JP2016056203A - デオキシノジリマイシン誘導体及び該誘導体のグルコシルセラミダーゼ阻害剤としての用途 - Google Patents

Abstract

【課題】 セラミドを介するシグナル伝達系が関与する疾患、例えばゴーシェ病、テイ−サックス病、サンドホフ病、及びニーマン−ピック病からなる群より選ばれる疾患を治療するための方法及び医薬組成物を提供する。【解決手段】 スペーサー、例えばペンタメチレンを介してデオキシノジリマイシンの窒素原子に結合したアダマンタンメタノールやコレステロール等の大きな疎水性部分を含有し、グルコシルセラミドを阻害するデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩。【選択図】 なし

Description

本発明は、種々の疾患、特に、ゴーシェ病などの、血漿キトトリオシダーゼ（chitotriosidase）レベルの上昇を特徴とする疾患を治療するための方法及び医薬組成物に関する。

第二メッセンジャーとしてのセラミド
近年、シグナル伝達における第二メッセンジャーとしてのセラミドの重要性が認識されてきている。多くのサイトカインによって生じたシグナルが、この脂質の細胞内濃度の変化を介して伝達されることが明らかになってきた［１，２］。例えば、TNF−α（腫瘍壊死因子α）がその受容体に結合することで生じたシグナルの伝達において、細胞膜の特定領域、或いは（細胞膜内の）陥入部におけるセラミド濃度の局所的な変化が重要である。サイトカインがその受容体に結合すると、スフィンゴミエリナーゼはその触媒作用によりスフィンゴミエリンをホスホリルコリン及びセラミドに変換する。このようにして生成されるセラミドは、特定のタンパク質キナーゼ及びホスファターゼを活性化することによってシグナルを伝達し、細胞応答をもたらす。図１は、TNF−α及び他のサイトカイン（インターフェロンγ及びインターロイキン６など）のシグナル伝達機構の概略を示している。

シグナル伝達におけるセラミドの役割についての、説得力のある実験的な証拠がある。短縮された脂肪族アシル基を有する透過性のセラミドを投与することによって、あるいは、細胞を細菌由来のスフィンゴミエリナーゼで処理することにより細胞表面にセラミドを生成させることによって、TNF−αの効果を実験的に模倣できることが示されている（例えば参考文献２を参照）。

上記のシグナル伝達過程は、おそらくサイトカイン受容体の近辺の、極めて限られた範囲で起こると思われる。細胞膜中のセラミド濃度は、通常の条件下では非常に低いと考えられているが、相当量のセラミドがスフィンゴミエリンの構成単位として細胞膜中に存在している。スフィンゴミエリンが加水分解されると、局所的にセラミド濃度が相当に変化し、その結果シグナルが伝達される。

特定の転移酵素の作用により、セラミドは、ホスファチジルコリン（PC）からのホスホリルコリン部分の転移によってスフィンゴミエリンに再変換されうる。このとき同時にジアシルグリセロールが生じる。ホスファチジルコリンの、ホスホリルコリン及びジアシルグリセロールへの最終的な加水分解をもたらす上記の全経路を、スフィンゴミエリン回路という［２］。

セラミド及びスフィンゴ脂質の代謝
細胞内セラミド濃度の変動が、全てシグナル伝達に影響しているわけではないことは明らかである。セラミドは細胞内で大量に代謝される。この脂質は小胞体膜でアシルCoA及びスフィンゴシンから生合成され、更にゴルジ装置のレベルでスフィンゴミエリン、グルコシルセラミド及びこれに関連する複合体であるガングリオシドに、或いはガラクトシルセラミド及びこれに関連するグロボシドやスルファチドに変換される。スフィンゴミエリン及びグリコスフィンゴ脂質はまた、異化されてセラミド等の、細胞のリソソーム画分の構成成分になる。リソソームで生成されたセラミドは、リソソームのセラミダーゼの作用により局所的に加水分解されてスフィンゴシン及び脂肪酸になり、あるいは細胞質に輸送されてスフィンゴ脂質の生合成に再利用される。セラミド代謝の該略図を図２に示す。

スフィンゴリピドーシス： ゴーシェ病
ヒトでは、リソソームのスフィンゴ脂質の異化作用に関する多くの遺伝性疾患、いわゆるスフィンゴリピドーシスが発生する（表１参照）。例えば、リソソームのスフィンゴミエリナーゼの遺伝的欠損は、ニーマン−ピック病の原因となり、リソソームのセラミダーゼ活性が欠損していると、ファーバー病の原因となる。最も頻繁にみられるスフィンゴリピドーシスは、ゴーシェ病である［３］。代謝に関連するこの疾患の原因は、リソソームのβ−グルコシダーゼ、即ちグルコセレブロシダーゼ（E.C.3.2.1.45）の欠損である。この酵素は、グルコシルセラミド（グルコセレブロシド）の加水分解を触媒し、グルコースとセラミドに変換する。ゴーシェ病の患者では、グルコシルセラミドが細管状の構造物として、特にマクロファージのリソソームに蓄積する。脂質が蓄積したマクロファージは特徴的な形態を示し、通常‘ゴーシェ細胞’と呼ばれている。ゴーシェ病の臨床的発現過程の中で、異常なマクロファージが、骨髄、脾臓、肝臓、腎臓及び肺などの身体の各部に大量に蓄積する。ゴーシェ病に関する最も著明な臨床的徴候は、進行性の脾腫、肝腫及び骨格の劣化（skeletal deterioration）である。多くの場合、ゴーシェ病患者には、神経性の合併症は見られない。通常見られる神経障害を伴わないゴーシェ病は、タイプ１ゴーシェ病と呼ばれている。極めて重篤なゴーシェ病の場合には、特徴的な神経学的異常が生じ、乳幼児期（タイプ２）あるいは少年期（タイプ３）に致死的な合併症を引き起こす［３］。

ゴーシェ細胞
グルコシルセラミドが蓄積したゴーシェ細胞は、病体生理学上重要な役割を果たしていると考えられている。身体の各部にゴーシェ細胞が大量に蓄積すると、局所的な病状をもたらすと考えられている。

ゴーシェ細胞を、単にグリコスフィンゴ脂質を容器の如く貯蔵しているだけの細胞と考えるべきではない。この貯蔵細胞は実際、活性化されたマクロファージであって、加水分解酵素及びサイトカインなどの特定のタンパク質を大量に分泌している。これらの因子はその後病原性因子として作用し、局所的な組織障害や代謝回転（turnover）を引き起こす。その上、サイトカインなどのゴーシェ細胞由来の因子は、付加的な活性化マクロファージの漸増（recruitment）を促進する（図３の概略図を参照）。

近年本発明者らは、ゴーシェ細胞に対する高感度なマーカーを見出した［４］。また本発明者らは、in situ ハイブリッド形成法（in situ hybridization）の技術を使って、ゴーシェ細胞が、分泌酵素であって、様々な種に存在するキチナーゼのヒトにおける類似体であるキトトリオシダーゼを大量に生合成していることを観察した。このことにより、臨床的な症状を呈しているゴーシェ病患者における、血漿キトトリオシダーゼレベルの劇的な上昇が説明される。このような患者の血漿キトトリオシダーゼレベルは、平均すると健常者に比べ約1,000倍高い。これに対し前症候性あるいは無症候性の遺伝的グルコセレブロシダーゼ欠損者では、血漿キトトリオシダーゼレベルが（ほぼ）通常の範囲内にある（表２参照）。血漿キトトリオシダーゼレベルの上昇が、他のスフィンゴリピドーシス、特にニーマン−ピック病の患者においても着目されてきていることは興味深い［５］。

末梢血単球由来の培養マクロファージにおいては、グルコシルセラミドの濃度が徐々に上昇することが観察される。グルコセレブロシダーゼの強力な非可逆的阻害剤であるコンズリットB−エポキシド（conduritol B-epoxide）の存在下で細胞を増殖させると、糖脂質濃度の上昇はより著明である。上記のマクロファージは、培養開始後約７日でキトトリオシダーゼｍRNAの合成を開始し、酵素を分泌する［４，６］。その結果、キトトリオシダーゼ遺伝子の発現は劇的に上昇する。約３週間後には、キトトリオシダーゼは生合成された全タンパク質の約１％に達する［７］。このことは放射能標識したメチオニンの取込み実験から明らかとなる。培養液中にグルコシルセラミド又はコンズリットB−エポキシド（リソソームのグルコセレブロシダーゼの非可逆的阻害剤）が継続的に存在していると、キトトリオシダーゼの発現が促進される。

ゴーシェ病に対する治療的介入
ゴーシェ病における病状の進行（natural history）についての情報は乏しく、また個々の症例に基づくものしかないが、それらによればゴーシェ病の臨床的症状は進行性であるが、発病は通常徐々に起こるのではない。殆どの患者において、特定の年齢に達すると特定の組織において急速に異常が起こるが、その後かなり長期にわたって症状が安定化することがある。そしてその後、病状は再度急速に進行する。言い換えれば、この疾患は局所的に進行するが、その進行の仕方は一定ではない（chaotic）。ゴーシェ細胞は、おそらくこうした局所的な発病過程において重大な役割を果たしていると考えられる。活性化貯蔵細胞が存在すると、局所的な組織障害や代謝回転を誘導し、またそのような場所での活性化マクロファージの漸増を促進して、病理学的事象のカスケードを開始させる（図３参照）が、その進行の仕方は一定でない。この概念によれば、病理学的カスケードを破壊又は阻害することによって、主たる有益な効果が発揮されることになる。ゴーシェ病の治療に対する、これまでに検討されてきた種々のアプローチ方法について以下に述べる。

