DE69330027T3

DE69330027T3 - Synthese von verschiedenen und nützlichen oligonukleotidsammlungen

Info

Publication number: DE69330027T3
Application number: DE69330027T
Authority: DE
Inventors: R. David SHORTLE; John Sondek
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1992-04-15
Filing date: 1993-04-13
Publication date: 2008-09-25
Anticipated expiration: 2013-04-14
Also published as: ES2156869T5; JPH08502642A; PT638089E; DE69330027D1; DE69330027T2; EP0638089B2; CA2133554A1; EP0638089A1; ES2156869T3; EP0638089B1; DK0638089T3; DK0638089T4; JP4138869B2; ATE199726T1; CA2133554C; WO1993021203A1; GR3035978T3

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Synthese von Oligonucleotiden und insbesondere ein neues Verfahren zur Herstellung von Gemischen von Oligonucleotiden in einer einzelnen automatisierten Synthese. Die Technik ermöglicht die Herstellung verschiedener DNA-Gemische, die verwendet werden können, um große Oligo- oder Polypeptid- und/oder Proteinsammlungen herzustellen.
Hintergrund der Erfindung
Verfahren zur Herstellung DNA gemischter Zusammensetzungen werden für das Studium biomolekularer Funktion sowie für die Suche nach Substanzen mit neuen und nützlichen Eigenschaften immer wichtiger. Als die DNA-Synthese-Technologie in den frühen 80er Jahren verbessert wurde, wurde es möglich Mehrfachsynthesen durchzuführen, um Oligonucleotidgemische herzustellen. Grundsätzlich können große und diverse Sammlungen in Mehrfachsynthesen hergestellt werden. In der Praxis haben mehrere Forscher erkannt, daß eine große Zahl von Oligonucleotiden durch die Kopplung von Mononucleotidgemische anstelle eines einzigartigen Monomerbausteins in einer einzigen Synthese hergestellt werden können. Die Komplexität der sich ergebenden Oligonucleotidsammlung oder „Bibliothek" wird durch die Anzahl der gekoppelten Monomere und die Zahl der Positionen, an denen Monomergemische eingeführt werden, bestimmt.
Oligonucleotide gemischter Zusammensetzungen werden zunehmend in der Proteinmutagenese und zum Studium der Struktur und Funktion verwendet. Durch die Expression von DNA-Sequenzen mit gemischter Zusammensetzung wird eine korrespondierende Bibliothek von Proteinmutanten hergestellt. Verbunden mit geeigneten Durchsuchungsverfahren können solche Bibliotheken auf Substanzen mit veränderten Eigenschaften hin durchsucht werden und sind daher in der Untersuchung biomolekularer Funktionen nützlich. Die allgemeinste Klasse der Mutagenesemethoden verwendet Oligonucleotide, die auf der Wildtyp-Gensequenz beruhen, und inkorporiert Veränderungen, die letztlich zu allen gewünschten Aminosäuresequenzänderungen führen. Diese Methoden wurden kürzlich übersichtsartig in der August 1991 Ausgabe von „Current Opinion in Structural Biology" dargestellt.
Nahezu alle genetischen Studien der Proteinstruktur und Aktivität verwenden Ersatzmutationen: eine oder mehrere Aminosäureseitengruppen werden ersetzt, aber die Länge des Proteins und der Abstand der Reste wird bewahrt. Um die Herstellung einer großen Anzahl von Substitutionsmutationen in einem einzigen Experiment zu ermöglichen, ist eine Vielzahl von Techniken im Stand der Technik entwickelt worden (Für eine Obersicht siehe Rotstein, D. & Shortle, D. (1985) Science 229, 1193–1201 und Zoller, M. J. (1991) Curr. Opin. Struct. Biol. 1, 605–610), von denen die beliebtesten die chemische Synthese komplexer Oligonucleotidgemische beinhaltet, die entweder als mutagene Primer für die DNA-Synthese (siehe Hermes, J. D., Parekh, S. M., Blacklow, S. C., Koster, H., & Knowles, J. R. (1989) Gene 84, 143–151) oder als mutagene Duplex-Fragmente zur Ligation mit Restriktionsfragmenten verwendet werden (siehe Matteucci, M. D. & Heynecker, H. L. (1983) Nucl. Acids Res. 11, 3113, 3121). Um die benötigten Substitutionen einzelner Aminosäuren zu erzeugen, wird jedes Monomer, das für die Oligonucleotidsynthese verwendet wird, mit kleinen Mengen der drei Nicht-Wildtyp-Mononucleotide versetzt. Grundsätzlich kann diese Methode jeden möglichen Nucleotidaustausch in einem Gensegment in einem einzelnen Experiment bereitstellen. Da die Verteilung der Nucleotidaustausche einer Poisson-Statistik folgen wird, werden zwei Mononucleotidaustausche in demselben Codon bei den Zusatzmengen, die pro mutiertes Gen nur zu einer oder nur zu einigen Aminosäuresubstitutionen führen, relativ selten sein. Dementsprechend kann für diese Strategie zur Herstellung von Gemischen mutagener Oligonucleotide in der Praxis erwartet werden, nur zu einem Drittel aller möglichen Aminosäuresubstitutionen zu führen, wobei die Arten der Aminosäuresubstitutionen, die an einer bestimm ten Position ausgelöst werden, durch die Sequenz des Wildtyp-Codons bestimmt werden. Es sollte auch bemerkt werden, daß der Monomerzusatz von Oligonucleotiden des Stands der Technik, nicht verwenden werden kann, um andere Arten der Änderung der DNA-Sequenz, wie Insertion oder Deletion, auszulösen.
