KR100329245B1

KR100329245B1 - 종양 세포의 발병도를 측정하는 것을 돕는 생체외 분석방법

Info

Publication number: KR100329245B1
Application number: KR1020017009035A
Authority: KR
Inventors: 쿠하자프란시스피; 패스터넥게리알
Original assignee: 더 존스 홉킨스 유니버시티
Priority date: 1992-07-24
Filing date: 1993-07-26
Publication date: 2002-03-18
Also published as: AU4786493A; EP0651636B1; CA2140866A1; ES2183815T3; AU682007B2; ATE225167T1; WO1994002108A1; JPH07509470A; MX9304501A; PT651636E; DK0651636T3; DE69332353D1; KR100325766B1; CA2140866C; DE69332353T2; EP0651636A1

Abstract

환자로부터 분리된 시료 중에 존재하는 지방산 신타제 활성을 나타내는 단 백질의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 이 때 종양 세포에 의한 지방산 신타제 활성을 나타내는 단백질의 발현이 발병도(virulence)를 나타내는 것인, 환자중에 존재하는 종양 세포의 발병도를 측정하는 것을 돕는 생체외(ex vivo) 분석 방법에 관한 것이다.

Description

종양 세포의 발병도를 측정하는 것을 돕는 생체외 분석 방법{AN EX VIVO ASSAY METHOD TO AID IN DETERMINING VIRLUENCE OF TUMOR CELLS}

본 출원은 1989년 1월 17일자로 출원되었으나 현재는 포기된 미국 출원 번호 07/297,722호; 이것의 계속 출원인 1990년 12월 4일자로 출원되었으나 현재는 포기된 미국 출원 번호 07/622,407호; 이것의 일부 계속 출원인 1991년 7월 26일자로 출원된 미국 출원 번호 07/735,522호; 이것의 일부 계속 출원인 1992년 7월 24일자로 출원된 미국 출원 번호 07/917,716호의 일부 계속 출원이며, 이 문헌들은 모두 참고 문헌으로 본원에 포함된다.

본 발명을 성취하도록 이끈 본 연구는 국립 보건소로부터 승인 번호 ROl CA 54404호로서 부분적으로 지원 받았다. 따라서, 미국 정부는 본 발명에 있어서일부 권리를 갖고 있다.

기술 분야

본 발명은 암의 화학요법 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양 세포에 대해 세포 독성 또는 세포 증식 억제성을 갖는 치료제를 암환자에게 투여하는 것에 관한 것이다.

배경 기술

일부 종양 세포는 그 증식이 느려서, 이런 세포를 갖는 환자에게 심각한 단기의 위험을 주지 않는 종양을 생성한다. 예를 들면, 많은 전립선암은 매우 느리게 진행하여 이 암은 그 환자가 또 다른 원인으로 사망한 후에야 검출된다. 따라서, 이러한 종양들은 치료되지 않은 상태로 안전하게 유지된다. 다른 종양들은 빠르게 전이하고 증식하여 환자의 사망을 초래한다. 이와 같이 보다 독성인 종양의 경우에는 그 증식 속도를 억제시킬 수 있는 임의의 치료가 필요하게 된다.

현재 대부분의 암 치료법들은 세포 분열을 억제시키는 화학 치료제 치료법이나 분열 세포 중의 DNA를 붕괴시키는 방사선 치료법을 포함한다. 그러나, 이러한 치료법들은 치료 시에 DNA의 분열이나 합성이 일어나고 있을 수도 있는 정상 세포에도 영향을 미친다. 따라서, 독성 종양 세포에만 영향을 미치도록 보다 특이적으로 표적화된 대안적인 치료법들이 필요하게 된다.

지방산 대사

인체에서 지방산 생합성 경로는 다음의 4가지 주요 효소들로 이루어진다: 즉, 말로닐-CoA를 합성하는 속도 제한 효소인 아세틸-CoA 카르복실라제; NADPH를 생산하는 말산 효소; 아세틸-CoA를 합성하는 구연산염 리아제(citrate lyase); 및아세틸-CoA 및 말로닐-CoA로부터 지방산의 NADPH-의존적인 합성을 촉매하는 지방산 신타제(fatty acid synthase). 지방산 신타제의 최종 생성물은 유리 지방산으로서, 이것은 다른 생성물 내로 병입(incorporation)되기 위해 조효소-A(coenzyme-A)에 의하여 별도로 효소적 유도체화될 필요가 있다. 인체에서 주요 지방산 합성은 2 부위, 즉, 팔미트 산이 주요 생성물인 간(Roncari, Can, J. Biochem.,52: 221-230, 1974)과 C₁₀-C₁₄지방산이 우세한 유즙 분비 유선(mammary gland)(Thompson, et al., Pediatr. Res.,19: 139-143, 1985)에서 일어날 수 있다. 유즙 분비 및 주기성 자궁 내막의 경우를 제외하고(Joyeux, et al., J. Clin. E ndocrinol. Metab.,70: 1319-1324, 1990), 지방산 생합성 경로는 간 및 다른 기관들 중에서 외인적인 식이성 지방산 흡수에 의해 억제 조절되므로(Weiss, et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler,367: 905-912, 1986), 작은 생리적 중요성을 갖고 있다.

간에서 아세틸-CoA 카르복실라제, 말산 효소 및 지방산 신타제는 전사 활성화를 통해 갑상선 호르몬과 인슐린에 의해 협동적으로 유도되고, 글루카곤(Goodridge, Fed. Proc.,45: 2399-2405, 1986)과 지방산 섭취(Blake, et al., J. Nutr.,120: 1727-1729, 1990)에 의해 억제된다. 지방 생성에 중요한 영향을 미치는 시토킨인 종양 괴사 인자 알파(TNF)는 연구되는 세포 종류에 따라 자극성(stimulatory)이거나 또는 억제성(inhibitory)이다. 즉, TNF는 지방 세포 중에서 아세틸-CoA 카르복실라제 및 지방산 신타제 단백질 합성을 감소시키므로써 지방 생성을 현저하게 억제시키지만, 간에서는 지방산 생합성의 속도 제한 효소인 아세틸-CoA-카르복실라제의 1차적인 알로스테릭 활성인자(allosteric activator)로서 구연산염의 양을 증가시키므로써 현저하게 자극성을 나타낸다.

인체 내의 지방산 생합성의 다른 주요 부위인 유즙 분비 유방에서, 지방산 합성은 프로락틴, 에스트로겐, 및 프로게스테론의 조절을 받는다. 임신 중에, 프로게스테론은 유방 발달을 촉진시키는 분열 촉진 인자(mitogen)로서 작용하고 동시에 프로락틴 수용체를 억제 조절하여, 분만 전에 지질과 유단백질의 합성을 억제시킨다. 분만 후, 에스트로겐과 프로게스테론의 양은 감소하여 프로락틴 수용체를 상승 조절하고 이어서 유방 내피 세포에 의한 지방 생성 효소와 유단백질 생성을 증가시킨다.

프로게스테론-자극된 유전자 발현의 모델로서 인체 유방암에서 지방산 신타제 발현의 조절이 주로 연구되어 왔다. 프로게스테론이 내피 세포의 증식을 자극하면서 지방생성 효소의 합성은 억제하는 정상적인 유즙 분비 유방과는 반대로, MCF-7, ZR-75-1, 및 T-47D와 같은 프로게스테론 수용체(progesteron receptor)(PR) 양성의 인체 유방 종양에서 프로게스테론은 세포 증식을 억제하면서 다른 지방 생성 효소 뿐만 아니라 지방산 신타제 생성은 유도한다(Chambon, et al., J. Steroid Biochem.,33:915-922(1989)). 프로게스테론은 래트의 지방산 신타제 프로모터에서 밝혀진 바와 같이(Amy, et al., Biochem. J.,271: 675-686, 1989) 스테로이드 호르몬 응답 반응 인자를 통해 지방산 신타제의 발현을 상승 조절 작용하는 것으로 추정되며, 이것은 FAS mRNA 전사를 증가시키거나, 또는 다른 기작에 의해 메시지 안정성을 증가시킨다(Joyeux, et al., Mol. Endrocinol.,4:681-686, 1989). PR-음성의 인체 유방암세포와 관련하여, 지방산 신타제가 SKBR3 세포 중에서 약 25%의시토졸(cytosol) 단백질을 차지하지만, 그 효소의 생물학적 중요성이나 조절과 관련된 데이타는 얻지 못했다고 하는 단독 연구가 보고된 바 있다(Thompson, et al., Biochim. Biophys. Acta,662: 125-130, 1981).

인체 유방과 관련된 시토킨과 다른 지방 생성 호르몬에 대해서는, 약간의 데이터만이 알려져 있다. 예를 들면, TNF는 일부 유방암 배양물에 대해 현저하게 증식 억제성을 나타내는 것으로 공지된 바 있다. TNF는 1차적인 래트 간세포 배양물에 대해 온화한 증식 억제성인 반면(ID₅₀= 5000 유니트/ml), MCF-7과 같은 일부 인체 유방암 세포에 대해서는 상당한 증식 억제성을 나타냈다(ID₅₀= 40 유니트/ml)(Chapekar, et al., Exp. Cell. Res.,185: 247-257, 1989). 그러나, 유방암 세포에 있어서 FAS 형질 발현이나 지방생성 활성에 대한 TNF의 효과는 알려져 있지 않다. 노던(Northern) 분석을 사용한 MCF-7 세포 중의 지방산 신타제 발현에 대한 연구는 5 내지 10배 증가시키는 프로게스테론에 비해 인슐린과 인슐린 증식 인자-1은 단지 약간 자극성을 나타내고, T₃은 어떤 효과도 나타내지 않는다는 것을 밝힌 바 있다(Chalbos, et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol.,43: 223-228, 1992). 종합해 보면, 수용체 양성 유방암에 있어서 FAS의 조절은 단지 엉성하게 조사되어 왔으며, 수용체 음성 종양에 대해서는 전혀 연구된 바도 없다.

이런 미약한 임상적 결과가 지방산 신타제의 발현이 연구된 몇몇 시스템에 서 유방암이나 임의의 다른 암과 관련성이 있는지에 대해서도 밝혀진 바가 전혀 없다. FAS 발현과 예후를 연관시키고자 의도한 유일한 한 연구에서는 27가지 유방암에 대하여 지방산 신타제 발현을 인 시투 하이브리드화(in situ hybridization)로 연구한 결과, 증가된 지방산 신타제 mRNA와 고도의 형태학적 분화 정도 간에는 연관성이 있으나, 에스트로겐 또는 프로게스테론 수용체 상태간에는 연관성이 없다는 것을 발견하였다(Chalbos, et al., J. Natl. Cancer Inst.,82: 602-606, 1990). 이들 자료로 부터 유방 종양에 있어서 지방산 신타제 발현이 형태학적 분화와 보다 관련성이 큰 바, 따라서 보다 공격성이 적은 종양과 관련이 있을 것으로 추론되었다. 두 번째 연구로서 지방산 신타제 mRNA의 노던 블롯팅(Northern blotting)으로 87가지 경우를 조사한 결과 지방산 신타제 형질 발현과 유년(갱년기 전의 환자)간의 연관성은 밝혀냈으나, 역시 수용체 상태와의 연관성은 밝혀 내지 못했다(Wysocki, et al., Anticancer Res.,10: 1549-1552, 1990). 이 연구들은 모두 그 환자들의 임상적 후속 검사를 제공하지 못했으며; FAS 형질 발현과 질병이 없는 기간이나 환자 생존율간을 비교하는 어떤 데이타도 제시하지 못했다. 이러한 임상적 결과 없이는 FAS 형질 발현과 종양 독성에 관한 어떤 신뢰성 있는 결론도 유도해 낼 수 없다.

이 연구들은 무질병 생존율이나 총 생존율의 측정을 통해 미결정된 기능을 갖는 단백질(OA-519로 명명됨)의 형질 발현과 미약한 예후간의 강력한 연관성이 있음을 입증하는 여러 센터로부터 선별한 200명 이상의 일련의 환자들에 대한 연구와 대조적인 결과를 나타냈다(Kuhajda, N. Engl. J. Med.,321: 636-641, 1989; Shurbaji, et al., Am. J. Clin. Pathol,96238-242, 1991; Corrigan, et al., Am. J. Clin. Pathol.,96: 406, 1991; Cote, et al., Lab. Invest.,66: 13A,1992; Ziegler, et al., Am. J. Clin. Oncol.,14: 101-110, 1991).

지방산 대사가 암 치료법의 연구 표적이 된 적은 없다. 후지 등(Fujii, et al., 1986, Japan J. Exp. Med.,56: 99-106)은 막 공격 복합체를 통해 보체-매개의 세포막 손상을 강화시키고자 하는 시도로서 세포막을 약화시키는 외인성 항종양 항체와 함께 지방산 신타제 억제제인 세룰레닌을 사용했다. 세룰레닌은 고농도일 때 세포에 대해 독성인 것으로 공지되어 있고, 후지 등은 세룰레닌의 농도가 보체-매개의 세포 용해의 체액성 면역 성분에 의해 부여된 선택성을 유지하도록 저농도이어야 한다고 교시하고 있다. 스피엘보겔(Spielvogel) 등은 미국 특허 제 5,143,907호에서 일련의 아인산염-보란 화합물이 항종양 활성 및 항 염증 활성을 나타내면서 혈청 콜레스테롤과 혈청 트리글리세라이드를 저하시킨다는 것을 교시했다. 아인산염-보란 화합물은 많은 세포 기능에 영향을 미치는 비특이적인 억제제이며, 따라서, 종양 세포에 대해 선택적으로 효과를 나타내지는 않는다. 스피엘보겔 등은 혈청의 콜레스테롤 및 트리글리세라이드에 대한 저지질혈증의 효과가 1 가지 이상의 기작을 통해 매개되고 항종양 효과가 저지질혈증 활성과 관련이 있는 것으로 밝혀진 바는 없다고 하였다.

발명의 개요

본 발명의 목적은 환자의 종양 정도를 감소시키기 위해 종양 환자를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 세포의 증식이 암세포에 대해 선택적으로 세포 독성 또는 세포 증식 억제성 방식으로 억제되도록 종양 세포에 의한 지방산 합성을 억제시키므로써 종양을 지닌 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

보다 특정한 구체예로서, 본 발명은 지방산 신타제(fatty acid synthase)(FAS) 억제제 또는 지방산 합성 경로의 다른 효소들의 억제제를 세포 독성 화학 치료제로서 투여하고, 이로써 종양 정도를 경감시키므로써 종양을 지닌 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

또 다른 구체예로서, 본 발명은 지방산 신타제 활성을 나타내는 단백질을 형질 발현하는 종양 조직을 지닌 종양 환자에게 지방산 신타제 억제제의 치료적 유효량을 투여하는 것으로 이루어지는 상기 종양 환자의 종양 정도를 경감시키는 방법을 제공한다. 생검, 절제, 또는 침 흡인술과 같은 절차로부터 얻은 조직 샘플 중의 지방산 신타제를 면역 조직 화학법, 시토졸 효소 면역 분석법 또는 방사능면역 분석법, 또는 효소 활성의 직접 측정법과 같은 분석법을 사용하여 검출하므로써 종양 조직에 있어서의 형질 발현을 직접적으로 측정할 수 있다. 종양에 의한 지방산 신타제의 형질 발현은 혈장 또는 체액 중의 지방산 신타제를 효소 면역 분석법 또는 방사능 면역 분석법과 같은 분석법을 사용하여 검출하므로써 간접적으로 측정할 수도 있다.