酵素補充療法
３０年以上にわたり、治療上の１つの選択肢として、ゴーシェ病患者のマクロファージへのヒトグルコセレブロシダーゼの補充が真剣に検討されてきた。しかし、ゴーシェ病の治療法を開発するための努力がなされたにもかかわらず、十分量の純粋なヒトグルコセレブロシダーゼを入手することが不可能であったり、組織内マクロファージのリソソームに静脈内投与した酵素を選択的に取り込ませることが困難であったため、この方法は長年の間殆ど不成功に終わっていた。１９９０年以降にようやく、ヒトグルコセレブロシダーゼを長期にわたり患者に補充することによる、ゴーシェ病に対する効果的な治療的介入が可能になった［８］。静脈内注入によって投与されるのは、N結合型グリカンを修飾し、マンノース残基が末端に存在するようにしたヒトグルコセレブロシダーゼである。上記の修飾はマンノース受容体を介した取込みに好都合である。修飾された［「マンノース末端化（mannose-terminated）」］酵素の、組織マクロファージのリソソームへの取込みは、マンノース受容体が介在するエンドサイトーシスによって起こるため、取り込みの選択性が改善される。現在、全投与量（月に１５−２４０Ｕ／ｋｇ体重）及び投与頻度（１−２週間に３回）が異なる種々の投与法が用いられている（例えば参考文献９参照）。ヒト胎盤から単離されたグルコセレブロシダーゼ（セレダーゼ；アルグルセラーゼ）及びCHO細胞内で組換えにより生成された酵素（セレザイム；イミグルセラーゼ）は、ゴーシェ病に関連する臨床的徴候を幾分好転させる作用があり、その有効性は同等であることが見出されている［１０］。

酵素補充療法の著しく有益な効果としては、肺や脾臓の体積の減少であり、又、ヘモグロブリン濃度、血小板数、白血球数などの血液学的パラメータの改善がある。ただし、同じ投与法で処置を受けた患者の間であっても、臨床的な反応の速さや強さに著しい個人差がある［９］。一般的には、生化学的な血清異常の著明な改善を伴って、処置後１年以内に最も著しい臨床的症状の改善が起こる。しかし酵素補充療法では、たとえ長年多量のグルコセレブロシダーゼ投与を受けている患者の場合でも、臨床的徴候の完全な好転や、血清異常、例えばアンギオテンシン変換酵素、酒石酸エステル耐性酸性ホスファターゼ及びキトトリオシダーゼのレベルの上昇などの完全な正常化は達成されない［１１］。酵素補充療法において症状が部分的にしか改善されないことは、骨髄移植が成功した患者においては症状の完全な改善が認められることと対照的である。

酵素補充療法における適切な投与法については、矛盾する見解が依然として存在している。血液学的な改善に関しては、酵素の投与量を低くする投与法と、酵素を多量に投与する投与法とでは効果が（ほぼ）同等であるのに対し、骨疾患への介入においては、適切とされる投与法は依然として疑わしいものである。

現在、１，５００人以上の患者が酵素補充療法を受けている。この治療法を受ける患者の近年の増加は、科学的な関心と共に一般からも相当に関心を持たれるようになったが、これはこの治療法が高い費用を要し、且つ潜在的な危険性を有するためでもある。これまでのところ、治療の結果が好ましいものであった場合、その費用が例外的に高額（患者一人当たり、年に１００，０００−４００，０００ドル）であるため、ゴーシェ病の酵素補充療法は他のあらゆる病気の薬物治療よりも高くつく、最も高価な薬物治療であるという確信をもたらした。また、アルグルセラーゼ製剤は微量のHCG及びその他の不純物を含有することが知られているが、これまでの例では、酵素補充療法は安全であることが示されている。

ゴーシェ病に対する酵素補充療法は、将来の他の希な遺伝性疾患に対する治療法の開発のためのモデルケースとなると考えられている。このことは、１９９５年２−３月にかけて、技術評価会議（Technology Assessment Conference）が国立衛生研究所（ベセスダ、USA）内に組織され、この会議がゴーシェ病を専門的に取り扱うものであったことによって最もよく説明される。この種の会議は、例外的に急を要する必要なヘルスケアがあるときのみ組織されるものである。会議運営の間、１２人の専門家からなる調査団は、ゴーシェ病の分野で指導的な立場にある科学者及び臨床医から証言を集め、ゴーシェ病に関する多くの臨床的徴候を好転させる上で、酵素補充療法が効果的であると結論した。さらに、ヒトタンパク質補充療法の費用及びこの治療法に伴う潜在的な危険性を減少させることが、患者のケア及びヘルスケアにおける経済性という点から重大な問題であると強調された［１２］。

その他の治療方法
限られた人数の少年期の患者において、骨髄移植によるゴーシェ病の治療が成功している。血液幹細胞にグルコセレブロシダーゼの正常な遺伝情報を導入すると、正常速度でグルコシルセラミドを加水分解できる血液細胞が形成されるようになる。骨髄移植の成功に伴ってゴーシェ病患者から臨床的な症状が消失するという事実は、血液細胞のグルコセレブロシダーゼ活性が正常であれば、疾患の症状が現れないことを示している。残念ながら、型が適合するドナーから骨髄を入手できる可能性が限られている上、このような介入に伴い患者が相当に病的な状態となるため、ゴーシェ病に対する治療法として骨髄移植を適応できる可能性は、特に患者が成人の場合非常に限定されている。

近年、ゴーシェ病治療のための選択肢としての遺伝子治療が集中的に研究されている。一般的に、以下の方法が構想されている。多能性血液幹細胞を単離し、ヒトグルコセレブロシダーゼｃDNAを有するベクターを形質導入する。形質導入が成功した後、上記の幹細胞を患者に再導入する。動物実験によって得られたデータは、遺伝子治療がゴーシェ病の治療法として有望であることを示唆しているが、この方法による効率的な介入を期待する前に、多くの重大な問題が解決されなければならない。最大の不利益な点は、「遺伝的に矯正された」幹細胞及びそれらの子孫細胞は、おそらくそれらが選別される上で有利ではないということである。したがって、遺伝子治療を効果的に行なうためには、矯正されている多能性幹細胞がその大半を占める状態が安定に保たれなければならないと想定される。遺伝子治療に関する技術の現状に対する評価については参考文献１３を参照されたい。

ゴーシェ病の治療法におけるもう一つのアプローチ方法として、いわゆる「基質剥奪療法（substrate deprivation therapy）」が提案されている［１４−１６］。生合成されるグルコシルセラミドの量を大幅に減少させると、マクロファージによって分解されるグルコシルセラミドの量も減少するので、有益な効果が得られると論議されている。グルコシルセラミド合成酵素の数種類の阻害剤が開発されている。例えば、１−フェニル−デカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（PDMP）、及び、その類似体である１−フェニル−２−ヘキサデカノイルアミノ−３−モルフォリノ−１−プロパノール（PPMP）［１４］、ブチル−デオキシノジリマイシン［１５］及びブチル−デオキシガラクトノジリマイシン［１６］などがある。

「基質の剥奪」というアプローチ方法における不利益な点としては、グリコシルセラミドの生合成だけでなく、より複雑なグリコスフィンゴ脂質の生合成までもが阻害されることである。その上、現在入手可能なグルコシルセラミド合成酵素阻害剤は、多くの重要な生化学的効果を示すことが知られており、このためこれらの阻害剤が治療薬として適用される可能性は限られたものとなるかも知れない。例えば、PDMPは、ある種の細胞にアポトーシスを誘導することが知られている。ブチル−デオキシノジリマイシンは、リソソームのグルコセレブロシダーゼ及びａ−グルコシダーゼＩを阻害することが知られており、ａ−グルコシダーゼＩは、小胞体（ＥＲ）に存在する酵素であって、新たに生成された糖タンパク質やこの酵素自体のＮ結合型グリカンの修飾において重大な役割を果たし、タンパク質の折りたたまれ方の状態を調節する。ブチル−デオキシノジリマイシンの抗ウイルス作用は、糖タンパク質の修飾に対する阻害作用によって引き起こされると考えられている。その上近年、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤は、同酵素の生合成を誘導することが報告されている。したがって、これらの阻害剤の投与を中止すると、グルコシルセラミド合成酵素の活性が異常に高レベルになり、グルコシルセラミドの負荷を増加させるので、ゴーシェ病患者に対するこれらの阻害剤の投与を長期にわたって継続する必要がある［１４］。

発明の概要
本発明は、スペーサーを介してデオキシノジリマイシンの窒素原子に結合した大きな疎水性部分を含有していることを特徴とする、デオキシノジリマイシン誘導体またはその塩を提供する。（以下、「デオキシノジリマイシン誘導体またはその塩」を単に「デオキシノジリマイシン誘導体」と言う。）

