DE69332353T2 - Verwendung von inhibitoren der synthese von fettsäuren zur behandlung von krebs - Google Patents
Verwendung von inhibitoren der synthese von fettsäuren zur behandlung von krebsInfo
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Description
- Diese Anmeldung ist eine Continuation-In-Part der am 24. Juli 1992 eingereichten U.S. Serial No. 07/917,716, die eine Continuation-In-Part der am 26. Juli 1991 eingereichten U.S. Serial No. 07/735,522 ist, die eine Continuation-in-Part der am 04. Dezember 1990 eingereichten und inzwischen fallengelassenen U.S. Serial No. 07/622,407 ist, die wiederum eine Continuation der am 17. Januar 1989 eingereichten und inzwischen fallengelassenen U.S. Serial No. 07/297/722 ist, die vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung sind.
- Die Arbeiten, die zu dieser Erfindung führten, wurden zum Teil durch Grant No. RO1 CA 54404 der "National Institutes of Health" gefördert. Die US-Regierung behält bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
- Die Erfindung betrifft das Gebiet der Chemotherapie von Krebs. Insbesondere sieht die Erfindung therapeutische Mittel vor, die für Tumorzellen zytotoxisch oder zytostatisch sind.
- Einige Karzinomzellen wachsen langsam, was zu Tumoren führt, die kein schwerwiegendes kurzfristiges Risiko für Patienten mit solchen Zellen darstellen. Beispielsweise schreiten viele Prostatakrebse so langsam fort, daß sie erst entdeckt werden, wenn der Patient aus anderer Ursache gestorben ist. Solche Karzinome werden gefahrlos unbehandelt gelassen. Andere Karzinome metastatisieren und wachsen rasch, was zum Tode des Patienten führt. Jede Behandlung, die das Wachstum dieser letztgenannten, virulenteren Karzinome verlangsamt, ist erwünscht.
- Jüngste Verfahren der Krebstherapie beinhalten die Behandlung mit Chemotherapeutika, die die Zellteilung hemmen, oder die Strahlentherapie, die DNA in sich teilenden Zellen zerstört. Diese Behandlungsmethoden beeinträchtigen jedoch auch normale Zellen, die sich zur Zeit der Behandlung gerade teilen oder DNA synthetisieren. Daher besteht ein Bedarf an alternativen Behandlungsmethoden, die spezifischer auf die Zellen virulenter Tumoren zielen.
- Die Fettsäurebiosynthese beim Menschen besteht aus vier Hauptenzymen: Acetyl-CoA-Carboxylase, das geschwindigkeitsbestimmende Enzym, das Malonyl-CoA synthetisiert; Malatenzym, das NADPH produziert; Citratlyase, die Acetyl-CoA synthetisiert; und Fettsäuresynthase, die die NADPH-abhängige Synthese von Fettsäuren aus Acetyl-CoA und Malonyl-CoA katalysiert. Die Endprodukte von Fettsäuresynthase sind freie Fettsäuren, die zum Einbau in andere Produkte eine separate enzymatische Derivatisierung mit Coenzym A benötigen. Beim Menschen erfolgt an zwei Stellen eine bedeutsame Fettsäuresynthese: in der Leber, in der freie Palmitinsäure das überwiegende Produkt ist (Roncari, Can. J. Biochem., 52: 221-230, 1974); und in den milchbildenden Brustdrüsen, in, denen C&sub1;&sub0;-C&sub1;&sub4;-Fettsäuren überwiegen (Thompson et al., Pediatr. Res., 19: 139-143, 1985). Außer für die Milchbildung und die Erneuerung des Endometriums (Joyeux et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 70: 1319-1324, 1990) ist die Fettsäurebiosynthese von untergeordneter physiologischer Bedeutung, da die Aufnahme exogener Fettsäuren mit der Nahrung den Stoffwechsel in der Leber und anderen Organen herunterreguliert (Weiss et al., Biol. Chem. Hoppe- Seyler, 367: 905-912, 1986).
- In der Leber werden Acetyl-CoA-Carboxylase, Malatenzym und Fettsäuresynthase konzertiert durch Thyroidhormon und Insulin auf dem Wege der transkriptionellen Aktivierung induziert und durch Glucagon (Goodridge, Fed. Proc., 45: 2399-2405, 1986) und Fettsäureaufnahme (Blake et al., J. Nutr., 120: 1727-1729, 1990) reprimiert. Tumornekrosefaktor alpha (TNF), ein Zytokin mit tiefgreifenden Wirkungen auf die Lipogenese, ist abhängig vom untersuchten Zelltyp entweder stimulatorisch oder inhibitorisch. In Adipozyten inhibiert TNF die Lipogenese deutlich, indem er die Proteinsynthese für Acetyl-CoA-Carboxylase und Fettsäuresynthase erniedrigt, in der Leber ist er jedoch deutlich stimulatorisch, indem er den Spiegel an Citrat, dem primären allosterischen Aktivator des geschwindigkeitsbestimmenden Enzyms der Fettsäurebiosynthese, Acetyl-CoA-Carboxylase, erhöht.
- In der milchbildenden Brust, der anderen wichtigen Stelle der Fettsäurebiosynthese beim Menschen, ist die Fettsäuresynthese unter Kontrolle von Prolactin, Östrogen und Progesteron. Während der Schwangerschaft wirkt Progesteron als ein Mitogen, das die Ausbildung der Brust fördert und gleichzeitig die Prolactinrezeptoren herunterreguliert, wodurch die Synthese von Lipid und Milchprotein vor der Geburt verhindert wird. Nach der Geburt erlaubt das Absinken des Östrogen- und Progesteronspiegels ein Herauf regulieren der Prolactinrezeptoren und nachfolgender Zunahme der Produktion von lipogenen Enzymen und Milchprotein durch die Epithelzellen der Brust.
- Die Regulierung der Fettsäuresynthase-Expression bei humanem Brustkrebs wurde primär als Modell für die Progesteron-stimulierte Genexpression untersucht. Im Gegensatz zur normalen milchbildenden Brust, in der Progesteron das Wachstum von Epithelzellen stimuliert, während es die Synthese lipogener Enzyme retardiert, hemmt Progesteron bei Progesteronrezeptor (PR)-positiven humanen Brustkarzinomen wie MCF-7, ZR-75-1 und T-47D das Wachstum und induziert die Produktion von Fettsäuresynthase zusammen mit anderen lipogenen Enzymen (Chambon et al., J. Steroid Biochem., 33: 915-922, 1989). Die Wirkung von Progesteron besteht vermutlich im Heraufregulieren der Fettsäuresynthase-Expression über das Steroidhormon-Response-Element, wie es im Promotor für die Fettsäuresynthase von Ratten gefunden wurde (Amy et al., Biochem. J., 221: 675-686, 1989), was zu einer erhöhten Transkription von FAS-mRNA oder, nach anderen Mechanismen, zu einer erhöhten Messengerstabilität führt (Joyeux et al., Mol. Endrocrinol., 4: 681-686, 1989). Was PR-negative humane Brustkrebszellen betrifft, so beschreibt eine einzelne Untersuchung, daß Festtsäuresynthase etwa 25% des zytosolischen Proteins in SKBR3-Zellen ausmacht, aber keine Daten hinsichtlich ihrer biologischen Bedeutung oder Regulierung zur Verfügung standen (Thompson et al., Biochim. Biophys. Acta, 662: 125-130, 1981).
- Was Zytokine und andere lipogene Hormone betrifft, so stehen hinsichtlich humanem Brustkrebs nur dürftige Daten zur Verfügung. So war beispielsweise bekannt, daß TNF auf manche Brustkrebskulturen deutlich wachstumshemmend wirkt. Während TNF das Wachszum von Kulturen von primären Ratten-Hepatozyten schwach hemmt, (ID&sub5;&sub0; = 5000 Units/ml), wird das Wachstum mancher humaner Brustkrebszellen wie MCF-7 extrem gehemmt (ID&sub5;&sub0; = 40 Units/ml) (Chapekar et al., Exp. Cell. Res., 185: 247-257. 1989). Die Wirkung von TNF auf die FAS-Expression oder die lipogene Aktivität in Brustkrebszellen bleibt jedoch unbekannt. Eine Untersuchung der Fettsäuresynthase-Expression in MCF-7- Zellen mit Northern-Analyse ergab, daß Insulin und Insulin-Wachstumsfaktor-1 im Vergleich mit einer mit Progesteron beobachteten 5-10fachen Zunahme nur schwach stimulatorisch wirkten, während T&sub3; keine Wirkung besaß (Chalbos et al., J. Steroid. Biochem. Molec. Biol., 43: 223-228, 1992). Insgesamt wurde die Regulation von FAS in Rezeptor-positivem Brustkrebs lediglich kursorisch untersucht, während Rezeptor-negative Tumoren gar nicht untersucht wurden.
- Kein Zusammenhang mit einem schlechtem klinischen Ergebnis wurde für Brustkrebs oder für andere Krebsarten in den wenigen Systemen gefunden, in denen die Fettsäuresynthase-Expression untersucht wurde. In der einzigen Untersuchung, in der die FAS-Expression angeblich mit einer Prognose in Zusammenhang gestellt wird, wurde die Fettsäuresynthase-Expression durch in situ-Hybridisierung in 27 Brustkrebsen untersucht, wobei eine Verbindung zwischen erhöhter mRNA von Fettsäuresynthase und einem höheren Grad an morphologischer Differenzierung gefunden wurde, jedoch ohne Zusammenhang mit Östrogen- oder Progesteronrezeptor- Status (Chalbos et al., J. Natl. Cancer Inst., 82: 602-606, 1990). Aus diesen Daten wurde geschlossen, daß die Fettsäuresynthase-Expression in Brustkarzinomen mit einem höheren Grad an morphologischer Differenzierung und daher vermutlich mit weniger aggressiven Tumoren assoziiert ist. Eine zweite Untersuchung von 87 Fällen durch Northern-Blot-Analyse von mRNA von Fettsäuresynthase fand eine Zusammenhang zwischen Fettsäuresynthase-Expression und jungem Alter (Prä-Menopause-Patienten), aber wiederum keinen Zusammenhang mit dem Rezeptorstatus (Wysocki et al., Anticancer Res., 10: 1549-1552, 1990). Keine der beiden Untersuchungen lieferte eine klinische Nachsorge ihrer Patienten; es gab keine Daten, die die FAS- Expression mit krankheitsfreien Intervallen oder dem Überleben der Patienten vergleichen. Ohne klinisches Ergebnis lassen sich keine verläßlichen Schlußfolgerungen hinsichtlich FAS-Expression und Tumorvirulenz ziehen.
- Diese Untersuchungen stehen im Gegensatz zu einer Reihe von Untersuchungen an mehr als 200 Patienten aus mehreren Zentren, die durch Messung des krankheitsfreien Überlebens oder des Gesamtüberlebens einen starken Zusammenhang zwischen einer schlechten Prognose und der Expression eines Proteins unbekannter Funktion (bezeichnet als OA-519) zeigen (Kuhajda, N. Engl. J. Med., 321: 636-641, 1989; Shurbaji et al., Am. J. Clin. Pathol., 96: 238-242, 1991; Corrigan et al., Am. J. Clin. Pathol., 96: 406, 1991; Cote et al., Lab. Invest., 66: 13A, 1992; Ziegler et al., Am. J. Clin. Oncol., 14: 101-110, 1991).
- Auch der Fettsäuremetabolismus war kein Untersuchungsziel bei der Krebstherapeutik. Fujii et al. (1986, Japan. J. Exp. Med., 5: 99-106) setzten den Fettsäuresynthase-Inhibitor Cerulenin in Kombination mit exogenen Antitumor-Antikörpern zur Schwächung der Zellmembran ein, in einem Versuch, die komplementvermittelte Schädigung der Zellmembran über den terminalen Komplementkomplex (Membrane Attack Complex) zu potenzieren. Es war bekannt, daß Cerulenin in hohen Konzentrationen für Zellen toxisch ist, und Fujii et al. lehrten, daß die Ceruleninkonzentration niedrig gehalten werden sollte, um die von den humoralen Immunkomponenten der komplementvermittelten Zellyse verliehene Selektivität aufrecht zu erhalten. Spielvogel et al., US-Patent 5.143.907, stellten fest, daß eine Reihe von Phosphit-Boran-Verbindungen sowohl antineoplastische Aktivität als auch antiinflammatorische Aktivität zeigten, wobei sie Serumcholesterin und Serumtriglyderide senkten. Die Phosphit-Boran-Verbindungen sind unspezifische Inhibitoren, die viele zelluläre Funktionen beeinträchtigen, so daß sie nicht selektiv gegen Tumorzellen wirken. Spielvogel et al. lehrten, daß die hypolipämische Wirkung auf Serumcholesterin und -triglyceride durch mehr als einen Mechanismus vermittelt wurde, und es wurde nicht gezeigt, daß die antineoplastische Wirkung mit der hypolipämisehen Aktivität zusammenhängt.
- Mehrere Dokumente des Standes der Technik offenbaren die Wachstumshemmung von Krebszellen durch Antikrebsmittel. Keines dieser Dokumente erwähnt jedoch die zytotoxischen Wirkungen der Verwendung von Inhibitoren, die für Fettsäuresynthase (PAS) spezifisch sind, um Tumorzellen zu supprimieren (M. J. Tisdale und Y. C. Leung (1988) Cancer Letters 42: 231-235; JP 1132542 (TOOMEN: KK); W. N. Hait et al. (1985) Cancer Chemother. Pharmacol. 14: 202-205; P. G. Partida und F. S. S nchez (1977) Arch. de Farmacol. y Toxicol. III(3): 231; Weitzen et al. (1971) Z. Physiol. Chem. 348: 433-442; C. J. Bacchi et al. (1959) Journal of Bacteriology 1969: 23-28; M. Furnica et al. (1971) Rev. roum. Biochim. 8(2): 117-122). Es wurde jedoch vermutet, daß Cerulenin (ein bekannter Inhibitor von FAS) für normale und maligne Zellen gleichermaßen zytotoxisch ist (Y. Fujii et al. (1986) Japan J. Exp. Med. 56(3): 99-106). Ferner offenbart die DD 252616 A1 die Verwendung von Cerulenin als Antibiotikum zur Behandlung von Infektionen bei immunkompromittierten Krebspatienten.
- D. Chalbos et al. ((1990) Ann. New. York Acad. Bei. (USA) 595: 67-73) offenbaren, daß der FAS-Spiegel sowohl mit dem Ausmaß der Differenzierung als auch mit dem Progestinspiegel in Tumorzellen korreliert sein kann. Es gibt jedoch keinen Hinweis darauf, daß der FAS-Spiegel als Marker zur Krebsdiagnose verwendet werden kann.
- Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Medikament zur Behandlung von Krebspatienten bereitzustellen, das die Tumorbelastung des Patienten reduziert.
- Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Medikament zur Behandlung virulenter Karzinome bereitzustellen.
- Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung eines Inhibitors der Fettsäuresynthese bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Hemmung, beim Menschen, des Wachstums von Tumorzellen vor, die wenigstens ein Enzym des Fettsäure-Biosynthesewegs exprimieren, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor spezifisch die Fettsäurebiosynthese einer Zelle inhibiert, wie durch Wachstumshemmung einer FAS- exprimierenden Tumorzelle in vitro gezeigt, wobei die Wachstumshemmung in vitro durch Oleat aufgehoben wird, wobei der Inhibitor spezifisch für die Tumorzellen zytotoxisch ist.
- Die Tumorzellen können ein Protein exprimieren, das Fettsäuresynthase-Aktivität zeigt.
- Der Patient kann ein Karzinom haben, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Brustkarzinomen, Rektalkarzinomen, Ovarialkarzinomen, Colonkarzinomen und Prostatakarzinomen.
- Die Fettsäuresynthase-Expression des normalen Gewebes des Patienten kann während der Behandlung herunterreguliert werden, beispielsweise indem man die Kalorienaufnahme des Patienten reduziert oder eine Zusammensetzung an den Patienten verabreicht, die langkettige freie Fettsäure oder Acylglycerid umfaßt. Eine solche Zusammensetzung kann dem Patienten essentielle Fettsäuren zuführen.
- Der Inhibitor der Fettsäuresynthese kann ein Inhibitor eines Enzyms sein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Fettsäuresynthase, Acetyl-CoA- Carboxylase, Citratlyase und Malatenzym besteht.
- Wenn das Enzym Fettsäuresynthase ist, kann der Inhibitor Cerulenin sein.
- Wenn das Enzym Acetyl-CoA-Carboxylase ist, kann der Inhibitor 5-Tetradecyloxy-2-furancarbonsäure (TOFA) sein.
- Ein weiterer Inhibitor der Lipidbiosynthese kann im wesentlichen gleichzeitig mit der pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden.
- Der Inhibitor der Lipidbiosynthese kann Triacsin C sein.