또 다른 구체예로서, 본 발명은 FAS 억제제의 치료적 유효량을 투여하기 전 및/또는 투여하는 동안 정상 세포의 FAS 효소 활성을 억제 조절하므로써, 강력한 독성으로부터 다양한 부위 상의 정상(비종양성) 조직(예, 정상적으로 지방산 신타제 활성을 발현할 수 있는 간과 같은 조직)을 보호하면서 종양을 지닌 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 억제 조절은, 예컨대 열량 흡수의 감소 또는 다른 유효한 방법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명자들은 유방암 및 기타 종양에서 발현되는 단백질(OA-519라고 명명함)의 예후적 중요성을 발견했다. 특히, 독성 종양들은 기타 다른 세포 중에서도 OA-519를 발현하는 세포를 갖는 경향이 있고, 이 OA-519 단백질은 종양 증식에 필요한 효소 활성이지만, 정상 세포에 대해서는 반드시 필요한 것은 아닌 지방산 신타제 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한 본 발명자들은 지방산 신타제의 억제제(FAS 억제제)가 OA-519를 발현하는 세포에 대해 세포 독성을 나타내는 것을 밝혀냈다. 이런 발견에 기초를 두고 본 발명자들은 종양 환자 중의 종양 정도를 감소시키기 위해 지방산 합성의 억제제를 투여하므로써 종양 환자를 치료하는 본 발명의 방법을 개발했다. 본 발명의 방법은 특히 FAS 억제제와 같은 억제제로의 치료가 지방산 신타제를 형질 발현하는 세포에 대해 선택적이므로 특히 유리하다. FAS는 일반적으로 정상 세포에 의해서는 발현되지 않는 유도가능 효소(inducible enzyme)이며, 결과적으로 종양 세포만이 그 억제제에 의해 주로 영향을 받는다.

제1도는 유방 종양에 있어서의 생존율과 OA-519 발현 사이의 상관 관계를 나타낸다.

제1a도는 유방암에 있어서의 프로게스테론 수용체(PR)와 OA-519 발현간의 예후적 상관 관계를 나타낸다.

제2a도는 전립선암에 있어서의 질병이 치료된 생존율과 OA-519 발현 사이의 상관 관계를 나타낸다.

제2b도는 난소 종양의 예후와 OA-519 발현 사이의 상관 관계를 나타낸다.

제2c도는 유방 종양으로부터 얻은 OA-519를 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의해 점진적으로 정제한 결과 및 여러 정제 단계에서 상응하는 단백질의 웨스턴 블롯을 나타낸 것이다.

제3a도는 OA-519와 면역학적으로 교차 반응성인 펩티드의 34개의 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 이 서열은 문헌 [Maeda, J. Biol.Chem.,Vol. 260, pp. 6698-6709, 1985]에 보고된hpr유전자에 의해 암호화되는 처음 34개의 아미노산에 상응한다.

제3b도는 OA-519의 펩티드 서열 분석을 나타낸 것이다.

제4도는 OA-519가 아세틸CoA 및 말로닐CoA로부터 지방산을 합성함을 나타낸 것이다.

제5도는 OA-519 지방산 신타제 활성에 대한 세룰레닌 억제의 딕슨 플롯(Dixon Plot)을 나타낸 것이다.

제6도는 세룰레닌이 종양 세포에 대해서는 증식 억제성이나 정상 세포에 대해서는 증식 억제성이 아님을 나타낸 것이다.

제7도는 OA-519 효소 활성이 증가함에 따라 세룰레닌 억제가 증가함을 나타낸 것이다.

제8도는 FAS 발현과 아실-글리세라이드 합성 사이의 상관 관계를 나타낸 것이다.

제9도는 FAS 서열을 갖는 리보프로브(riboprobe)와 인 시투 하이브리드화에 의해 종양 세포주내의 OA-519_FAS발현을 검출한 것이다.

제10도는 면역 조직 화학적 염색으로 검출된 OA-519의 선택적 발현을 나타낸 것이다.

제11a도 및 제11b도는 여러 유방 종양 세포주들에 대한 세룰레닌의 상대적인 증식 억제성을 나타낸 것이다.

제12a도 및 제12b도는 세룰레닌 농도가 아실-글리세라이드 합성의 억제와 상관 관계가 있으나, 콜레스테롤 합성의 억제와는 상관 관계가 없음을 나타낸다.

제13도는 세룰레닌 억제에 대한 감수성과 세포 증식율 사이에 상관 관계가 없음을 나타낸 것이다.

제14도는 전립선 종양 세포주에 대한 세룰레닌의 증식 억제를 나타낸 것이다.

제15도는 내인성 지방산 생합성 양이 많은 선택적인 유방 종양 세포주가 TOFA에 의해 선택적 증식 억제를 나타냄을 도시한 것이다.

제16도는 OA-519_FAS를 발현하는 종양 세포에 대한 트리악신-C(Triacsin-C)와 세룰레닌의 증식 억제 효과를 나타낸 것이다.

제17도는 외인적으로 첨가된 지방산이 FAS의 억제 작용을 극복하여 세룰레닌의 증식 억제 효과로부터 세포를 구제할 수 있음을 나타낸 것이다.

발명의 구체예에 대한 상세한 설명

I. 신규한 종양 관련 효소 활성에 대한 연구

본 발명자는 제3a도에 나타낸 펩티드에는 존재하지만, 합토글로빈(haptoglobin) 1 또는 합토글로빈 2에는 존재하지 않는 에피토프에 대해특이적인 항체와 특이적으로 면역반응성인 단백질을 발견하였으며, 이 단백질이 독성이 가장 큰 종양과 관련이 있다는 것을 발견하였다. OA-519로 명명되어 왔던 이 단백질 항원은 이하 본 명세서에서는 OA-519_FAS라고 한다. 다양한 종양을 가진 환자의 생존에 대한 연구는 환자의 혈장이나 종양에서 검출되는 OA-519가 나쁜 예후와 높은 통계학적 유효 수준으로 관련이 있음을 입증했다(표 1 참조).

OA-519 형질 발현 및 암의 예후(면역 조직 화학법으로 검출함)
종양 유형	개체수	예후적 연상	참고 문헌
유방암	70 (단계 1 및 2)	질병 재발 3.92비교적 위험	A
	135 (총 단계)	생존, 4.86비교적 위험	마틴 외 다수*
	49 (단계 1 및 2)	초기(<2년)재발프로게스테론 수용체와 결합(p<0.02)	B
전립선암	42 (총 단계)	종양 등급 (p<0.006),종양 크기 (p<0.004)	C
결장암	27 (총 단계)	원거리 전이(p<0.02)	D
난소암	34 (총 단계)	질병 재발 및 생존(p<0.05)	카진스키 외 다수*
A. 쿠하다 외 다수,N. Engl. J. Med., 321 : 636-41, 1989.B. 코트 외 다수,Mod. Pathol., 5 : 13A, 1992.C. 슈르바지 외 다수,Am. J. Clin. Pathol., 97 : 686-691, 1992.D. 레드스톤 외 다수,Mod. Pathol., 5 : 47A, 1992.* 실시예 1 참조

본 발명자들은 OA-519를 분리했으며, 분리된 단백질이 지방산 신타제 활성을 나타낸다는 것을 측정했다. 인체 유방 종양 세포주에서 정제한 OA-519는 래트의 지방산 신타제와 펩티드 서열의 상동성이 있고, 또 OA-519는 지방산 신타제의 기능적 특성을 나타낸다. OA-519에 의한 지방산 합성은 지방산에¹⁴C 말로닐 조효소 A를 병입시키고, 이어서 지방산을 에스테르화시키고, 역상 박층 크로마토그래피로 분석하여 입증했다. 정제된 OA-519의 비활성은 NADPH를 산화시킨 후 아세틸 조효소 A 및 말로닐 조효소 A의 존재 하에 340 nm에서 분광 광도계로 측정했다. 1차 측정에서, OA-519의 비활성은 586 nmol의 산화된 NADPH/분/mg 단백질로 측정되었으며, 이는 인체 간에서 얻은 FAS의 측정값인 404와 비교해 볼 때 바람직한 것이다.

지방산 신타제는 특정 조직, 예컨대, 간 및 유즙 분비 유선 유래의 세포에 존재하는 시토졸에서 발견되는 거대 단백질이지만, FAS는 대부분의 정상(비-악성) 성인 조직에서는 발현되지 않는다. 고등 생물에서의 지방산 신타제는 단일 분자에대해 아세틸 트랜스아실라제, 말로닐 트랜스아실라제, 베타-케토아실 합성 효소(축합효소), 베타-히드록시아실 탈수 효소, 에노일 환원 효소, 티오에스터라제와 같은 7 가지 효소 기능을 수행하는 것으로 공지된 다기능 효소이다(참조 문헌 : Wakil, S. J.,Biochemistry, 28:4523-4530, 1989).

유방암 세포는 지방산 신타제를 발현시키는 것으로 알려져 있지만, 대부분의 다른 종양 세포는 상기 효소의 존재 또는 부재에 대해 시험된 바 없다. 로쉬포트(Rochefort)와 그의 공동 연구자는 유방암 세포 유래의 FAS를 부분적으로 클로닝하여, 유방암 세포주에 의한 FAS 발현이 프로게스테론에 대한 응답성과 관련이 있다는 것을 밝혀 내었다(참조 문헌 : 찰버스 외 다수,J. Biol. Chem., 262:9923-9926, 1987). 이 증거를 기초로 하여 FAS를 형질 발현하는 세포는 분화성이 큰 종양 유래의 세포로서 독성이 적다고 결론지었다(참조 문헌 : 찰버스 외 다수,J. Nat'l. Cancer Inst., 82:602-606, 1990). 그러나, 본 발명자들은 로쉬포트의 교시와는 반대되게, FAS 활성을 띠는 단백질인 OA-519의 존재가 독성이 가장 큰 종양과 관련성이 크다는 것을 발견하였다.

표준 시험관내 증식 억제 분석법을 사용하여, 본 발명자들은 OA-519 의 억제제가 종양 세포의 증식을 억제하지만, 정상인의 섬유아세포에는 거의 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하였다. 사실상, FAS 활성이 매우 낮은 섬유아세포는 OA-519 활성이 큰 유방암 세포의 성장을 80% 이상 억제하는 FAS 억제제 농도에 대해 내성을 갖는다. OA-519 신타제 활성과 FAS 억제제에 의한 증식 억제 사이의 상관 관계를 밝히기 위해, 다중 유방암, 전립선암, 폐암, 결장암 및 난소암의 세포주들과 정상의 섬유아세포를 사용하여 연구하였다. 약물 민감도와 OA-519 효소 활성 사이의 관계는 시험한 모든 유형의 종양 세포에 적용되었다. 따라서, 독성이 가장 큰 종양에서 고도로 발현되는 지방산 신타제 효소를 억제시키므로써 상기 종양 내의 세포 증식을 억제시킬 수 있다.

II. 지방산 합성 억제를 기초로 한 치료

본 발명은 내인적으로 합성되는 지방산(세포 내에서 합성되는 지방산)에 의존하는 세포를 함유하는 종양을 지닌 종양 환자의 종양 정도를 경감시키는 방법을 제공한다. 이 세포들은 보통 FAS 활성을 가진 단백질을 과잉 발현한다. 종양 정도는 지방산 합성이나 이용을 방해하는 1종 이상의 억제제를 환자에게 투여함으로써 감소시킬 수 있다. 이 억제제는 FAS를 발현하는 종양 세포에 대해 세포 독성을 나타내며, 지방산 합성 및 조직에 의한 지방산 이용의 감소 및/또는 환자 체액 내의 FAS 활성 감소를 일으킬 정도로 투여하면 종양 정도는 감소할 것이다.

A. 환자 집단 선별

본 발명의 방법은 지방산 신타제의 증가량을 나타내는 암에 걸린 환자를 치료하는데 사용할 수 있다. 치료받을 수 있는 특징적인 종양의 예는 방광, 타액선, 피부 부속기관, 담즙관, 자궁경관 점막, 자궁 경질부, 질, 식도, 비인강 및 구강인두의 종양 또는 배아 세포원의 종양 및 중피종을 포함한다. 특히, 위, 자궁 내막, 신장, 간, 및 폐의 종양 또는 선암 뿐아니라, 흑색종도 본 발명으로 치료할 수 있다. 유방, 결장, 직장, 전립선 및 난소의 선암은 본 치료법을 적용하기에 특히 적절한 유형의 선암이다.

본 발명의 방법은 FAS를 형질 발현하거나, 내인성 지방산(세포내에서 합성됨)에 의존적인 세포를 갖는 종양의 치료법에 관한 것이다. 이런 세포에 의한 내인성 지방산 합성은 아실 글리세라이드 내로 아세틸 CoA의 병입 속도가 1 분당200,000 세포당 10 펨토몰(fmol) 이상으로 진행되는 것이 바람직하다. 바람직한 환자는 주변의 정상(예, 비종양성) 조직에서 발견되는 양 보다 높은 양으로 아세틸 CoA 카르복실라제(ACC)와 같은 지방산 합성 경로의 다른 효소들이나 OA-519를 발현하는 세포를 함유한 종양을 갖기 때문에 식별될 수 있다. 상기 세포는 공격성 종양 세포이며, 생존율의 감소, 전이율의 증가, 임상재발율의 증가 및 전반적으로 악화된 예후를 나타낸다.

보통, 지방산 합성 억제제에 대한 종양 세포 민감도는 FAS 양에 따라 지속적으로 변화한다. 1 분당 200,000 세포당 지방산 내로 병입되는 말로닐 CoA가 20 펨토몰 이상인 FAS 활성의 양을 발현하는 공격성 종양 세포는 지방산 신타제 억제제에 민감하다고 추정할 수 있다. 많은 종양 세포들은 내인성 지방산 합성에 매우 의존적이기 때문에, 지방산 신타제 억제제를 사용한 치료법에 대한 후보로서 FAS 활성이 낮은 특정 종양을 배제시킬 필요는 없다.

종양 세포 내의 FAS의 존재는 적절한 방법, 예를 들면, 활성 분석법 또는 염색법, 항-FAS 항체를 사용한 면역 검정법, FAS mRNA를 측정하는 분석법 등으로 검출할 수 있다. 특히 바람직한 방법은 OA-519의 존재를 측정하는 분석법이며, OA-519는hpr유전자(참조 문헌 : 마에다,J. Biol. Chem., 260권, 6698-6709 페이지, 1985)의 유전자 생성물과 면역학적으로 교차 반응성을 갖지만, 합토글로빈 1 또는 2와는 교차반응성을 갖지 않는 단백질이다. 이 분석법은 본 명세서에서 참고로 인용된 국제 공개 공보 WO 90/08324 또는 미국 출원 번호 07/735,522호에 교시되어 있다. 가장 바람직한 분석법은 조직이나 혈장에 존재하는 OA-519에 대한 면역 검정법이다.

FAS 형질 발현은 면역 조직 화학법, 시토졸 효소 면역 검정법 또는 방사능 면역 검정법이나 FAS 서열을 갖는 mRNA 표적과 핵산 프로브의 인 시투 하이브리드화, 또는 효소 활성의 직접 측정법 같은 분석법으로 생검, 절제 또는 침 흡인법과 같은 절차를 통해 얻은 종양 조직 시료 내에서 직접 측정할 수 있다. 종양에 의한 지방산 신타제의 발현은 적절한 임의의 측정법을 사용하여 환자의 혈액, 소변, 혈청, 림프액, 타액, 정액, 복수, 또는 특히 혈장과 같이 환자에게서 얻은 체액 샘플에서 간접적으로 측정할 수 있다. 체액 내의 FAS에 대한 바람직한 분석법의 예는 효소 면역 검정법 또는 방사능 면역 검정법이 있다.

내인적으로 합성된 지방산 의존성인 세포는 종양 주위의 비-종양성 조직에서 발견되는 것 보다 높은 양으로 존재하는 지방산 합성 경로의 다른 효소를 검출하므로써 식별될 수 있다. 특히, 기대 이상으로 높은 아세틸 CoA 카르복실라제를 갖는 세포의 치료 방법은 본 발명에 포함된다. 이 효소의 존재는 FAS에 대해 설명한 것과 유사한 분석 방법으로 검출할 수 있다.