本発明において用いられる「スペーサー」とは、疎水性の基をデオキシノジリマイシンの窒素原子に結合しうる２価の部分又は基であれば特に限定されない。スペーサーは、好ましくは３から８個の炭素原子からなるポリアルキレン鎖、より好ましくは３から６個の炭素原子からなるポリアルキレン鎖、最も好ましくは５個の炭素原子からなるポリアルキレン鎖である。本発明の特に好ましい態様において、スペーサーは、―(ＣＨ₂)_n―で表される構造を有し、上記構造中のｎが３〜８、好ましくは３〜６、より好ましくは５である。

本発明において用いられる「大きな疎水性部分」とは、脂質親和性の性質を有し、生体の脂質二重層膜に安定に入り込むことができる疎水性の部分又は基であれば特に限定されない。通常、この疎水性部分は、飽和、不飽和、及び部分的に不飽和の環状構造からなる群より選ばれる少なくとも一つの環状構造、特に２つ以上の縮合環からなる縮合環構造を包含するものが好ましい。特に好ましい大きな疎水性部分は、２つ以上の炭素原子を他の環と共有する環を３つ以上包含する多環式アルコールより誘導されたものである。この様な大きな疎水性部分は、脂質二重層膜に入り込むことができる。
大きな疎水性部分は、好ましくはアダマンタンメタノール (adamantanemethanol)、コレステロール、β−コレスタノール、アダマンタノール (adamanthanol)、及び９−フェナントロール (9-hydroxyphenanthrene)からなる群より選ばれる化合物から誘導されたものである。

更に本発明は、デオキシノジリマイシン誘導体またはその塩を含有する医薬組成物、及びいくつかの治療用途を含む、デオキシノジリマイシン誘導体の様々な用途を提供する。

次に、本発明の理解を容易にするために、本発明の基本的特徴及び好ましい諸態様を列挙する。

１．スペーサーを介してデオキシノジリマイシンの窒素原子に結合した大きな疎水性部分を含有し、該大きな疎水性部分が２つ以上の炭素原子を他の環と共有する環を３つ以上包含する多環式アルコールより誘導されたものであり、且つ脂質二重層膜に入り込むことが可能であり、該スペーサーが３から８個の炭素原子からなるポリアルキレン鎖を含んでなることを特徴とする、デオキシノジリマイシン誘導体またはその塩。

２．該スペーサーが、３から６個の炭素原子からなるポリアルキレン鎖を含んでなることを特徴とする、前項１に記載のデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩。

３．該スペーサーが、５個の炭素原子からなるポリアルキレン鎖を含んでなることを特徴とする、前項２に記載のデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩。

４．該スペーサーが、―(ＣＨ₂)_n―で表される構造を有し、上記構造中のｎが３〜８であることを特徴とする、前項１に記載のデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩。

５．ｎが３〜６であることを特徴とする、前項４に記載のデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩。

６．ｎが５であることを特徴とする、前項５に記載のデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩。

７．大きな疎水性部分が、アダマンタンメタノール、コレステロール、β−コレスタノール、アダマンタノール、及び９−フェナントロールからなる群より選ばれる化合物から誘導されたものであることを特徴とする、前項１〜６のいずれかに記載のデオキシノジリマイシンの誘導体またはその塩。

８．前項１〜７のいずれかのデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩を含有する、グルコシルセラミダーゼの阻害剤。

９．セラミドを介するシグナル伝達系が関与する疾患を、セラミドを介するシグナル伝達系との干渉によって治療するのに用いられる、前項１〜７のいずれかのデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩を含有する治療剤。

１０．セラミドを介するシグナル伝達系が関与する疾患が炎症性疾患である、前項９に記載の治療剤。

１１．グルコシルセラミダーゼを有する細胞膜におけるグルコシルセラミド濃度の上昇によって生じ、リソソームのグルコシルセラミド分解能の欠損に起因する疾患の治療に用いられる、前項１〜７のいずれかのデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩を含有する治療剤。

１２．前項１〜７のいずれかのデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩を含有する、リソソーム脂質蓄積症の治療剤。

１３．前項１〜７のいずれかのデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩を含有する、ゴーシェ病、テイ−サックス病、サンドホフ病、及びニーマン−ピック病からなる群より選ばれる疾患の治療剤。

１４．前項１〜７のいずれかのデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩と、薬学的に投与可能な担体とを含有してなる医薬組成物。

１５．前項１〜７のいずれかのデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩の、グルコシルセラミダーゼ阻害剤としての使用。

１６．ゴーシェ病、テイ−サックス病、サンドホフ病、ニーマン−ピック病、及びセラミドを介するシグナル伝達系が関与する炎症性疾患からなる群より選ばれる疾患の治療用医薬組成物の製造を目的とする、前項１５に記載の使用。

１７．ゴーシェ病、テイ−サックス病、サンドホフ病、ニーマン−ピック病、及びセラミドを介するシグナル伝達系が関与する炎症性疾患からなる群より選ばれる疾患の治療用医薬組成物の製造を目的とする、前項１〜７のいずれかのデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩の使用。

１８．リソソーム脂質蓄積症治療用医薬組成物の製造を目的とする、前項１〜７のいずれかのデオキシノジリマイシン誘導体またはその塩の使用。

発明の詳細な説明
新規な治療方法：マクロファージの活性化の阻害
現在用いられている酵素療法には多大な費用が必要であり、この療法の効果は個人によって非常にばらつくことが証明されている。酵素療法の代わりとなるその他の治療方法は、限定された患者のみにしか適用できない（骨髄移植）か、または効果や安全性が立証されていない（遺伝子治療や基質剥奪療法）。この様な状況で、本発明者らは、酵素療法に加えて用いられうる新規な治療方法について鋭意研究を行った。

本発明者らの考えるゴーシェ病の病因（図３を参照）によると、加水分解酵素及びサイトカインの放出を引き起こすマクロファージの活性化こそが、介入のための理想的な標的である。

ゴーシェ細胞の活性化を防ぐことが可能な薬剤は治療剤として有用であり、更にこの様な薬剤は、酵素治療の効果を増大させるとも考えられる。

マクロファージの活性化阻害に基づく介入方法の開発

介入のための標的の同定
目的とする治療剤を開発するために、初めに、ゴーシェ細胞がその特徴的な活性化状態に至るメカニズムを解明した。

本発明者らは、目的とする薬剤の開発を可能にした２つの重要な事柄を研究の過程で発見した。

初めに、ゴーシェ細胞の特徴的な活性化状態を検出するための高感度マーカー、即ち、ゴーシェ細胞による多量のキトトリオシダーゼの合成及び分泌（上記を参照）を見出した。培養液中のマクロファージによるキトトリオシダーゼの生成・分泌が、どれだけ薬剤によって阻害されるかを分析することによって、疾患に関連したマクロファージの活性化を防止すると予想される薬剤の効果を精密に試験することが可能であるという点が重要である。
次に本発明者らは、リソソームのグルコセレブロシダーゼ以外にも、グルコシルセラミドをグルコースとセラミドに加水分解しうる別の酵素がヒト細胞中に存在することを見出した（参考文献１７）。

非リソソーム性グルコシルセラミダーゼ
このグルコシルセラミダーゼは、リソソームのグルコセレブロシダーゼとは色々な点で異なる酵素である。この酵素は、グルコセレブロシダーゼとは異なり、リソソームには存在しない。また、グルコセレブロシダーゼとは異なり、ゴーシェ病患者においても欠損は認められない。更に、この酵素は、膜関連タンパク質としての性質を有するグルコセレブロシダーゼとは異なり、膜内在性タンパク質である。そして、人工基質、阻害剤、賦活剤に対して、グルコセレブロシダーゼとは異なる特異性を示す。例えば、グルコセレブロシダーゼとは異なり、グルコシルセラミダーゼはｂ-キシロシド系の人工基質（artificial b-xylosidic substrate）の加水分解を行わない。また、グルコセレブロシダーゼはコンズリットＢ−エポキシド（conduritol B-epoxide）で不可逆的に阻害されるが、グルコシルセラミダーゼはこの物質に対して感受性がない。更に、リソソーム由来の活性化タンパク質であるサポシンＣは、グルコセレブロシダーゼに対し強力な活性化作用を示すが、グルコシルセラミダーゼには何ら影響を与えない。

グルコシルセラミダーゼの機能に関する重要な事柄が見出された。比較的新しい細胞内成分の分画方法を用いた結果、グルコシルセラミダーゼは細胞膜又は初期エンドソームに存在することが判明した。即ち、グルコシルセラミダーゼの作用により、細胞膜内、又は細胞膜内の特異的な陥入部位にセラミドが生成する。実際、顕著な量のグルコシルセラミドが細胞膜に存在することが知られている。従って、セラミドを介するシグナル伝達に関与する細胞膜においては、グルコシルセラミダーゼの作用によって、対応するセラミド濃度の変化が生じている可能性がある。