- Eine weitere Ausführungsform der Erfindung sieht ein Assayverfahren zur Unterstützung bei der Bestimmung der Tumorzellenvirulenz in einem Patienten vor, das umfaßt:
- a. Erhalten einer Probe von dem Patienten;
- b. Bestimmen der Menge eines Proteins mit Fettsäuresynthase-Aktivität in der Probe, wobei der Bestimmungsschritt ferner den Nachweis der Bindung zwischen dem Protein und einem Antikörper umfaßt, der das Protein immunologisch bindet, wobei der Antikörper nicht immunologisch kreuzreaktiv mit Haptoglobin 1 oder 2 oder mit einem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz Leu Tyr Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ser Asp Asp Arg Phe Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala Asn Gly Tyr Val Glu Lys Leu Phe Arg Tyr Gin Cys ist, wobei die Expression eines Proteins mit Fettsäuresynthase-Aktivität durch Tumorzellen Virulenz anzeigt.
- Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Assayverfahren zur Unterstützung bei der Bestimmung der Tumorzellvirulenz in einem Patienten, das umfaßt:
- a. Erhalten einer Probe von dem Patienten;
- b. Bestimmen der Menge eines Proteins mit Fettsäuresynthase-Aktivität in der Probe, wobei der Bestimmungsschritt den Nachweis der Hybridisierung zwischen einer Nukleinsäuresonde und einer für das Protein codierenden mRNA umfaßt, wobei die Expression eines Proteins mit Fettsäuresynthase-Aktivität durch Tumorzellen Virulenz anzeigt.
- In dem erfindungsgemäßen Assayverfahren kann die Probe eine Tumorgewebeprobe oder eine biologische Flüssigkeit des Patienten sein.
- Die Tumorzellen können aus einem Brustkarzinom, Prostatakarzinom oder Ovarialkarzinom stammen.
- Die Erfinder haben die prognostische Bedeutung eines Proteins (bezeichnet als OA-519) herausgefunden, das bei Brustkrebs und anderen Karzinomen exprimiert wird. Besonders virulente Karzinome enthalten unter anderem häufig Zellen, die OA-519 exprimieren, und es wurde gefunden, daß dieses bestimmte Protein Fettsäuresynthase- Aktivität besitzt, was eine Enzymaktivität zu sein scheint, die für das Wachstum von Karzinomen, aber nicht notwendig von normalen Zellen notwendig ist. Die Erfinder haben ferner gefunden, daß Inhibitoren von Fettsäuresynthase (FAS-Inhibitoren) für Zellen, die OA- 519 exprimieren, zytotoxisch sind. Auf Grundlage dieser Beobachtungen haben die Erfinder die vorliegende Erfindung entwickelt, die in der Verwendung von Fettsäuresynthese-Inhibitoren zur Verringerung der Tumorbelastung bei Krebspatienten besteht. Die vorliegende Erfindung ist besonders vorteilhaft, weil Medikamente, die Inhibitoren wie FAS-Inhibitoren umfassen, selektiv für Zellen sind, die Fettsäuresynthase exprimieren. FAS ist ein induzierbares Enzym, das im allgemeinen von normalen Zellen nicht exprimiert wird, und als Folge davon werden die Tumorzellen durch die Inhibitoren bevorzugt getroffen.
- Fig. 1 zeigt die Korrelation zwischen OA-519- Expression und Überleben bei Brustkarzinom.
- Fig. 1A zeigt die prognostische Korrelation zwischen der Expression von OA-519 und Progesteronrezeptor (PR) bei Brustkrebs.
- Fig. 2A zeigt die Korrelation zwischen OA-519- Expression und krankheitsfreiem Überleben bei Prostatakrebs.
- Fig. 2B zeigt die Korrelation zwischen OA-519- Expression und Prognose bei Ovarialkarzinom.
- Fig. 2C zeigt die fortlaufende Reinigung von OA-519 aus Brustkarzinomen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese und entsprechende Western-Blots von Protein in verschiedenen Reinigungsstadien.
- Fig. 3A zeigt die 34-Aminosäuresequenz eines mit OA-519 immunologisch kreuz reaktiven Peptids. Die Sequenz entspricht den ersten 34 Aminosäuren, die von dem hpr-Gen. exprimiert werden, das von Maeda, J. Biol. Chem., Bd. 260, S. 6698-6709, 1985, beschrieben wird.
- Fig. 3B zeigt die Peptidsequenzanalyse von OA-519.
- Fig. 4 zeigt, daß OA-519 Fettsäuren aus Acetyl- und Malonyl-CoA synthetisiert.
- Fig. 5 zeigt einen Dixon-Plot der Inhibierung der Fettsäuresynthase-Aktivität von OA-519 durch Cerulenin.
- Fig. 6 zeigt, daß Cerulenin das Wachstum von Karzinomzellen, aber nicht von normalen Zellen hemmt.
- Fig. 7 zeigt, daß die Inhibierung durch Cerulenin zunimmt, wenn die Enzymaktivität von OA-519 zunimmt.
- Fig. 8 zeigt die Korrelation zwischen FAS-Expression und Acylglycerid-Synthese.
- Fig. 9 zeigt den Nachweis der OA-519FAS-Expression in Tumorzellinien durch in situ-Hybridisierung von Ribosonden mit einer FAS-Sequenz.
- Fig. 10 zeigt die durch immunohistochemische Färbung nachgewiesene selektive Expression von OA-519.
- Fig. 11A und B zeigen die relative Wachstumshemmung durch Cerulenin für verschiedene Mammakarzinom-Zellinien.
- Fig. 12A und B zeigen, daß die Ceruleninkonzentration mit der Inhibierung der Acylglyceridsynthese, aber nicht mit der Inhibierung der Cholesterinsynthese korreliert.
- Fig. 13 zeigt das Fehlen einer Korrelation zwischen der Zellproliferationsrate und der Sensitivität gegenüber Inhibierung durch Cerulenin.
- Fig. 14 zeigt die Wachstumshemmung durch Cerulenin für Prostatakarzinomlinien.
- Fig. 15 zeigt die selektive Wachstumshemmung durch TOFA für ausgewählte Mammakarzinomlinien mit höherer endogenen Fettsäurebiosynthese.
- Fig. 16 zeigt die wachstumshemmende Wirkung von Triacsin C und Cerulenin auf Tumorzellen, die OA-519FAS exprimieren.
- Fig. 17 zeigt, daß exogen zugeführte Fettsäuren die Inhibierung von FAS aufheben und Zellen vor der wachstumshemmenden Wirkung von Cerulenin retten können.
- Die Erfinder haben ein Protein gefunden, das spezifisch mit Antikörpern immunreagiert, die für ein Epitop spezifisch sind, das auf dem in Fig. 3A gezeigten Peptid, aber nicht auf Haptoglobin 1 oder Haptoglobin 2 zu finden ist, und sie haben gefunden, daß das Protein mit den stark virulenten Karzinomen hoch korreliert ist. Dieses Proteinantigen wurde OA-519 genannt, hier auch als OA-519FAS bezeichnet. Untersuchungen zum Überleben von Patienten mit zahlreichen verschiedenen Karzinomen haben gezeigt, daß der Nachweis von OA-519 im Tumor oder Plasma des Patienten mit hoher statistischer Signifikanz mit einer schlechten Prognose korreliert. (Siehe Tabelle 1) Tabelle 1 OA-519-Expression und Krebsprognose (bestimmt durch Immunhistochemie)
- A. Kuhajda et al., N. Engl. J. Med., 321: 636-41, 1989.
- B. Cote et al., Mod. Pathol., 5: 13A, 1992.
- C. Shurbaji et al., Am. J. Clin. Pathol., 97: 686-691, 1992.
- D. Reston et al., Mod. Pathol., 5: 47A, 1992.
- * Siehe Beispiel 1.
- Die Erfinder haben OA-519 isoliert und gefunden, daß das isolierte Protein Fettsäuresynthase-Aktivität zeigt. Das aus einer humanen Brustkrebs-Zellinie gereinigte OA-519 weist Peptidsequenzhomologie mit der Fettsäuresynthase von Ratten auf, und OA-519 weist auch funktionelle Charakteristiken einer Fettsäuresynthase auf. Fettsäuresynthese durch OA-519 wurde durch Einbau von ¹&sup4;C-Malonyl-Coenzym A in Fettsäuren, anschließende Veresterung der Fettsäuren und Analyse mittels "Reversed- Phase"-Dünnschichtchromatographie nachgewiesen. Die spezifische Aktivität von gereinigtem OA-519 wurde spektrophotometrisch durch Verfolgen der Oxidation von NADPH bei 340 nm in Gegenwart von Acetyl-Coenzym A und Malonyl-Coenzym A bestimmt. Bei einer Bestimmung wurde die spezifische Aktivität von OA-519 als 586 nanomol oxidiertes NADPH/min/mg Protein gemessen, was im Vergleich mit dem Wert von 404, der für FAS aus menschlicher Leber erhalten wurde, günstig ist.
- Fettsäuresynthase ist ein großes Protein, das im Zytosol von Zellen aus bestimmten Geweben, einschließlich Leber und milchbildenden Brustdrüsen, gefunden wird, FAS wird jedoch in den meisten normalen (nicht-malignen) adulten Geweben nicht exprimiert. In höheren Organismen ist Fettsäuresynthase ein multifuktionelles Enzym, von dem allgemein bekannt ist, daß es die folgenden sieben enzymatischen Funktionen auf einem einzigen Molekül durchführt (Wakil, S. J., Biochemistry. 28: 4523-4530, 1989):
- Acetyltransacylase
- Malonyltransacylase
- beta-Ketoacylsynthase (kondensierendes Enzym)
- beta-Hydroxyacyldehydrogenase
- Enoylreduktase
- Thioesterase
- Es wurde gefunden, daß Brustkrebszellen Fettsäuresynthase exprimieren, während die meisten anderen Tumorzellen nicht auf An- oder Abwesenheit dieses Enzyms getestet wurden. Rochefort und Mitarbeiter haben FAS aus Brustkrebszellen teilweise kloniert und gefunden, daß die FAS-Expression in Brustkrebs-Zellinien mit dem Ansprechverhalten auf Progesteron korreliert war (Chalbos et al., J. Biol. Chem., 262: 9923-9926, 1987). Aufgrund dieses Befunds schlossen sie, daß Zellen, die FAS exprimierten, aus Tumoren stammten, die weniger dedifferenziert und daher weniger virulent waren (Chalbos et al., J. Natl. Cancer Inst., 82: 602-606, 1990). Die Erfinder haben entdeckt, daß die Gegenwart von OA-519, einem Protein, das FAS-Aktivität zeigt, entgegen der Lehre von Rochefort mit den stark virulenten Karzinomen hoch korreliert ist.
- Mit Hilfe eines Standard-in vitro-Assays für die Wachstumshemmung haben die Erfinder gezeigt, daß Inhibitoren von OA-519 das Wachstum von Karzinomzellen hemmen, aber nur geringe Wirkung auf normale humane Fibroblasten haben. Tatsächlich sind Fibroblasten, die eine sehr niedrige FAS-Aktivität aufweisen, gegen Konzentrationen von FAS-Inhibitoren resistent, die das Wachstum von mehr als 80% der Brustkrebszellen mit hoher OA-519-Aktivität hemmen. Untersuchungen mit mehreren Brust-, Prostata-, Lungen-, Colon- und Ovarialkarzinom- Zellinien und mit normalen Fibroblasten bestätigen die Korrelation zwischen OA-519-Synthase-Aktivität und Wachstumshemmung durch FAS-Inhibitoren. Der Zusammenhang zwischen Wirkstoff-Sensitivität und OA-519-Enzymaktivität gilt für alle getesteten Tumorzelltypen. Die Inhibierung des Fettsäuresynthase-Enzyms, das in den hochvirulenten Karzinomen stark exprimiert wird, kann also das Zellwachstum in diesen Tumoren hemmen.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Medikament zur Linderung der Tumorbelastung von Krebspatienten bereit, deren Tumor Zellen enthält, die von endogen synthetisierter Fettsäure (Fettsäure, die in den Zellen synthetisiert wird) abhängig sind. Solche Zellen überexprimieren üblicherweise ein Protein mit FAS- Aktivität. Die Tumorbelastung kann in solchen Patienten reduziert werden, indem dem Patienten ein oder mehrere Inhibitoren verabreicht werden, die die Fettsäuresynthese oder -verwertung beeinträchtigen. Diese Inhibitoren sind für Tumorzellen, die FAS exprimieren, zytotoxisch, und eine Verabreichung, die zur Reduktion der Fettsäuresynthese und -verwertung durch das Gewebe und/oder zur Reduktion der FAS-Aktivität in biologischen Flüssigkeiten dieser Patienten führt, verringert die Tumorbelastung.
- Das Medikament dieser Erfindung kann dazu verwendet werden, Patienten zu behandeln, die an Krebsarten leiden, die erhöhte Spiegel an Fettsäuresynthase auf weisen. Charakteristische Karzinome, die einer Behandlung zugänglich sind, umfassen diejenigen der Blase, der Speicheldrüse, der Hautadnexe, des Gallengangs, der Endocervix, der Ektocervix und der Vagina, des Ösophagus, des Nasopharynx und Oropharynx, oder diejenigen des Keimzellenursprungs sowie Mesotheliome. Insbesondere sind erfindungsgemäß Karzinome oder Adenokarzinome des Magens, des Endometriums, der Niere, der Leber und der Lunge sowie Melanome behandelbar. Besonders geeignete Arten von Adenokarzinomen sind Brust-, Colon- und Rektum-, Prostata- und Ovarialadenokarzinome.
- Das Medikament dieser Erfindung kann zur Behandlung von Tumoren verwendet werden, die Zellen enthalten, die FAS exprimieren oder von endogener Fettsäure (synthetisiert in der Zelle) abhängig sind. Die endogene Fettsäuresynthese solcher Zellen erfolgt vorzugsweise mit einer Einbaurate in Acylglycerid von mehr als 10 fmol Acetyl-CoA pro 200.000 Zellen pro Minute. Bevorzugte Patienten lassen sich identifizieren, weil sie Tumoren haben, die Zellen enthalten, die OA-519 oder andere Enzyme der Fettsäuresynthese, beispielsweise Acetyl-CoA- Carboxylase (ACC), in Mengen exprimieren, die höher liegen als die Menge, die in dem benachbarten normalen (z. B. nicht-neoplastischem) Gewebe gefunden wird. Solche Zellen sind aggressive Tumorzellen und führen zu einer kürzeren Überlebensdauer, höherer Metastasenbildung, schnelleren klinischen Rezidiven und einer insgesamt verschlechterten Prognose.
- Die Sensitivität der Tumorzellen gegenüber Fettsäuresynthese-Inhibitoren variiert üblicherweise kontinuierlich mit den FAS-Spiegeln. Von aggressiven Tumorzellen mit einer exprimierten FAS-Aktivitat, die bei einer Größenordnung von mehr als 20 femtomol Malonyl-CoA liegt, das pro 200.000 Zellen pro Minute in Fettsäure eingebaut wird, ist zu erwarten, daß sie gegenüber Fettsäuresynthase-Inhibitoren sensitiv sind. Da viele Tumorzellen extrem abhängig von der endogenen Fettsäuresynthese sind, muß eine niedrigere FAS-Aktivität einen speziellen Tumor nicht als Kandidaten für eine Therapie mit Fettsäuresynthase-Inhibitoren ausschließen.
- Die Anwesenheit von FAS in Zellen des Karzinoms kann mit jeder zweckmäßigen Methode nachgewiesen werden, einschließlich Aktivitätsassays oder -färbungen, Immungssays mit anti-FAS-Antikörpern, Assays, die FAS-mRNA bestimmen usw. Besonders bevorzugt sind Assays auf die Anwesenheit von OA-519, einem Protein, das mit dem Genprodukt des hpr-Gens (Maeda, J. Biol. Chem., Bd. 260, S. 6698-6709, 1985) aber nicht mit Haptoglobin 1 oder 2 immunologisch kreuzreagiert. Solche Assays werden in der Internationalen Offenlegungsschrift WO 90/08324 oder der US-Anmeldung mit dem Aktenzeichen Nr. 07/735.522 gelehrt, die hier vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung sind. Ganz besonders bevorzugte Assays sind Immungssays für OA-519, entweder im Gewebe oder im Plasma.
- Die Expression von FAS kann direkt in Tumorgewebeproben bestimmt werden, die durch Verfahren wie Biopsien, Resektionen oder Nadelpunktionen erhalten wurden, wobei Assays wie Immunhistochemie, Immungssays oder Radioimmungssays auf zytosolisches Enzym, in situ- Hybridisierung von Nukleinsäuresonden mit mRNA-Targets mit FAS-Sequenzen oder direktes Messen der Enzymaktivität zur Anwendung kommen. Die Expression von Fettsäuresynthase durch den Tumor kann indirekt in Proben von biologischen Flüssigkeiten bestimmt werden, die von den Patienten erhalten wurden, beispielsweise Blut, Urin, Serum, Lymphe, Speichel, Spermien, Aszites oder besonders Plasma, wobei beliebige zweckmäßige Assays eingesetzt werden können. Bevorzugte Assays auf FAS in biologischen Flüssigkeiten beinhalten Enzymimmungssays oder Radioimmungssays.