내인적으로 합성된 지방산을 필요로 하는 세포는 종양, 특히 독성이 가장 강한 종양에 퍼져 있다. FAS의 존재를 치료 이전에 측정하는 것이 바람직할 지라도, 임상 전문의라면 이런 측정이 항상 필요한 것은 아니라는 것을 알고 있을 것이다. 종양 정도를 감소시키는 지방산 합성 억제제, 특히 FAS 억제제를 이용한 종양 환자의 치료는 종양 내에 FAS가 존재함을 증명하는 것이다. 종양 환자가 본 발명의 방법으로 성공적으로 치료될 수 있다면, FAS의 독자적인 측정은 불필요한 것이다. 일반적으로, FAS를 발현시키는 것으로 밝혀진 종양 유형의 실험적 치료방법도 본 발명에 속하는 것이다.

또한, 지방산 합성 억제제는 다른 화학요법제와 함께 이용되기도 한다. 현재 처방된 지방산 신타제 경로에 대해 특이 활성을 갖는 암 화학 요법제는 없지만, FAS 억제제는 현존하는 항암 약물, 특히 다른 동화 대사 또는 이화 대사 경로를 표적으로 하는 항 대사 약물을 보충할 수 있을 것이다.

지방산 합성 경로의 억제제에 의한 FAS 형질 발현 및 증식 억제 효과는 세포 주기와는 무관하다. 그러므로, 지방산 합성 억제제는 급속 순환 세포를 표적으로 하는 화학요법제와 함께 사용될 때 특히 효과적이라는 것을 예측할 수 있다. 또는, 지방산 합성 억제제를 투여하여 치료하고자 하는 특정 유형의 종양에 대해 효과적인 것으로 공지된 항종양제를 기초로 한 화학요법적 섭생을 보충할 수 있다. 특히, 다른 제제를 사용하는 치료 프로그램과 함께, 검출되지는 않지만 독성이 강한 소량의 세포 증식을 억제하기 위해 지방산 합성 억제제를 사용하는 것도 본 발명에 포함된다.

한편, 지방산 합성 억제제가 보체 활성화(complement activation)의 대안적 경로나 또는 항체에 의해 개시되는, 막 공격 복합체를 통하여 보체-매개의 세포 손상을 일으키는 제제(참조 문헌 : Bhakdi 외 다수(1983), '보체에 의한 막 손상', Biochim. Biophys. Acta,737: 343 : 372)와 함께 사용될 수 있다는 것은 고려하지 않는다. 그러므로, 본 발명은 보체-의존성 막 공격 복합체를 활성화시키는 외부에서 공급된 제제의 존재 하에 지방산 합성 억제제를 사용하는 것은 포함하지 않는다.

B. 지방산 합성 경로의 억제

내인적으로 합성된 지방산에 의존성을 갖는 종양 세포는 FAS를 발현시킬 것이다. 이는 FAS 억제제가 증식 억제성을 갖는다는 사실과 외부에서 첨가된 지방산이 FAS 억제제로부터 정상 세포는 보호하지만 종양 세포는 보호할 수 없다는 사실에 의해 보여진다. 그러므로, 세포에 의한 지방산 합성을 막는 것은 종양 치료에 사용될 수 있다.

지방산은 기질인 아세틸 CoA, 말로닐 CoA 및 NADPH를 사용하여 지방산 신타제(FAS)에 의해 합성된다. 그러므로, 지방산 합성 경로는 대개 4 가지 효소를 포함하는 것으로 생각된다: FAS와 이의 기질을 생성하는 3 가지 효소, 즉 아세틸 CoA 카르복실라제(ACC), 말산 효소 및 구연산염 리아제. 또한, 상기 경로에 기질을 공급할 수 있는 다른 효소, 예컨대, 육탄당 일인산염 분로(分路)를 통해 NADPH를 생성하는 효소는 또한 지방산 합성 속도에 영향을 미칠 수 있는 바, 이는 내인적으로 합성된 지방산에 의존하는 세포 내에서 중요하다. 이러한 임의의 효소의 활성이나 발현을 억제하면 내인적으로 합성된 지방산에 의존하는 종양 세포의 증식에 영향을 미칠 것이다. 본 발명에 의하면, 종양 세포에 의한 지방산 합성을 억제시키는데 적절한 모든 방법을 사용하여, 특히 그 경로상의 임의의 4 가지 효소의 활성 억제제를 이용하는 방법을 사용하여 종양 환자 내의 종양의 정도를 감소시킬 수 있다.

FAS 생성물은 유리된 C₁₂-C₁₆지방산, 대개 팔미트산이다. 팔미트산은 각종 지질 성분에 대한 세포의 요구를 충족시키기 위해 추가로 가공되어야 한다. 본 명세서에서 사용된 '지질 생합성'이란 용어는 지방산 합성이나 지방산을 함유하는 세포 성분을 만들기 위한 지방산의 후속 가공시 일어나는 어느 1 단계 또는 여러 단계들의 조합을 의미한다. 이런 다운-스트림 가공(down-stream processing)에 있어서의 제1 단계는 지방 효소, 즉 아실 CoA 합성 효소에 의해 촉매되는 조효소 A에 대한 지방산의 커플링 처리로 지방산을 활성화시키는 것이다.

지방산의 다운-스트림 가공이나 이용에 있어서 주요 단계들을 억제하면 세포가 내인성 지방산에 의존적이거나 또는 세포의 외부로부터 공급된 지방산을 이용하거나 세포 기능이 억제될 것으로 기대되며, 따라서 다운-스트림 단계들의 억제제는 내인성 지방산에 의존적인 종양 세포에 대해 충분히 선택적이지 않을 수 있다. 그러나, 상기 세포에 지방산 합성 억제제를 투여하면 상기 세포가 다운-스트림 지방산 가공 및/또는 이용 과정 중의 억제제 보다 더욱 민감한 억제 작용을 나타낸다는 것을 발견했다. 이러한 상승 효과에 따라, 지질 생합성 및/또는 이용에 있어서의 다운-스트림 단계들에 관여하여 1종 이상의 억제제와 함께 지방산 합성 억제제를 조합물 형태로 투여하면 내인적으로 합성되는 지방산에 의존적인 종양 세포에 선택적으로 영향을 미칠 것이다. 바람직한 조합물은 FAS 또는 ACC의 억제제와 혼합된 아실 CoA 합성 효소 억제제이다.

C. 지방산 합성 억제제

환자가 FAS를 발현하는 종양을 갖는 것으로 결정되었을 때, 또는 OA-519가 암 환자로부터 얻은 체액 내에서 발견되었을 경우, 본 발명의 방법에 따라 지방산 합성 억제제를 환자에게 투여함으로써 환자를 치료할 수 있다. 본 발명의 범위에 포함되는 투여용 억제제는 세포에 의한 지질 생합성 또는 이용시 입증할만한 억제를 보여주는 모든 화합물을 포함할 수 있다.

지방산 합성을 억제하는 임의의 화합물을 종양 세포 증식 억제에 사용할 수 있으나, 환자에게 투여되는 화합물이니 만큼 악성 세포와 정상(비-악성) 세포에 대해서 동등하게 독성을 나타내서는 안된다. 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 억제제는 치료 지수가 높은 것이어야 한다(치료 지수(therapeutic index)란 정상 세포에 영향을 미치는 농도 대 종양 세포에 영향을 미치는 농도의 비이다). 치료 지수가 높은 억제제는 2 가지 세포주, 즉, 정상인 섬유아세포주와 같은 1종의 비-악성 세포주와 OA-519를 다량으로 발현시키는 것으로 나타난 1종의 종양세포주에대하여 그 억제제의 효과를 비교함으로써 동정할 수 있다.

특히, 치료 지수는 낮은 지방산 합성 활성 정도, 바람직하게는 1 분당 200,000 세포당 아실 글리세라이드 내로 약 10 fmol 미만의 아세틸-CoA 병입율을 나타내는 인간 세포주 같은 동물 세포의 증식 억제율과 높은 지방산 합성 활성 정도, 바람직하게는 1 분당 200,000 세포당 약 20 fmol 이상의 아세틸-CoA 병입율, 보다 바람직하게는 1 분당 200,000 세포당 아실 글리세라이드내로 약 80 fmol 이상의 아세틸-CoA 병입율을 나타내는 인체 암세포의 증식 억제율을 비교하므로써 측정할 수 있다. 바람직한 지방산 합성 활성 정도를 갖는 세포는 당업자라면 쉽게 얻을 수 있으며, 통상적으로 구입 가능한 세포주의 예는 하기 실시예 7에 기재한다. 세포 배양액에 첨가된 외인성 지방산, 예컨대, BSA에 결합된 0.5 mM의 올레산의 존재 하에 증식 억제 분석을 실시하는 것이 바람직하다.

억제제는 세포 증식을 50% 억제시키는데 필요한 농도(IC₅₀또는 ID₅₀)로 특정화될 수 있다. 치료 지수가 높은 FAS 억제제는, 예컨대, 비-악성 세포의 IC₅₀보다 낮은 농도(IC₅₀측정값)에서 종양 세포에 대해 증식 억제를 나타낼 것이다. 이 2 가지 세포 종류에 대한 억제 효과가 더 큰 차이를 나타내는 억제제가 보다 바람직하다. 바람직한 지방산 합성 억제제는 지방산 합성 활성이 높은 세포에 대한 IC₅₀값이 지방산 합성 활성이 낮은 세포에 대해 측정된 억제제의 IC₅₀보다 1/2 log 이상 낮고, 더욱 바람직하게는 1 log 이상 낮은 것이다.

지방산 합성 경로에 기질을 공급하는 효소 또는 지방산의 다운-스트림 가공및/또는 이용을 촉매하는 효소중 어느 하나의 효소에 대한 1종 이상의 억제제와 1종 이상의 지방산 합성 억제제의 상승 조합물을 투여하여 종양을 치료하고자 할 때, 치료 지수는 조합물의 성분과 억제제들의 농도에 대해 민감하게 된다. 비-악성 세포와 OA-519 발현 세포에 대한 특정 혼합물의 효과를 비교하여 각 성분들의 최적 농도를 측정하는 방법은 당업자에게는 통상적인 일이다. 치료 효과를 얻는데 필요한 각 성분들의 투여량은 각 성분의 약리학적 특성을 고려하여 약학적 표준 방법으로 결정할 수 있다.

지방산 합성 억제제 또는 억제제들의 상승 조합물은 치료하고자 하는 동물을 치사시킬 수 있는 농도 이하의 농도(투여량 및 치료 기간을 기초로 함)로 투여한다. 투여는 생체 기관을 비가역적으로 손상시키지 않는 농도로 투여되거나 또는 간 기능, 신장 기능, 심폐 기능, 위장 기능, 비뇨 생식 기능, 피부 기능, 근골격 기능 또는 신경 기능을 영구적으로 감퇴시키지 않는 것이 바람직하다. 한편, 연속적으로 재생되는 몇몇 세포(예, 자궁 내막 세포)를 치사시킬 수 있는 정도의 억제제 투여는 반드시 배제되는 것은 아니다.

아세틸 CoA 카르복실라제 및 FAS 복합체의 축합 효소는 억제 처리에 바람직한 대상이다. 이 효소들의 억제제를 사용하면 지방산 합성은 감소되거나 정지될 것이다. 그 결과로써 막 지질의 결손이 초래되어 세포를 치사시키게 된다. 그러나, 정상 세포는 순환 지질을 도입할 수 있기만 하면 생존할 것이다. 아세틸 CoA 카르복실라제는 지질 생합성 조절의 주요 요소이다. FAS 복합체의 축합 효소는 구조 및 기능면에서 잘 규명되어 있는 것으로서, 그 활성 중심(active center)은 중요한 시스테인 티올을 함유하며, 이는 세룰레닌 같은 항 지방혈증제의 표적이다.

지방산 신타제(FAS)를 억제하는 화합물은 다수 공지되어 있는 바, 종양 환자의 치료에 적절한 FAS 억제제를 선별하는 것은 당업자라면 충분히 가능한 것이다. 정제 효소를 사용하여 지방산 신타제 활성을 억제하는 화합물의 능력을 시험함으로써 FAS 억제제를 동정할 수 있다. 지방산 신타제 활성은 NADPH의 산화를 기초로 하여 분광 광도계로 측정하거나 또는 방사능 표지된 아세틸-CoA 또는 말로닐-CoA의 병입을 방사능 활성으로 측정하여 검출할 수 있다(참고 문헌 : 딜즈 외 다수,Methods Enzymol,35 : 74-83). 적절한 FAS 억제제는, 예컨대 표 2a ∼2c에 예시된 것 중에서 선택할 수 있다.

지방산 합성 경로에 관여하는 효소들의 대표적인 억제제

지방산 신타제의 억제제 :

1,3-디브로모프로파논엘만 시약(Ellman's reagent)[5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산), DTNB]4-(4'-클로로벤질옥시)벤질 니코티네이트(KCD-232)4-(4'-클로로벤질옥시)벤조산(MII)2[5(4-클로로페닐)펜틸]옥시란-2-카르복실레이트(POCA) 및 이의 CoA 유도체에톡시포름산 무수물티오락토마이신세룰레닌멜라소프롤요오도아세테이트페닐아르신옥사이드

지방산 합성 경로에 관여하는 효소들의 대표적인 억제제

지방산 신타제의 억제제 :

펜토스탬멜리틴메틸 말로닐 CoA

구연산염 리아제에 대한 억제제 :

(-) 히드록시시트레이트(R,S)-S-(3,4-디카르복시-3-히드록시-3-메틸 부틸)-CoAS-카르복시메틸-CoA

아세틸 CoA 카르복실라제에 대한 억제제 :

세톡시딤할록시폽 및 이의 CoA 에스테르디클로폽 및 이의 CoA 에스테르클레토딤알록시딤트리폽클로피브르산2,4-D 메코프롭달라폰2-알킬 글루타레이트2-테트라데카닐글루타레이트(TDG)2-옥틸글루타르산9-데세닐-1-펜텐디산데카닐-2-펜텐디산데카닐-1-펜텐디산(S)-이부프로페닐-CoA(R)-이부프로페닐-CoA플루아지폽 및 이의 CoA 에스테르클로폽5-(테트라데시클록시)-2-푸란산β, β'-테트라메틸헥사데칸디산트랄콕시딤유리 β, β'-메틸-치환된 헥사데칸디산 또는 이의 모노티오에스테르(MEDICA 16)α-시아노-4-히드록시신나메이트S-(4-브로모-2,3-디옥소부틸)-CoAp-히드록시머큐리벤조에이트(PHMB)N6,O2-디부티릴 아데노신 시클릭 3',5'-모노포스페이트N6,O2-디부티릴 아데노신 시클릭 3',5'-모노포스페이트N6,O2-디부티릴 구아노신 시클릭 3',5'-모노포스페이트5-(테트라데실옥시)-2-푸란산(TOFA)의 CoA 유도체2,3,7,8-테트라클로로디벤조-p-디옥신

말산 효소에 대한 억제제 :

페리오데이트-산화된 3-아미노피리딘 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산)p-히드록시머큐리벤조에이트N-에틸말레이미드S-옥살릴글루타티온 같은 옥살릴 티올 에스테르고시폴

지방산 합성 경로에 관여하는 효소들의 대표적인 억제제

말산 효소에 대한 억제제 :

페닐글리옥살2,3-부탄디온브로모피루베이트프레그네놀론

약물 멜라소프롤은 3가 비소 화합물이며 ; 펜토스탐은 5가 안티몬 화합물이다. 3가 비소 화합물은 5가 안티몬 화합물과 같이 인접 티올기와 반응한다. 지방산 신타제 활성은 멜라소프롤 및 다른 SH 시약에 의한 억제의 표적으로서 작용하는 다수의 환원된 티올기를 필요로 한다.