更に、細胞及び組織から調製した細胞膜懸濁液を用いた実験の結果、リソソームのグルコセレブロシダーゼによってグルコシルセラミドから生成されたセラミドは、ほとんどスフィンゴミエリンに変換されないことが認められた。この現象は、グルコシルセラミダーゼによって生じたセラミドが効率よくスフィンゴミエリンに変換されることと非常に対照的である。また、一過性の第２メッセンジャーとして機能する脂質に期待されるように、グルコシルセラミダーゼによって生じたセラミドは、明らかに、同じ細胞膜内で急速に更なる代謝を受ける。

上記の発見に基づき、本発明者らはゴーシェ病において病因となるマクロファージの活性化について、新規なメカニズムを仮定した。このモデル（図４に示した）によると、グルコセレブロシダーゼ欠損者においては、リソソームにグルコシルセラミドの分解能がないため、グルコシルセラミダーゼを有する細胞膜においてこの糖脂質（グルコシルセラミド）の濃度が増加する。従って、そこに存在する糖脂質（グルコシルセラミド）は異常に高い速度で加水分解されセラミドとなる。生じたセラミドは、タンパク質キナーゼやフォスファターゼを活性化し、特徴的なマクロファージの活性化と、それに伴う病原性因子の生成及び放出を引き起こす。上記モデルの実験による証明、即ち、しかるべき反応に基づいて活性化されたグルコシルセラミダーゼが、マクロファージを活性化するという実験結果を下記で説明する。

病理カスケードへの介入のための標的としてのグルコシルセラミダーゼ活性
グルコシルセラミダーゼは、ゴーシェ病において生じるマクロファージの活性化の防止に利用できる理想的且つ新規な標的である。酵素活性を特異的に阻害することにより、更なる病原性因子放出が防止され、また病理カスケードの破壊が生じ、その結果として治療効果が得られる。この方法と酵素補充療法を合わせて用いることにより、治療効果が著しく向上すると同時に、関連費用の大幅な削減が可能になると考えられる。

グルコシルセラミダーゼ活性の特異的阻害剤の設計
グルコシルセラミダーゼに適した阻害剤を特定するために、細胞膜懸濁液および細胞そのものに存在するグルコシルセラミダーゼについて注意深い分析を行った。その結果、重要な関連事項が多数判明した。

グルコシルセラミダーゼは細胞膜に強く結びついており、基質であるグルコシルセラミドの加水分解は、基質も細胞膜に挿入された状態で行われる可能性が最も高い。また、グルコシルセラミダーゼが細胞膜（及び陥入した細胞膜）のどこに存在するかを特定することも重要である。

更に、グルコシダーゼの阻害剤として知られる様々な物質［Ｄ−グルコノラクトン (D-gluconolactone)、カスタノスペルミン (castanospermine)、デオキシノジリマイシン (deoxynojirimycin)、及びブチル−デオキシノジリマイシン (butyl-deoxynojirimycin)］のグルコシルセラミダーゼ活性阻害能を検討した。上記物質の中で、効果の期待できる阻害剤はデオキシノジリマイシンとブチル−デオキシノジリマイシンであり、特にブチル−デオキシノジリマイシンは有望であった。しかし、どちらの阻害剤も、試験に用いた他の阻害剤と同様に、特異性に乏しかった。例えば、リソソームのグルコセレブロシダーゼも阻害剤に対して感受性を示すため、既にグルコセレブロシダーゼを欠損しているゴーシェ病患者に投与するにはいずれの阻害剤もあまり有用とは考えられなかった。更に上記阻害剤は、酵素療法に用いられるアルグルセラーゼ（alglucerase）及びイミグルセラーゼ(imiglu-cerase)を阻害するので、酵素療法を受けている患者に対してはより深刻な問題を引き起こす。

グルコシルセラミダーゼに対するＩＣ₅₀の濃度のデオキシノジリマイシンとブチル−デオキシノジリマイシン（それぞれ２０と０.３μＭ）の存在下で細胞の培養を行ったところ、顕著なグルコセレブロシダーゼ活性の阻害（それぞれ約２０と１０％）及びグルコシルセラミド合成酵素活性の阻害（それぞれ約３０と２０％）が認められた。この阻害剤について、数種の細胞において同様の濃度範囲でＥＲ（小胞体）のａ−グルコシダーゼＩ活性［末端Ｎ−グリカンの修飾（N-linking glycan trimming）］を阻害するとの報告もある(参考文献１５)。

既知グルコシダーゼ阻害剤が好ましくない結果を示すことから、本発明者らは新規な、より特異性の高いグルコシルセラミダーゼの阻害剤の設計を、グルコシルセラミダーゼの性質に関する確立された情報を利用しながら行った。

その結果、強力且つ特異的なグルコシルセラミダーゼ阻害剤は以下の性質を有することが判明した。

１− デオキシノジリマイシンからなる部分
グルコシルセラミダーゼ酵素活性の確立された、比較的強力な阻害剤。
２− Ｎ−アルキルからなるスペーサー
デオキシノジリマイシンのＮ−アルキル化は、グルコシルセラミダーゼ阻害能を高めることが本発明者らの研究から明らかとなった。
３− スペーサーにカップリングした、脂質二重層膜、好ましくは細胞膜（及び陥入した細胞膜）に入り込むことができる大きな疎水性部分
グルコシルセラミダーゼを含有する膜に阻害剤が挿入されると、阻害剤のin vivoでの阻害能及び特異性が向上する。

デオキシノジリマイシン−アナログの合成
本発明者らの考えを検討し、且つ理想的なグルコシルセラミダーゼ阻害剤を開発するために、一連のデオキシノジリマイシン誘導体の化学合成を行った。上記の考えに基づき、以下に示すような一連のデオキシノジリマイシン(ＤＮＭ)誘導体を合成した(式１)：

上記の構造において、Ｘは飽和アルカン鎖であり、Ｒは大きな無極性基である。この様な化合物は、市販のテトラベンジルグルコピラノース （tertabenzyl-glucopyranose）から７段階の反応で得られるデオキシノジリマイシン塩酸塩（ＤＮＭ・ＨＣｌ）（参考文献１８）と、適切なアルデヒドとの還元的アミノ化(参考文献１９)反応によって得られる化合物である（スキーム１）。

合成方法を以下の２種の化合物、Ｎ−（５−コレステロールオキシペンチル）−デオキシノジリマイシン［N-(5-cholesteroloxy-pentyl)-deoxynojirimycin］（化合物９）及びＮ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシペンチル）−デオキシノジリマイシン［N-(5-adamantane-1-yl-methoxy-pentyl)-deoxynojirimycin］（化合物１０）について例示する（スキーム２）。具体的には、まずグルタルアルデヒド（化合物１）を、イオン交換樹脂を触媒として用い、モノアセタール（化合物２）に転換した（参考文献２０）。得られたモノアセタールの、対応するアルコール(化合物３)への還元と、メシラート (mesylate)（化合物４）への変換を行った後、塩基性の条件下で、適切なアルコール（ＲＯＨは、それぞれコレステロール又はアダマンタンメタノールである）と反応させて、アセタールである化合物５と６を得た。脱保護により第二の遊離アルデヒド基を形成（即ち、化合物７及び８の生成）した後、得られた化合物とデオキシノジリマイシン塩酸塩との還元的アミノ化反応を行い、目的とする化合物９及び１０を得た。

デオキシノジリマイシン−アナログの阻害効果の定量
様々なデオキシノジリマイシン−アナログが関連酵素に与える阻害効果を、in vitroおよび細胞を用いた実験系で分析した。

in vitro（試験管内）の実験
初めに、精製したヒト由来の酵素とヒト組織より得られた細胞膜懸濁液を用いたin vitroの実験を行った。実験はリソソーム由来のグルコセレブロシダーゼとグルコシルセラミダーゼ活性の阻害、及びリソソーム由来のａ−グルコシダーセ活性の阻害に着目して行われた。グルコシルセラミダーゼとしては、ヒト脾臓より得られた膜画分を用いた。グルコシルセラミダーゼ活性は、グルコセレブロシダーゼの活性を消すためにコンズリットＢ−エポキシドによる前処理を行った膜画分を用い、４ＭＵ−ｂ−グルコシド (4MU-b-glucoside) の加水分解能として測定した。グルコセレブロシダーゼとしては、酵素療法に用いられるヒト胎盤酵素［セレダーゼ (ceredase), 米国（ボストン）、Genezyme Corp社製］、または、ヒト脾臓より得られた膜画分を用いた。グルコセレブロシダーゼの活性は、コンズリットＢ−エポキシドによって阻害可能な、４ＭＵ−ｂ−グルコシドの加水分解能として測定した。リソソーム由来のａ−グルコシダーゼの活性は、精製したａ−グルコシダーゼ調製液による４ＭＵ−ｂ−グルコシドの加水分解能として測定した。

表６及び表７に試験に用いた化合物の構造を示す。表３には、測定によって得られた阻害剤のＫｉを示す。

表３より明らかなように、グルコシルセラミダーゼはデオキシノジリマイシンのＮ−アルキル誘導体によって強く阻害される。至適阻害活性はＮ−ペンチル誘導体に見られた。Ｎ−ヘキシル−デオキシノジリマイシン(N-hexyl-deoxynojirimycin) の効果は若干劣っていた（表３に示していない）。また、スペーサーにカルボニル基が存在すると、阻害能に好ましくない影響を与える。