- Zellen, die von endogen synthetisierten Fettsäuren abhängig sind, lassen sich auch durch den Nachweis anderer Enzyme der Fettsäuresynthese in Mengen identifizieren, die höher liegen als diejenigen, die in dem nicht-neoplastischen Gewebe gefunden werden, das den Tumor umgibt. Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung die Behandlung von Zellen mit unerwartet hohen Mengen Acetyl-CoA-Carboxylase vor. Die Anwesenheit dieser Enzyme läßt sich durch Assayverfahren nachweisen, die analog zu den für FAS beschriebenen sind.
- Zellen, die endogen synthetisierte Fettsäure benötigen, sind unter Karzinomen weit verbreitet, insbesondere unter den besonders virulenten Karzinomen. Obwohl die Anwesenheit von FAS bevorzugt vor der Behandlung bestimmt wird, erkennt der erfahrene Kliniker, daß eine derartige Bestimmung nicht immer erforderlich ist. Behandlung eines Krebspatienten mit einem Fettsäuresynthese-Inhibitor, insbesondere einem FAS- Inhibitor, die zur Verringerung der Tumorbelastung führt, zeigt die Anwesenheit von FAS im Tumor. Wenn ein Krebspatient erfolgreich mit dem Verfahren dieser Erfindung behandelt werden kann, kann eine unabhängige Bestimmung von FAS unnötig sein. Eine solche empirische Behandlung von Karzinomen des Typs, bei dem man gewöhnlich FAS-Expression findet, ist durch diese Erfindung ebenfalls vorgesehen.
- Fettsäuresynthese-Inhibitoren eignen sich auch zum Einsatz in Verbindung mit anderen Chemotherapeutika. Da keines der zur Zeit verschriebenen Krebs- Chemotherapeutika spezifisch wirksam gegen den Fettsäuresynthase-Stoffwechselweg ist, ergänzen FAS- Inhibitoren bereits vorhandene Wirkstoffe gegen Krebs, insbesondere antimetabolische Wirkstoffe, die auf andere anabolische oder katabolische Stoffwechselwege zielen.
- Die FAS-Expression und die wachstumshemmende Wirkung von Inhibitoren der Fettsäuresynthese sind unabhängig vom Zellzyklus. Daher ist zu erwarten, daß Fettsäuresyntese- Inhibitoren in Kombination mit Chemotherapeutika, die auf Zellen zielen, die sich schnell teilen, besonders wirksam sind. Alternativ können Fettsäuresynthese-Inhibitoren verabreicht werden, um ein chemotherapeutisches Behandlungsschema auf Basis antineoplastischer Mittel, deren Wirkung gegen den jeweils behandelten Tumortyp bekannt ist, zu ergänzen. Insbesondere sieht die Erfindung die Verwendung von Fettsäuresyntheseinhibitoren vor, um das Wachstum eines kleinen Teils unentdeckter, aber hochvirulenter Zellen in Verbindung mit einem Therapieprogramm mit anderen Mitteln zu verhindern.
- Andererseits ist nicht zu erwarten, daß Fettsäuresynthese-Inhibitoren in Kombination mit Mitteln nützlich sind, die über den terminalen Komplementkomplex zu einer komplementvermittelte Schädigung der Zelle führen, gleichgültig ob durch Antikörper oder durch den alternativen Weg zur Komplementaktivierung initiiert (Bhakdi et al. (1983), "Membrane Damage by Complement," Biochim. Biophys. Acta, 737: 343-372). Daher ist diese Erfindung nicht auf die Verwendung von Fettsäuresyntheseinhibitoren in Gegenwart exogen zugeführter Mittel gerichtet, die den komplementabhängigen terminalen Komplementkomplex aktivieren.
- Karzinomzellen, die von ihrer eigenen endogen synthetisierten Fettsäure abhängig sind, exprimieren FAS. Dies zeigt sich sowohl durch die Tatsache, daß FAS- Inhibitoren wachstumshemmend sind, als auch durch die Tatsache, daß exogen zugeführte Fettsäuren normale Zellen, aber nicht diese Karzinomzellen vor FAS- Inhibitoren schützen können. Daher kann Verhindern der Synthese von Fettsäuren durch die Zelle dazu eingesetzt werden, um Karzinome zu behandeln.
- Fettsäuren werden durch Fettsäuresynthase (FAS) synthetisiert, wobei die Substrate Acetyl-CoA, Malonyl- CoA und NADPH verwendet werden. Man betrachtet die Fettsäuresynthese also üblicherweise als einen Syntheseweg, der vier Enzyme beinhaltet - nämlich FAS und die drei Enzyme, die ihre Substrate produzieren, d. h. Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC), Malatenzym und Citratlyse. Andere Enzyme, die Substrate in diesen Stoffwechselweg einbringen, beispielsweise die Enzyme, die NADPH über den Hexosemonophosphat-Seitenweg produzieren, können die Fettsäuresynthesegeschwindigkeit ebenfalls beeinflussen und so in Zellen bedeutsam sein, die von endogen synthetisierter Fettsäure abhängig sind. Die Inhibierung der Expression oder der Aktivität irgendeines dieser Enzyme beeinträchtigt das Wachstum von Karzinomzellen, die von endogen synthetisierter Fettsäure abhängig sind.
- Erfindungsgemäß kann jedes geeignete Verfähren zur Inhibierung der Fettsäuresynthese von Karzinomzellen verwendet werden, um die Tumorbelastung in Krebspatienten zu verringern, besonders Inhibitoren der Aktivität von irgendeinem der vier Enzyme des Stoffwechselwegs.
- Das Produkt von FAS ist eine freie C&sub1;&sub2;-C&sub1;&sub6;-Fettsäure, üblicherweise Palmitat. Palmitinsäure muß weiter prozessiert werden, um den Bedarf der Zelle an verschiedenen Lipidkomponenten zu decken. Der Ausdruck "Lipidbiosynthese", wie er hier verwendet wird, bezeichnet irgendeinen oder eine Kombination von Schritten, die bei der Fettsäuresynthese oder der nachfolgenden Fettsäureprozessierung zur Herstellung fettsäurehaltiger Zellkomponenten ablaufen. Der erste Schritt bei dieser Downstream-Prozessierung ist die Aktivierung der Fettsäure durch Kupplung mit Coenzym A, die durch ein Enzym, nämlich Acyl-CoA-Synthase, katalysiert wird.
- Die Inhibierung von Schlüsselschritten bei der Downstream-Prozessierung oder -verwertung von Fettsäuren läßt eine Inhibierung der Zellfunktion erwarten, gleichgültig ob die Zelle von endogen synthetisierter Fettsäure abhängig ist oder Fettsäuren verwertet, die der Zelle von außen zugeführt werden, und daher sind Inhibitoren dieser Downstream-Schritte möglicherweise nicht unbedingt ausreichend selektiv für Tumorzellen, die von endogenen Fettsäuren abhängig sind. Es wurde jedoch gefunden, daß die Verabreichung eines Fettsäuresyntheseinhibitors an deratige Zelle diese gegenüber einer Inhibierung durch Inhibitoren der Downstream- Fettsäureprozessierung und/oder -verwertung sensitiver macht. Wegen dieses Synergismus trifft die Verabreichung eines Fettsäuresynthese-Inhibitors in Kombination mit einem oder mehreren Inhibitoren der Downstream-Schritte bei der Lipidbiosynthese und/oder -verwertung selektiv Tumorzellen, die von endogen synthetisierter Fettsäure abhängig sind. Bevorzugte Kombinationen beinhalten einen Inhibitor von Acyl-CoA-Synthase in Kombination mit einem Inhibitor von FAS oder ACC.
- Wenn festgestellt wurde, daß ein Patient einen Tumor hat, der FAS exprimiert, oder wenn OA-519 in einer biologischen Flüssigkeit eines Krebspatienten gefunden wurde, kann der Patient erfindungsgemäß behandelt werden, indem dem Patienten ein Fettsäuresynthese-Inhibitor verabreicht wird. Inhibitoren, deren Verabreichung von dieser Erfindung vorgesehen ist, umfassen alle Verbindungen, die eine nachweisbare Inhibierung der Lipidbiosynthese oder -verwertung durch eine Zelle zeigen, wobei die Hemmung des Zellwachstums in vitro durch Oleat aufgehoben wird.
- Jede solche Verbindung, die die Fettsäuresynthese inhibiert, kann verwendet werden, um das Wachstum von Tumorzellen zu hemmen, natürlich dürfen aber die Verbindungen, die einem Patienten verabreicht werden, nicht gleichermaßen toxisch für maligne und normale (nicht-maligne) Zellen sein. Bevorzugte Inhibitoren zur Verwendung bei dem Verfahren dieser Erfindung sind solche mit hohen therapeutischen Indizes (therapeutischer Index ist das Verhältnis der Konzentration, die normale Zellen beeinträchtigt, zur Konzentration, die Tumorzellen beeinträchtigt). Inhibitoren mit hohem therapeutischen Index lassen sich identifizieren, indem man die Wirkung des Inhibitors auf zwei Zellinien, eine nicht-maligne Linie, beispielsweise eine normale Fibroblastenlinie, und eine Karzinomlinie, von der gezeigt wurde, daß sie große Mengen an OA-519 exprimiert, vergleicht. Insbesondere kann der therapeutische Index bestimmt werden, indem man die Hemmung des Wachstums von Lebewesenzellen mit geringer Fettsäuresynthese-Aktivität, vorzugsweise weniger als etwa 10 fmol Acetyl-CoA-Einbau in Acylglycerid pro Minute pro 200.000 Zellen, beispielsweise von humanen Zellinien, mit der Hemmung des Wachstums von humanen Krebszellen mit hoher Fettsäuresynthese-Aktivität, vorzugsweise größer als etwa 20 fmol Acetyl-CoA-Einbau pro 200.000 Zellen pro Minute, besonders bevorzugt mindestens etwa 80 fmol Acetyl-CoA- Einbau in Acylglycerid pro 200.000 Zellen pro Minute, vergleicht. Zellen mit der bevorzugten Fettsäuresynthese- Aktivität lassen sich vom Fachmann leicht erhalten, und Beispiele öffentlich zugänglicher Zellinien sind im nachfolgenden Beispiel 7 angegeben. Vorzugsweise werden die Assays auf die Wachstumshemmung in Gegenwart von exogener Fettsäure durchgeführt, die dem Zellkulturmedium zugegeben wird, beispielsweise 0,5 mM Ölsäure im Komplex mit BSA.
- Inhibitoren lassen sich durch die Konzentrationen charakterisieren, die erforderlich sind, um das Zellwachstum um 50% (IC&sub5;&sub0; oder ID&sub5;&sub0;) zu hemmen. FAS- Inhibitoren mit hohem therapeutischem Index sind beispielsweise bei einer geringeren Konzentration für die Karzinomzellen wachstumshemmend (gemessen durch IC&sub5;&sub0;) als der IC&sub5;&sub0; für die nicht-malignen Zellen. Inhibitoren, deren Wirkung auf diese beiden Zelltypen größere Unterschiede zeigt, sind besonders bevorzugt. Bevorzugte Fettsäuresynthese-Inhibitoren besitzen eine IC&sub5;&sub0; für Zellen mit hoher Fettsäuresynthese-Aktivität, die wenigstens 1/2 log niedriger, besonders bevorzugt wenigstens 1 log niedriger liegt als die für Zellen mit niedriger Aktivität bestimmte IC&sub5;&sub0; des Inhibitors.
- Wenn Tumoren durch Verabreichung einer synergistischen Kombination aus wenigstens einem Fettsäuresynthese-Inhibitor und wenigstens einem Inhibitor für entweder die Enzyme, die Substrate in die Fettsäuresynthese einbringen, oder für die Enzyme, die eine Downstream-Prozessierung und/oder -verwertung von Fettsäuren katalysieren, behandelt werden, ist der therapeutische Index auf die Konzentrationen der Inhibitoren, die die Komponenten der Kombination ausmachen, empfindlich. Die Optimierung der Konzentrationen der einzelnen Komponenten durch Vergleich der Wirkungen bestimmter Mischungen auf nicht-maligne und OA-519-exprimierende Zellen ist für den Fachmann eine Routineangelegenheit. Die Dosis der einzelnen Komponenten, die benötigt wird, um die therapeutische Wirkung zu erzielen, kann dann nach pharmazeutischen Standardmethoden bestimmt werden, wobei die Pharmakologie der einzelnen Komponenten berücksichtigt wird.
- Der Fettsäuresynthese-Inhibitor oder die synergistische Kombination von Inhibitoren wird in einer Menge verabreicht (basierend auf Dosis und Therapiedauer), die unterhalb der Menge liegt, die das behandelte Lebewesen töten würde. Vorzugsweise erfolgt die Verabreichung in einer Menge, die lebenswichtige Organe nicht irreversibel schädigt oder nicht zu einer permanenten Reduktion von Leberfunktion, Nierenfunktion, Herz-Lungen-Funktion, Gastrointestinalfunktion, Urogenitalfunktion, Integumentfunktion, Skelettmuskelfunktion oder neurologischer Funktion führt. Andererseits ist die Verabreichung von Inhibitoren in einer Menge, die einige Zellen abtötet, die anschließend regeneriert werden (z. B. Endometriumzellen), nicht notwendig ausgeschlossen.
- Acetyl-CoA-Carboxylase und das kondensierende Enzym des FAS-Komplexes sind wahrscheinliche Kandidaten für eine Inhibierung. Die Fettsäuresynthese würde durch Inhibitoren dieser Enzyme herabgesetzt oder abgebrochen. Das Resultat wäre eine Verarmung an Membranlipiden, die zum Zelltod führen würde. Normale Zellen würden jedoch überleben, da sie fähig sind, zirkulierendes Lipid zu importieren. Acetyl-CoA-Carboxylase ist der Brennpunkt für die Kontrolle der Lipidbiosynthese. Das kondensierende Enzym des FAS-Komplexes ist hinsichtlich Struktur und Funktion gut charakterisiert; das aktive Zentrum enthält ein kritisches Cysteinthiol, das das Ziel antilipämischer Reagentien wie Cerulenin ist.
- Von zahlreichen verschiedenen Verbindungen wurde gezeigt, daß sie Fettsäuresynthase (FAS) inhibieren, und die Auswahl eines geeigneten FAS-Inhibitors zur Behandlung von Krebspatienten liegt im Wissen des Durchschnittsfachmanns auf diesem Gebiet. FAS-Inhibitoren lassen sich identifizieren, indem man die Fähigkeit einer Verbindung untersucht, die Fettsäuresynthase-Aktivität zu inhibieren, wobei man gereinigtes Enzym verwendet. Fettsäuresynthase-Aktivität läßt sich auf Basis der Oxidation von NADPH spektrophotometrisch oder durch Messung des Einbaus von radiomarkiertem Acetyl- oder Malonyl-CoA radioaktiv bestimmen (Dils et al., Methods Enzymol, 35: 74-83). Geeignete FAS-Inhibitoren lassen sich beispielsweise aus den in Tabelle 2 angegebenen Inhibitoren auswählen, vorausgesetzt, daß ihre inhibierende Wirkung durch Oleat aufgehoben werden kann.
- 1,3-Dibrompropanon
- Ellman's Reagens [5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure), DTNB]
- 4-(4'-Chlorbenzyloxy)benzylnikotinat (KCD-232)
- 4-(4'-Chlorbenzyloxy)benzoesäure (Mil)
- 2-[5-(4-Chlorphenyl)pentyl]oxiran-2-carboxylat (POCA) und sein CoA-Derivat
- Diethylpyrocarbonat
- Thiolactomycin
- Cerulenin
- Melarsoprol
- Iodacetat
- Phenylarsinoxid
- Pentostam
- Melittin
- Methylmalonyl-CoA
- (-)-Hydroxycitrat
- (R,S)-S-(3,4-Dicarboxy-3-hydroxy-3-methylbutyl)-CoA
- S-Carboxymethyl-CoA
- Sethoxydim
- Haloxyfop und sein CoA-Ester
- Diclofop und sein CoA-Ester
- Clethodim
- Alloxydim
- Trifop
- Clofibrinsäure
- 2,4-D-Mecoprop
- Dalapon
- 2-Alkylglutarat
- 2-Tetradecanylglutarat (TDG)
- 2-Octylglutarsäure
- 9-Decenyl-1-pentendicarbonsäure
- Decanyl-2-pentendicarbonsäure
- Decanyl-1-pentendicarbonsäure
- (S)-Ibuprofenyl-CoA
- (R)-Ibuprofenyl-CoA
- Fluazifop und sein CoA-Ester
- Clofop
- 5-Tetradecyloxy-2-furancarbonsäure
- β,β'-Tetramethylhexadecandicarbonsäure Tralkoxydim
- β,β'-methylsubstituierte Hexadecandicarbonsäure (MEDICA 16), freie Säure oder Monothioester
- alpha-Cyan-4-hydroxyzinnamat
- S-(4-Brom-2,3-dioxobutyl)-CoA
- p-Hydroxymercuribenzoat (PHMB)
- cyclisches N6,O2-Dibutyryladenosin-3',5'-monophosphat
- cyclisches N6,O2-Dibutyryladenosin-3',5'-monophosphat
- cyclisches N2,O2-Dibutyrylguanosin-3',5'-monophosphat
- CoA-Derivat von 5-Tetradecyloxy-2-furancarbonsäure (TOFA)
- 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin
- Periodat-oxidiertes 3-Aminopyridin-Adenin-Dinukleotid- Phosphat
- 5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoesäure)
- p-Hydroxymercuribenzoat
- N-Ethylmaleimid
- Oxalylthiolester wie S-Oxalylglutathion
- Gossypol
- Phenylglyoxal
- 2,3-Butadion
- Brompyruvat
- Pregnenolon
- Der Wirkstoff Melarsoprol ist eine dreiwertige Arsenverbindung; Pentostam ist eine fünfwertige Antimonverbindung. Dreiwertige Arsenverbindungen reagieren mit benachbarten Thiolgruppen ebenso wie fünfwertige Antimonverbindungen. Die Fettsäuresynthase- Aktivität erfordert mehrere reduzierte Thiolgruppen, die als Ziele für eine Inhibierung durch Melarsoprol und andere SH-Reagenzien dienen können.