상기 구충 약물 외에도, 다양한 부위에서 FAS를 억제하는 많은 다른 화합물이 있는데, 예컨대 단백질 키나제 억제제는 전사를 차단시키며 ; 미세관(microtubule)으로의 콜치신(colchicine) 간섭은 FAS의 인슐린 유도를 차단하며 ; 벌의 독에서 얻은 펩티드인 멜리틴은 몇몇 종에서 얻은 FAS의 아실 담체 단백질에 가교 결합을 형성하며 ; 항생제인 세룰레닌은 FAS의 축합 효소 활성을 차단한다. 세룰레닌은 참고 문헌[푸나바시 외 다수,J. Biochem.,105 : 751-755, (1989)]에 예시된 바와 같은 지방산 신타제의 축합 효소 활성의 특이적 억제제이며 ; 세룰레닌은 본 발명의 방법에 바람직한 FAS 억제제이다.

축합 효소의 바람직한 억제제로는 다양한 범위의 화합물을 포함하며, 이의 예는 알킬화제, 산화물 제제 및, 디설피드 상호교환을 일으킬 수 있는 제제이다. 효소의 결합 포켓(binding pocket)은 하기와 같은 장쇄,E,E, 디엔이 바람직하다.

주로 전술한 바와 같은 측쇄 디엔을 포함하는 시약과 티올레이트 음이온과 반응성이 있는 기는 축합 효소의 우수한 억제제가 될 수 있다. 그 일예는 다음과 같이 표시되는 세룰레닌 (2S)(3R) 2,3-에폭시-4-옥소-7,10-도데카디에노일 아미드이다.

여러 가지 작용기와 디엔 측쇄를 갖는 다른 화합물의 예는 하기와 같다 :

X = 토실, 할라이드 또는 다른 이탈기(leaving group)

R기 테일(tail)은 참고 문헌[모리사키 외 다수, Eur. J. Biochem.211, 111(1993)]의 보고에 따라 달라질 수 있다. 측쇄 길이를 증가시키거나 감소시키는 것은 억제역가를 감소시킨다. 테트라히드로세룰레닌은 세룰레닌보다 80 내지 150 배 정도 효능이 적다. 이는 측쇄내의 π전자가 결합에 중요한 역할을 한다는 사실과 일치한다. 또한, 트랜스 이중 결합은 중요할 수도 있는 구조적 강도를 부여한다.

본 발명의 다른 구체예로서, 아세틸 CoA 카르복실라제, 말산 효소 또는 구연산염 리아제를 억제하는 화합물을 투여하여 종양 환자를 치료할 수 있다. 이 효소들에 대표적인 억제제를 표 2a ∼2c에 나타낸다. 특정 억제제의 선별 기준은 전술한 FAS 억제제에 대해 논의된 것과 동일하다.

아세틸-CoA 카르복실라제에 대한 분석법은 본 명세서에서 참고 인용된 미국 특허 제5,143,907호에 교시되어 있으며, 이 분석법은 당업자에 의해 공지된 절차로 ACC 억제제에 대한 억제 상수를 측정하는데 사용될 수 있다.

다양한 유기체에서 유래하는 아세틸 CoA 카르복실라제를 억제하는 억제제로서 프로파노에이트가 바람직하다. 이 억제제는 하기 화학식으로 나타낼 수 있다:

상기 식 증에서, R은 수소, 알킬 또는 아릴일 수 있다. 비대칭 탄소 원자의 배열은R,S또는 라세믹일 수 있다. 식물의 아세틸 CoA 카르복실라제는R이성질체에 훨씬 더 민감하다. R¹은 주로 아릴-옥시-아릴, Ar-O-Ar이다. 방향족 고리는 벤젠, 피리딘 등일 수 있다. 방향족 고리상의 할로- 및 다른 치환체도 사용 가능하다. 프로파노에이트의 예는 하기와 같고, 및/또는 표 2a∼2c에 기재한 바와 같다.

플루아지폽

디클로폽

디클로르프롭

프로파노에이트의 몇몇 동족체들은 우수한 억제제이다. 한 예로는 TOFA, 5-(테트라데실옥시)-2-푸란산으로서, 강력한 아세틸 CoA 카르복실라제 억제제이다. 그 구조는 하기와 같다:

이 경우 C-2 는 비대칭 탄소가 아니다. R 기는 선형의 포화된 14 개의 탄소 측쇄이다. 또한, 본 발명에 포함되는 이 화합물과 관련 화합물을 합성하는 방법은 본원에 참고 인용된 미국 특허 제4,146,623호에 교시되어 있다.

프로파노에이트 동족체의 또 다른 예는 하기 TDGA 또는 테트라데실글리시드산이다:

소수성이고 에테르 산소에 대해 β위치의 카르복실 탄소가 공통적인 구조적 특징이다. 기타 관련된 2-치환된 프로파노에이트들은 이부프로펜, 이부프록삼 및 그 유도체와 같은 화합물을 포함한다.

이부프로펜 이부프록삼

R=이소부틸 R=이소부틸

케토시클로헥센은 아세틸 CoA 카르복실라제 억제제의 또 다른 군을 나타낸다. 그 일예로 세톡시딤이 있다 :

세톡시딤

상기 식 중에서, R은 에틸티오프로필 기이다.

아세틸 CoA 카르복실라제를 억제하는 화합물의 또 다른 군은 하기 화학식으로 표시된다 :

글루타르산 및 펜텐디산과 같은 구체적인 예들은 표 2a∼2c에 기재하였다.

아세틸 CoA 카르복실라제와 FAS 외에도, 기타 다른 표적 효소로는 구연산염 리아제과 말산 효소를 포함한다. 이 효소들은 FAS를 통한 지질 생합성에 아세테이트와 NADPH를 제공한다. 각 반응들은 다음과 같다 :

구연산염 + ATP + CoA →Ac-CoA+ ADP + 옥살로아세테이트

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구연산염 리아제

말레산염 + NADP → 피루베이트 + CO₂+NADPH

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말산 효소

또한, 아세틸 CoA 또는 NADH의 제거가 지질 합성을 정지시킬 수 있으므로 치료 화합물은 상기 억제제들을 기본 성분으로 할 수 있다.

지방산 합성 경로의 효소들 중에서, FAS는 지방산 경로내에서만 작용하기 때문에 억제용으로 바람직한 표적인 반면, 기타 다른 세 가지 효소들은 다른 세포 작용에도 관여한다. 그러므로, 기타 세 가지 효소들 중의 하나를 억제하면 정상세포들에도 영향을 미치는 수가 더 많다. 그러나, 이들 효소들 중의 하나에 대한 억제제가 전술한 바와 같은 높은 치료 지수를 갖는 것으로 나타나는 경우에 본 발명에서는 그 억제제를 치료학적으로 사용할 수도 있다. 숙련된 임상의라면 후술하는 것을 기초로 상기 치료를 요하는 암환자를 치료하기 위해 지방산에 대한 합성 경로내의 모든 효소의 억제제를 투여하고 그 투여 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명에 있어서, 높은 치료 지수로 나타나는 것 같은 지질 생합성에 대해 비교적 특이적인 특정 억제제(예컨대, 전술한 상승 작용을 갖는 조합물의 일부로서)들이 제조될 수 없다면, 미국 특허 제5,143,907호에 개시된 아인산염-보란이나, 또는 요오도아세트아미드 같은 많은 다른 세포 효소 계와 경로에 대해 일반적으로 억제성인 억제제들을 사용하는 것은 본 발명에 포함되지 않는다.

팔미테이트는 지방산 합성효소 경로의 주생성물이다. 팔미테이트의 신장 및 산화 반응은 필수적인 막지질의 생성에 중요할 수 있다. 그런 목적을 위해, 지방산에 대한 신장 및 산화 단계와 기타 다른 가공 단계들은 치료법에 이용 가능한 분자적 표적일 수 있다. 내인적으로 합성된 지방산 및 외인적으로 섭취하는 지방산은 지질에 병입되려면 먼저 아실-CoA 합성효소에 의해 활성화되어야 한다. 장쇄 지방산 아실-CoA는 동물 세포에 대한 필수 대사산물이므로 아실-CoA 합성 효소는 바람직한 표적이다.

도모다 외 그 동료들(도모다 외 다수, Biochim. Biophys. Act 921 : 595-598 1987 ; 오무라 외 다수, J. Antibiotics 39:1211-1218 1986)은 천연적으로 발생하는 아실-CoA 합성 효소 억제제로서, 스트렙토마이세스 종 SK-1894의 생성물인 트리악신 C(Triacsin C; 때로는 WS-1228A로 언급됨)를 기술하였다. 트리악신 C의 화학적 구조는 1-히드록시-3-(E,E,E-2',4',7'- 운데카트리에닐리딘) 트리아젠이다. 트리악신 C는 8.7 μM에서 래트의 간 아실-CoA 합성 효소의 50%를 억제하며; 관련 화합물인 트리악신 A는 장쇄 지방산에 대해 경쟁적인 기작에 의해 아실 CoA-합성 효소를 억제한다. 아실-CoA 합성 효소를 억제하는 것은 동물 세포에 해롭다. 도모다 외 다수(도모다 외 다수, J. Biol. Chem. 266; 4214-4219, 1991)는 트리악신 C가 1.0 μM에서 Raji 세포들의 증식을 억제하며, 또 Vero 및 Hela 세포들의 증식도 억제하는 것으로 밝혀졌음을 니타내고 있다. 또한, 도모다 외 다수는 아실-CoA 합성 효소가 동물 세포에서 필수적이며 그 효소를 억제하는 것은 치명적 영향을 미친다고 개시하고 있다.

지질 합성은 다수의 효소적 단계로 이루어진다. 따라서, 2 이상의 단계에서 지질 생합성을 억제하는 것이 상승 작용을 나타낼 수 있는 바, 단일 제제의 필요한 농도와 잠재적 독성을 저하시킬 수 있다. 아실-CoA 합성 효소는 모든 세포들이 지속적으로 존속하기 위해 반드시 요구되는 보편적인 효소이므로, 그 억제제는 너무 독성이 커서 단일 항암제로는 유효하게 사용될 수 없다. 이와는 반대로, 아실-CoA 합성 효소 억제제가 세룰레닌, 즉 특이적인 지방산 합성 효소 억제제와 함께 사용되는 경우에는 상승 효과가 얻어지며, 각 약물은 더욱 효과적으로 된다.

D. 지방산 합성 억제제 투여

지방상 합성의 억제제는 억제제와 약학적 허용 담체를 함유한 약학 조성물로 배합되는 것이 바람직하다. 다른 성분들이 치료가 소용없을 정도로 합성 억제제의유효성을 감소시키지 않는 한 그 약학 조성물은 다른 성분들을 함유할 수 있다. 약학적 허용 담체는 공지되어 있으며, 약학 분야의 당업자라면 특정 투여 경로에 적합한 담체를 쉽게 선택할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985).

본 발명의 억제제중 임의의 억제제를 함유하는 약학 조성물은 약물, 종양의 유형 및 종양의 위치에 따라 필요한 만큼 비경구적으로(피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 늑막내, 소낭내, 또는 척추강내), 국소적으로, 경구적으로, 직장내 또는 비측으로 투여될 수 있다.

치료시 투여량 및 지속 시간은 약물의 치료 지수, 종양 유형, 환자의 연령, 환자의 체중 및 독성의 내성(tolerance)을 비롯하여 다양한 인자들에 좌우될 것이다. 일반적으로 투여량은 혈청내 농도가 약 0.1 ㎍/ml 내지 약 100 ㎍/ml이 되도록 선택한다. 초기 투여량은 약물의 성질에 따라 치료 지수를 측정하는데 사용된 것과 같은,시험관내모델, 및 생체내 모델과 임상 시험에서 유효한 것으로 보이는 포괄적인 농도 내지 최대 허용량 이하로 선택하는 것이 바람직하다. 종양학의 표준 절차는 화학요법이 환자 각각에 대해 조정되고, 그 화학 요법제의 순환 농도가 규칙적으로 모니터될 것을 필요로 한다. 특정 환자에 대한 특정 약물의 투여량 및 치료 지속 기간은 숙련된 임상의라면 전술한 여러 인자들을 고려하여 표준 약리학적 접근법으로 측정할 수 있다. 치료에 대한 응답 반응은 지방산 신타제의 혈액내 농도 또는 체액내 농도 분석, 종양 조직내의 FAS 활성 또는 OA-519 양의 측정 또는 환자내에 존재하는 종양 정도의 모니터링으로 조사할 수 있다. 숙련된 임상의라면이런 측정에 의해 나타나는 치료에 대한 응답 반응을 기초로 하여 치료의 지속 시간 및 투여량을 조정 가능할 것이다.

E. 선택적 화학 치료 방법

바람직한 양태에서, 본 발명의 방법은 지방산 합성 억제제를 사용하여 치료되는 환자의 정상 세포를 보호한다. 잠재적 독성으로부터 간(보통 광범위한 지방산 신타제 활성을 발현할 수 있음) 같은 비-종양성 정상 조직을 보호하기 위해, FAS 효소 및/또는 지방산 합성 활성의 농도는 치료전 및/또는 치료중에 억제-조절할 수 있다. 억제 조절은 음식물 내에 필수 지방산을 공급하거나, 열량 흡수를 감소시키거나 또는 글루카곤 투여 같은 기타 효과적인 방법에 의해 수행될 수 있다.

FAS는 정상 조직에 존재하는 유도성 효소이기 때문에, 열량 흡수를 감소시키면 정상 세포에 의한 FAS의 발현을 낮출 수 있을 것이다. 독성이 가장 강한 종양 세포는 FAS(OA-519)를 구조적으로(constitutively) 발현한다. 열량 흡수를 제한시킨 환자에 있어서, FAS 발현은 종양 세포에 제한되며, FAS 억제제의 세포 독성 효과는 유사하게 제한될 것이다. 일반적으로, FAS 발현의 억제-조절은 억제제의 투여전 및 투여 중에 환자의 열량 흡수를 감소시키므로써 지방산 합성 억제제 요법과 병행한다.

FAS 발현을 감소시키는 다른 적합한 방법은 지방산, 바람직하게는 필수 지방산을 외인적으로 투여하는 방법이다. 이 지방산은 정상 세포의 FAS 발현을 억제-조절하는 모든 방법으로 제제화될 수 있다. 또는, 환자의 음식 중에 포함시키거나, 지방산 합성 억제제와 동일한 약학 조성물 내에 배합시키거나 또는 기타 적합한 방법으로 투여될 수 있다.

정상 조직내의 FAS 발현을 감소시키기에 적합한 식이요법은 보통 임상의라면 쉽게 실시할 수 있는 것이다. 또한, 정상 세포에 의한 FAS 발현을 감소시키는 임의의 방법도 지방산 합성 억제제가 종양 세포에 대해 세포 독성인 수준으로 환자 내에 존재하는 동안 정상 세포 내의 FAS 농도를 감소시킨다면, 본 발명에 포함되는 것이다.

실시예

하기 실시예들은 단지 예시를 위한 것이다. 이것은 전술한 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니며, 본 발명은 오직 첨부된 특허 청구 범위에 의해서만 한정된다.

실시예 1 : 유방암 환자의 생존률 감소 및 전립선 암과 난소암 환자의 생존률 및 무질병 생존률의 감소와 관련 있는 OA-519 발현

본원에 참고 인용된 국제 특허 공개 번호 WO 90/08324호 또는 미국 출원 일련번호 07/735,522호에 기재된 실시예 7은 유방암에서의 OA-519 발현이 병의 재발을 증가시키는 것에 관여한다는 것을 입증하였다. 따라서, 임상학적 연구를 통해 OA-519의 발현과 전립선 및 유방암에 있어서의 총 생존률 감소 및 난소암에 있어서의 총 생존률 및 무질병 생존률 감소와의 관련성을 확인하였다.