大きな疎水性の基、例えばアダマンタン（Ｐ２１）やコレステロール（Ｐ２４）を、Ｎ−ペンチルからなるスペーサーとカップリングすると、化合物のグルコシルセラミダーセ活性阻害能が劇的に向上する。

いくつかの阻害剤について、そのＩＣ₅₀も測定した。Ｐ２１とＰ２４の、見かけのＩＣ₅₀は非常に低く、それぞれ１ｎＭと０.１μＭであった。比較のために測定したデオキシノジリマイシンとブチル−デオキシノジリマイシンのＩＣ₅₀は、それぞれ２０μＭと０.３μＭであった。

表３は、一般にグルコセレブロシダーゼの方が、グルコシルセラミダーゼに比べて阻害剤に対する感受性が若干低いことを示す。

溶液中の純粋なグルコセレブロシダーゼ（セレダーゼ）と膜に結び付いた酵素は、阻害剤に対して異なる感受性を示す。４ＭＵ−ｂ−グルコシドに対して測定されたＫｍ値が異なることから、２つの異なる状態にある酵素は、反応速度的な性質が異なることが示唆された。

溶解性のグルコセレブロシダーゼも、膜に結び付いたグルコセレブロシダーゼも、共にＮ−ペンチルからなるスペーサーを介してカップリングした大きな疎水性部分を含有するデオキシノジリマイシン−アナログによって最も強く阻害される。

溶解性のグルコセレブロシダーゼ（セレダーゼ）における見かけのＩＣ₅₀は、Ｐ２１で０.２μＭであり、Ｐ２４で０.８μＭであった。膜に結び付いたグルコセレブロシダーゼにおける見かけのＩＣ₅₀は、Ｐ２１とＰ２４でそれぞれ０.０６μＭ及び０.７μＭであった。

リソソーム由来のａ−グルコシダーゼに関しては、デオキシノジリマイシン中の一部を置換しても、全体的にほとんど阻害能の変化を生じなかった。しかし、Ｐ４, Ｐ１１, Ｐ１６, Ｐ９とＰ１３は非常に弱い阻害剤であった。

in vivo（生体内）の実験
次に、細胞そのものが有するグルコシルセラミダーゼ活性及びグルコセレブロシダーゼ活性に対する、デオキシノジリマイシン−アナログの活性阻害能について検討した。酵素活性の測定は参考文献１７の方法に従って行った。実験には、コンズリットＢ−エポキシドの存在下または非存在下で事前に培養しておいた培養メラノーマ細胞を用い、メラノーマ細胞による４ＭＵ−ｂ−グルコシドの加水分解を測定した。コンズリットＢ−エポキシド感受性の活性はグルコシルセラミダーゼ活性であり、コンズリットＢ−エポキシド非感受性の活性はグルコセレブロシダーゼ活性である。この実験の結果を表４に示す。

表３と表４の比較から、メラノーマ細胞そのものにおける、デオキシノジリマイシン−アナログによるグルコシルセラミダーゼ活性の阻害は、脾臓の細胞膜調製液を用いたin vitroの実験と同様の結果であることが示された。実験に用いたアナログのうち、最も有効な阻害剤はＰ２１及びＰ２４であり、ＩＣ₅₀の値はそれぞれ約０.３ｎＭ及び５０ｎＭであった。上記阻害剤は、ＩＣ₅₀の値及びその１０倍の濃度においても、顕著なグルコセレブロシダーゼ活性の阻害は検出されなかった（表４を参照）。

また、デオキシノジリマイシン−アナログの阻害定数を、メラノーマ細胞によるＣ６−ＮＢＤグルコシルセラミド（C6−NBD glucosylceramide）の代謝を用いて決定した。この実験においてもコンズリットＢ−エポキシドを用い、この化合物に対して非感受性のグルコシルセラミダーゼ活性と感受性のグルコセレブロシダーゼ活性を区別した。C6−NBDグルコシルセラミドを基質として用いた実験の結果は、蛍光ラベルした４ＭＵ−ｂ−グルコシドを基質として用いた実験とほぼ同一であった（結果は示していない）。

他の反応がどの程度デオキシノジリマイシンのアナログによって阻害されるかを検討するために、グルコシルセラミダーゼ活性に対してＩＣ₅₀となる濃度のＰ２１とＰ２４をそれぞれ用いて細胞を培養した。この様な培養条件において、ラット肝細胞のグリコーゲン合成酵素、及び培養メラノーマ細胞のグルコシルセラミド合成酵素及びリソソーム由来のa−グルコシダーゼの活性に対する阻害は見られなかった。

グルコシルセラミダーゼがＰ２１に対して非常に高い感受性を示すことから、次に、この阻害反応が不可逆反応であるかどうかを検討した。実験を行うために、培養ミエローマ細胞をＰ２１の存在下及び非存在下で事前に培養し、続いて細胞を充分に洗浄した。次に、得られた細胞を用い、４ＭＵ−ｂ−グルコシドを基質として用いたグルコセレブロシダーゼ及びグルコシルセラミダーゼの活性をそれぞれ測定した。その結果、阻害剤による前処理はグルコセレブロシダーゼ活性に対しては顕著な効果を示さなかったが、グルコシルセラミダーゼ活性の不可逆的な損失を引き起こした。

本発明の効果の証明：マクロファージの活性化に介入する物質としてのデオキシノジリマイシン−アナログの効果
Ｐ２１（Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシペンチル）−デオキシノジリマイシン）［N-(5-adamantane-1-yl-methoxy-pentyl) deoxynojirimycin］とブチル−デオキシノジリマイシンの培養マクロファージに与える影響に付いて検討した。ＤＭＳＯ中に溶解した１０ｍＭのイミノ糖類を、いろいろな希釈度でマクロファージの培養液に添加した。上記の方法で培養液に混入した微量のＤＭＳＯは実験結果に影響を与えないことも確認した。

表５に、Ｃ６−ＮＢＤグルコシルセラミドを基質として用いた、マクロファージにおけるデオキシノジリマイシン−アナログによるグルコセレブロシダーゼ活性及びグルコシルセラミダーゼ活性の阻害結果を示す。デオキシノジリマイシン−アナログのマクロファージに対する効果は、ミエローマ細胞における酵素活性阻害と同様であった。更に表５に、デオキシノジリマイシン−アナログの細胞によるキトトリオシダーゼの分泌に対する影響も示す。表５から明らかなように、キトトリオシダーゼの分泌はグルコシルセラミダーゼ活性の阻害に伴って減少するが、リソソームのグルコセレブロシダーゼ活性とは関連が無い。更に、Ｃ６−ＮＢＤグルコシルセラミドを基質として用いた、マクロファージのグルコシルセラミド合成酵素活性も測定した。その結果、この酵素活性は、キトトリオシダーゼの分泌を減少させる５μＭのブチルデオキシノジリマイシンが培養液に存在しても顕著な阻害は受けないことが明らかとなった。更に、グルコシルセラミド合成酵素を阻害するＰＤＭＰ及びＰＰＭＰの存在は、キトトリオシダーゼの分泌には影響しないことが判明した。

結論として、上記の実験により、低濃度のブチルデオキシノジリマイシン及び特にＰ２１は、そのグルコシルセラミダーゼに対する特異的な阻害能によって、大量にキトトリオシダーゼを（その他の加水分解酵素及びサイトカインと共に）分泌するマクロファージを不活性化することが示された。従って、本発明の効果は実験的に証明された。

グルコシルセラミダーゼ活性阻害剤の用途
新規に開発された非常に高い特異性を示す阻害剤の１つの用途として、ゴーシェ病に対する治療的介入を挙げることができる。上記したように、マクロファージの活性化に対する阻害剤の効果は、ゴーシェ病の病因に好ましい影響を与えると考えられる。阻害剤の投与は酵素療法の効率を高めると考えられ、その当然の結果として、臨床効果を向上し、関連費用の削減に繋がる。

細胞質中における高濃度のキトトリオシダーゼによって特徴付けられるその他の疾患、例えば、ニーマン−ピック病やサルコイドーシスに対しても、グルコシルセラミダーゼの阻害剤は好ましい効果を発揮すると考えられる（参考文献４及び５を参照）。更に、アテローマ性動脈硬化症の泡末細胞は、キトトリオシダーゼを過剰に産生していることが知られている。

セラミドを介するシグナル伝達系は、グルコシルセラミダーゼ活性の阻害によって直接又は間接的に影響を受けると考えられる。従って、開発した阻害剤の考えられる用途は非常に広範囲に渡るものであり、特に、セラミドを介したシグナル伝達において、ＴＮＦ−αやその他の前炎症性（proinflammatory）サイトカインが引き起こす炎症性疾患の症状に関連した用途は注目されている。具体的には、敗血病性ショック、慢性関節リウマチおよびクーロン病への応用が例示される。