- Neben diesen antiparasitären Wirkstoffen gibt es eine Fülle anderer Verbindungen, die FAS an einer Vielzahl von Stellen inhibieren: Proteinkinase-Inhibitoren blockieren die Transkription; die Einwirkung von Colchicin auf Mikrotubuli blockiert die Induktion von FAS durch Insulin; Melittin, ein Peptid aus Bienengift, vernetzt das Acyl-Carrier-Protein von FAS bestimmter Spezien; und Cerulenin, ein Antibiotikum, blockiert die Aktivität des kondensierenden Enzyms von FAS. Cerulenin ist ein spezifischer Inhibitor der Aktivität des kondensierenden Enzyms von Fettsäuresynthase, wie von Funabashi et al. (J. Biochem. 105: 751-755, 1989) gezeigt wurde, und Cerulenin ist ein bevorzugter FAS-Inhibitor dieser Erfindung.
- Bevorzugte Inhibitoren des kondensierenden Enzyms umfassen einen breiten Bereich chemischer Verbindungen, einschließlich Alkylierungsmittel, Oxidationsmittel und Reagenzien, mit denen ein Disulfidaustausch erfolgen kann. Die Bindungstasche des Enzyms bevorzugt langkettige E,E-Diene wie:
- Grundsätzlich könnte ein Reagens, das das oben gezeigte Seitenkettendien und eine Gruppe enthält, die mit Thiolatanionen reagiert, ein guter Inhibitor für das kondensierende Enzym sein. Ein Beispiel ist Cerulenin, (2S)(3R)-2,3-Epoxy-4-oxo-7,10-dodecadienoylamid:
- Beispiele für alternative Verbindungen mit verschiedenen funktionellen Gruppen und der Dien- Seitenkette sind nachfolgend gezeigt:
- X = Tosyl, Halogenid oder eine andere Abgangsgruppe
- Der R-Gruppen-Schwanz kann nach dem Artikel von Morisaki et al. [Eur. J. Biochem. 211, 111 (1993)] variieren. Eine Verlängerung oder Verkürzung der Länge der Seitenkette reduziert die inhibitorische Wirkung. Tetrahydrocerulenin ist 80-150mal weniger wirksam als Cerulenin. Dieses Ergebnis stimmt mit der Idee überein, daß π-Elektronen in der Seitenkette bei der Bindung wichtig sind. Ferner sorgen die trans-Doppelbindungen für eine eine Konformationsstarre, was ebenfalls wichtig sein kann.
- In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden Verbindungen eingesetzt, die entweder Acetyl-CoA- Carboxylase, Malatenzym oder Citratlyase inhibieren. Repräsentative Inhibitoren für diese Enzyme sind ebenfalls in Tabelle 2 gezeigt. Die Überlegungen für die Auswahl des jeweiligen Inhibitors sind die gleichen wie oben für FAS-Inhibitoren diskutiert.
- Assays für Acetyl-CoA-Carboxylase werden in US-Patent 5.143.907 gelehrt, das vollinhaltlich Bestandteil dieser Offenbarung ist, und diese Assays können vom Fachmann dazu benutzt werden, um mittels allgemein bekannter Verfahren die Hemmkonstanten für ACC-Inhibitoren zu bestimmen.
- Propanoate, die Acetyl-CoA-Carboxylasen aus diversen Organismen inhibieren, sind bevorzugte Inhibitoren. Die Inhibitoren lassen sich durch die nachfolgend gezeigte allgemeine Struktur darstellen:
- R kann Wasserstoff, Alkyl oder Aryl sein. Die Konfiguration am asymmetrischen Kohlenstoffatom kann. R, S, oder racemisch sein. Die Acetyl-CoA-Carboxylase in Pflanzen ist gegenüber dem R-Isomer häufig sensitiver. R¹ ist häufig Aryl-oxy-aryl:
- Ar-O-Ar-
- Die aromatischen Ringe können Benzol, Pyridin usw. sein. Halogen und andere Substituenten an den aromatischen Ringen sind möglich. Beispiele für Propanoate sind nachfolgend gezeigt und/oder in Tabelle 2 aufgeführt: Fluazifop Diclofop Dichlorprop
- Einige Propanoat-Homologe sind gute Inhibitoren. Ein Beispiel ist TOFA, 5-Tetradecyloxy-2-furancarbonsäure, ein wirksamer Acetyl-CoA-Carboxylase-Inhibitor. Die Struktur ist nachfolgend gezeigt:
- C-2 ist in diesem Fall nicht chiral. Die R-Gruppe ist eine lineare gesättigte Seitenkette mit 14 Kohlenstoffen. Verfahren zur Synthese dieser Verbindung und verwandter Verbindungen, die ebenfalls im Rahmen dieser Erfindung liegen, werden in US-Patent 4.146.623 gelehrt, das vollinhaltlich Bestandteil dieser Offenbarung ist.
- Ein weiteres Beispiel für ein Homologes der Propanoate ist TDGA oder Tetradecylglycidinsäure:
- R = CH&sub3;(CH&sub2;)&sub1;&sub3;-
- Hydrophober Charakter und ein Carboxylkohlenstoff in beta-Stellung zu einem Ethersauerstoff sind gemeinsame strukturelle Merkmale. Andere wichtige 2-substituierte Propanoate umfassen Verbindungen wie Ibuprofen, Ibuproxam und Derivate davon. Ibuprofen
- R = Isobutyl Ibuproxam
- R = Isobutyl
- Ketocyclohexene stellen eine weitere Klasse von Acetyl-CoA-Carboxylase-Inhibitoren dar. Ein Beispiel ist Sethoxydim: Sethoxydim
- worin R eine Ethylthiopropylgruppe ist.
- Eine weitere Klasse von Verbindungen, die Acetyl-CoA- Carboxylasen inhibieren, wird durch die allgemeine Struktur
- dargestellt. Spezielle Beispiele wie Glutarsäure und Pentendicarbonsäuren sind in Tabelle 2 aufgeführt.
- Andere Zielenzyme neben Acetyl-CoA-Carboxylase und FAS umfassen Citratlyase und Malatenzym. Diese Enzyme liefern Acetat und NADPH zur Lipidbiosynthese über FAS. Die jeweiligen Reaktionen sind wie folgt:
- Therapeutische Verbindungen könnten auch auf diesen Inhibitoren basieren, da die Verarmung an Acetyl-CoA oder NADH die Lipidsynthese ebenfalls abbrechen würde.
- Von den Enzymen der Fettsäuresynthese ist FAS das bevorzugte Ziel für eine Inhibierung, da es nur innerhalb des Stoffwechselwegs zu Fettsäuren fungiert, während die anderen drei Enzyme auch an anderen zellulären Funktionen beteiligt sind. Die Inhibierung eines der anderen drei Enzyme beeinträchtigt normale humane Zellen daher mit höherer Wahrscheinlichkeit. Wenn jedoch, wie oben beschrieben, gezeigt werden kann, daß ein Inhibitor für eines dieser Enzyme einen hohen therapeutischen Index besitzt, kann der Inhibitor gemäß der Erfindung therapeutisch eingesetzt werden. Der erfahrene Kliniker ist in der Lage, Inhibitoren für jedes Enzym der Fettsäuresynthese zu verabreichen, um Krebspatienten, die eine solche Behandlung benötigen, auf Basis der nachfolgenden Lehre zu behandeln.
- Die Erfindung sieht keine Verwendung von Inhibitoren vor, die generell eine große Zahl verschiedener zellulärer Enzymsysteme und Stoffwechselwege inhibieren, beispielsweise wie die in US-Patent 5.143.907 offenbarten Phosphitborane oder Iodacetamid, sofern der jeweilige Inhibitor nicht nachweislich eines hohen therapeutischen Index relativ spezifisch für die Lipidbiosynthese gemacht werden kann (beispielsweise als Teil einer der oben diskutierten synergistischen Kombinationen).
- Palmitat ist das Hauptprodukt des Fettsäuresynthase- Stoffwechselwegs. Die Elongation und Oxidation von Palmitat kann für die Produktion notwendiger Membranlipide kritisch sein. Zu diesem Zweck sind die Elongations- und Oxidationsschritte und andere Prozessierungsschritte für Fettsäuren wahrscheinliche molekulare Ziele für Therapeutika. Zum Einbau in Lipide müssen sowohl endogen, synthetisierte Fettsäuren als auch exogene Fettsäuren in der Nahrung zuerst durch Acyl-CoA- Synthase aktiviert werden. Langkettiges Fettsäure-Acyl- CoA ist ein wesentlicher Metabolit für Lebewesenzellen, und daher ist Acyl-CoA-Synthase ein bevorzugtes Ziel.
- Tomoda und Kollegen (Tomoda et al., Biochim. Biophys. Act 921: 595-598 1987; Omura et al., J. Antibiotics 39: 1211-1218, 1986) beschreiben Triacsin C (manchmal als WS-1228A bezeichnet), ein natürlich vorkommender Acyl- CoA-Synthase-Inhibitor, der ein Produkt von Streptomyces sp. SK-1894 ist. Die chemische Struktur von Triacsin C ist 1-Hydroxy-3-(E,E,E-2',4',7'-undecatrienylidin)- triazen. Triacsin C führt bei 8,7 uM zu einer 50%igen Inhibierung von Acyl-CoA-Synthase aus Rattenleber; eine verwandte Verbindung, Triacsin A, inhibiert Acyl-CoA- Synthase nach einem Mechanismus, der für langkettige Fettsäuren kompetitiv ist. Die Inhibierung von Acyl-CoA- Synthase ist für Lebewesenzellen toxisch. Tomoda et al. (Tomoda et al., J. Biol. Chem. 266: 4214-4219, 1991) lehren, daß Triacsin C in Raji-Zellen bei 1,0 uM zu einer Wachstumshemmung führt, und haben außerdem gezeigt, daß es das Wachstum von Vero- und Hela-Zellen hemmt. Tomoda et al. lehren außerdem, daß Acyl-CoA-Synthase in Lebewesenzellen essentiell ist und daß eine Inhibierung des Enzyms tödliche Folgen hat.
- Die Lipidsynthese besteht aus mehreren enzymatischen Schritten. Die Daten zeigen, daß die Inhibierung der Lipidbiosynthese an zwei oder mehr Schritten synergistische Wirkungen erzeugen kann, was sowohl zu einer Senkung der benötigten Konzentration als auch der potentiellen Toxizität jedes einzelnen Mittels führt. Da Acyl-CoA-Synthase ein ubiquitäres Enzym ist, das anscheinend von allen Zellen für ihren dauerhaft gesunden Zustand benötigt wird, sind ihre Inhibitoren potentiell zu toxisch, um allein effektiv als Antikrebsmittel eingesetzt werden zu können. Im Gegensatz dazu erhält man synergistische Effekte, wenn Acyl-CoA-Synthase- Inhibitoren mit Cerulenin, einem spezifischen Fettsäuresynthase-Inhibitor kombiniert werden, wobei jeder Wirkstoff effektiver wird.
- Fettsäuresynthese-Inhibitoren werden bevorzugt in pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert, die den Inhibitor und einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann andere Komponenten enthalten, solange die anderen Komponenten die Wirksamkeit des Synthese-Inhibitors nicht so weit reduzieren, daß die Therapie unwirksam wird. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind allgemein bekannt, und ein Fachmann auf pharmazeutischem Gebiet, kann leicht Träger auswählen, die für die jeweiligen Verabreichungswege geeignet sind (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985).
- Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die einen der Inhibitoren der Erfindung enthalten, können auf parenteralem (subkutan, intramuskulär, intravenös, intraperitoneal, intrapleural, intravesikulär oder intrathekal), topischem, oralem, rektalem oder nasalem Weg verabreicht werden, wie es die Wahl des Wirkstoffs, des Tumortyps und die Lokation des Tumors erfordern.
- Dosis und Dauer der Therapie hängen von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich des therapeutischen Index der Wirkstoffe, des Tumortyps, des Alters der Patienten, des Gewichts der Patienten und der Toxizitätstoleranz. Die Dosis wird im allgemeinen so gewählt werden, daß Serumkonzentrationen zwischen 0,1 ug/ml und 100 ug/ml erreicht werden. Vorzugsweise werden die Mengen der Initialdosis bis zu den maximal tolerierten Mengen auf Basis ihrer Fähigkeit gewählt, Umgebungskonzentrationen zu liefern, von denen gezeigt wurde, daß sie in in-vitro-Modellen, beispielsweise dem, das zur Bestimmung des therapeutischen Index verwendet wurde, und in in-vivo-Modellen und in klinischen Versuchen wirksam sind. Die Standardvorgehensweise in der Onkologie erfordert, daß die Chemotherapie auf den einzelnen Patienten zugeschnitten wird und die Konzentration des Chemotherapeutikums im Blutkreislauf regelmäßig überprüft wird. Die Dosis eines bestimmten Wirkstoffs und die Dauer der Therapie für einen bestimmten Patienten können vom erfahrenen Kliniker unter Berücksichtigung der obigen Faktoren mittels üblicher pharmakologischer Vorgehens weisen bestimmt werden. Die Reaktion auf die Behandlung kann durch Analyse der Fettsäuresynthase-Spiegel im Blut oder in Körperflüssigkeiten, durch Messung der FAS-Aktivität oder der OA-519-Spiegel im Tumorgewebe oder durch Überwachen der Tumorbelastung des Patienten verfolgt werden. Der erfahrere Kliniker wird die Dosis oder die Dauer der Therapie auf Grundlage der Reaktion auf die Behandlung, wie sie sich aufgrund dieser Messungen darstellt, einstellen.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform schützt das erfindungsgemäße Medikament auch normale Zellen von Patienten, die mit Fettsäuresynthese-Inhibitoren behandelt werden. Um nicht-neoplastische normale Gewebe wie Leber (die Fettsäuresynthase-Aktivität üblicherweise innerhalb eines breiten Bereichs exprimieren kann) vor potentieller Toxizität zu schützen, kann die Menge an FAS-Enzym und/oder der Grad der Fettsäuresynthese- Aktivität vor und/oder während der Therapie herunterreguliert werden. Das Herunterregulieren kann durch Zuführen essentieller Fettsäuren in der Diät, durch Reduktion der Kalorienaufnahme oder durch andere wirksame Methoden, beispielsweise Verabreichung von Glucagon, erfolgen.
- Da FAS in normalem Gewebe ein induzierbares Enzym ist, führt die Reduktion der Kalorienaufnahme zu einer geringeren Expression von FAS durch normale Zellen. Die hochvirulenten Tumorzellen exprimieren FAS (OA-519) konstitutiv. Bei einem Patienten mit limitierter Kalorienaufnahme beschränkt sich die FAS-Expression auf Tumorzellen, und die zytotoxische Wirkung von FAS- Inhibitoren ist ähnlich begrenzt. Das Herunterregulieren der FAS-Expression wird üblicherweise an die Therapie mit dem Fettsäuresynthese-Inhibitor gekoppelt, indem die Kalorienaufnahme des Patienten vor und während der Verabreichung des Inhibitors reduziert wird.
- Eine weitere geeignete Methode, um die FAS-Expression zu reduzieren, ist die exogene Verabreichung von Fettsäuren, vorzugsweise von essentiellen Fettsäuren. Diese Fettsäuren können in jeder beliebigen Art und Weise formuliert werden, die zur Herunterregulierung der FAS- Expression von normalen Zellen führt. Dies kann dadurch erfolgen, daß man sie in die Diät des Patienten mit einbezieht, oder indem man sie in derselben pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert wie den Fettsäuresynthese-Inhibitor, oder nach irgendeiner anderen geeigneten Methode.