유방암

환자 개체군: 유방에 걸린 135명의 여성들로 이루어진 최초 집단 (최초의 외과적 치료 연구에 동원된 환자들)을 노르톤 병원의 종양 등록소에 의해 확인 절차를 밟고, 그들 모두를 원시 침윤성 관 유방암에 대해 유방절제술을 시술하였다. 평균 연령은 52세이며 32세부터 72세까지 포함한다. 후속 검사는 평균 12.3년 이었으며 10년 내지 16년까지 실시하였다. 수술 후의 치료 기록, 사망 원인, 생존시간 및 원발성 종양의 파라핀 블록이 각각의 환자에 대해 입수되었을 때 환자들에 대한 연구를 시작하였다. 에스트로겐 및 프로게스테론 수용체 정보를 면역 조직 화학적으로 측정하였다. 또한, 환자의 연령, 화학 요법의 투여량과 종류, 방사선 치료요법 및 호르몬 치료요법을 문서화하였다. 또한, 침윤 종양 종류와 핵 등급을 피셔 외 다수(피셔 외 다수,Cancer, 46:908-918, 1980)의 기준을 사용하여 평가하였다.

OA-519에 대한 면역 조직 화학적 염색: 미국, 메릴랜드 20852, 록빌, 파크런 드라이브 12301에 소재한 미국 모식균 배양 배양소에서 ATCC 수탁 번호 HB10853 호하에 1991년 7월 26일자로 기탁한 OA-519-M1 또는 HPR-2로 명명되는 하이브리도마 세포로부터 취한 단일클론 항-OA-519 항체를 사용하여 면역조직화학적 염색법을 실시하였다.

개략하면, 1차 항-OA-519 단일클론 항체를 탈파라핀화한 조직 단편 상에서 2.5 ㎍/ml으로 1 시간 동안 37 ℃에서 항온 처리시켰다. 세정완충액으로 세정한 후, 슬라이드들을 1 시간 동안 1/400 토끼 항-마우스 항체(DAKO)내에서 항온 처리시켰다. 또 한번 세정한 후, 슬라이드들을 아비딘-결합된 양고추냉이 퍼옥시다제(Vectastaing ABC 키트)와 1 시간 동안 항원 처리시켰다. 아비딘-비오틴 복합체의 형성후, 슬라이드들을 수성 헤마톡실린 중에서 항온 처리하고, 커버글라스를 덮고, 관찰하였다.

OA-519 면역 반응성 및 양성에 대한 기준: 양성 염색은 미립의, 세포질성이며 이질성이었다. 또한, 염색은 100 배율에서 육안으로 보여야 하거나 또는 양성으로 기록될 경우에 대해 종양 세포들의 10% 이상을 표지하여야 한다.

OA-519 면역반응성의 예후적 의미: OA-519에 대해 양성 염색된 종양을 갖는 환자는 유방암으로 사망할 위험성이 현저히 증가했다. 제1도는 OA-519 양성 및 음성 환자들의 운명을 보여주는 생명표이다. 예를 들면, 12년후, OA-519 양성 환자들은 약 85%가 사망하는 것에 비해 OA-519 음성 환자들은 약 37%가 사망하였다.

다음 표는 단계별 OA-519 반응성의 의미를 보여준다 :

	단계 1	단계 2	단계 3
	사망율%	사망율%	사망율%
OA-519+	9/13 (70%)	27/31 (87%)	9/9 (100%)
OA-519-	3/20 (15%)	16/41 (39%)	12/21 (57%)
p-값	0.002	< 0.0001	0.019

전립선 선암에 의한 OA-519의 발현

전립선암에 있어서도 OA-519의 발현이 병의 재발과 관련이 있는 것으로 발견되었다. 전립선 선암으로 진단받고 치료 받은 환자는 마운틴 홈 VA 메디칼 센터의 파일 중에서 선택하였다. 연구 모집단은 미국 비뇨기과 시스템(AUS)에서 단계 A 내지 D1에 속하는 전립선 암에 걸린 99명의 환자를 포함했다. 종양 등록소의 개요서나 또는 임상기록를 검토하여 임상 단계에 대한 정보를 입수하였다. 선택 시기에 원거리 전이 상태(AUS 단계 D2)이고, 마지막 후속 검사시의 상태를 알지 못하거나 또는 총 후속 검사가 2년 미만인 환자들은 상기 연구로부터 제외시켰다.

조직 병리학적 연구 :

종양 등급 : 모든 슬라이드들을 검토하여 글리슨(Gleason) 스코어를 두개의 가장 우세한 2가지 유형에 대한 수를 더하므로써 측정하였다(Gleason, Tannenbaum M(ed)내에서 : 비뇨기 병리학 : 전립선 필라델피아, 1988, Lea & Febiger, pp171-198). 글리슨 스코어 2 내지 4 는 등급 I로, 스코어 5 내지 7 은 등급 II로, 스코어 8 내지 10 은 등급 III으로 정하였다.

면역조직화학적 연구

하나의 대표적인 조직 블록을 면역조직화학적 염색법으로 각 암환자들로 부터 선별하였다. OA-519 정제물에 대해 토끼 내에서 유발된 친화도 정제된 다중클론 항체를 본 연구에 사용하였다. 통상적으로 처리하고, 포르말린 고정시키고, 파라핀 함침시킨 조직을 염색시켰다. 표지되지 않은 1차 항체를 사용하는 아비딘-비오틴 복합체(ABC) 면역 퍼옥시다아제 기법을 사용하였다. 개략해 보면, 20분 동안 3% 과산화수소를 포함한 인산염 완충 식염수(PBS) 중의 5% 탈지 분유 중에서 6 mm의 탈파라핀화하고 재수화시킨 조직 단편을 항온 처리시켜서 비특이성 단백질 상호작용 뿐 아니라 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단시켰다. 그 후, 실온에서 1 시간 동안 pH 7.2의 PBS 중에 함유된 친화도-정제된 다중클론 항-OA-519 2.7 ㎍/ml과 함께 슬라이드들을 항온 처리시켰다. 중간에 PBS로 세척하면서, 세포 단편을 PBS (벡터 연구소)중에 1:200의 비율로 희석시킨 비오틴화된 염소 항-토끼 면역글로불린과 아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 복합체(Vectastain^R, 벡터 연구소)로 각각 30 분씩 22 ℃에서 연속 항온 처리시켰다. 아미노에틸 카르바졸(AEC) (벡터 연구소)을 메이어의 헤마톡실린 대비염색시의 색소원으로서 사용하였다. 음성 대조군으로서각 경우마다 1차 항체 대신 PBS를 사용하였다. 공지의 항 OA-519 양성군은 각 실험마다 양성 대조군으로 사용하였다.

염색은 (1) 면역반응성을 저배율(100 x)에서 식별할 수 있고,

(2) 관찰 가능한 핵염색없이도 과립 세포질 염색이 나타나며, 그리고

(3) 염색이 이질성(즉, 세포간 또는 단편들마다 반응성의 정도가 다름) 이라면 OA-519 에피토프에 대해 양성으로 판정한다. 종양은 양성 또는 음성으로 기록하였다. OA-519에 대한 양성 염색은 조사된 99명의 원발성 전립선 암중에 56명(57%)에게서 나타났다.

평균 총 후속 검사 시간은 4.17년(범위, 2.01년 내지 9.33년)이었다. 전립선암은 환자들중 19명(19%)에게서 재발 또는 진행되었다. 진행은 근본적인 전립선 절제술 또는 방사선과 같은 '치료 효험이 있는' 치료후 국소적 또는 전이 질병의 발현으로 정의하거나 또는 호르몬 치료법으로 치료되거나 또는 기대한 만큼 치료된 환자의 질병 단계의 진전으로 정의한다. 질병의 평균 진행 시간은 2.54년(범위 0.67년 내지 5.85년)이었다.

질병의 진행은 OA-519-양성 군 중에서 15명(27%)인데 비해 OA-519-음성 군 중에서는 4명(9%)이었다(케플렌-마이어(Kaplan-Meier) 도표, 제24-1도). 진행된 암의 비율에 있어서 전술한 군들간의 차이는 통계적으로 뚜렷하였다(윌콕슨 및 log 순위 시험(P<0.009) 및 피셔 정확도 시험(P<0.04)). OA-519는 낮은 저등급과 중간 등급의 전립선암 중에서 특히 중요한 예후성 지시 인자인 반면, 글리슨 스코어에 의한 조직학적 등급은 뚜렷한 예후성 지시 인자가 아니었다(데이타는 제시되지 않음).

난소암

카진스키 등에 의한 난소암은 유방암 연구에서 사용했었던 것과 같은 항체, 염색 과정 및 해석법을 사용하여 진행하였다. 그러나, 이제까지 이루어졌던 34명의 환자들의 분석 결과를 기초로 하여, 무질병 생존률과 총 생존률의 감소와 OA-519 발현 사이의 관련성을 제2b도에 제시하였다.

실시예 1A:예후성 마커

실시예 1에서 나타낸 바와 같이 초기 유방암에서 OA-519 발현은 강력한 예후 인자 이었다. 이 예후 가능성은 에스트로겐과 프로게스테론의 수용체가 제공하는 예후력과는 무관한 것이었다. 인체 유방암중에서 OA-519의 발현 증가는 질병의 재발 또는 총 생존률에 의해 측정되는 바와 같이 현저히 악화된 예후를 제공하였다. 단계 I 내지 III의 유방암(마틴 등, 원고 준비중)을 가진 135명의 환자에 대한 임상 연구에서, 콕스의 다변수 비례 위험 분석은 OA-519와 프로게스테론 수용체의 발현이 단계와는 무관하게 생존률의 역으로 강력하고 독립적인 관련성이 있음을 입증했다(일변수 상대적 위험은 각각 4.860, 0.070이고; 다변수 상대적 위험은 각각 2.567, 0.153 임).

OA-519 발현의 예후력은 케플렌-메이어 도표를 수반하여 상세히 설명한다(제1도 및 제1a도). 제1도는 OA-519 음성 환자의 약 50%에 비해 OA-519 양성 환자의 약 10%가 15년간 생존하였음을 입증한다. 제1a도는 2개의 독립적인 예후성 마커인 OA-519 및 프로게스테론 수용체가 복합되는 경우, 개선된 예후적 층형성을 보여준다. 이것은 환자들을, OA-519 양성, 프로게스테론 수용체 음성의 매우 위험한 그룹(88% 사망), OA-519 음성/프로게스테론 수용체 양성의 덜 위험한 그룹(5.4% 사망), 및 중간 위험 그룹(63% 사망)으로 층형성시켰다.

이 연구에 포함된 여러 마커들 중에서, OA-519는 p185^ncu및 카텝신 D 발현과는 무관하였다. 흥미롭게도, OA-519 발현은 세포핵 항원을 증식시키므로써 측정되는 바와 같이 종양 세포 증식과는 관련이 없었다. 유동 세포 측정법으로 측정한 S-단계와 OA-519 발현의 개별 연구에서는 OA-519 발현이 또한 S-상 분획과 연관성이 없다고 밝힌 바 있다(Shurbaji 등, Lab Invest.,68: 69A, 1993). 따라서, OA-519 발현은 전술한 마커 또는 기타 독립적인 예후적 마커를 사용하여 환자 모집단의 층형성을 증진시킬 수 있다.

실시예 2 : 세포 파쇄액으로부터 OA-519 단백질의 정제 및 부분 서열

인간의 유방암 세포주로부터 정제한 OA-519는 쥐의 지방산 신타제와 상동성인 펩티드 서열을 갖는데, 이것은 OA-519의 제한된 단백분해성 분해물을 전기블롯팅하고, 이어서 PVDF 막으로부터 직접 미소 서열 결정화하여 얻은 OA-519의 내부 펩티드 서열을 기초로 한 것이다.

제2c도에 도시된 바와 같이 ZR-75-1 인체 유방암 세포주로부터 OA-519를 정제하였다. 이 도면은 다양한 정제 단계로 정제된 단백질 제조물의 4% 내지 - 8% 구배 겔 SDS PAGE를 보여준다. 오른쪽 패널은 쿠마시 블루로 염색한 것이고, 왼쪽 패널은 제3a도에 도시된 펩티드에 대해 유발된 친화도 정제된 다중 클론 항체를 사용한 웨스턴 블롯이다.

ZR-75-1 인체 유방암 세포를 배지 중에서 거의 응집성이 되도록 성장시켰다. 응집성 단일층을 인산염-완충 식염수로 세정한 후, 긁어내어 원심 분리에 의해 수거한 다음, 동결 저장하였다.

약 1.5 × 10⁷세포씩 분획한 각 일정량에, 10 ml의 정제용 완충액(20 mM 트리스 HCl, 4 ℃에서 pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.1 mM 디이소프로필플루오로포스페이트, 0.1mM 플루오르화 페닐메틸설포닐)을 첨가하였다. 다운스 균질기로 10회 세포들을 균질화시킨 뒤, 4 ℃에서 30분간 16,000 × g로 원심 분리하여 의해 투명한 상청액을 얻었다(제2c도의 레인 L에 투명한 ZR-75-1 저장성 파쇄액을 장입함).

2.5 × 90 cm의 세파크릴 S-200(파마시아) 겔 여과 컬럼을 1 mM β-메르캅토에탄올 및 100 mM KCl을 함유한 pH 8.0의 정제 완충액으로 미리 평형화시켰다. 0.45 mM 여과지를 통해 ZR-75 파쇄액을 여과한 후 컬럼상에 25ml/h씩 주입하였다. 분획들을 4% 쿠마시-염색 겔을 사용하여 SDS-PAGE한 결과 270,000 Da의 폴리펩티드가 존재함이 확인되었다. 폴리펩티드의 존재는 제3a도에 제시된 펩티드에 대해 특이적인 다중 클론 항체 또는 항- OA-519 단백질과 웨스턴 블로팅하고, 이 블롯을¹²⁵I-단백질 A로 발색시키므로써 선택적으로 확인할 수 있다(제2c 도의 레인 G에는 겔 여과 컬럼으로부터 모은 분획들을 주입하였다).

세파크릴 칼럼에서 얻은 양성 분획을 모으고, 같은 부피의 정제용 완충액 + 1 mM β-메르캅토에탄올로 희석한 후 미리 평형화시킨 모노-Q HR5/5 음이온 교환 HPLC 컬럼(파마시아)상에 주입하였다. 1 ml/분의 유동 속도에서 그 컬럼을 정제용완충액 + 1 mM β-메르캅토에탄올 15ml로 세척하고, 최종 농도가 1M KCl이 되게 하여 60ml의 선형 구배로 60분간 용출시킨 후 1M KCl 함유-정제용 완충액 + 1 mM β-메르캅토에탄올 5 ml로 세척하였다. 폴리펩티드를 함유한 분획을 쿠마시-염색된 4% 겔을 사용하여 SDS-PAGE로 선별하였다(제2c도의 레인 A에는 음이온 교환 컬럼으로부터 모은 분획을 주입하였다). OA-519로 표시한 정제 폴리펩티드를 함유한 분획을 모으고 다운 스트림 실험 요구 조건에 따라 더 가공하였다. 특징적인 수율은 2 × 10⁷개의 세포당 대략 OA-519 1 mg이었으며, 순도는 쿠마시 염색 SDS 폴리아크릴아미드 겔로 측정한 결과 98% 이상이었다.

최종적으로 히드록시아파타이트 크로마토그래피 단계를 추가 실시하여 Bio-Rad MAPS 분석용 HPHT 카트리지를 사용하여 99% 이상의 순도를 얻었다. 0 mM 내지 600 mM 인산염 구배를 사용한 결과, OA-519가 200 mM 인산염에서 하나의 피크 내로 용출되었다.

정제된 OA-519를 pH 8.0의 50 mM 중탄산 암모늄으로 투석하고, 내인성 단백질 분해 효소 글루타메이트 C(V8 프로테아제)의 1:50 희석액으로 37 ℃에서 15분간 단백분해적으로 절단하였다. 그 펩티드를 4% 렘리(Laemmli) 겔 상에서 SDS-PAGE 처리하고 PVDF 막(Bio Rad)으로 이동시키고, Applied Bio Systems 기체상 서열결정기로 자동 에드만 분해법을 사용하여 PVDF 막에서 직접 서열을 결정하였다(Matsudaira, P. T., 'A Practical Guide To Protein and Peptide Purification for Micro-Sequencing)미소-서열 결정을 위한 단백질 및 펩티드 정제에 대한 실제적 지침', Academic Press, 뉴욕, 1989).

