannt, dass sie durch Iminozucker-Inhibitoren stabilisiert werden (Fan et al., Nature Med. 5, 112–115, 1999). Es wurde herausgefunden, dass die Halbwertszeit des Enzyms im Blutkreislauf zuvor publizierten Werten ähnelte (Friedman et al., Blood 93, 2807–2816, 1999).
In Anwesenheit von NB-DNJ war jedoch die Halbwertszeit verlängert, was darauf hindeutet, dass der Inhibitor des Enzym vor Inaktivierung schützt oder die Beseitigung durch Rezeptor-vermittelte Aufnahme reduziert (Friedman, et al., ebd. 1999).
Die vorstehenden Daten weisen daher darauf hin, dass das pharmakologische Profil von β-Glucocerebrosidase in Anwesenheit von niedrigen Konzentrationen von NB-DNJ nicht gefährdet würde, sondern eine Verbesserung aufweisen kann.

Claims

Verwendung einer Kombination aus einem N-Alkylderivat von Desoxynojirimycin, das zwei bis zwanzig Kohlenstoffatome in der Alkylkette hat, und einem Glucocerebrosidase-Enzym zur Herstellung eines Arzneimittels zur Linderung oder Inhibierung einer Glykolipid-Speicherkrankheit.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das N-Alkylderivat von Desoxynojirimycin vier bis sechs Kohlenstoffatome in der Alkylkette enthält.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das N-Alkylderivat von Desoxynojirimycin N-Butyl-DNJ ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das N-Alkylderivat von Desoxynojirimycin N-Nonyl-DNJ oder N-Decyl-DNJ ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das N-Alkylderivat von Desoxynojirimycin N-Nonyl-DNJ ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Glykolipid-Speicherkrankheit die Gaucher-Krankheit ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Glykolipid-Speicherkrankheit die Gaucher-Krankheit ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Glykolipid-Speicherkrankheit die Gaucher-Krankheit ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das N-Alkylderivat von Desoxynojirimycin in einer Dosis von 0,1 bis 1000 mg und die Glucocerebrosidase in einer Dosis von 7,5 bis 60 E pro Kilogramm Gewicht des Patienten in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Trägerstoff verabreicht wird.
Kombinationsarzneimittel-Zusammensetzung, die ein N-Alkylderivat von Desoxynojirimycin, das zwei bis zwanzig Kohlenstoffatome in der Alkylkette hat, und ein Glucocerebrosidase-Enzym in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Trägerstoff umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, in der das N-Alkylderivat von Desoxynojirimycin N-Butyl-DNJ ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, in der das N-Alkylderivat von Desoxynojirimycin N-Nonyl-DNJ oder N-Decyl-DNJ ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, in der das N-Alkylderivat von Desoxynojirimycin N-Nonyl-DNJ ist.