- Diäten, die sich zur Reduktion der FAS-Expression in normalem Gewebe eignen, sind dem Durchschnittskliniker bekannt. Jede Methode zur Reduktion der FAS-Expression von normalen Zellen liegt im Rahmen des Verfahrens dieser Erfindung, solange der FAS-Spiegel in normalen. Zellen während der Zeit reduziert wird, in der der Fettsäuresynthese-Inhibitor im Patienten in Mengen vorliegt, die für Tumorzellen zytotoxisch sind.
- Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung.
- OA-519-Expression hängt mit einer kürzeren Überlebensdauer bei Brustkarzinom und einer kürzeren Überlebensdauer und krankheitsfreier Überlebensdauer bei Prostata- und Ovarialkarzinomen zusammen.
- Beispiel 7 der Internationen Offenlegungsschrift WO 90/08324 oder der US-Serial No. 07/735.522, die vollinhaltlich Bestandteil der vorliegenden Offenbarung sind, zeigt, daß die OA-519-Expression bei Brustkarzinom mit einem erhöhten Wiederauftreten der Krankheit in Zusammenhang stand. Klinische Untersuchungen bestätigen, daß die OA-519-Expression bei Prostata- und Brustkarzinomen mit einer kürzeren Gesamtüberlebensdauer und bei Ovarialkarzinomen mit einer kürzeren gesamten und krankheitsfreier Überlebensdauer assoziiert ist.
- Patientenpopulation: Eine Anfangsgruppe (Patienten, die zum Zeitpunkt der anfänglichen chirurgischen Behandlung in die Untersuchung aufgenommen wurden) von 135 Frauen mit Brustkrebs wurde durch das Norton Hospital-Tumorregister identifiziert, von denen alle wegen primärem infiltrierendem duktalem Brustkarzinom mit Brustamputation behandelt worden waren. Das durchschnittliche Patientenalter betrug 52 und lag zwischen 32 und 72 Jahren. Die durchschnittliche Nachsorge betrug 12,3 Jahre und lag im Bereich von 10 bis 16 Jahren. Patienten wurden zur Untersuchung zugelassen, wenn postchirurgische Behandlungsbefunde, Todesursache, Überlebensdauer und Paraffinblöcke des primären Tumors für den jeweiligen Patienten zur Verfügung standen. Informationen über Östrogen und Progesteronrezeptoren wurde immunhistochemisch erhalten. Zusätzlich wurden Patientenalter, Dosis und Art der Chemotherapie, Radiotherapie und Hormontherapie dokumentiert. Die Art des infiltrierenden Tumors und der nukleare Grad wurden ebenfalls festgestellt, wobei die Kriterien von Fisher, et al. (Fisher et al., Cancer, 46: 908-918, 1980) zur Anwendung kamen.
- Inununhistochemische Färbung für OA-519: Die immunhistochemische Färbung benutzte monoklonale anti- OA-519-Antikörper aus Hybridomzellen mit der Bezeichnung OA-519-M1 oder HPR-2, die bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 am 26. Juli 1991 unter der ATCC-Zugangsnr. HB 10853 hinterlegt wurden.
- Kurz, der primäre monoklonale anti-OA-519-Antikörper wurde auf den deparaffinierten Gewebe schnitten mit 2,5 ug/ml 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Nach Spülen in Spülpuffer wurden die Objektträger 1 Stunde in 1/400 Kaninchen-anti-Maus-Antikörper (DAKO) inkubiert. Nach einer weiteren Spülung wurden die Objektträger mit Avidin-gekoppelter Meerrettichperoxidase (Vectastain ABC- Kit) 1 Stunde inkubiert. Nach Bildung des Avidin-Biotin- Komplexes wurden die Objektträger in wäßrigem Hämatoxylin inkubiert, mit einer Deckplatte versehen und betrachtet.
- OA-519-Immunreaktivität und Kriterium für Positivität: Positive Färbung war fein-granulär, zytoplasmatisch und heterogen. Darüber hinaus mußte die Färbung entweder bei 100facher Vergrößerung sichtbar sein oder wenigstens 10% der Tumorzellen markieren, damit der Fall positiv gewertet wurde.
- Prognostische Signifikanz der OA-519- Immunreaktivität: Patienten, deren Tumoren positiv für OA-519 färbten, besaßen ein deutlich erhöhtes Risiko, an Brustkrebs zu sterben. Fig. 1 ist eine Lebenstabelle, die das Schicksal von OA-519-positiven und -negativen Patienten zeigt. Beispielsweise waren nach 12 Jahren etwa 37% der OA-519-negativen Patienten gestorben, verglichen mit etwa 85% der OA-519-positiven Patienten.
- Die folgende Tabelle zeigt die Signifikanz der OA-519-Reaktivität nach Stadien:
- Es wurde gefunden, daß die OA-519-Expression auch bei Prostatakrebs mit dem Wiederauftreten der Krankheit im Zusammenhang stand. Patienten, bei denen Prostata- Adenokarzinom diagnostiziert worden war und die daraufhin behandelt worden waren, wurden aus den Akten des Mountain Home VA Medical Center selektiert. Die Population der Untersuchung umfaßte 99 Patienten mit Prostatakrebs in den Stadien A bis D1 gemäß "American Urologie System" (AUS). Informationen zum klinischen Stadium wurde aus den Zusammenfassungen des Tumorregisters oder durch Durchsicht der klinischen Aufzeichnungen erhalten. Patienten wurden aus der Untersuchung ausgeschlossen, wenn sie zum Zeitpunkt der Krankenvorstellung entfernte Metastasen hatten (AUS-Stadium D2), ihr Status bei der letzten Nachsorge unbekannt war oder wenn die gesamte Nachsorge weniger als zwei Jahre betrug.
- Tumoreinstufung: Alle Objektträger wurden überprüft und es wurde ein Gleason-Score bestimmt, indem die Zahlen für die beiden überwiegenden Muster zusammengezählt wurden (Gleason, in Tannenbaum M (Herausg.): Urologie pathology: The prostate. Philadelphia, 1988, Lea & Febiger, S. 171-198). Gleason-Score 2-4 wurde Grad I zugeordnet, Score 5-7 wurde Grad II zugeordnet und Score 8-10 wurde Grad III zugeordnet.
- Ein einzelner repräsentativer Gewebeblock wurde aus jedem Krebs zur immunhistochemischen Färbung ausgewählt. In dieser Untersuchung wurde ein affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper aus Kaninchen gegen gereinigtes OA-519 verwendet. Die Färbung erfolgte an routinemäßig verarbeitetem. Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe. Es wurde die Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Immunperoxidasemethode verwendet, wobei unmarkierter primärer Antikörper eingesetzt wurde. Kurz, 6 mm deparaffinierte und rehydrierte Gewebe schnitte wurden in 5% fettfreier Trockenmilch in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 3% Wasserstoffperoxid enthielt, 20 Minuten inkubiert, um endogene Peroxidase-Aktivität sowie unspezifische Proteinwechselwirkungen zu blockieren. Dann wurden die Objektträger mit affinitätsgereinigtem polyklonalem anti- OA-519 bei 2,7 ug/ml eine Stunde bei Raumtemperatur in PBS bei pH 7,2 inkubiert. Unter zwischenzeitlichem Waschen mit PBS wurden die Schnitte nacheinander mit biotinyliertem Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin, verdünnt 1 : 200 in PBS (Vector Laboratories), und Avidin- Meerrettichperoxidase-Komplex (Vectastain®, Vector Laboratories) jeweils 30 Minuten bei 22ºC inkubiert. Aminoethylcarbazol (AEC) (Vector Laboratories) wurde als Chromogen mit Mayers Hämatoxylin-Kontrastfärbung verwendet. Für die negativen Kontrollen wurde der primäre Antikörper für jeden Fall durch PBS ersetzt. Ein bekannter positiver anti-OA-519-Fall wurde bei jedem Versuch als positive Kontrolle verwendet.
- Die Färbung wurde als positiv für OA-519-Epitope definiert, wenn (1) die Immunreaktivität bei niedriger Vergrößerung (100x) sichtbar war, (2) granuläre zytoplasmatische Färbung ohne wahrnehmbare nukleare Färbung vorlag und (3) die Färbung heterogen war (d. h. die Stärke der Reaktivität von Zelle zu Zelle und von Bereich zu Bereich variierte). Tumoren wurden als positiv oder negativ klassifiziert. Eine positive Färbung für OA-519 war bei 56 (57%) der 99 untersuchten primären Prostatakarzinome zu beobachten.
- Die mittlere gesamte Nachsorgedauer betrug 4,17 Jahre (Bereich: 2,01-9,33). Bei 19 (19%) Patienten trat der Prostatakrebs wieder auf oder schritt fort. Fortschreiten wurde als Auftreten lokaler oder metastatischer Krankheit nach "heilender" Behandlung" definiert, beispielsweise radikaler Prostatektomie oder Bestrahlung, oder als Fortschreiten im Stadium der Krankheit bei Patienten, die durch Hormontherapie oder in deren Erwartung behandelt worden waren. Die durchschnittliche Zeit bis zum Fortschreiten der Krankheit betrug 2,54 Jahre (Bereich: 0,67-5,85).
- In der OA-519-negativen Gruppe gab es vier (9%) Fälle des Fortschreitens der Krankheit, verglichen mit 15 (27%) in der OA-519-positiven Gruppe (Kaplan-Meier-Plot, gezeigt in Fig. 24-1). Der Unterschied zwischen diesen Gruppen im Verhältnis von Krebs, der fortschritt, war statistisch signifikant (Wilcoxon und Rangsummentests ("Log Rank Tests") (P < 0,009) und Fisher's exakter Test (P < 0,04)). OA-519 war ein besonders wertvoller Prognoseindikator bei Prostatakrebserkrankungen niederen und mittleren Grades, bei denen der histologische Grad nach Gleason-Score kein signifikanter Prognoseindikator war (Daten nicht gezeigt).
- Eine Untersuchung an Ovarialkarzinomen durch Kacinski et al. ist im Gange, wobei der gleiche Antikörper, das gleiche Färbeverfahren und die gleiche Interpretation wie in der obigen Untersuchung zu Brustkarzinomen zur Anwendung kamen. Wie in Fig. 2B gezeigt, gibt es jedoch basierend auf einer bis jetzt für 34 Patienten abgeschlossenen Analyse einen Zusammenhang zwischen der OA-519-Expression und einer geringeren krankheitsfreien und gesamten Überlebensdauer.
- OA-519-Expression war, wie in Beispiel 1 gezeigt, bei frühem Brustkrebs stark prognostisch. Dieses Prognosepotential war unabhängig vom prognostischen Leistungsvermögen von Östrogen- und Progesteronrezeptoren. Erhöhte Expression von OA-519 bei humanem Brustkarzinom ergab eine signifikant verschlechterte Prognose, gemessen entweder am Wiederauftreten der Krankheit oder an der Gesamtüberlebensdauer. Bei einer klinischen Untersuchung von 135 Patienten mit Brustkarzinomen der Stadien I-III (Martin et al., Manuskript in Vorbereitung) zeigte eine multivariate proportionale Gefährdungsanalyse nach Cox, daß die Expression von OA-519 und von Progesteronrezeptor ungeachtet des Stadiums sehr stark und unabhängig mit einer ungünstigen Überlebensdauer assoziiert war (univariates relatives Risiko 4,860 bzw. 0,070; multivariates relatives Risiko 2,567 bzw. 0,153).
- Das prognostische Leistungsvermögen der OA-519- Expression wird durch die anliegenden Kaplan-Meier-Plots (Fig. 1 und 1A) näher erläutert. Fig. 1 zeigt, daß ungefähr 10% der OA-519-positiven Patienten 15 Jahre überlebten, verglichen mit etwa 50% der OA-519-negativen Patienten. Fig. 1A zeigt graphisch die verbesserte prognostische Stratifikation, wenn die beiden unabhängigen prognostischen Marker, OA-519 und Progesteronrezeptor, kombiniert werden. Dies erlaubt eine Stratifikation der Patienten in eine OA-519-positive, Progesteronrezeptor-negative Hochrisikogruppe (88% gestorben), eine OA-519-negative/Progesteronrezeptor- positive Gruppe mit niedrigem Risiko (5,4% gestorben) und eine mittlere Risikogruppe (63% gestorben).
- Unter den Markern, die von dieser Untersuchung erfaßt wurden, war OA-519 unabhängig von der p185neu- und Cathepsin D-Expression. Interessanterweise war die OA-519-Expression nicht mit der Tumorzellproliferation, wie bestimmt mittels "Proliferating Cell Nuclear Antigen". In einer getrennten Untersuchung von OA-519- Expression und S-Phase, bestimmt mittels Durchflußzytometrie, zeigte OA-519-Expression auch keine Verbindung mit der S-Phase-Fraktion (Shurbaji et al., Lab Invest., 68: 69A, 1993). Daher konnte die OA-519- Expression mit den oben erwähnten oder irgendwelchen anderen unabhängigen prognostischen Markern eingesetzt werden, um die Stratifikation der Patientenpopulation zu verbessern.
- OA-519, das aus einer humanen Brustkarzinom-Zellinie gereinigt wurde, besitzt - bezogen auf eine interne Peptidsequenz von OA-519, die durch Elektroblotting eines limitierten proteolytischen Verdaus von OA-519 und anschließende Mikrosequenzierung direkt von der PVDF- Membran erhalten wurde - eine Peptidsequenzhomologie mit der Fettsäuresynthase von Ratten.
- OA-519 wurde wie in Fig. 2C gezeigt aus der humanen Brustkarzinom-Zellinie ZR-75-1 gereinigt. Die Figur zeigt ein 4-8%iges SDS-PAGE-Gradienten-Gel eines Proteinpräparats in verschiedenen Reinigungsstadien. Die rechte Platte ist mit Coomassie Blue gefärbt und die linke Platte ist ein Western-Blot unter Verwendung affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper gegen das in Fig. 3A gezeigte Peptid.
- Humane Brustkarzinomzellen ZR-75-1 wurden in Medium bis nahe Konfluenz gezüchtet. Konfluente Monolayer wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült, dann abgeschabt, durch Zentrifugation geerntet und eingefroren aufbewahrt.
- Zu jedem Aliquot von etwa 1,5 · 10&sup7; Zellen wurden 10 ml Reinigungspuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5 bei 4º, 1 mM EDTA, 0,1 mM Diisopropylfluorphosphat, 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) zugegeben. Die Zellen wurden mit 10 Schlägen eines Dounce-Homogenisators homogenisiert, anschließend wurde durch 30 Minuten Zentrifugation bei 16.000 · g bei 4ºC ein klarer Überstand erhalten (Spur L von Fig. 2C wurde mit geklärtem hypotonischem Lysat von ZR-75-1 beladen).
- Eine Sephacryl S-200 Gelfiltrationssäule (Pharmacia), 2,5 · 90 cm, wurde mit Reinigungspuffer, pH = 8,0, der 1 mM β-Mercaptoethanol und 100 mM KCl enthielt, äquilibriert. ZR-75-1-Lysat wurde durch 0,45 mM-Filter filtriert und anschließend mit 25 ml/h auf die Säule geladen. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE mit einem Coomassie-gefärbten 4%-Gel auf Anwesenheit eines 270.000 Da-Polypeptids analysiert. Die Anwesenheit des Polypeptids kann gegebenenfalls durch Western-Blotting mit entweder polyklonalen Antikörper, der für ein wie in Fig. 3A gezeigtes Peptid oder anti-OA-519-Protein spezifisch ist, bestätigt werden, wobei die Blots mit ¹²&sup5;I-protein A entwickelt wurden. (Spur G von Fig. 2C wurde mit gepoolten Fraktionen aus der Gelfiltrationssäule beladen.)
- Positive Fraktionen aus der Sephacryl-Säule wurden gepoolt, mit einem gleichen Volumen Reinigungspuffer plus 1 mM β-Mercaptoethanol verdünnt und anschließend auf eine voräquilibrierte Mono-Q HR 5/5-HPLC- Anionenaustauschersäule (Pharmacia) geladen. Die Säule wurde bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 1 ml/min mit 15 ml Reinigungspuffer plus 1 mM β-Mercaptoethanol gewaschen, mit einem linearen 60 ml-Gradienten 60 min bis zu einer Endkonzentration von 1 M KCl eluiert und dann mit 5 ml Reinigungspuffer mit 1 M KCl plus 1 mM β- Mercaptoethanol gewaschen. Fraktionen, die das Polypeptid enthielten, wurden mittels SDS-PAGE selektiert, wobei Coomassie-gefärbte 4%-Gele verwendet wurden (Spur A in Fig. 2C wurde mit gepoolten Fraktionen aus der Anionenaustauschersäule beladen.) Fraktionen, die gereinigtes, als OA-519 bezeichnetes Polypeptid enthielten, wurden gepoolt und entsprechend dem späteren experimentellen Bedarf weiter verarbeitet. Charakteristische Ausbeuten lagen grob bei 1 mg OA-519 pro 2 · 10&sup7; Zellen mit einer Reinheit von 98% oder höher, abgeschätzt mittels Coomassie-gefärbten SDS- Polyacrylamidgelen.