제한된 단백분해적 절단은 약 150 kD 및 134 kD의 2개의 주된 펩티드를 만든다. 150kD 펩티드는 차단된 N-말단을 가지므로 N 말단의 OA-519 펩티드를 대표한다. 제3b도에 제시된 13개의 아미노산들에 있어서 쥐의 지방산 신타제와 84.6% 상동성을 보이는 134kD 내부 펩티드로부터 N-말단 서열을 얻었다. 따라서, OA-519는 약 270kD 분자인 지방산 신타제와 구조적 상동성을 나타낸다.

실시예 3 : 지방산 신타제 활성을 갖는 OA-519

ZR-75-1 인체 유방암 세포주로부터 정제한 OA-519는 지방산 신타제에 대한 특이적 반응인, NADPH의 존재 하에 아세틸 조효소 A와 말로닐 조효소 A를 지방산 내로 병입하는 능력에 근거한 지방산 신타제 활성을 갖는다(Wakil, S. J.,Biochemistry, 28: 4523-4530, 1989). 이 반응은 지방산 신타제에 대해 특이적이다. OA-519에 의한 지방산 합성은¹⁴C 말로닐 조효소 A의 지방산내로의 병입, 연속적인 지방산의 에스테르화, 및 역상 박층 크로마토그래피 분석에 의해 입증하였다.

OA-519에 의한 지방산내로 ¹⁴ C 말로닐 조효소 A의 병입:

프로테아제 억제제가 신타제 분석의 최종 단계를 방해하므로 프로테아제 억제제를 제외시킨 것 외에는 실시예 2에서와 같이 OA-519를 정제하였다. 25 ℃, pH 7.5에서 20 mM Tris HCl, 270 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT로 이루어진 용액 20 ㎕ 중에 용해시킨 OA-519 4.2 ㎍을 다음 반응 혼합물에 첨가하였다: 75 nM NADPH; 25 nM 아세틸 조효소 A; 1M 인산 칼륨 16.6 ㎕(pH 6.6, 25 ℃); 총부피 150 ㎕가 되도록 첨가되는 HPLC 등급용 물 97㎕. 반응 혼합물을 볼텍스한 뒤,¹⁴C 말로닐 조효소A(20 μCi/ml; 51 mCi/mM) 5 ㎕ 와 25 nM 말로닐 조효소 A를 첨가했다. 볼텍스 후에, 그 반응 혼합물을 37 ℃에서 20분간 항온 처리시키고 클로로포름: 메탄올(1:1) 1ml를 첨가하여 정지시켰다.

¹⁴ C 지방산의 메틸 에스테르화:

¹⁴C 지방산 혼합물을 박층 크로마토그래피 분리하기 전에¹⁴C 지방산의 메틸에스테르를 메탄올성 황산 방법을 사용하여 제조하였다. 클로로포름: 메탄올: 반응 혼합물을 볼텍스 한 뒤 30 분 동안 교반하였다. 원심분리후, 그 상청액을 N₂하에 건조시켰다. 건조된 지질을 수화된 n-부탄올: HPLC용 물(1:1) 400 ㎕로 2회 추출하고, 모아서, 세척하고, N₂하에 건조하였다. 메틸에스테르를 합성하기 위해, 메탄올 중의 2% 황산 0.75 ml를 건조 지방산에 첨가하고 N₂가스 주입하고 2시간 동안 70 ℃에서 항온 처리하였다. 0.75ml HPLC 등급의 물을 첨가한 뒤,¹⁴C 지방산 메틸 에스테르를 1.5ml 펜탄으로 2회 추출하고 0.5ml HPLC 물로 세척하고 건조하였다.

¹⁴C 지방산 메틸 에스테르를 분리하고 역상 박층 크로마토그래피를 사용하여 다음과 같이 식별하였다. 역상 박층 크로마토그래피 판(20 × 20cm, Analtech)을 20분간 80 ℃의 진공 오븐에서 소성하였다. 건조된¹⁴C 지방산 메틸 에스테르 및 표준물을 20 ㎕의 클로로포름:메탄올(9:1)중에 재현탁시키고, 점적하고, 클로로포름:메탄올:물(5:15:3)로 크로마토그래피하였다. 비-방사능성 표준물은 요오드증기중의 시클로덱스트린 분무액으로 가시화하였다.¹⁴C 지방산 메틸에스테르를 Autochanger 3000을 구비한 Bioscan 시스템 2000 영상화 스캐너를 사용하여 감지하였다.

결과:OA-519는 약 6% 미리스테이트 및 8% 스테아레이트(각각 14개와 18개의 탄소로 이루어진 포화지방산)와 함께 85% 팔미테이트(16개의 탄소로 이루어진 포화 지방산)를 합성하였다(제4도). 이 데이타들은¹⁴C-표지된 말로닐-CoA로부터 완전한 지방산을 생성한다는 것을 보여주므로써 OA-519가 지방산 신타제 활성을 갖는다는 것을 입증한다. 생성된 지방산들의 비율은 인체 간으로부터 추출된 지방산 신타제에 의한 지방산 비율과 유사하나, 유즙 분비성 인체 유방으로부터 얻은 지방산 신타제의 비율(34% 스테아레이트, 33% 팔미테이트, 16% 미리스테이트)과는 크게 달랐다.

OA-519 지방산 신타제의 반응역학적 특성

정제된 OA-519의 비활성은 NADPH의 산화 반응 후에 아세틸 조효소 A 및 말로닐 조효소 A의 존재 하에 340nm에서 분광학적으로 측정되었다. 인체 간에서 얻은 산화된 NADPH/분/mg 단백질의 비활성 값은 404인데 비해 OA-519는 산화된 NADPH/분/mg 단백질의 비활성이 586 nM로 보다 바람직하였다.

OA-519_FAS를 사용한 분광학적 연구는 말로닐-CoA에 대한 겉보기 K_m 값이 86.2 × 10^-5M로서, 쥐 또는 토끼 포유류 유방선에 대해 종래 보고된 값(각각 1.3 × 10^-5M 또는 2.9 × 10^-5M임)(스미스 등, Methods Enzymol.,35: 65-74, 1975; 딜스 등, Methods Enzymol., 35: 74-83, 1975) 또는 인체 유방암 세포주 SKBR 3으로부터 얻은 신타제에 대한 값(1.8 × 10^-5M)(톰슨 등, Biochim. Biophys. Acta,662: 125-130, 1981)보다 더 높다는 것을 입증한다. 정상인의 조직으로부터 얻은 정제된 신타제에 대한 K_m은 보고된 바 없다. K_m값과 대조적으로, 624nmol의 산화된 NADPH/분/mg 단백질의 비활성은 인체 간을 비롯하여 다양한 공급원으로부터 정제된 지방산 신타제들에 관해 보고된 비활성과 유사했다(론카리, Methods Enzymol.,71: 73-39, 1981).

실시예 4 : FAS 억제제에 의해 억제되는 OA-519에 의한 지방산 합성

푸나바시 등(참조 : J. Biochem., 105 : 751-755, 1989)에 의해 입증된 바와 같이 세룰레닌은 지방산 신타제의 축합 효소 활성의 특이적 억제제이다. 약물인 멜라소프롤은 3가의 비소 화합물이며 ; 3가의 비소 화합물은 인접 티올기와 반응한다. 지방산 신타제 활성은 멜라소프롤에 의한 억제 작용의 표적으로서 작용할 수 있는 다수의 환원된 티올기를 필요로 한다.

정제된 OA-519를 사용하는 분광학적 효소 분석법에서, 세룰레닌은 OA-519 지방산 신타제 활성의 비-경쟁적 억제제로 밝혀졌다.

분광학적 지방산 신타제 분석: 지방산 신타제 분석은 하기 성분을 총부피 451 ㎕로 만들어 25 ℃에서 수행하였다 : 실시예 2에 기재한 바와 같은 유방 암 세포주 ZR-75-1 유래의 정제된 OA-519 지방산 신타제 18.88 μg, 아세틸-CoA 25nmol, NADPH 75 nmol 및 pH 6.6의 1 M 농도의 인산 칼륨 50 μl. 0, 9.9, 세룰레닌 0 μM, 9.9 μM, 148 μM, 198 μM 또는 397 μM 존재 하에 기질 말로닐-CoA를 0.5 μM 및 0.6 μM 첨가하였다. 모든 분석물의 최종 부피는 HPLC 등급의 물을 첨가하여 451 μl로 만들었다.

효소, NADPH, 아세틸-CoA, 인산염, 세룰레닌 및 물을 혼합하고, 볼텍스한 뒤, 37 ℃의 벡크만 DU650 분광 광도계내에서 항온 처리하였다. NAPDH의 산화는 기준치를 결정하기 위해 기질 없이 340 nm에서 2 분 동안 모니터하였다. 말로닐-CoA를 반응 큐벳에 첨가하고, 혼합한 뒤, NADPH 산화를 총 2 분 동안 분광 광도계로 340 nm에서 10 초 간격으로 측정하면서 37 ℃에서 항온 처리했다. 모든 측정은 2 반복으로 실시하였다.

결과: 분광학적 자료는 각각 소정의 기질 농도에서 1/v에 대해 억제제 농도를 그래프화한 Dixon 플롯(참조 : Dixon, M.,Biochem. J., 55 : 170-171, 1953)으로 도시하였다. 제5도의 분석은 세룰레닌이 기질인 말로닐-CoA에 대한 겉보기 Ki가 32 μM이 되게 OA-519 지방산 신타제를 억제함을 입증한 것이다. 또한, 억제는 곡선이 횡좌표에서 교차하는 바, 세룰레닌에 대해 보고되었던 바와 같이(참조 : Funabashi, 등,J. Biochem., 105 : 751-755, 1989), 비-경쟁적인 것으로 나타난다.

실시예 5 : FAS 억제제의 선택적 효과

FAS 억제제는 암종 세포의 성장은 억제하나, 정상 세포에 대해서는 그러하지 아니하다. 0A-519는 좋지 않은 징후를 가진 유방 암종에서는 초과 발현되나 정상조직에서는 OA-519 발현이 거의 확인되지 않는다. 표준 시험관내 성장 억제 분석법을 사용하여, OA-519의 2 가지 억제제인 세룰레닌과 멜라소프롤은 암종 세포의 증식을 억제하나, 정상의 인간 섬유아세포에 대한 효과는 거의 없는 것으로 밝혀졌다.

OA-519 억제에 대한 시험관내 증식 억제 분석은 융합성까지 성장시킨 ZR-75-1 세포 또는 정상의 인간 섬유아세포를 사용하여 실시하고, 25,000개의 세포를 미리 탈지한 소혈청 알부민에 결합된 0.5 mM의 올레산을 생리적 수준으로 보충한, 1:1의 조정된 배지 : 새로운 배지(10% 태아 소혈청을 가진 RPMI) 내에 도말하였다. 세포를 부착시킨 뒤 밤새 성장시켰다. 배양 0 시간째, 10% 소의 태내 혈청을 가진 RPMI 배지로 희석한 약물을 다음과 같은 농도로 첨가하였다 : 50 ㎍/ml 내지 0.01 ㎍/ml, 약물을 포함하지 않은 일련의 2배 희석물, 및 대조용의 빈 웰. 각각의 농도에 대해 4 반복으로, 4, 8, 24 및 48 시간의 시점에서 분석을 수행하였다. 약물 처리후, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, SDS 내에 용해시키고, 570 nm에서 몰레큘라 디아고노스틱스 자동화 평판 판독기로 판독하였다.

제6도는 세룰레닌 농도 6.25 ㎍/ml에서 정상의 인간 섬유아세포는 약물에 의해 영향을 받지 않는데 반하여, ZR-75-1 세포의 성장은 48 시간까지 80% 이상 억제되었다. 배양 배지내에 0.5 mM의 올레산의 존재는 정상 섬유아세포에서 세룰레닌의 증식 억제를 방해하나, 유방 암종 세포에서는 그러지 아니하다. 올레산을 보충하지 않은 유사 실험에서는 유방 암종과 정상 섬유아세포의 성장이 억제되었다.

실시예 6:OA-519 신타제 활성의 농도와 관련 있는 OA-519 억제의 세포독성

OA-519 신타제 활성이 거의 없는 섬유아세포는 OA-519 활성이 큰 유방 암종 세포를 80% 이상까지 성장을 억제하는 세룰레닌 농도에 대해 내성이 있다. OA-519를 발현하는 암종 세포주는 OA-519 억제제에 민감한 반면, OA-519 활성이 낮은 세포주는 내성이 있음을 확인하기 위해, 다수의 유방, 전립선, 폐, 결장 및 자궁의 암종 세포주와 정상 섬유아세포를 사용하여 OA-519 신타제 활성과 세룰레닌에 의한 성장 억제의 상관 관계에 관하여 연구하였다. 약물 민감성과 OA-519 효소 활성 사이의 관계는 모든 유형의 세포에서 유지되었다.

OA-519 지방산 신타제 활성: 각각의 세포 유형에 대해 3 반복 실험으로200,000 세포를 24 웰 평판에 위치시키고 하룻밤 동안 배양시켰다. 세포를 긁어 내고, 펠릿화한 뒤, 및 OA-519 효소 활성에 대해 분석할 때까지 -80 ℃에서 냉동하였다.

실시예 3에 사용된 분광 광도 분석과 비교하여 지방산내로¹⁴C-말로닐 조효소 A의 병입을 측정하므로써 감도를 증가시킨 변형된 분석법을 사용하여 OA-519 지방산 신타제 활성을 측정하였다. 25 ℃에서 1 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 7.5의 20 mM 트리스 HCl 내에서 냉동 세포 펠릿을 저장성 용해한 후, 14,000 × g에서 10 분 동안 원심 분리하고, 파쇄액 20 ㎕를 NADPH 75 nmol ; 아세틸 조효소 A 25 mmol ; pH 6.6의 1 몰 인산 칼륨 16.6 ㎕를 포함하는 반응 혼합물에 25 ℃에서 첨가하고, 97 ㎕의 HPLC 등급수를 첨가하여 총부피를 150 ㎕로 하였다. 볼텍스 후,¹⁴C-말로닐조효소 A(20 μCi/ml ; 51 mCi/mmolar) 2 ㎕ 및 말로닐 조효소 A 25 nmol을 첨가하고 볼텍스하였다. 반응 혼합물을 37 ℃에서 20 분 동안 배양하고, 1:1의 클로로포름 : 메탄올 1 ml를 첨가하여 정지시켰다.

클로로포름 : 메탄올 : 반응 혼합물을 볼텍스하고 30 분 동안 교반하였다. 원심 분리후, 상청액을 N₂하에서 건조하였다. 건조된 지질을 수화된 n-부탄올 : HPLC용 물(1:1)의 400 ㎕로 2 회 추출하고, 세척하고, N₂하에서 건조하여¹⁴C에 대해 계수하였다.

성장 억제 분석: 각각의 세포주에 대한 세룰레닌의 증식 억제 활성은 올레산을 첨가하지 않고 24 시간의 시점에서 한 번 시험하는 것을 제외하고는 실시예 5에 기술한 바와 동일한 분석법과 약물 농도를 사용하여 측정하였다.