最適な医薬組成物の投与方法およびその組成は、当業者の通常の知識の範囲内で選択することができる。例えば、本発明に適した投与方法は非経口（静脈、皮下、筋肉）投与である注射や注入、経口投与、及び局所投与である。特に好ましい方法としては、油性の賦形剤を用い、ゆっくりと長期に渡って貯蔵性の製剤より薬剤を放出させるとよい。しかし、経口投与や静脈注射に油性の賦形剤を用いることは困難である。経口投与の場合、消化器系における脂質親和性化合物の吸収は、混合ミセル状態の化合物の溶解と同時に起こり、引き続き、腸の内膜を介した拡散による吸収が起こる。静脈注射の場合は、脂質親和性の化合物を事前に取り込ませておいたリポソームを用いることができる。

実施例
５，５−ジエトキシペンタン−１−オール（３）
５，５−ジエトキシペンタナール（１）（3 g, 17 mmol）及びNaBH₄（0.65 g, 17 mmol）を、エタノール30 ml中室温下で３時間攪拌した後、溶媒を留去して残さを得た。得られた残さを10 % NaOH中ですりつぶし（triturated）、得られた混合物をCH₂Cl₂による抽出処理に付した。得られた有機層を合わせて乾燥（Na₂SO₄）し、溶媒を留去した後、残さをシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル60-80／酢酸エチル＝１／１にて溶出）に付すことにより精製し、化合物（２）を得た（収率59 %）。
1H NMR (CDC1₃): d 4.47 (t, 1H, J=5.7 Hz, C-1), 3.70-3.58 (m, 4H,C-5, CH₂ acetal), 3.46 (dq, 2H, J= 7.1 Hz, 2.3 Hz, CH₂ acetal), 1.65-1.50 (m, 4H, C-2, C-4), 1.41 (m, 2H, C-3), 1.18 (t, 6H, J=7.1 Hz, CH₃ acetal).

メタンスルホン酸５，５−ジエトキシペンチルエステル（４）
上記化合物（２）（0.3 g、1.7 mmol）及びトリエチルアミン（0.21 g、2.0 mmol）を3 mlのCH₂Cl₂に溶解して得られた溶液に、氷冷下メタンスルホニルクロライド（0.21 g、1.9 mmol）を添加した。この混合物を室温で１時間攪拌した後、反応混合物を水で洗浄し、有機層をNa₂SO₄上で乾燥した後減圧下で溶媒を留去することにより、化合物（４）を得た（0.43 g、1.7 mmol、収率100%）。このものはこれ以上精製することなく以降の反応に用いた。
1H NMR (CDC1₃): d 4.47 (dt, 1H, J=5.5 Hz, 2.5 Hz, C-1) , 4.21 (dt, 2H, J=6.5 Hz, 2.7 Hz, C-5), 3.63 (m, 2H, CH₂ acetal), 3.48 (m, 2H, CH₂ acetal), 3.00 (s, 3H, OSO₂CH₃), 1.77 (m, 2H, C-2), 1.63 (m, 2H, C-4), 1.47 (m, 2H, C-3), 1.20 (t, 6H, J=7.0 Hz, CH₃ acetal).

１−（５，５−ジエトキシペンチルオキシメチル）アダマンタン（５）
NaH［60 % 分散液（disp.）、0.108 g、2.7 mmol］を、ペンタンを用いて洗浄した後、5 mlのDMF中でアダマンタンメタノール（0.4 g、1.6 mmol）と共に室温で１時間攪拌し、（アダマンタンメタノールの）ナトリウム塩懸濁液を得た。この懸濁液に上記化合物（４）（0.4 g、1.6 mmol）を加え、得られた混合物を70℃で４時間加熱した後室温で１晩攪拌し、反応混合物を得た。得られた反応混合物を数滴のメタノールで処理した後氷水中に投入し、得られた混合物をジエチルエーテルによる抽出処理に付した（15 ml×３回）。有機層をNa₂SO₄上で乾燥した後減圧下で溶媒を留去し、残さをシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル60-80／酢酸エチル＝７／３にて溶出）に付すことにより精製し、化合物（５）を粘稠なシロップ状物質として得た。
5: yield 34%. 1H NMR (CDCl₃) : d 4.48 (t, 1H, J=5.7 Hz, C-1 chain), 3.61 (dq, 2H, J=7.1 Hz, 2.3 Hz, CH₂ acetal), 3.49 (dq, 2H, J=7.1 Hz, 2.2 Hz, CH₂ acetal), 3.37 (t, 2H, J=6.5 Hz, C-5 chain), 2.94 (s, 2H, CH₂ adamant.), 1.94 (m, 3H, adamant.), 1.73-1.51 (m, 16H, C-2, C-4 chain, adamant.), 1.45-1.35 (m, 2H, C-3 chain), 1.19 (t, 6H, J=7.1 Hz, CH₃ acetal).

１−（５，５−ジエトキシペンチルオキシ）−１７−（ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン［Ｏ−（５，５−ジエトキシペンチル）−コレステロール］（６）
NaH（60 % 分散液、0.12 g、3 mmol）を、ペンタンを用いて洗浄した後、6 mlのDMF中でコレステロール（1.16 g、3 mmol）と共に65〜70℃で４５分間攪拌し、（コレステロールの）ナトリウム塩懸濁液を得た。この懸濁液に上記化合物（４）（0.508 g、2 mmol）を加え、得られた混合物を70〜75℃で20時間加熱し、反応混合物を得た。得られた反応混合物に含まれるDMFを留去し、得られた残さを水とジエチルエーテルによる抽出処理に付し、ジエチルエーテル抽出物をNa₂SO₄上で乾燥した後減圧下で溶媒を留去し、残さをシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（石油エーテル60-80／酢酸エチル＝５／１にて溶出）に付すことにより精製し、生成物（６）を粘稠なシロップ状物質として得た。
1H NMR (CDCl₃): d 5.31 (m, 1H, C-6 chol.), 4.45 (t, J=5.5 Hz, 1H, C-1 chain), 3.61 (dq, 2H, J=7.1 Hz, 2.4 Hz, CH₂ acetal), 3.45 (m, 4H, CH₂ acetal, C-5 chain), 3.10 (m, 1H, C-3 chol.), 2.34 (m, 1H, chol.), 2.16 (m, 1H, chol.), 2.07-1.70 (bm, 4H), 1.70-0.75 (bm, 46H, chol., CH₃ acetal), 0.67 (s, 3H, CH₃ chol.).

５−［１７−（ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル−オキシ−］ペンタナール（５−コレステリルペンタナール）（７）及び５−（アダマンタン−１−イル−メトキシ）−ペンタナール（８）
上記アセタール（５）又は（６）（0.2 mmol）、アセトン3 ml及び5 % 塩酸1 mlを混合して得られる混合物を室温で１時間攪拌し、得られた反応混合物に含まれるアセトンを留去した。得られた残さをジエチルエーテルによる抽出処理に付し（7 ml×３回）、ジエチルエーテル抽出物をNa₂SO₄上で乾燥した後減圧下で溶媒を留去し、アルデヒドを定量的に得た。このアルデヒドはこれ以上精製することなく以降の反応に用いた。
7: yield 100%. 1H NMR (CDC1₃): d 9.77 (s, 1H, CHO), 5.33 (m, 1H, C-6 chol.), 3.46 (t, 2H, J=6.1 Hz,C-5 chain), 3.11 (m, 1H, C-3 chol.), 2.46 (dt, 2H, J=7.2 Hz, 1.4 Hz, C-2 chain) 2.34 (m, 1H, chol.), 2.16 (m, 1H, chol.), 2.05-1.75 (bm, 42H, C-3 C-4 chain, chol), 0.67 (s, 3H, CH₃ chol.).
8: yield 100%. 1H NMR (CDCl₃): d 9.76 (t, 1H, J=1.7 Hz, CHO), 3.38 (t, 2H, J=6.2 Hz, C-5 chain), 2.94 (s, 2H, CH₂ adamant.), 2.46 (dt, 2H, J=7.2 Hz, 1.7 Hz, C-2 chain), 1.95 (m, 3H, adamant.), 1.80-1.45 (m, 16H, C-3, C-4 chain, adamant.).