- Es wurde ein abschließender Chromatographieschritt mit Hydroxyapatit angeschlossen, um eine Reinheit von größer 99% zu erreichen, wobei ein "Bio-Rad MAPS Analytical HPHT Cartridge" eingesetzt wurde. Bei Verwendung eines 0-600 mM-Phosphat gradienten eluiert OA-519 in einem Peak bei 200 mM Phosphat.
- Gereinigtes OA-519 wurde in 50 mM Ammoniumbicarbonat, pH 8,0, dialysiert und mit einer 1 : 50-Verdünnung von Endoproteinase-Glutamat C (V8-Protease) 15 Minuten bei 37ºC proteolytisch gespalten. Die Peptide wurden auf 4%-Laemmli-Gelen einer SDS-PAGE unterzogen und auf PVDF- Membranen (BioRad) transferiert und anschließend direkt von den PVDF-Membranen sequenziert, wobei ein automatisierter Edman-Abbau mit einem Gasphasensequenzierer von Applied BioSystems eingesetzt wurde (Matsudaira, P. T., "A Practical Guide To Protein and Peptide Purification for Micro-Sequencing", Academic Press, New York, 1989).
- Limitierte proteolytische Spaltung lieferte zwei größere Peptide von etwa 150 und 134 kD. Das 150 kD- Peptid hatte einen blockierten N-Terminus und stellte somit das N-terminale OA-519-Peptid dar. Die N-terminale Sequenz wurde aus dem internen 134 kD-Peptid erhalten, das - wie in Fig. 3B zu sehen - über einen Strang von 13 Aminosäuren eine 84,6%-Homologie mit Fettsäuresynthase von Ratten zeigte. OA-519 besitzt also eine strukturelle Homologie mit Fettsäuresynthase, ebenfalls ein Molekül mit etwa 270 kD.
- OA-519, gereinigt aus der humanen Brustkarzinom- Zellinie ZR-75-1, besitzt Fettsäuresynthase-Aktivität basierend auf seiner Fähigkeit, Acetyl-Coenzym A und Malonyl-Coenzym A in Gegenwart von NADPH in Fettsäuren einzubauen, eine Reaktion, die für Fettsäuresynthase spezifisch ist (Wakil, S. J., Biochemistry, 28: 4523-4530, 1989). Diese Reaktion ist spezifisch für Fettsäuresynthase. Fettsäuresynthese durch OA-519 wurde durch Einbau von C-Malonyl-Coenzym A in Fettsäuren, anschließende Veresterung der Fettsäuren und Analyse mittels "Reversed-Phase"-Dünnschichtchromatographie gezeigt.
- Einbau von C-Malonyl-Coenzym A in Fettsäuren durch OA-519: OA-519 wurde wie in Beispiel 2 beschrieben gereinigt, außer daß Proteaseinhibitoren weggelassen wurden, da sie den letzten Schritt des Synthase-Assays beeinträchtigen. 4,2 ug OA-519 in 20 ul 20 mM Tris-HCl, 270 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7,5 bei 25ºC wurden zu folgender Reaktionsmischung gegeben: 75 nanomol NADPH; 25 nanomol Acetyl-Coenzym A; 16,6 ul 1 M Kaliumphosphat, pH 6,6 bei 25ºC; und 97 ul Wasser in HPLC-Reinheit auf ein Gesamtvolumen von 150 ul. Die Reaktionsmischung wurde gevortext und es wurden 5 ul ¹&sup4;C-Malonyl-Coenzym A (20 uCi/ml; 51 mCi/mM) und 25 nanomol Malonyl-Coenzym A zugegeben. Nach Vortexen wurde die Reaktionsmischung bei 37ºC 20 Minuten inkubiert und durch Zugabe von 1 ml Chloroform : Methanol, 1 : 1, gestoppt.
- Methylveresterung von ¹&sup4;C-Fettsäuren: Vor der dünnschichtchromatographischen Auftrennung der ¹&sup4;C-Fettsäuremischung wurden mit dem Verfahren mit methanolischer Schwefelsäure Methylester der ¹&sup4;C-Fettsäuren hergestellt. Die Chloroform : Methanol- Reaktionsmischung wurde gevortext und dann 30 Minuten geschüttelt. Nach der Zentrifugation wurde der überstand unter N&sub2; getrocknet. Die getrockneten Lipide wurden zweimal mit 400 ul wasserhaltigem n-Butanol : HPLC-Wasser (1 : 1) extrahiert, gepoolt, gewaschen und unter N&sub2; getrocknet. Zur Synthese der Methylester wurden 0,75 ml 2%ige Schwefelsäure in Methanol zu den getrockneten Fettsäuren gegeben, es wure mit N&sub2; begast und 2 h bei 70ºC inkubiert. Nach Zugabe von 0,75 ml HPLC-reinem Wasser wurden die ¹&sup4;C-Fettsäuremethylester zweimal mit 1,5 ml Pentan extrahiert, mit 0,5 ml HPLC-Wasser gewaschen und getrocknet.
- Die ¹&sup4;C-Fettsäuremethylester wurden abgetrennt und mittels "Reversed-Phase"-Dünnschichtchromatographie wie folgt identifiziert. "Reversed-Phase"- Dünnschichtchromatographie-Platten (20 · 20 cm, Analtech) wurden im Vakuumofen bei 80ºC 20 Minuten gebacken. Getrocknete ¹&sup4;C-Fettsäuremethylester und Standards wurden in 20 ul Chlorform : Methanol (9 : 1) resuspendiert, auf getüpfelt und in Chloroform : Methanol : Wasser (5 : 15 : 3) Chromatographiert. Nicht-radioaktive Standards wurden mit Cyclodextrinspray in Ioddampf sichtbar gemacht. ¹&sup4;C-Fettsäuremethylester wurden mit einem Bioscan System 2000-Bildscanner mit Autochanger 3000 nachgewiesen.
- Ergebnisse: OA-519 synthetisierte 85% Palmitat (gesättigte Fettsäure mit 16 Kohlenstoffen) mit etwa 6% Myristat und 8% Stearat (gesättigte Fettsäuren mit 14 bzw. 18 Kohlenstoffen) (Fig. 4). Diese Daten zeigen, daß OA-519 Fettsäuresynthase-Aktivität besitzt, indem sie die Bildung vollständiger Fettsäuren aus ¹&sup4;C-markiertem Malonyl-CoA zeigen. Das Verhältnis der produzierten Fettsäuren ist ähnlich dem der Fettsäuresynthase aus menschlicher Leber, aber deutlich verschieden von dem der Fettsäuresynthase aus milchbildender menschlicher Brust (34% Stearat, 33% Palmitat, 16% Myristat).
- Die spezifische Aktivität von gereinigtem OA-519 wurde spektrophotometrisch bestimmt, indem die Oxidation von NADPH bei 340 nm in Gegenwart von Acetyl-Coenzym A und Malonyl-Coenzym A verfolgt wurde. OA-519 hat eine spezifische Aktivität von 586 nanomol oxidiertes NADPH/min/mg Protein, was verglichen mit dem Wert von 404, der für menschliche Leber erhalten wird, günstig ist.
- Spektrophotometrische Untersuchungen mit OA-&sup5;¹&sup9;FAS zeigten, daß der apparente Km-Wert von 86,2 · 10&supmin;&sup5; für Malonyl-CoA höher war als die Literaturwerte, die für die Brustdrüse von Ratten oder Kaninchen (1,3 · 10&supmin;&sup5; bzw. 2,9 · 10&supmin;&sup5; M) (Smith et al., Methods Enzymol., 35: 65-74, 1975; Dils et al., Methods Enzymol., 35: 74-83, 1975) oder für die Synthase aus der humanen Brustkrebs-Zellinie SKBR-3 (1,8 · 10&supmin;&sup5; M) (Thompson et al., Biochim. Biophys. Acta, 662: 125-130, 1981) angegeben werden. Der Km-Wert für die gereinigte Synthase aus normalem menschlichen Gewebe wurde nicht beschrieben. Im Gegensatz zu den Km- Werten war die spezifische Aktivität von 624 nanomol oxidiertes NADPH/min/mg Protein ähnlich der beschriebenen spezifischen Aktivität von Fettsäuresynthasen, die aus einer Reihe verschiedener Quellen einschließlich menschlicher Leber gereinigt wurden (Roncari, Methods Enzymol., 71: 73-39, 1981).
- Cerulenin ist ein spezifischer Inhibitor der Aktivität des kondensierenden Enzyms der Fettsäuresynthase, wie von Funabashi, et al., J. Biochem., 105: 751-755, 1989, gezeigt wurde. Der Wirkstoff Melarsoprol ist eine trivalente Arsenverbindung;
- trivalente Arsenverbindungen reagieren mit benachbarten Thiolgruppen. Fettsäuresynthase-Aktivität benötigt mehrere reduzierte Thiolgruppen, die als Target für die Inhibierung durch Melarsoprol dienen.
- Mit gereinigtem OA-519 im spektrophotometrischen Enzymassay wurde gezeigt, daß Cerulenin ein nichtkompetitiver Inhibitor der OA-519-Fettsäuresynthase- Aktivität ist.
- Spektrophotometrischer Fettsäuresynthase-Assay: Der Fettsäuresynthase-Assay wurde in einem Gesamtvolumen von 451 ul mit folgenden Komponenten durchgeführt: 18,88 ug gereinigte OA-519-Fettsäuresynthase aus der Brustkarzinom-Zellinie ZR-75-1, wie in Beispiel 2 beschrieben, 25 nanomol Acetyl-CoA, 75 nanomol NADPH und 50 ul 1 M Kaliumphosphat, pH 6,6 bei 25ºC. Das Substrat Malonyl-CoA wurde in Konzentrationen von 0,5 und 0,6 uM in Gegenwart von 0, 9,9, 148, 198 oder 397 uM Cerulenin zugegeben. HPLC-reines Wasser wurde für alle Assays bis zu einem Endvolumen von 451 ul zugegeben.
- Das Enzym, NADPH, Acetyl-CoA, Phosphat, Cerulenin und Wasser wurden vereinigt, gevortext und in einem Beckman DU 650-Spektrophotometer bei 37ºC inkubiert. Die Oxidation von NADPH wurde bei 340 nm ohne Substrat 2 Minuten verfolgt, um den Background zu bestimmen. Dann wurde Malonyl-CoA in die Reaktionsküvette gegeben, gemischt und bei 37ºC inkubiert, wobei die NADPH- Oxidation in Abständen von 10 Sekunden über insgesamt 2 Minuten bei 340 nm im Spektrophotometer bestimmt wurde. Alle Bestimmungen erfolgten doppelt.
- Ergebnisse: Die spektrophotometrischen Daten wurden entsprechend Dixon (Dixon, M., Biochem. J., 55: 170-171, 1953) auf getragen, wobei die Inhibitorkonzentration gegen 1/V für jede gegebene Substratkonzentration aufgetragen wird. Die Analyse in Fig. 5 zeigt, daß Cerulenin die OA-519-Fettsäuresynthase mit einem apparenten Ki-Wert von 32 uM für das Substrat Malonyl-CoA inhibiert. Die Inhibierung scheint auch nicht-kompetitiv zu sein, wie für Cerulenin beschrieben wurde (Funabashi, et al., J. Biochem., 105: 751-755, 1978), da sich die Kurven an der Abszisse schneiden.
- FAS-Inhibitoren sind wachstumshemmend für Karzinomzellen, aber nicht für normale Zellen. OA-519 wird in Brustkarzinomen mit schlechter Prognose überexprimiert, aber in normalem Gewebe wird wenig OA-519-Expression festgestellt. Mit in vitro- Standardassays für die Wachstumshemmung wurde gezeigt, daß zwei Inhibitoren von OA-519, Cerulenin und Melarsoprol, antiproliferativ auf Karzinomzellen wirkten, aber nur geringe Wirkung auf normale humane Fibroblasten hatten.
- Für die OA-519-Inhibierung wurden die In vitro-Assays für die Wachstumshemmung mit ZR-75-1-Zellen oder normalen humanen Fibroblasten durchgeführt, die bis zur Konfluenz gezüchtet wurden, und dann wurden 25.000 Zellen in 1 : 1 konditioniertem : frischem Medium (RPMI mit 10% fötalem Kälberserum), supplementiert auf physiologischem Niveau mit 0,5 mM Ölsäure, die zuvor an delipidisiertes Rinderserumalbumin gebunden worden war, ausplattiert. Man ließ die Zellen anhaften und über Nacht wachsen. Zum Zeitpunkt 0 wurden die in RPMI-Medium mit 10% fötalem Kälberserum verdünnten Wirkstoffe zugegeben, um die folgenden Konzentrationen zu erreichen: 50 ug/ml bis 0,01 ug/ml mit zweifachen Verdünnungen in Reihe, einschließlich Kontrollen ohne Wirkstoff und leeren Vertiefungen. Jede Konzentration wurde vierfach getestet und Zeitpunkte wurden bei 4, 8, 24 und 48 Stunden genommen. Nach der Behandlung mit Wirkstoff wurden die Zellen mit Kristallviolett gefärbt, in SDS solubilisiert und an einem automatischen Molecular Diagnostics- Plattenlesegerät bei 570 nm gelesen.
- Fig. 6 zeigt, daß normale humane Fibroblasten bei einer Ceruleninkonzentration von 6,25 ug nicht vom Wirkstoff beeinträchtigt wurden, während das Wachstum der ZR-75-1-Zellen bei 48 h über 80% gehemmt war. Die Anwesenheit von Ölsäure im Kulturmedium verhinderte bei normalen Fibroblasten eine Wachstumshemmung durch Cerulenin, nicht aber in den Brustkarzinomzellen. In ähnlichen Experimenten ohne Ölsäure-Supplementierung wurde sowohl das Wachstum von Brustkarzinomzellen als auch das von normalen Pibroblasten gehemmt.
- Fibroblasten mit verschwindend geringer OA-519- Synthase-Aktivität sind gegenüber Ceruleninkonzentrationen resistent, die das Wachstum von Brustkarzinomzellen mit hoher OA-519-Aktivität um mehr als 80% hemmen. Um zu zeigen, daß Karzinoma-Zellinien, die OA-519 exprimieren, sensitiv gegenüber OA-519- Inhibitoren sind, während die mit geringer OA-519- Aktivität resistent sind, wurden mehrere Brust-, Prostata-, Lungen- Colon- und Ovarialkarzinom-Zellinien und normale Fibroblasten untersucht, wobei OA-519- Synthase-Aktivität und Wachstumshemmung durch Cerulenin in Korrelation gesetzt wurden. Der Zusammenhang zwischen Wirkstoff-Sensitivität und OA-519-Enzymaktivität galt für alle Zelltypen.
- OA-519-Fettsäuresynthase-Aktivität: Für jeden Zelltyp wurden dreimal 200.000 Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen plattiert und über Nacht wachsen gelassen.
- Die Zellen wurden dann abgekratzt, pelletiert und bei -80ºC eingefroren, bis sie auf OA-519-Enzymaktivität getestet wurden.
- Zur Bestimmung der OA-519-Fettsäuresynthase-Aktivität wurde ein modifizierter Assay verwendet, um die Empfindlichkeit, mit der der Einbau non ¹&sup4;C-Malonyl- Coenzym A in Fettsäure gemessen werden konnte, im Vergleich zu dem in Beispiel 3 verwendeten spektrophotometrischen Assay zu erhöhen. Nach hypotonischer Lyse der eingefrorenen Zellpellets in 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 bei 25ºC, und 10 Minuten Zentrifugation bei 14.000 · g werden 20 ul Lysat zu einer Reaktionsmischung mit 75 nanomol NADPH; 25 nanomol Acetyl-Coenzym A; 16,6 ul 1 M Kaliumphosphat, pH 6,6 bei 25ºC und 97 ul HPLC-reinem Wasser im Gesamtvolumen von 150 ul gegeben. Nach Vortexen wurden 2 ul ¹&sup4;C-Malonyl-Coenzym A (20 uCi/ml; 51 mCi/millimol) und 25 nanomol Malonyl-Coenzym A zugegeben und gevortext. Die Reaktionsmischung wurde 20 Minuten bei 37ºC inkubiert und durch Zugabe von 1 ml Chloroform : Methanol im Verhältnis 1 : 1 gestoppt.
- Die Chloroform : Methanol-Reaktionsmischung wurde gevortext und 30 Minuten geschüttelt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand unter N&sub2; getrocknet. Die getrockneten Lipide wurden zweimal mit 400 ul wasserhaltigem n-Butanol : HPLC-reinem Wasser (1 : 1) gepoolt, gewaschen, unter N&sub2; getrocknet und die ¹&sup4;C-Impulse wurden gezählt.