제7도는 OA-519 효소 활성과 억제제 세룰레닌에 대한 암종 세포의 감도 사이의 관계를 나타낸 것이다. 1 분당 200,000 세포당 지방산내 병입되는 말로닐 CoA 양이 4 pmoles 이하인 효소 활성에서, 50% 미만의 세포가 성장 억제 되었다(예외적으로, H125 폐암종 세포주의 경우는 1 분당 11.6 pmoles에서 48% 성장 억제됨). 대조적으로, 1 분당 200,000 세포당 지방산내로의 말로닐 CoA 병입량이 7 pmoles 이상인 대부분의 세포주는 50% 이상의 성장 억제를 나타냈다. 이렇게, OA-519 효소 활성의 증가와 세룰레닌 증식 억제 활성에 대한 증가된 감도는 관련이 있다. 증가된 OA-519 효소 활성을 가진 세포는 OA-519 지방산 신타제 경로에 의존적인 것으로 보인다.

실시예 7 : 암세포주와 인간 섬유아세포에서 아실-글리세라이드 합성과 병행되는 0A-519 지방산 신타제 활성

표 3은 인체 태아 섬유아세포주와 함께 이하 기재되는 실험에 사용된, 고, 중, 저의 FAS 효소 활성을 가진 일군의 인간 세포주 10 가지를 목록화하였다.

OA-519 신타제 활성: 각각의 세포 유형에 대해, 200,000 개의 세포를 표준 24 웰 평판에 3 반복으로 평판 배양하고, 밤새 성장시키고, 긁어낸 뒤, 펠릿화하고, -80 ℃에 냉동하였다. 25 ℃에서 1 mH DTT, 1 mM EDTA, pH 7.5의 20 mM 트리스 HCl 내에서 냉동 펠릿을 저장성 용해한 후, 반응 혼합물에 20 ㎕의 파쇄액을 첨가한 후,¹⁴C 말로닐-CoA를 첨가하였다. 반응 혼합물을 37 ℃에서 20 분 동안 배양하고, 1:1의 클로로포름 : 메탄올 1 ml을 첨가하여 정지시켰다. 추출 30 분후, 지질을 N₂하에서 건조하고, 1:1의 수화된 n-부탄올 : 물 400 ㎕에서 2 회 추출하고, 모아서 N₂하에서 건조하고, 및¹⁴C에 대해 계수하였다. 활성은 세포수 또는 총 세포 단백질에 대해 표준화하였다. 결과는 표 3에 기재하였다.

시험관내 실험에 이용된 세포주의 특징
세포주	기원	배양 배지	FAS 활성
SKBR3	인체 유방 ER-	맥코이 배지 + 15% FCS	고^a	198.04
ZR-75-1	인체 유방 ER+	RPMI + 10% FCS	중^a	38.08
MCF-7	인체 유방 ER+	DMEM + 10% FCS	중^a	31.27
MCF-7a	인체 유방,아드리아마이신 내성	DMEM + 10% FCS	저^a	18.32
HS-27	인체 섬유아세포	DMEM + 10% FCS	저^a	13.87
SW-480	인체 결장	라이보비쯔 배지 + 10% FCS	저^a	7.93
LNCAP	인체 전립선안드로겐 응답성 음성	DMEM + 10% FCS	고^b	700
TSU-prl	인체 전립선안드로겐 응답성 음성	DMEM + 10% FCS	고^b	700
Dupro 1	인체 전립선안드로겐 응답성 음성	DMEM + 10% FCS	중^b	400
DU-145	인체 전립선안드로겐 응답성 음성	DMEM + 10% FCS	중^b	400
PC3	인체 전립선안드로겐 응답성 음성	DMEM + 10% FCS	저^b	140
a. 1 분당 200,000 세포당 지방산내로 병입된 14C-말로닐-CoA fmol.
b. 1 분당 1 ㎍ 단백질당 지방산내로 병입된 14C-말로닐-CoA fmol.

추가의 분석을 수행하여 FAS 증가량과 총 지방산 생합성의 증가와의 상호 관계 여부를 측정하였다. 이 경로에서 속도 제한 효소인 아세틸 CoA 카르복실라제는 지방산 신타제에 근접하여 위치하기 때문에,¹⁴C-아세테이트로 부터의 아실-글리세라이드 생산 분석은 총 경로 활성의 믿을 만한 척도로서 측정될 수 있다.

아실-글리세라이드내로 내인성 지방산 병입 측정 :

비극성 및 극성 지질 분석을 위해 각각의 세포 유형에 대해, 200,000 개의 세포를 3 반복수로 평판 배양하였다. 밤새 배양후, 각각의 웰의 세포를 1 μCi의¹⁴C 아세테이트와 함께 2 시간 동안 배양하였다.¹⁴C-표지된 지질을 전술한 바와 같이 추출하고, N₂하에서 건조하였다. 비극성 지질 분석을 위해, 샘플을 10 ㎕의 클로로포름에 재현탁시키고 실리카겔 N-HR(브링크만)상에 점적하고 부피비가 65:25:4 인 헥산 : 에틸에테르 : 아세트산내에서 크로마토그래피하였다. 콜레스테롤, 팔미트산, 트리팔미틴 및 콜레스테롤 팔미테이트(마트레야)를 각각 50 ㎍ 씩 대조용으로 전개시켰다. 극성 지질 분석을 위해, 샘플을 실리카겔 6A(와트만)상에 점적하고 부피비가 90:10:1 인 헥산 : 에틸 에테르 : 아세트산 내에서 크로마토그래피하였다. 콜레스테롤, 포스파티딜 에탄올아민, 레시틴 및 리소레시틴(마트레야) 각각 50 ㎍을 대조용으로 전개시켰다.¹⁴C-표지된 지질을 검출하고, Autochanger 3000을 구비한 바이오스캔 시스템 2000 상 스캐너를 사용하여 정량하였다. 비-방사능성 표준물은 자외선하에서 로다민 스프레이를 사용하여 가시화하였다. 제8도의 오차바는 평균 표준 오차를 나타낸다. 포스파티딜콜린 및 트리글리세라이드는 주로 검출된 아실-글리세라이드였다.

제8도에 도시한 바와 같이, FAS 활성(총 지질 내로의¹⁴C-말로닐-CoA 혼입에 의해 측정됨)은 총 지방산 생합성 경로 활성(아실-글리세라이드내로의¹⁴C-아세테이트 병입율로 측정함)과 상당한(r²=0.93) 상호 연관성이 있다. 중요한 것은, TLC 분석 결과는 실험중 대부분의¹⁴C-아세테이트는 다양한 양의 트리글리세라이드 또는 포스파디딜에탄올아민을 가진 포스파티딜콜린내로 병입되었음이 입증되었다는 것이다.¹⁴C-표지된 콜레스테롤 에스테르, 유리 지방산, 또는 포스파디딜 세린은 검출되지 않았다. 이들 자료는 (a) 증가된 FAS 활성은 증가된 총 지방산 합성을 나타내고, (b) 주된 막 지질인 포스파티딜콜린은 FAS의 우세한 최종 생성물이고, 및 (c) 정상 세포에서 FAS를 사용하여 상호 조절되는 아세틸 CoA 카르복실라제 및 말산 효소의 활성은 이들 세포에서 증가될 수 있음을 의미한다.

실시예 8 : 인 시투 하이브리드화에 의해 분석된 OA-519 발현

ZR-75-1 라이브러리로부터의 cDNA는 쥐 지방산 신타제 cDNA의 3' 서열과 85%의 뉴클레오티드 동일성을 지닌 1.6 kb 프로브, pFAS 1.6을 생성한다. 총 ZR-75-1 RNA의 노던 블롯으로, 이 프로브와 단일 ∼9.5 kb 메세지(자료는 나타내지 않음)를 하이브리드화하였다. Bluescript II 내의 pFAS 1.6으로부터 유도된 디곡시게닌-표지된 리보프로브를 사용하여 포르말린-고정된 파라핀-침지된 ZR-75-1 내와 DU-4475 인간 섬유아세포내에 존재하는 OA-519에 대한 동일계내 하이브리드화 시험 결과를 제9도에 도시하였다. 왼쪽 패널은 안티-센스이고, 오른쪽 패널은 센스 대조군이다. pFAS 1.6 으로부터 생성된 안티 센스 리보프로브는 DU-4475 세포보다 ZR-75-1 세포와 본질적으로 더 강한 하이브리드화 신호를 생성하였으며(제9도), 이는 메시지(message) 양과 단백질 양이 일치함을 나타낸다. 이렇게, OA-519를 발현하는 세포는 면역 조직화학법이나 동일계내 하이브리드화법에 의해 검출할 수 있다.

이들 자료는 OA-519 과잉 발현이 메시지 활성화의 증가 또는 메시지 안정성의 연장에 기인하는 메시지 양의 증가로부터 유도됨을 제안한다. 따라서 OA-519 양의 증가는 OA-519 메시지 과잉 발현에 의해 OA-519 단백질 과잉-발현이 수반되기때문인 바, OA-519 단백질 반감기의 연장에 기인할 것 같지 않았다. 유사하게, OA-519 발현이 광범위하게 다른 세포주들의 서던 블롯 중에서 등량의 pFAS 1.6 하이브리드화 신호가 있는지를 실험한 결과 과잉-발현이 유전자 증폭에 의한 것은 아님을 알 수 있었다.

실시예 9 : 인간 유방 암종에서 OA-519의 선택적 발현

제10도는 침윤성 도관 암종의 포르말린-고정되고 파라핀-침지된 박편 상에 대해 친화성 정제된 항-천연, OA-519 토끼 다중 클론 항체를 사용한 면역 조직화학적 염색 결과를 도시한 것이다. OA-519는 발색원으로서 디아미노벤지딘을 사용하는 표준 비오틴-아비딘 면역 조직화학법을 사용하여 검출하였다. FAS 발현의 특이성은 제10도에 설명하였다. 침윤성 유방 암 세포의 세포질은 항-OA-519 항체와 강하게 반응하나 조직학적으로 정상인 유방 상피 세포 및 간질 세포의 인접 가장자리는 반응하지 않았다. 종양 세포의 세포질내의 강력한 갈색 염색은 OA-519 발현을 나타내고 정상 유방 도관 및 소엽(화살표) 및 유방 간질은 음성이었다. 암세포와 정상 세포 사이의 지방산 신타제의 이런 발현성의 차이는 FAS의 생체내 억제가 강력한 선택성 임을 입증하는 것이다.

FAS의 특이 억제제

하기 실시예는 종양 세포에서 세룰레닌의 효과를 나타낸다. 지방산 신타제의 특이적 및 비-경쟁적 억제제인 세룰레닌은 지방산 합성의 대표적인 억제제로서 종양 세포에서 연구되었다. 세룰레닌은 지방산 신타제중 축합 효소의 활성 위치내 티올기에 공유 결합하여, 이 주요한 효소적 단계를 불활성화시킨다(참조 :Funabashi 등, J. Biochem.,105, 751-755, 1989). 말로닐-CoA와 아세틸기 또는 초기 지방산 사슬과의 축합을 촉매하고 CO₂를 생성하는 축합 효소 반응은 상기 신타제중 가장 특이적인 반응이며, 기타의 효소가 관여하지 않는다. 세룰레닌이 기타의 활성을 갖고 있는 것으로 지적되어 왔지만, 이들 활성은 인간 세포와는 무관할 수 있는 미생물(예를 들어, 진균류에서 콜레스테롤 합성의 저해, 오무라(1976), Bacteriol. Rev.,40: 681-697 ; 또는 비루스에서 감소된 RNA 합성, 페레쯔 등(1991), FEBS,280: 129-133)에서, 실질적으로 더 높은 약물 농도(5 mg/ml에서 비루스성 HIV 프로테아제의 억제, 모엘링 등(1990), FEBS,261: 373-377)에 의해 일어나거나 내인성 지방산 합성의 억제(B 임파구 및 마크로파지에서 항원 처리의 억제, 팔로 등(1987), J. Immunol., 139 : 3918-3923)의 직접적인 결과일 수 있다. 최근의 자료는 세룰레닌이 단백질의 미리스토일화(myristoylation)를 특이적으로 억제하지 않음을 제안한다(참조 : 시몬 등, J. Biol. Chem.,267: 3922-3931, 1992). 본 연구에서 사용된 농도에서, 세룰레닌은 하기하는 바와 같이 중요한 FAS 활성을 발현하는 인간 종양 세포에 대한 특이적인 성장 억제제이다.

실시예 10 : 암 세포주 및 인간 섬유아세포내에서 아실-글리세라이드 합성에 병행하는 세룰레닌 세포독성

세룰레닌 세포독성은 2개의 실험 방식으로 연구하였다. 첫째, 클론원성(한계 희석함) 분석은 세룰레닌이 세포독성, 세포 활동 억제성, 또는 입증 가능한 효과의 존재 여부를 테스트하였다. 일단 세포독성이 확립되면, 많은 양을 처리할 수 있는 96 웰 미량-역가 평판 분석을 사용하여 표 3의 대부분의 세포주 상에서 다양한 투여량을 검사하였다. 암세포가 내인성 지방산 합성에 의존하는 경우, 세룰레닌의 독성은 지방산 합성 수준에 정비례해야 한다 : 즉, 더 높은 수준의 FAS를 가진 세포가 세룰레닌에 대해 더 민감해야 한다.

클론원성 분석(clonogenic assay): 백만개의 세포를 25 cm²플라스크내에서 평판 배양하였다. 밤새 배양후, 세포를 처리하지 않거나 6 시간 동안 2.5, 5.0 또는 10.0 ㎍/ml 의 세룰레닌으로 처리하였다. 그후, 세포를 트립신으로 처리하여 단세포 현탁액으로 하고 접시당 1000 또는 500개의 세포로 16mm 접시에서 3 반복수로 평판 배양하였다. ZR-75-1 및 MCF-7 세포에 대해서는 배양 3일 후, SKBR3 세포에 대해서는 배양 7일 후에, 콜로니를 계수하고 미처리 대조군에 대한 백분율로서 표현하였다.

제11a도에 나타낸 바와 같이, 클론원성 분석에서 10㎍/ml의 세룰레닌으로 MCF-7 세포를 처리하는 것은 투여량-의존성 세포독성을 나타냈다. 10㎍/ml에서 24 시간 동안으로 노출 시간을 증가시키는 것은 3대수 보다 큰 세포 치사율을 제공하였다. 따라서, 세룰레닌은 내인성 지방산 합성을 수행하는 세포주에 대해 세포독성이 있었다.

성장 억제의 측정 :세포주를 1웰당 5,000개의 세포로 96웰 미량역가 평판에서 평판 배양하였다. 18시간 성장시킨 후, 세룰레닌(10% DMSO로 희석함)을 배지에 첨가하여 10 ㎍/ml를 획득하였다. 각각의 시점에서, 빈 웰을 대조용으로 4반복수로 측정하였다. 세룰레닌에 24시간 노출후, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 1% SDS에 용해시키고, 570nm에서 몰레큘라 디아고노스틱스 자동화 평판 판독기상에서 판독하였다. 오차 바는 평균 표준 오차를 나타낸다.

미량 역가 평판 세포독성 분석을 사용하여, 제11b도는 10㎍/ml 세룰레닌에 24시간 노출시킨후, 상대적인 성장 억제가 6개의 모든 세포주에서 지방산 생합성의 기측정된 속도와 직접적으로 관련이 있음을 입증하고 있다. MCF-7 아드리아마이신-내성 세포주(MCF-7a)만 중요한 예외였다. 성장 억제 대 FAS 활성을 그래프화하여 유사한 결과를 수득하였다(참조: 실시예 6, 제7도). 이렇게, 세룰레닌의 성장 억제는 내인성 지방산 생합성 또는 FAS 활성의 수준에 의해 대부분 예상되었다. 중요한 것은, 이런 사실이 암세포 및 정상 태아 섬유아세포 둘 다에 대해 적용된다는 것이다. 그러므로, 세룰레닌 성장 억제와 지방산 합성과의 관계는 형질 전환된 세포에 독점적인 특징은 아니다.