１−｛５−［１７−（ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イル−オキシ−］ペンチル｝−２−ヒドロキシメチル−ピペリジン−３，４，５−トリオール［Ｎ−（５−コレステリルペンチル）−デオキシノジリマイシン］（９）
上記アルデヒド（７）（0.118 g、0.25 mmol）を、少量の加熱した酢酸エチルに溶解し、更に約4 mlのエタノールを加えて希釈した。得られた溶液に、デオキシノジリマイシン塩酸塩（0.050 g、0.2 mmol）及び酢酸ナトリウム（0.020 g、0.25 mmol）を0.4 mlのメタノールに溶解して得られた溶液と混合し、得られる混合物を室温で１時間攪拌した。得られた反応混合物を０℃に冷却した後、NaCNBH₃（0.016g, 0.25 mmol）を添加し、得られた懸濁液を室温で１８時間激しく攪拌し、最終的に温度を６０℃まで上げて更に１時間攪拌した。得られた反応混合物を室温まで冷却した後、5 %塩酸を用いて酸性（pH < 1）にし、１時間攪拌した後減圧乾固した。残留した固形物をCH₂Cl₂とメタノール（1/1）の混合溶媒20 mlに懸濁させ、得られた懸濁液に、メタノール性アンモニア（20 %のアンモニアを含むメタノール）2 ml及び約5 gのシリカを加え、減圧下で（注意深く）溶媒を留去した後、溶離液（CH₂Cl₂／メタノール／上記メタノール性アンモニア＝80/15/5）で前処理したシリカのカラムの上部に添加して、カラムクロマトグラフィーを行った。このとき、溶離液の組成を、CH₂Cl₂／メタノール／上記メタノール性アンモニア＝80/15/5→75/20/5→70/25/5のように変化させた。このようにして得られた目的物を含む画分の溶媒を留去し、純粋な化合物（９）を固体として得た（0.081 g、0.13 mmol、収率65 %）。

化合物（９）の塩酸塩：化合物（９）（0.050 g）を加熱したエタノール20-30 mlに溶解し、濃塩酸３滴で処理した後溶媒を留去することにより、化合物（９）の塩酸塩を結晶性の固体として定量的に得た［融点：235-238℃（約190℃から昇華し始める）］。

1H NMR (D₂O): d 5.36 (m, 1H, C-6 chol.), 4.10 (d, 1H, J=12.6 Hz, C-6 DNM), 3.92 (d, 1H, J=12.6 Hz, C-6 DNM), 3.73 (m, 1H, C-2 DNJ), 3.61 (m, 1H, C-4 DNJ), 3.52 (t, 2H, J=6.2 Hz, C-5 chain), 3.47 (dd, JC-1/C-1=12.1, JC-1/C-2=4.8, C-1 eq.DNM), 3.39 (m, 2H, C-3 DNM, C-1 chain), 3.29-3.05 (m, 3H, C-1 chain, C-3 chol., C-5 DNM), 3.00 (app.t, 1H, J=11.6 Hz, C-1 ax. DNM), 2.34 (m, 1H, C-4 eq chol.), 2.15 (m, 1H, C-4 eq chol.), 2.03 (m, 1H, C-2 chol.), 1.97-0.80 (bm, 43H, C-2 C-4 C-3 chain, chol), 0.72 (s, 3H, CH₃ chol.). HRMS (FAB) obs mass 640.4979 (MNa⁺), calcd for C₃₈H₆₇N0₅Na 640.4917; obs mass 618.5086 (MH⁺), calcd for C₃₈H₆₈N0₅ 618.5097.

１−［５−（アダマンタン−１−イル−メトキシ）−ペンチル］−２−ヒドロキシメチルピペリジン−３，４，５−トリオール｛［Ｎ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシ）−ペンチル］−デオキシノジリマイシン｝（１０）
上記化合物（８）（0.056 g、0.22 mmol）をメタノール1 mlに溶解して得られた溶液を０℃に冷却し、これに、デオキシノジリマイシン塩酸塩（0.030 g、0.15 mmol）の溶液と、数μlの酢酸をメタノール2 mlに添加して得られる溶液とを加え、更にNaCNBH₃（0.014g, 0.22 mmol）を添加した後室温で１晩攪拌し、反応混合物を得た。得られた反応混合物を濃縮し、5 %塩酸2 mlで処理し、室温で１時間攪拌した後、炭酸ナトリウム（固体）を加え、得られた水性懸濁液をCH₂Cl₂による抽出処理に付した。得られた有機層を合わせて乾燥（Na₂SO₄）し、溶媒を留去した後、残さをシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（CH₂Cl₂／メタノール／8 Nアンモニアを含むメタノール＝70/30/4にて溶出）に付すことにより精製し、純粋な化合物（１０）を油状物質として得た（0.030 g、0.08 mmol、収率50 %）。

化合物（１０）をメタノール5 mlに溶解し、30 %塩酸を1 ml滴下し、溶媒と過剰の塩酸をメタノールとの共沸により除去し、化合物（１０）の塩酸塩を得た。

1H NMR (D₂0) : d 4.11 (d, 1H, J=12.5 Hz, C-6 DNM), 3.98 (d, 1H, J=11.6 Hz, C-6 DNM), 3.82 (m, 1H, C-2 DNM), 3.69 (t, 1H, J=9.6 Hz, C-4 DNM), 3.62-3.45 (m, 4H, C-1 eq., C-3 DNM, C-5 chain), 3.36 (m, 1H, C-1 chain), 3.21 (m, 2H, C-5 DNM, C-1 chain), 3.08 (m, 3H,C-1 ax. DNM, CH₂ adamant.), 1.95 (m, 3H, adamant.), 1.90-1.56 (m, 10H, C-2, C-4 chain, adamant.), 1.52-1.30 (m, 8H, C-3 chain, adamant.). HRMS (FAB) obs mass 420.2745 (MNa⁺), calcd for C₂₂H₃₉NO₅Na 420.2726; obs mass 398.2905 (MH⁺), calcd for C₂₂H₄₀NO₅ 398.2906.

下記 表２：血漿及び白血球中のキトトリオシダーゼ活性
対照、無症候性のゴーシェ病患者及び症候性のゴーシェ病患者から得た血漿サンプル中のキトトリオシダーゼ活性の測定は、参考文献４の方法に従って行った。キトトリオシダーゼ欠損者に関するデータは表には示されていない。

下記 表３：各種グルコシダーゼにおける見かけ上のＫｉ値
阻害剤による酵素活性の阻害が拮抗阻害によるものであり、ミカエリス・メンテン速度論に従うものとして、一定濃度の阻害剤に対して基質の濃度を変化させることにより、各阻害剤に対するＫｉ値（阻害定数）を求めた。表中の各阻害定数（constants）の単位はμＭとする。〔−〕の符号は阻害剤濃度１００μＭにおいて阻害がなかったことを示す。試験に用いた各阻害剤の構造は表６及び表７に示す。
４ＭＵ−ｂ−グルコシドに対するセレダーゼの活性は、クエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ ５．２）中で、０．２５％（ｗ／ｖ）タウロコール酸ナトリウム及び０．１％（ｖ／ｖ）トリトン（Triton）Ｘ−１００の存在下において測定した。
４ＭＵ−ｂ−グルコシドに対する、細胞膜懸濁液中の、グルコセレブロシダーゼ及びグルコシルセラミダーゼの活性は、クエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ ５．２）中で測定した。コンズリットＢ−エポキシドは上記２種の酵素の活性を識別するために用いた。リソソームのａ−グルコシダーゼの４ＭＵ−ａ−グルコシドに対する活性は、クエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ ４）中で測定した。

表３の註）
Ｐ２１及びＰ２４の可溶性グルコセレブロシダーゼ（セレダーゼ）に対する見かけ上のＩＣ₅₀の値は、それぞれ、０．２μＭ及び０．８μＭであった。
Ｐ２１及びＰ２４の細胞膜懸濁液中のグルコセレブロシダーゼに対する見かけ上のＩＣ₅₀の値は、それぞれ、０．０６μＭ及び０．７μＭであった。
Ｐ２１及びＰ２４のグルコシルセラミダーゼに対する見かけ上のＩＣ₅₀値は、それぞれ、１ｎＭ及び０．１μＭであった。

下記 表４：デオキシノジリマイシン−アナログによるin vivo（生体内）阻害
メラノーマ細胞を様々な濃度の阻害剤と共にインキュベートし、各阻害剤のin vivoでのＩＣ₅₀値（即ち、酵素反応が５０％阻害される阻害剤濃度）を調べた。グルコシルセラミダーゼ及びグルコセレブロシダーゼの活性はそれぞれ参考文献１７に記載の方法に従って測定した。表中の記号ＮＩは、阻害剤濃度１μＭにおいて有意な阻害が認められなかったことを示す。

下記 表５：培養マクロファージに対するＤＮＪの効果
参考文献４に記載の方法で得られた培養ヒトマクロファージを、種々の濃度のブチルデオキシノジリマイシン（ＢＤＮＪ）又はＮ−（５−アダマンタン−１−イル−メトキシペンチル）−デオキシノジリマイシン［N-(5-adamantane-1-yl-methoxy-pentyl)-deoxynojirimycin］（Ｐ２１）と共にインキュベートした。阻害剤と共に４日間プレインキュベートした後、グルコシルセラミダーゼ及びグルコセレブロシダーゼの活性を、Ｃ６−ＮＢＤグルコシルセラミドを基質として用いて測定した（参考文献１７）。また同時に、培養液中に分泌されたキトトリオシダーゼの活性も測定した（参考文献４）。ＢＤＮＪ及びＰ２１の存在下における酵素活性及びキトトリオシダーゼの分泌は、ＢＤＮＪ及びＰ２１の非存在下における酵素活性及びキトトリオシダーゼ活性値を１００％としたときの比率で示されている。

表５の註）
グルコシルセラミド合成酵素活性に関しては、５μＭのＢ−ＤＮＪ又は１ｎＭのＰ２１の存在下では有意な阻害は認められない。ＰＤＭＰ又はＰＰＭＰが存在すると、グルコシルセラミド合成は強力に阻害されるが、キトトリオシダーゼの分泌量が減少することはない。

表７：Ｎ置換デオキシノジリマイシン（N−Complex deoxynojirimycin derivatives）（次頁参照）
大きな無極性基の構造名：
１．アダマンタンメタノール；
２．アダマンタノール；
３．９−ヒドロキシフェナントレン；
４．コレステロール；
５．β−コレスタノール；
６．アダマンタンメタノール；及び
７．コレステロール。

構造式１〜５に示した大きな無極性基は、２つのカルボニル基を含む炭素鎖によってＤＮＪと結合している。構造式６及び７においては、上記の２つのカルボニル基がメチル基に置き換わっている。

＜参考文献＞
1. Heller, R.A., Kronke, M. (1994) J. Cell Biol. 126, 5-9. Tumor necrosis factor receptor-mediated signaling pathways.