- Assay auf Wachstumshemmung: Die anti-proliferative Aktivität von Cerulenin für jede Zellinie wurde bestimmt, indem der gleiche Assay und die gleiche Wirkstoffkonzentration wie in Beispiel 5 verwendet wurden, außer daß keine Ölsäure zugegeben wurde und ein einziger Zeitpunkt von 24 h genommen wurde.
- Fig. 7 zeigt den Zusammenhang zwischen OA-519- Enzymaktivität und Sensitivität von Karzinomzellen gegenüber dem Inhibitor Cerulenin. Bei einer Enzymaktivität von weniger als 4 picomol in Fettsäure eingebautes Malonyl-CoA pro 200.000 Zellen pro Minute wurden weniger als 50% der Zellen im Wachstum gehemmt (mit Ausnahme der Lungenkarzinom-Zellinie H125, 11,6 picomol pro Minute und 48% Hemmung). Im Gegensatz dazu zeigten die meisten Zellinien bei einem Einbau von mehr als 7 picomol Malonyl-CoA in Fettsäure pro 200.000 Zellen pro Minute eine mehr als 50%ige Wachstumshemmung. Eine erhöhte OA-519-Enzymaktivität ist also mit einer erhöhten Sensitivität gegenüber der anti-proliferativen Aktivität von Cerulenin assoziiert. Zellen mit erhöhter OA-519- Enzymaktivität scheinen auf den OA-519-Fettsäuresynthase- Stoffwechselweg angewiesen zu sein.
- Tabelle 3 führt eine Gruppe von 10 humanen Zellinien mit hoher, mittlerer und niedriger Enzymaktivität auf, die zusammen mit humanen Embryofibroblastenlinien in den hier beschriebenen Experimenten eingesetzt wurden.
- OA-519-Synthase-Aktivität: Für jeden Zelltyp wurden dreimal 200.000 Zellen in Standardplatten mit 24 Vertiefungen plattiert, über Nacht wachsen gelassen, abgekratzt, pelletiert und bei -80ºC eingefroren. Nach hypotonischer Lyse der eingefrorenen Zellpellets in 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 bei 25ºC, wurden 20 ul Lysat und anschließend ¹&sup4;C-Malonyl-CoA zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde 20 min bei 37ºC inkubiert und durch Zugabe von 1 ml Chloroform : Methanol im Verhältnis 1 : 1 gestoppt. Nach einer 30-minütigen Extraktion wurden die Lipide unter N&sub2; getrocknet, zweimal mit 400 ul wasserhaltigem n-Butanol : Wasser, 1 : 1, extrahiert, gepoolt, gewaschen, unter N&sub2; getrocknet und es wurden die ¹&sup4;C-Impulse gezählt. Die Aktivität wurde auf die Zellzahl oder auf gesamtes Zellprotein normiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Charakteristiken der in den In-Vitro- Experimenten verwendeten Zellinien
- a. fmol in Fettsäuren eingebautes ¹&sup4;C-Malonyl-CoA pro 200.000 Zellen pro Minute
- b. fmol in Fettsäuren eingebautes ¹&sup4;C-Malonyl-CoA pro ug Protein pro Minute
- Weitere Assays wurden durchgeführt, um festzustellen, ob erhöhte FAS-Spiegel mit erhöhter Gesamtfettsäure- Biosynthese korreliert waren. Weil Acetyl-CoA- Carboxylase, das geschwindigkeitsbestimmende Enzym im Stoffwechsel, benachbart zur Fettsäuresynthase liegt, kann die Acylglycerid-Produktion aus ¹&sup4;C-Acetat als verlässlicher Indikator der Gesamtstoffwechselaktivität bestimmt werden.
- Messung des Einbaus von endogener Fettsäure in Acylglyceride: Zur Analyse nichtpolarer und polarer Lipide wurden für jeden Zelltyp dreimal 200.000 Zellen ausplattiert. Nach Wachstum über Nacht wurde jede Vertiefung mit Zellen 2 Stunden mit 1 uCi ¹&sup4;C-Acetat inkubiert. ¹&sup4;C-markierte Lipide wurden wie oben extrahiert und unter N&sub2; getrocknet. Zur Analyse nichtpolarer Lipide wurden die Proben in 10 ul Chloroform resuspendiert und auf ein N-HR-Silikagel (Brinkmann) getüpfelt und in Hexan : Ethylether : Essigsäure, 65 : 25 : 4 im Volumen, chromatographiert. Cholesterin, Palmitinsäure, Tripalmitin und Cholesterinpalmitat (Matreya) wurden mit jeweils 50 ug als Kontrollen laufen gelassen. Zur Analyse polarer Lipide wurden die Proben auf ein 6A-Silikagel (Whatman) getüpfelt und in Hexan : Ethylether : Essigsäure, 90 : 10 : 1 im Volumen, chromatographiert. Jeweils 50 ug Cholesterin, Phosphatidylethanolamin, Licithin und Lysolecithin (Matreya) wurden als Kontrollen laufen gelassen. Die ¹&sup4;C-markierte Lipide wurden mit einem Bioscan System 2000-Bildscanner mit Autochanger 3000 nachgewiesen und quantifiziert. Nicht-radioaktive Standards wurden mit Rhodaminspray unter Ultraviolettlicht sichtbar gemacht. Die Fehlerbalken auf Fig. 8 stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar. Phosphatidylcholin und Triglyceride waren die überwiegend nachgewiesenen Acylglyceride.
- Wie in Fig. 8 gezeigt, korreliert die FAS-Aktivität (gemessen durch ¹&sup4;C-Malonyl-CoA-Einbau in Gesamtlipid) stark (r² = 0,93) mit der Gesamtfettsäure- Biosyntheseaktivität (gemessen durch die Geschwindigkeit des ¹&sup4;C-Acetat-Einbaus in Acylglyceride). Wichtigerweise zeigte die TLC-Analyse, daß während dem zeitlichen Verlauf des Experiments der größte Teil des ¹&sup4;C-Acetats bei variablen Mengen an Triglyceriden und Phosphatidylethanolamin in Phosphatidylcholin eingebaut wurde. Es wurden keine ¹&sup4;C-markierten Cholesterinester, freien Fettsäuren oder Phosphatidylserin nachgewiesen. Diese Daten bedeuten, daß (a) eine erhöhte FAS-Aktivität eine erhöhte Gesamtfettsäuresynthese anzeigt, (b) Phosphatidylcholin, eines der wichtigsten Membranlipide, das vorherrschende Endprodukt von FAS war und (c) die Aktivität von Acetyl-CoA-Carboxylase und Malatenzym, die in normalen Zellen mit FAS co-reguliert ist, in diesen Zellen ebenfalls erhöht sein kann.
- cDNA aus einer ZR-75-1-Genbank lieferte eine 1,6 kb- Sonde, pFAS 1.6, die -85% Nukleotididentität mit den 3'-Sequenzen der cDNA von Fettsäuresynthase aus Ratten zeigte. Auf Northern-Blots von Gesamt-RNA von ZR-75-1 hybridisierte diese Sonde mit einem einzigen Messenger mit etwa 9,5 kb (Daten nicht gezeigt). Eine In situ- Hybridisierung auf OA-519 in Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten ZR-75-1- und humanen DU-4475- Fibroblatenzellen mit Digoxigenin-markierten Ribosonden, die aus pFAS 1.6 in Bluescript II stammten, ist in Fig. 9 gezeigt. Die linke Platte ist Antisense, während die Rechte Platte die Sense-Kontrolle ist. Antisense- Ribosonden, die aus FAS 1.6 generiert wurden, lieferten ein wesentlich stärkeres Hybridisierungssignal mit ZR-75-1-Zellen als mit DU-4475-Zellen (Fig. 9), was zeigt, daß Messengermengen und Proteinmengen konkordant waren. Zellen, die OA-519 exprimieren, können also entweder durch Immunhistochemie oder durch in situ- Hybridisierung nachgewiesen werden.
- Diese Daten lassen zusammengenommen vermuten, daß die Überexpression von OA-519 auf erhöhte Messengermengen zurückgeht, die entweder auf einer erhöhten transkriptionellen Aktivierung oder auf einer längeren Messengerstabilität beruht. Die erhöhten OA-519-Spiegel waren wahrscheinlich nicht auf eine längere Halbwertszeit des OA-519-Proteins zurückzuführen, da die Überexpression des OA-519-Proteins von einer Überexpression des OA-519- Messengers begleitet war. In ähnlicher Weise zeigten Experimente, bei denen äquivalente pFAS 1.6- Hybridisierungssignale auf Southern-Blots von Zellinien gefunden wurden, die in der OA-519-Expression stark verschieden waren, daß die Überexpression wahrscheinlich nicht auf eine Genamplifikation zurückzuführen war.
- Fig. 10 zeigt eine immunhistochemische Färbung mit affinitätsgereinigten, gegen, natives OA-519 gerichteten polyklonalen Kaninchenantikörpern auf einem Formal infixierten, in Paraffin eingebetteten Schnitt von infiltrierendem Ductuskarzinom. OA-519 wurde mittels üblicher Biotin-Avidin-Immunhistochemie mit Diaminobenzidin als Chromogen nachgewiesen. Die Spezifität der FAS-Expression ist in Fig. 10 gezeigt. Das Zytoplasma der infiltrierenden Brustkrebszellen reagierte stark mit anti-OA-519-Antikörpern, während der angrenzende Rand von histologisch normalen Brustepithel- und Stromazellen nicht reaktiv war. Zu beachten ist die intensive Braunfärbung im Zytoplasma der Tumorzellen, die eine OA-519-Expression anzeigen, während der normale Brust-Ductus und -Lobulus (Pfeile) und die Brust-Stoma negativ waren. Diese differentielle Expression von Fettsäuresynthase zwischen Krebszellen und normalen Zellen bildet die Grundlage der potentiellen selektiven In vivo-Inhibierung von FAS.
- Die folgenden Beispiele zeigen die Wirkung von Cerulenin auf Tumorzellen. Cerulenin, ein spezifischer und nichtkompetitiver Inhibitor von Fettsäuresynthase, wurde als repräsentativer Fettsäuresynthese-Inhibitor in Tumorzellen untersucht. Cerulenin bindet kovalent an eine Thiolgruppe an der aktiven Stelle des kondensierenden Enzyms der Fettsäuresynthase, wodurch dieser enzymatische Schlüsselschritt inaktiviert wird. (Funabashi et al., J. Biochem., 105: 751-755. 1989). Die Reaktion des kondensierenden Enzyms, das die Kondensation von Malonyl- CoA mit einer Acetylgruppe oder mit der wachsenden Fettsäurekette unter Bildung von CO&sub2; katalysiert, ist die spezifischste Reaktion der Synthase und wird von anderen Enzymen nicht geteilt. Obwohl festgestellt wurde, daß Cerulenin auch andere Aktivitäten besitzt, treten diese entweder in Mikroorganismen auf, die keine relevanten Modelle für humane Zellen darstellen können (z. B. Inhibierung der Cholesterinsynthese in Pilzen, Omura (1976), Bacteriol. Rev., 40: 681-697; oder verminderte RNA-Synthese bei Viren, Perez et al. (1991), FEES, 280: 129-133), oder sind das unmittelbare Ergebnis der Inhibierung der endogenen Fettsäuresynthese (Inhibierung der Antigenprozessierung in B-Lymphozyten und Makrophagen, Falo et al. (1987), J. Immunol., 139: 3918- 3923). Jüngste Daten lassen vermuten, daß Cerulenin nicht spezifisch die Myristoylierung von Proteinen inhibiert (Simon et al., J. Biol. Chem., 267: 3922-3931, 1992). Wie nachfolgend gezeigt ist Cerulenin bei den Konzentrationen, die bei den vorliegenden Untersuchungen eingesetzt wurden, ein spezifischer Wachstums-Inhibitor für humane Tumorzellen, die signifikante FAS-Aktivität exprimieren.
- Die Zytotoxizität von Cerulenin wurde in zwei experimentellen Formaten untersucht. Zuerst testeten clonogene (limitierte Verdünnung) Assays, ob Cerulenin zytotoxisch oder zytostatisch war oder keinen nachweisbaren Effekt hatte. Sobald eine Zytotoxizität festgestellt wurde, wurde ein Mikrotiterplatten-Assay mit 96 Vertiefungen für hohen Durchsatz verwendet, um verschiedene Dosen an den meisten der Zellinien von Tabelle 3 zu testen. Wenn Krebszellen auf endogene Fettsäure-Biosynthese angewiesen sind, folgt daraus, daß die Toxizität von Cerulenin direkt proportional zum Grad der Fettsäure-Biosynthese sein sollte; d. h., Zellen mit höherem FAS-Spiegel sollten sensitiver gegen Cerulenin sein.
- Clonogener Assay: Eine Million Zellen wurden in einen eckigen 25 cm-Kolben plattiert. Nach Inkubation über Nacht blieben die Zellen entweder unbehandelt oder wurden 6 Stunden mit 2,5, 5,0 oder 10 ug/ml Cerulenin behandelt. Dann wurden die Zellen zu einer Einzelzellen-Suspension trypsiniert und in 16 mm-Platten dreifach zu 1000 oder 500 Zellen pro Platte ausplattiert. Nach 3-tägiger Inkubation der 2R-75-1- und MCF-7-Zellen und nach 7-tägiger Inkubation der SKBR3-Zellen wurden die Kolonien gezählt und als Prozentsatz der unbehandelten Kontrolle ausgedrückt.
- Wie in Fig. 11A gezeigt, führte eine Behandlung von MCF-7-Zellen mit Cerulenin bei 10 ug/ml in clonogenen Assays zu einer dosisabhängigen Zytotoxizität. Steigerung der Expositionszeit auf 24 Stunden bei 10 ug/ml führte zu mehr als drei Log Zellabtötung. Cerulenin war also für Zellinien, bei denen gerade eine endogene Fettsäuresynthese erfolgte, zytotoxisch.
- Messung der Wachstumshemmung: Zellinien wurden mit 5.000 Zellen pro Vertiefung auf Mikrititerplatten mit 96 Vertiefungen plattiert. Nach 18 Stunden Wachstum wurde Cerulenin (verdünnt in 10% DMSO) auf 10 ug/ml zu dem Medium gegeben. Jeder Zeitpunkt wurde viermal genommen, mit leeren Vertiefungen als Kontrolle. Nach 24 Stunden Cerulenin-Exposition wurden die Zellen mit Kristallviolett gefärbt, in 1% SDS solubilisiert und an einem automatischen Molecular Diagnostics- Plattenlesegerät bei 570 nm gelesen. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar.
- Unter Verwendung des Zytotoxizitäts-Assays auf Mikrotiterplatten zeigt Fig. 11B, daß die relative Wachstumshemmung nach 24 Stunden Exposition gegenüber 10 ug/ml Cerulenin mit der zuvor gemessenen Fettsäure- Biosyntheserate in allen sechs Zellinien in direktem Bezug stand. Die Adriamyzin-resistente Zellinie (MCF-7a) war die einzige signifikante Ausnahme. Das graphische Auftragen der Wachstumshemmung gegen die FAS-Aktivität lieferte ein ähnliches Ergebnis (siehe Beispiel 6, Fig. 7). Die Wachstumshemmung durch Cerulenin wurde also großenteils durch den Grad der endogenen Fettsäure- Biosynthese oder der FAS-Aktivität vorhergesagt. Wichtigerweise gilt dies sowohl für Krebszellen als auch für normale Embryofibroblasten. Der Zusammenhang zwischen der Wachstumshemmung durch Cerulenin und der Fettsäure- Biosynthese war daher nicht ausschließlich ein Merkmal von transformierten Zellen.
- Messung des Einbaus von endogener Fettsäure in Acylglyceride und Cholesterin: Zur Analyse nichtpolarer und polarer Lipide wurden für jeden Zelltyp für jede Wirkstoffdosis dreimal 200.000 Zellen in Platten mit 24 Vertiefungen plattiert. Nach Wachstum über Nacht wurden die Zellen 6 Stunden mit Cerulenin (verdünnt in 10% DMSO) inkubiert, das in 0, 2,5, 5,0 oder 10 uCi/ml zugegeben wurde. Für die letzten beiden Stunden der Inkubation mit Cerulenin wurde 1 uCi ¹&sup4;C-Acetat pro Vertiefung zugesetzt. Dann wurden die ¹&sup4;C-markierten Lipide extrahiert, chromatographiert und wie oben beschrieben nachgewiesen. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar.