실시예 11 : 아실-글리세라이드내로 ¹⁴ C-아세테이트의 병입에 있어서 투여량-의존성 억제를 야기시키는 세룰레닌, 세룰레닌에 의해 일정하게 변경되지 않는 콜레스테롤 합성

아실-글리세라이드 및 콜레스테롤 내로의 내인성 지방산 병입량의 측정:

각각의 세포 유형에 대해, 200,000개의 세포를 24웰 평판에서 각각의 약물 투여량에 대한 비-극성 및 극성 지질 분석을 위해 3 반복수로 평판 배양하였다. 밤새 성장시킨 후, 세룰레닌(10% DMSO로 희석함)을 0, 2.5, 5.0 또는 10.0 ㎍/ml이 되도록 첨가하여 6 시간 동안 배양하였다. 세룰레닌 배양의 최종 2시간 동안 1웰당 1μCi의¹⁴C-아세테이트를 첨가하였다.¹⁴C-표지된 지질을 추출한 후, 크로마토그래피하고, 상기와 같이 검출하였다. 오차바는 평균 표준 오차를 나타낸다.

제12a도는 아실-글리세라이드내로¹⁴C-아세테이트의 병입이 표 3에 목록화한 6개의 세포주내에서 투여량-관련 방식으로 세룰레닌에 의해 일정하고 현저하게 억제되었음을 증명한다. 대조적으로, 제12b도는 콜레스테롤 합성이 MCF-7 세포에서의 가벼운 억제로부터 SKBP3 세포에서의 자극까지 가변적이고 극한적으로 영향 받음을 나타낸다. 이들 자료는 세룰레닌이 콜레스테롤 생합성의 효소에 직접적인 영향이 없음을 제안한다. 게다가, 이들 세포에서 콜레스테롤 생합성의 기본 수준과 세룰레닌 성장 억제와는 무관하였다(자료는 나타내지 않음). 이렇게, 세룰레닌은 암세포주 및 섬유아세포내에서 콜레스테롤 생합성에 대한 현저하거나 일정한 영향 없이 아실-글리세라이드 합성을 억제하였다.

실시예 12: 세포 증식과 무관한 세룰레닌 억제

임상적 유방암 및 몇몇 세포주에서 OA-519_FAS발현은 유사 분열 지수에 의해 측정된 바와 같이(참조: Kuhajda 등, N. Engl. J. Med.,321: 636-641, 1989) 증식이나, 증식성 세포핵 항원(PCNA) 발현(자료는 나타내지 않음) 또는 유동 세포 측정법(참고: Shurbuji 외 다수, Lab. Invest.,6869A, 1993)에 의한 세포주기와 FAS 발현의 상호 관련과는 무관하기 때문에, 세룰레닌 항-증식 활성은 암 세포 증식과는 무관할 것으로 예상된다. 미량 역가 평판 분석을 사용하여, 6개의 세포주에 대한 배가 시간을 결정하고 세룰레닌 증식 억제(10 ㎍/ml, 24h)와 비교하였다. 종양 세포 배가 시간과 세룰레닌 증식 억제 또는 FAS 발현과는 무관하였다(제13도).

실시예 13: 전립선 암종 세포에 대한 세룰레닌의 항-증식 활성

세룰레닌의 항증식 활성을 비교적 높은 FAS 활성을 나타내는 2개의 인간 안드로겐-비의존성 전립선 암종 세포주로 확장하였다(참조: 표 3). TSU-pr1 및 Dupro-1 세포주를 95% 공기; 5% CO₂로 구성된 습식 대기내에서 각각 3 × 10⁵세포와 1 × 10⁵세포/T25 플라스크로 10% 태아 소혈청을 함유한 RPMI-1640내에서 평판배양하였다. 24시간 후, 초기 평판 배양 밀도를 측정하였다. 추가로, 배지를 교체(대조용)하거나 2.5 내지 10 ㎍/ml의 세룰레닌을 첨가하고 2 반복수로 배양하였다. 48시간 후, 세포를 트립신 처리하고 생존 세포(트립판 블루 제외)를 계수하였다. 배가된 집단의 수를 산정하였다. 2개의 세포주에 대해, 세룰레닌(3-4 ㎍/ml)에 48시간 노출은 미처리된 배양물에 대해 군집 배가의 50%를 억제하였다. 도 14는 각각의 2 반복 실험중 1 가지 실험의 대표적 데이터를 나타낸 것이다.

실시예 14 : 아세틸 CoA 카르복실라제의 억제제에 의한 암세포주의 성장 억제

또한, TOFA(아세틸 CoA 카르복실라제의 억제제)는 다른 수준의 FAS 효소 활성(표 3에 나타냄)과 지방산 생합성(제8도에 나타냄)을 가진 세포주 패널상에서 항-증식 효과를 입증하였다. 이 실험은 크리스탈 바이올렛 성장 억제 분석을 사용하여 수행하였다. FAS 활성 정도가 다른 세포를 96웰 평판내에서 10% 열-불활성화된 태아 소혈청을 첨가한 RPMI-1640에서 1웰당 5000개의 세포로 평판 배양하였다. 습식 95% 공기: 5% CO₂대기내에서 72시간 배양후, TOFA(5-테트라데실옥실)-2-푸란산의 농도를 변화(0-500 ㎍/ml)시키면서 첨가하고, 배양물을 48시간 동안 재배양하였다. 평판을 제거한 후 기술한 바와 같이 크리스탈 바이올렛을 사용하여 염색하여다. 흡광도 판독값은 시약(n=4), 대조용(n=8), 및 기준치(n=28) 각각의 농도에 대한 평균값을 구하였다. 기준치 판독 값을 감하였다. 제15도에서 TOFA의 농도를 성장에 대해(성장률로서) 플롯하였다.

TOFA에 대해 48시간 노출후, 아세틸 CoA 카르복실라제(참조: Halvorson, D. L. 및 McCune., S. A., Lipids19: 851-856, 1984)의 억제제는 각각 44.7, 59.8, 0.8 및 4.6 ㎍/ml에 의한 SKBR-3, ZR-75-1, SW 480, 및 HS27 세포주의 증식 억제로 귀결되었다. TOFA 또는 5-(테트라데실옥시)-2-푸란산은 제15도에 나타낸 바와 같이, 더 낮은 FAS 활성을 나타내는 세포주(HS27 및 SK-8R-3)의 증식 억제제 보다 높은 FAS 활성을 나타내는 세포주(ZR-75-1 및 SW80)의 더 강력한 증식 억제제였다.

실시예 15 : 지방산 합성의 다양한 억제제에 의한 SKBR-3 세포 증식의 억제

이들 실험에서, 세포를 96 웰 미량역가 평판에서 1웰당 5000개의 세포로 평판배양하고 10% 열-불활성화된 소의 태아 혈청과 함께 RPMI-1640내에 72시간 동안 유지시켰다. 다음으로, 표 4에 나타낸 화합물을 첨가하고, 세포를 추가로 48시간 동안 배양하였다. 크리스탈 바이올렛 법을 사용하여 증식 억제를 측정하였다.

인간 SK-BR-3 포유 동물 암종 세포주(높은 FAS 활성을 가진 세포주로서 표 3에 나타냄)의 성장을 억제하기 위해 필요한 세룰레닌의 농도는 실시예 X-4-A의 전립선 종양 세포주의 성장 억제를 위한 필요 농도와 유사하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 3.6 ㎍/ml에 48시간 노출할 경우 성장이 50% 억제되었다. 또한 표 4에 나타낸 바와 같이, 지방산 생합성에 관련된 효소를 억제하는 것으로 보고된 기타 화합물은 유사한 방식으로 0.3 내지 61.4 ㎍/ml의 50% 억제 투여량(ID50)으로 SK-BR-3 유방 암종 세포주의 성장을 강하게 억제하였다.

이들 결과는 모두, 세룰레닌 뿐 아니라 지방산 생합성의 기타 효소의 억제가 유방, 결장, 및 전립선 암종 세포주의 성장을 강하게 억제함을 나타낸다. 게다가, 성장 억제 효능은 이들 배양된 세포에 의해 나타나는 지방산 생합성의 상대적인 수준에 비례하였다.

내인성 지방산 생합성에 관계하는 효소의 억제제에 의한 SK-BR-3 세포주의 성장 억제
표적 효소	화합물	ID₅₀(㎍/ml)
구연산염 리아제	S-카르복시메틸 CoA	61.4
말산 효소	브로모피루베이트	52.0
	고시폴	3.1
	N-에틸말레이미드	0.9
아세틸 CoA 카르복실라제	세톡시딤	9.5
아세틸 CoA 카르복실라제	5-(테트라데실옥실)-2-푸란산	4.6
지방산 신타제	세룰레닌	3.6
지방산 신타제	요오도아세트아미드	0.3

고수준의 FAS 활성을 가진 것으로 나타난 SK-BR-3 인간 유방 암종 세포를 96 웰 미량 역가 평판에서 5000 세포/웰로 평판 배양하고 95% 공기: 5% CO₂를 함유하는 습식 공기내에서 10% 열-불활성된 태아 소혈청과 함께 RPMI-1640 내에 유지시켰다. 72 시간 후, 화합물을 첨가하고, 48시간 동안 더 배양하였다. 평판을 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 전술한 바와 같이 흡광도를 측정하였다. ID₅₀은 4 반복으로측정 및 분석한 바와 같은, 대조용 흡광도를 50% 감소시키는 화합물의 투여량을 나타낸다.

실시예 16 : 트리악신-C 및 세룰레닌 사이의 상승 작용

ZR-75-1 세포를 96웰 미량 역가 평판에서 1웰당 2500개의 세포로 평판 배양하고 5% CO₂내에서 37 ℃로 밤새(18시간) 배양하였다. 트리악신-C를 첨가하여 0, 2.5, 5.0 또는 10.0 ㎍/ml의 세룰레닌 존재하에서 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.1, 6.2, 12.5, 25, 50 μ몰 농도를 획득하였다. 각각의 농도에 대해 측정을 4회 수행하였다. 세포를 24 시간 동안 배양하고, PBS에서 세척하고, 세포를 24시간 동안 배양하고, PBS에서 세척하고, 1% SDS내에 용해시키고, 2% 에탄올내에서 0.2% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 490nm에서 몰레귤라 디아고노스틱스 평판 판독기로 판독하였다.

제16도는 트리악신-C가 OA-519_FAS를 발현하는 종양 세포주중 세포(ZR-75-1)의 성장을 억제함을 나타낸다. 세룰레닌을 ID₅₀에 근접하는 수준으로 첨가하는 경우, 트리아신-C에 대한 ID₅₀은 약 15 μM 내지 1 μM 미만으로 저하되며, 이들 2개의 억제제의 조합에 의해 나타나는 상승 작용 효과를 입증한다.

실시예 17 : 세룰레닌에 의한 성장 억제로부터 ZR-75-1 세포를 구제하는 고농도의 외인성 올레이트

제17도는 ZR-75-1 세포 성장에 대한 세룰레닌의 억제는 고농도의 외인성 올레이트와 가역적임을 입증한다. ZR-75-1 세포(1 웰당 5,000)을 96 웰 미량 역가평판내 탈지한 소혈청 알부민에 4:1의 몰비로 결합된 0, 0.5, 1.0 또는 1.5 mM 올레이트로 강화된 배지 내에서 평판 배양하였다. 18 시간 배양한 후, 10 ㎍/ml의 투여량으로 세룰레닌을 첨가하였다. 실시예 10에서와 같이 24 시간(제17도 상부선) 또는 48 시간(하부선)후 세포를 염색 및 분석하였다. 제17도의 중간선은 24 시간에 세룰레닌 없이 각각의 올레이트 농도를 포함하는 배지를 재공급하고 48 시간의 총 배양시간후 분석한 세포를 나타낸다. 오차 바는 평균 표준 오차를 나타낸다.

0, 0.5, 1.0 또는 1.5 mM 올레이트의 존재 하에 24 시간 동안 10 ㎍/ml의 세룰레닌에 노출시킨 세포를 나타내는 제17도의 상부 선에서, 1.5 mM 농도의 올레이트는 세룰레닌에 의한 성장 억제의 실질적으로 완전한 역점을 획득하였다. 세포를 48 시간 동안 배양시키는 경우, 더 낮은 곡선에 의해 입증되는 바와 같이 나타난 현저한 독성은 올레이트에 의해 역전되지 않는다. 48 시간째에 보인 항-증식 활성이 배지내 올레이트의 고갈에 기인하는 경우, 24 시간째에 추가의 세룰레닌은 없고 동일한 각각의 올레이트 농도를 포함하는 새로운 배지로 재공급하므로써 세포를 구할 수 있다. 중간의 곡선은 24 시간째의 재공급의 효과를 나타내며, 실제로는 1.5 mM 올레이트의 사용으로 48 시간후에 세포를 구했다. 올레이트가 부재인 경우, 재공급된 및 재공급되지 않은 세포는 유사한 세룰레닌-중재된 증식 억제를 나타냈다.

이 실험은 세룰레닌의 항-증식 활성으로부터의 구조는 추가의 지방산을 기인하며, 배지내에 존재하는 성장 인자 같은 글루코즈 또는 기타 물질에 기인하지 않는다. 흥미롭게도, SW-480 및 정상의 인간 섬유아세포 같은 FAS 활성이 낮은 세포주는 세룰레닌 성장 억제로부터 세포를 구하기 위해 더 낮은(0.5 mM) 올레이트의 생리적 농도를 필요로 했다(참조 : 실시예 5). ZR-75-1 세포를 구하기 위해 필요한 올레이트 수준(1.5 mM)은 초생리적이며, 이 수준은 지방산 함량을 높인 음식물에 의해 획득될 수 있을 것 같지 않다. 이들 자료는 함께 세룰레닌은 세포사멸에 이르는 지방산 고갈 상태를 생성하므로써 행동하고, 이것은 내인성 지방산 합성 수준에 비례한다.

본 발명은 이의 특정 양태와 관련하여 기술되어 왔으며, 전술한 설명 및 실시예는 본 발명을 예시하나, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 기타의 단점, 잇점 및 변형은 본 발명을 포함하는 당해 기술 분야의 숙련자들에게 명백할 것이며, 이를 관점 및 변형은 본 발명의 범위 내에 있으며 첨부한 특허 청구의 범위에 의해서만 제한된다.

국제 양식

미생물본 미생물과 관련있는 명세서 부분은 제31쪽 11행 내지 13행이다
A. 기탁 표시
기탁명미국 모식균 배양 수집소(ATCC)주소미국 매릴랜드 20852 록빌 파크런 드라이브 12301
기탁일 :1991. 7. 26	수탁번호 :HB 10853
B. 부가 표시
뮤린 하이브리도마 세포주, 892S (HPR-2)
C. 표시가 이루어진 소정 상태

D. 별도의 구비요건

E. 수령자 (서명)

Form PCT/RO/134(1991.1)

Claims

환자로부터 분리된 시료 중에 존재하는 지방산 신타제 활성을 나타내는 단 백질의 양을 측정하는 단계를 포함하며, 이 때 종양 세포에 의한 지방산 신타제 활성을 나타내는 단백질의 발현이 발병도(virulence)를 나타내는 것인, 환자중에 존재하는 종양 세포의 발병도를 측정하는 것을 돕는 생체외(ex vivo) 분석 방법.
제1항에 있어서,

시료가 종양 조직 시료인 방법.
제1항에 있어서,

시료가 환자의 체액인 방법.
제1항에 있어서,

상기 측정 단계가 단백질을 암호화하는 mRNA와 핵산 프로브 사이의 하이브리드화를 검출하는 것을 포함하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 측정 단계가 단백질에 면역학적으로 결합하는 항체와 단백질 사이의 결합을 검출하는 것을 더 포함하며, 이 항체가 합토글로빈 1 또는 2와는 면역학적으로 교차반응하지 않거나 아미노산 서열 leu tyr ser gly asn asp val thr asp ile ser asp asp arg phe pro lys pro pro glu ile ala asn gly tyr val glu lys leu phe arg tyr gln cys 을 갖는 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응하는 것임을 특징으로 하는 방법.