2. Hannun, Y.A. (1994) J. Biol. Chem. 269, 3125-3128. The sphingomyelin cyclin and the second messenger function of ceramide.

3. Barranger, J.A., Ginns, E.I. (1989). Glucosylceramide lipidoses: Gaucher's disease. In: The Metabolic Basis of Inherited Diseases. C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly & D. Valle, editors; McGraw-Hill.Inc. New York, 1677-1698.

4. Hollak, C.E.M., van Weely, S., van Oers, M.H.J., Aerts, J.M.F.G. (1994) J. Clin. Invest. 93, 1288-1292. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease.

5. Guo, Y., He, W., Boer, A.M., Wevers, R.A., de Bruyn, A.M., Groener, J.E.M., Hollak, C.E.M., Aerts, J.M.F.G., Galjaard, H., van Diggelen, O.P. (1995) J. Inher. Metab. Dis. 18, 717-722. Elevated plasma chitotriosidase activity in various lysosomal storage disorders.

6. Renkema, G.H., Boot, R.G., Muysers, A.O., Donker-Koopman, W.E., Aerts, J.M.F.G. (1995) J. Biol. Chem. 270, 2198-2202. Purification and characterization of human chitotriosidase, a novel member of the chitinase family of proteins.

7. Boot, R.G., Renkema, G.H., Strijland, A.H., van Zonneveld, A.J., Aerts, J.M.F.G. (1995) J. Biol. Chem. 270, 26252-26256. Cloning of a cDNA encoding chitotriosidase, a human chitinase produced by macrophages.

8. Barton, N.W., Furbish, F.S., Murray, G.J., Garfield, M., Brady, R.O. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1913-1916. Therapeutic response to intravenous infusions of glucocerebrosidase in a patient with Gaucher disease.

9. Hollak, C.E.M., Aerts, J.M.F.G., Goudsmit, R., Phoa, S.S.K.S., Ek, M., van Weely, S., von dem Borne, A.E.G.Kr., van Oers, M.H.J. (1995) Lancet 345, 1474-1478. Individualised low-dose alglucerase therapy for type 1 Gaucher's disease.

10. Grabowski, G.A., Barton, N.W., Pastores, G., Dambrosia, J.M., Banerjee, T.K., McKee, M.A., Parker, C., Schiffmann, R., Hill, S.C., Brady, R.O. (1995) Ann. Int. Medicine 122, 33-39. Enzyme therapy in type 1 Gaucher disease: comparative efficacy of mannose-terminated glucocerebrosidase from natural and recombinant sources.

11. Aerts, J.M.F.G., Boot, R.G., Renkema, G.H., van Weely, S., Jones, S., Hollak, C.E.M., van Oers, M.H.J. (1995) Sem. Hematol. 32, suppl. 1, 10-13. Molecular and biochemical abnormalities of Gaucher disease: chitotriosidase, a newly identified biochemical marker.

12. NIH Technology Assessment Panel on Gaucher Disease (1996) JAMA 275, 548-553. Gaucher disease. Current issues in diagnosis and treatment.

13. Marshall, E. (1995) Science 269, 1050-1055. Gene therapy's growing pains.

14. Abe, A., Radin, N.S., Shayman, J.A. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1299, 333-341. Induction of glucosylceramide synthase by synthase inhibitors and ceramide.

15. Platt, F.M., Neises, G.R., Dwek, R.A., Butters, T.D. (1994) J. Biol. Chem. 269, 8362-8365. N-butyldeoxynojirimycin is a novel inhibitor of glycolipid biosynthesis.

16. Platt, F.M., Neises, G.R., Karlsson, G.B.,Dwek, R.A., Butters, T.D. (1994) J. Biol. Chem. 269, 27108-27114. N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.

17. van Weely, S., Brandsma, M., Strijland, A., Tager, J.M., Aerts, J.M.F.G. (1993) Biochim. Biophys. Acta 1181, 53-62. Demonstration of the existence of a second, non-lysosomal glucocerebrosidase that is not deficient in Gaucher disease.

18. Overkleeft, H.S., van Wiltenburg, J., Pandit, U.K. (1994) Tetrahedron 34, 4215-4224.

19. Baxter, E.W., Reitz, A.B. (1994) J. Org. Chem. 59, 3175-3185.

20. Wanner, M.J., Koomen, G.J. (1995) J. Org. Chem. 60, 5634-5637.

図１は、セラミドを介したシグナル伝達系の概略図である。ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α、tumor necrosis factor alfa）、ＩＬ−１（インターロイキン１、interleukin 1）、ＮＧＦ（神経増殖因子、nerve growth factor）、ＩＦＮ（インターフェロンγ、interferon gamma）がそれぞれのレセプターと結合すると、中性スフィンゴミエリナーゼ (neutral sphingomyelinase) の作用によりスフィンゴミエリンからセラミドが生成する。セラミドはタンパク質キナーゼ及びをホスファターゼを活性化し、その結果として細胞応答が生じる。 図２は、セラミドの代謝の概略図である。図中の略語は、Chol＝コリン；Glc＝グルコース；GlcCer＝グルコシルセラミド；GSL＝複合グリコスフィンゴ脂質；LacCer＝ラクトシルセラミド；SM＝スフィンゴミエリンである。 図３は、ゴーシェ病の病体生理学を示す図である。脂質を過剰に蓄積したマクロファージ（即ち、「ゴーシェ細胞」）は、加水分解酵素を分泌して組織障害と代謝回転を引き起し、またサイトカインを分泌してマクロファージの漸増を促進し、結果として病理カスケードを作動させる。 図４は、ゴーシェ病の病因と、治療目的で病理カスケードに介入するための標的を示す仮想モデルである。リソソームのＧＣ（グルコシルセラミド）異化作用障害によって、非リソソーム性グルコシルセラミダーゼ活性が増加する。その結果、セラミド（Ｃ）の生成が増加し、セラミドが関連する核へのシグナル伝達も増加する。次に、病理カスケードの作動を促進する特定の因子が生成・分泌される。グルコシルセラミダーゼ活性を特異的に阻害することにより、ゴーシェ病の病因となるメカニズムに容易に介入することができると考えられる。

Claims (12)

1. テイ−サックス病、サンドホフ病、及びニーマン−ピック病からなる群より選ばれる疾患の治療用医薬組成物の製造のための、デオキシノジリマイシン誘導体またはその塩のグルコシルセラミダーゼ阻害剤としての使用であって、
   該デオキシノジリマイシン誘導体は、スペーサーを介してデオキシノジリマイシンの窒素原子に結合した酸素原子を有する大きな疎水性部分を含有し、該大きな疎水性部分がアダマンタンメタノール、コレステロール、β−コレスタノール、アダマンタノール、及び９−フェナントロールからなる群より選ばれる化合物であり、該スペーサーが―(ＣＨ₂)_n―で表される構造を有し、上記構造中のｎが３〜８である、ことを特徴とする使用。
2. デオキシノジリマイシン誘導体が下記式で表されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
   

   
3. ｎが３〜６であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
4. ｎが５であることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
5. ｎが５であり、大きな疎水性部分がアダマンタンメタノールであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
6. デオキシノジリマイシン誘導体またはその塩が、デオキシノジリマイシン誘導体またはその塩と、薬学的に投与可能な担体とを含有してなる医薬組成物の形態であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
7. テイ−サックス病、サンドホフ病、及びニーマン−ピック病からなる群より選ばれる疾患の治療用医薬組成物の製造のための、デオキシノジリマイシン誘導体またはその塩の使用であって、
   該デオキシノジリマイシン誘導体は、スペーサーを介してデオキシノジリマイシンの窒素原子に結合した酸素原子を有する大きな疎水性部分を含有し、該大きな疎水性部分がアダマンタンメタノール、コレステロール、β−コレスタノール、アダマンタノール、及び９−フェナントロールからなる群より選ばれる化合物であり、該スペーサーが―(ＣＨ₂)_n―で表される構造を有し、上記構造中のｎが３〜８である、ことを特徴とする使用。
8. デオキシノジリマイシン誘導体が下記式で表されることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
   

   
9. ｎが３〜６であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。
10. ｎが５であることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
11. ｎが５であり、大きな疎水性部分がアダマンタンメタノールであることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれかに記載の使用。
12. 該医薬組成物が、デオキシノジリマイシン誘導体またはその塩と、薬学的に投与可能な担体とを含有してなることを特徴とする、請求項７〜１１のいずれかに記載の使用。

Images