- Fig. 12A zeigt, daß der Einbau von ¹&sup4;C-Acetat in Acylglyceride in sechs der in Tabelle 3 aufgeführten Zellinien konsistent und signifikant in dosisabhängiger Weise durch Cerulenin inhibiert wurde. Im Gegensatz dazu zeigt Fig. 12B, daß die Cholesterin-Synthese variabel und marginal beeinflußt wurde, was von einer schwachen Hemmung in MCF-7-Zellen bis zu einer Stimulation in SKBR3-Zellen reichte. Diese Daten lassen vermuten, daß Cerulenin die Enzyme der Cholesterin-Biosynthese nicht direkt beeinträchtigte. Ferner gab es in diesen Zellen keinen Zusammenhang zwischen Basis-Level von Cholesterin- Biosynthese und Wachstumshemmung durch Cerulenin (Daten nicht gezeigt). Cerulenin inhibierte also die Acylglycerid-Synthese in Krebszellen und Pibroblasten ohne signifikante oder entsprechende Wirkung auf die Cholesterin-Biosynthese.
- Da die OA-519FAS-Expression bei klinischem Brustkrebs und einigen anderen Zellen, wie durch den mitotischen Index bestimmt (Kuhajda et al., N. Engl. J. Med., 321: 636-641. 1989), unabhängig von der Proliferation, der Expression von "Proliferating Cell Nuclear Antigen" (PCNA) (Daten nicht gezeigt) oder der Korrelation zwischen FAS-Expression und Zellzyklus entsprechend Durchflußzytometrie (Shurbaji et al., Lab. Invest., 68: 69A, 1993) ist, war zu erwarten, daß die antiproliferative Aktivität von Cerulenin unabhängig von der Tumorzellproliferation ist. Mit Hilfe des Mikrotiterplatten-Assays wurden die Verdopplungszeiten für sechs Zellinien bestimmt und mit der Wachstumshemmung durch Cerulenin (10 ug/ml, 24 h) verglichen. Es gab keine Korrelation zwischen den Verdopplungszeiten der Tumorzellen und der Wachstumshemmung durch Cerulenin oder der FAS-Expression (Fig. 13).
- Die anti-proliferative Aktivität von Cerulenin erstreckte sich auch auf zwei Androgen-unabhängige Prostatakarzinomlinien, die relativ hohe FAS-Aktivität zeigten (siehe Tabelle 3). Die TSU-prl- und die Dupro-1-Zellinie wurden in RPMI-1640 mit 10% fötalem Rinderserum mit 3 · 10&sup5; bzw. 1 · 10&sup5; Zellen/T25-Kolben in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft: 5% CO&sub2; ausplattiert. Nach 24 Stunden wurde die anfängliche Plattierungsdichte bestimmt. Zusätzlich wurde das Medium ersetzt (Kontrolle) oder Cerulenin wurde mit 2,5-10 ug/ml zu zwei Kulturen gegeben. 48 Stunden später wurden die Zellen trypsiniert und die lebensfähigen Zellen (Trypan- Blau-Ausschluß) gezählt. Die Anzahl der Verdopplungen der Population wurde bestimmt. Bei beiden Zellinien führte eine 48-stündige Exposition gegenüber Cerulenin (3-4 ug/ml) im Vergleich mit unbehandelten Kulturen zu einer 50%igen Hemmung der Populationsverdopplung. Fig. 14 zeigt repräsentative Daten von einem von zwei unabhängigen Experimenten
- TOFA (ein Inhibitor von Acetyl-CoA-Carboxylase) zeigte ebenfalls eine anti-proliferative Wirkung auf eine Reihe von Zellinien mit verschiedenem Grad an FAS- Enzymaktivität (in Tabelle 3 gezeigt) und Fettsäurebiosynthese (in Fig. 8 gezeigt). Dieses Experiment erfolgte mittels des Assays auf Wachstumshemmung mit Kristallviolett. Zellen mit verschiedener FAS-Aktivität wurden mit 5.000 Zellen pro Vertiefung in RPMI-1640 mit 10% hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum in Platten mit 96 Vertiefungen plattiert. Nach 72 Stunden Inkubation in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft: 5% CO&sub2; wurden verschiedene Konzentrationen (0-500 ug/ml) TOFA (5-Tetradecyloxy-2-furancarbonsäure) zugegeben und die Kulturen erneut 48 Stunden inkubiert. Dann wurden die Platten entnommen und wie beschrieben mit Kristallviolett gefärbt. Die abgelesenen Absorptionswerte wurden für jede Wirkstoffkonzentration (n = 4), die Kontrolle (n = 8) und den Background (n = 8) gemittelt. Die Werte für den Background wurden abgezogen. Die Konzentration von TOFA ist in Fig. 15 gegen das Wachstum (als % des Wachstums der Kontrolle) auf getragen.
- 48-stündige Exposition gegen TOFA, einen Inhibitor von Acetyl-CoA-Carboxylase (Halvorson, D. L. und McCune, S. A., Lipids 19: 851-856, 1984) führte zur Wachstumshemmung der Zellinien SKBR-3, ZR-75-1, SW480 und HS27 mit ID&sub5;&sub0;-Werten von 4,6, 0,8, 59,8 bzw. 44,7 ug/ml. TOFA oder 5-Tetradecyloxy-2-furancarbonsäure war, wie in Fig. 15 gezeigt, ein stärkerer Inhibitor für das Wachstum von Hoch-FAS-Zellinien (ZR-75 1 und SW480) als von Zellinien, die niedrigere Mengen FAS-Aktivität exprimierten (HS27 und SKBR-3).
- In diesen Experimenten wurden Zellen mit 5.000 Zellen pro Vertiefung in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen plattiert und 72 Stunden in RPMI-1640 mit 10% hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum gehalten. Als nächstes wurden die in Tabelle 4 angegebenen Verbindungen zugegeben und die Zellen weitere 48 Stunden inkubiert. Dann wurde die Wachstumshemmung mittels der Kristallviolett-Methode gemessen.
- Die Ceruleninkonzentration, die erforderlich war, um das Wachstum der humanen SK-BR-3-Mammakarzinomlinie (in Tabelle 3 als Linie mit hoher FAS-Aktivität gezeigt) zu hemmen, war ähnlich der, die für die Wachstumshemmung der Prostatatumorlinien von Beispiel X-4-A notwendig war. Wie in Tabelle 4 gezeigt, führte eine 48-stündige Exposition gegenüber 3,6 ug/ml zu einer 50%igen Wachstumshemmung. Wie ebenfalls in Tabelle 4 gezeigt, hemmten andere Verbindungen, von denen berichtet worden war, daß sie an der Fettsäurebiosynthese beteiligte Enzyme inhibieren, das Wachstum der SK-BR-3-Mammakarzinomlinie in ähnlicher Weise, wobei die 50% hemmenden Dosen (ID&sub5;&sub0;) im Bereich von 0,3-61,4 ug/ml liegen.
- Zusammengenommen zeigen diese Daten, daß Cerulenin sowie Inhibitoren anderer Enzyme der Fettsäuresynthese das Wachstum von Mamma-, Colon- und Prostatakarzinomlinien stark hemmen. Außerdem war die Stärke der Wachstumshemmung proportional zur relativen Stärke der Fettsäurebiosynthese, die diese kultivierten Zellen zeigten. Tabelle 4 Wachstumshemmung der SK-BR-3-Zellinie durch Inhibitoren von Enzymen, die an der endogenen Fettsäurebiosynthese beteiligt sind
- Humane SK-BR-3-Mammakarzinomzellen, von denen gezeigt wurde, daß sie hohe FAS-Aktivität haben, wurden mit 5.000 Zellen/Vertiefung auf Platten mit 96 Vertiefungen plattiert und in RPMI-1640 mit 10% hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum in einer befeuchteten Atmosphäre mit 95% Luft: 5% CO&sub2; gehalten. Nach 72 Stunden wurden Verbindungen zugegeben und die Zellen weitere 48 Stunden inkubiert. Die Platten wurden mit Kristallviolett gefärbt und die Extinktion wie beschrieben gemessen. Der ID&sub5;&sub0;- Wert, vierfach gemessen und analysiert, stellt die Dosis der Verbindung dar, die zu einer 50%igen Senkung der Extinktion der Kontrolle führte.
- Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden mit ZR-75-1-Zellen in 25.000 Zellen/Vertiefung ausplattiert und über Nacht (18 h) bei 37ºC in 5% CO&sub2; inkubiert. Triacsin C wurde so zugegeben, daß in Gegenwart von 0, 2,5, 5,0 oder 10,0 ug/ml Cerulenin die folgenden mikromolaren Konzentrationen erhalten wurden: 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,6, 0,8, 0,4, 0,2, 0,1, 0. Jede Konzentration wurde vierfach angesetzt. Die Zellen wurde 24 Stunden inkubiert, in PBS gewaschen, in 1% SDS solubilisiert, mit 0,2% Kristallviolett in 2% Ethanol gefärbt und bei 490 nm an einem Molecular Diagnostics- Plattenlesegerät gelesen.
- Fig. 16 zeigt, daß Triacsin C das Wachstum von Zellen einer Tumorzellinie (ZR-75-1), die OA-519FAS exprimiert, hemmt. Wenn Cerulenin in einer Menge zugegeben wird, die in etwa bei seinem ID&sub5;&sub0;-Wert liegt, sank der ID&sub5;&sub0;-Wert von Triacsin C von etwa 15 uM auf weniger als 1 uM, was die synergistische Wirkung zeigt, die durch die Kombination dieser beiden Inhibitoren ausgeübt wird.
- Fig. 17 zeigt, daß die Hemmung des Wachstums von ZR-75-1-Zellen durch Cerulenin bei hohen Konzentrationen von exogenem Oleat reversibel ist. ZR-75-1-Zellen (5.000 pro Vertiefung) wurden in Medium, das mit 0, 0,5, 1,0 oder 1,5 mM Oleat, gebunden an delipidisiertes Rinderserumalbumin in einem Molverhältnis von 4 : 1, Supplementiert war, in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen plattiert. Nach 18 Stunden Inkubation wurde Cerulenin in einer Dosis von 10 ug/ml zugegeben. Die Zellen wurden gefärbt und wie in Beispiel 10 nach 24 Stunden (Fig. 17, obere Linie) oder 48 Stunden (untere Linie) getestet. Die mittlere Linie in Fig. 17 stellt Zellen dar, denen nach 24 Stunden erneut Medium zugefüttert wurde, das die jeweilige Oleatkonzentration ohne Cerulenin enthielt, und die nach einer 48-stündigen Gesamtinkubationszeit getestet wurden. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert dar.
- In der oberen Kurve von Fig. 17, bei der die Zellen 24 Stunden gegenüber 10 ug/ml Cerulenin in Gegenwart von 0, 0,5, 1,0 oder 1,5 mM Oleat exponiert waren, führte die Konzentration von 1,5 mM Oleat zu einer im Grunde vollständigen Umkehr der Wachstumshemmung durch Cerulenin. Wenn man die Zellen 48 Stunden inkubieren läßt, trat - wie in der unteren Kurve gezeigt - signifikante Toxizität auf, die sich durch Oleat nicht umkehren ließ. Wäre die bei 48 Stunden beobachtete antiproliferative Aktivität auf eine Verarmung von Oleat im Medium zurückzuführen, sollte das erneute Füttern der Zellen nach 24 Stunden mit frischem Medium mit den gleichen respektiven Oleatkonzentrationen aber ohne zusätzliches Cerulenin die Zellen retten. Die mittlere Kurve zeigt die Wirkung einer erneuten Fütterung der Zellen nach 24 Stunden, die die Zellen bei 1,5 mM Oleat nach 48 Stunden tatsächlich rettete. Wenn Oleat fehlte, zeigten nichtgefütterte und nachgefütterte Zellen eine ähnliche Cerulenin-vermittelte Wachstumshemmung.
- Dieses Experiment zeigt, daß ein "Rescue" vor der anti-proliferativen Aktivität von Cerulenin auf die zusätzliche Fettsäure zurückzuführen war und nicht auf Glucose oder andere Stoffe wie Wachstumsfaktoren, die im Medium vorhanden waren. Interessanterweise benötigten Zellinien mit niedriger FAS-Aktivität, wie SW-480 und normale Fibroblasten, für einen "Rescue" vor der Wachstumshemmung durch Cerulenin eine geringere (0,5 M) physiologische Oleatkonzentration (siehe Beispiel 5). Die Oleatmenge, die für einen "Rescue" von ZR-75-1-Zellen erforderlich war (1,5 mM) ist überphysiologisch und es ist unwahrscheinlich, daß diese Menge durch eine Diät mit erhöhtem Fettsäuregehalt erreicht werden kann. Zusammengenommen lassen diese Daten vermuten, daß die Wirkung von Cerulenin darin besteht, daß ein Zustand der Fettsäurehungerung erzeugt wird, der zum Zelltod führt und der proportional zur endogenen Fettsäuresynthese ist. Internationales Aktenzeichen Nr: PCT/ Mikroorganismen
Claims (19)
1. Verwendung eines Fettsäuresynthese-Inhibitors bei der
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung
zur Hemmung, beim Menschen, des Wachstums von
Tumorzellen, die wenigstens ein Enzym des Fettsäure-
Biosyntheseweges exprimieren, dadurch gekennzeichnet,
daß der Inhibitor spezifisch die Fettsäurebiosynthese
einer Zelle inhibiert, wie durch Wachstumshemmung
einer FAS exprimierenden Tumorzelle in vitro gezeigt,
wobei die Wachstumshemmung in vitro durch Oleat
aufgehoben wird, wobei der Inhibitor spezifisch für
die Tumorzellen zytotoxisch ist.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Tumorzellen ein
Protein exprimieren, das Fettsäuresynthase-Aktivität
zeigt.
3. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1-2, wobei
der Patient ein Karzinom hat, das ausgewählt ist aus
der Gruppe bestehend aus Brustkarzinomen,
Rektalkarzinomen, Ovarialkarzinomen, Colonkarzinomen
und Prostatakarzinomen.
4. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1-3, wobei
ferner die Fettsäuresynthase-Expression des normalen
Gewebes des Patienten während der Behandlung
herunterreguliert wird.
5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die
Herunterregulierung der Fettsäuresynthase-Expression
durch Reduktion der Kalorienaufnahme des Patienten
erreicht wird.
6. Verwendung nach Anspruch 4, wobei die.
Herunterregulierung der Fettsäuresynthase-Expression
durch Verabreichung einer Zusammensetzung an den
Patienten erreicht wird, die langkettige freie
Fettsäure oder Acylglycerid umfaßt.
7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die
Zusammensetzung, die langkettige Fettsäure oder
Acylglycerid enthält, dem Patienten essentielle
Fettsäuren zuführt.
8. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1-7, wobei
der Inhibitor der Fettsäuresynthese ein Inhibitor
eines Enzyms ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus Fettsäuresynthase, Acetyl-CoA-Carboxylase,
Citratlyase und Malatenzym besteht.
9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Enzym
Fettsäuresynthase (FAS) ist.
10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Inhibitor
Cerulenin ist.
11. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Enzym Acetyl-
CoA-Carboxylase ist.
12. Verwendung nach Anspruch 9, wobei der Inhibitor
5-Tetradecycloxy-2-furancarbonsäure (TOFA) ist.
13. Verwendung nach irgendeinem der Ansprüche 1-12,
dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung ferner im
wesentlichen gleichzeitig mit der pharmazeutischen
Zusammensetzung die Verabreichung eines Inhibitors
der Lipidbiosynthese umfaßt.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Inhibitor der
Lipidbiosynthese Triacsin C ist.
15. Assayverfahren zur Unterstützung bei der Bestimmung
der Tumorzellvirulenz in einem Patienten, umfassend:
a. Erhalten einer Probe von dem Patienten;
b. Bestimmen der Menge eines Proteins mit
Fettsäuresynthase-Aktivität in der Probe, wobei
der Bestimmungsschritt ferner den Nachweis der
Bindung zwischen dem Protein und einem Antikörper
umfaßt, der das Protein immunologisch bindet,
wobei der Antikörper nicht immunologisch
kreuzreaktiv mit Haptoglobin 1 oder 2 oder mit
einem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz
Leu Tyr Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Ile Ser Asp
Asp Arg Phe Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala Asn Gly
Tyr Val Glu Lys Leu Phe Arg Tyr Gin Cys ist,
wobei die Expression eines Proteins mit
Fettsäuresynthase-Aktivität durch Tumorzellen
Virulenz anzeigt.
16. Assayverfahren zur Unterstützung bei der Bestimmung
der Tumorzellvirulenz in einem Patienten, umfassend:
a. Erhalten einer Probe von dem Patienten;
b. Bestimmen der Menge eines Proteins mit
Fettsäuresynthase-Aktivität in der Probe, wobei
der Bestimmungsschritt den Nachweis der
Hybridisierung zwischen einer Nukleinsäuresonde
und einer für das Protein codierenden mRNA
umfaßt, wobei die Expression eines Proteins mit
Fettsäuresynthase-Aktivität durch Tumorzellen
Virulenz anzeigt.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Probe
eine Tumorgewebeprobe ist.
18. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Probe
eine biologische Flüssigkeit des Patienten ist.
19. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 15-18, worin
die Tumorzellen von einem Brustkarzinom,
Prostatakarzinom oder Ovarialkarzinom sind.
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