Eine verwandte Anwendung gemischter DNA-Synthese verwendet ausgedehnte Sammlungen verschiedener Oligonucleotide in Verfahren, die auf die Entdeckung von Substanzen mit neuen und nützlichen Eigenschaften gerichtet sind. PeptidBibliotheken (Cwirla, S. E., Peters, E. A., Barrett, R. W., & Dower, W. J. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6378–6382), RNA-Bibliotheken (Tsai, D., Kenan, D., & Keene, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8864–8868) und DNA-Bibliotheken (Bock, L., Griffin, L., Latham, J., Vermass, E., & Toole, J. (1992) Nature 355, 564–566), die alle aus Oligonucleotid-Sammlungen hergestellt wurden, die durch gemischte Monomersynthese erzeugt wurden, sind durchsucht worden, um Moleküle zu identifizieren, die an bestimmte Zielsubstanzen binden. Bei diesem Ansatz hängt die Nützlichkeit der Peptidbibliotheken kritisch davon ab, in welcher Art und Weise das Oligonucleotidgemisch hergestellt wird. Dieses ergibt sich aus der Degeneration des genetischen Codes: Aminosäuren werden nicht durch eine gleiche Anzahl von Trinucleotidcodons repräsentiert, einige Aminosäuren werden nur durch ein Codon, andere durch bis zu sechs codiert. Deshalb werden die codierten Aminosäuren, obwohl Oligonucleotide, die aus gleichen Gemischen aller vier Monomere hergestellt werden, jedes der 64 Trinucleotide enthalten können, ungleich repräsentiert und „Stop"-Codons werden unvermeidlich hergestellt. Als Ergebnis werden die Aminosäuren, die durch die größte Codonanzahl codiert werden, auf Kosten derer überrepräsentiert, die nur durch ein oder zwei Codons codiert werden. Beispielsweise wird, wenn eine bestimmte Mutationsart erwünscht ist (beispielsweise nur der Ersatz von hydrophoben Aminosäuren) die sich ergebende Bibliothek einen hohen Anteil unerwünschter Spezies enthalten. Dieser Nachteil ist besonders kritisch, wenn sich die Anzahl der Positionen, an denen Substitutionen eingeführt werden, erhöht.
In einem Versuch die Effizienz der Synthese gemischter DNA-Sequenzen zur Herstellung von Peptid- und Proteinbibliotheken zu erhöhen, sind Schemata eingeführt worden, in denen Monomere in rationaler Weise gemischt werden. Beispielsweise hat Youvan optimale Monomergemische zur Bestimmung bestimmter Aminosäureuntergruppen berechnet (Arkin, A. P. & Youvan, D. C. (1992) Bio/Technology, 10, 297–300). Die Verwendung dieser Gemische erhöht den Anteil erwünschter Aminosäuren in Peptid- oder Proteinbibliotheken. Sie verhindert jedoch nicht die Herstellung unerwünschter Austausche, die aus bestimmten Monomerkombinationen entstehen. Selbst mit diesen Verfahren sind die gewünschten Austausche üblicherweise nur ein Bruchteil derer, die an jeder Position eingeführt werden. Dementsprechend verringert sich der Anteil der erwünschten Mutanten in der Bibliothek, wenn sich die Anzahl der veränderten Positionen vergrößert.
In Kenntnis der Probleme, die mit der Verwendung von Monomergemischen einhergehen, hat Huse ein Verfahren beschrieben (in WO 92/03461 offenbart), in dem die DNA-Synthese so durchgeführt wird, daß mehrere Synthesen nachgeahmt werden. Dies wird dadurch erreicht, daß die Synthese auf mehreren festen Trägern durchgeführt wird, die gemischt und wieder getrennt werden können, wenn notwendig. In dieser Weise können vielfältige Oligonucleotidgemische unter Verwendung von Monomeren hergestellt werden, und die Probleme, die mit der Degeneration des genetischen Codes assoziiert sind, vermieden werden. Das Verfahren hat zwei Nachteile: (i) für jede Synthese ist das arbeitsintensive Teilen und Wiedervermischen des Trägermaterials erforderlich, und (ii) die Gesamtanzahl der verschiedenen Sequenzen, die synthetisiert werden kann, ist durch die Anzahl physikalisch trennbarer Träger, die in der Synthese verwendet werden, begrenzt, die typischerweise in der Größenordnung 10⁸ liegt.
Wells, J. A., Vasser, M. & Powers, P. B. (1985) Gene 34, 315–323 haben ein Verfahren zur Verwendung von Phosphotriester-Trinucleotidgemischen zur Herstellung von Gemischen von Oligonucleotiden beschrieben und haben fehler hafte Ergebnisse erhalten. Zon, G., Gallo, K. A., Samson, C. J., Shao, K.-L., Summers, M. F. & Byrd, R. A. (1985) Nucl. Acids Res. 13, 8181–8196 haben das Kopplungsverhalten neu entwickelter Phosphoramiditmonomerer beschrieben und stellten fest, daß selektive Kopplungen erwartet werden können.
Zusammenfassend leiden die bestehenden Verfahren der Synthese mehrfacher DNA-Sequenzen unter mehreren Nachteilen:

1. Obwohl jede mögliche Nucleotidsubstitution unter Verwendung von Oligonucleotiden, die mit gemischten Monomeren versetzt sind, hergestellt werden kann, sind zusammenhängende zwei und drei Mononucleotidsubstitutionen außergewöhnlich unüblich. Dies ist ein Nachteil hinsichtlich der Proteinmutagenese, da jede Aminosäure in einem Protein durch drei zusammenhängende Nucleotide bestimmt wird, und diese Strategie nur etwa ein Drittel aller möglichen Aminosäuresubstitutionen für jede Wildtyp-Aminosäure, in einer Einzelsynthese effizient generieren kann.
2. Keine Strategie, die die Synthese von Oligonucleotidgemische beinhaltet, die im Stand der Technik gelehrt wird, erlaubt die Herstellung von mutierten Proteinen mit Insertion von einem oder mehreren Codons an mehr als einer einzelnen Position in dem synthetisierten Oligonucleotid.
3. Die Degeneration des genetischen Codes bedeutet, daß jedes Mononucleotidgemisch, das in gemischter DNA-Synthese verwendet wird, unvermeidlich zu Oligonucleotiden führt, die nicht gewünschte Codons enthalten oder nicht alle gewünschten Codons bereitstellt. Dieses Problem wird kritisch, wenn die Anzahl der Positionen, in denen die Gemische eingeführt werden, ansteigt.
4. Methoden, die mehrere Synthesen simulieren sind arbeitsintensiv und die Vielzahl der erzeugbaren Sequenzen ist durch die Anzahl der verwendeten physikalisch trennbaren Trägern begrenzt.

Die vorliegende Erfindung stellt Lösungen für diese Probleme bereit und ermöglicht die Herstellung von Gemischen von Oligonucleotiden mit einer Vielzahl von Anwendungen in der modernen Molekularbiologie. Beispielsweise können Gemische von Oligonucleotiden, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, verwendet werden, um Gene herzustellen, die für Peptid- und/oder Proteinbibliotheken codieren. Zusätzlich sind Trinucleotide für die Herstellung degenerierter Primer für die polymerase Kettenreaktion nützlich. Die Erfindung ist besonders nützlich für Proteinmutagenese; Einzelstrangmutagenese Primer und Doppel-Strang-„Kassetten”, die für jede Aminosäurekombination codieren, können durch die Anwendung des hier offenbarten Verfahrens einfach hergestellt werden. Die vorliegende Erfindung ermöglicht auch Substitutions- und Insertionsmutagenese.
Das Verfahren beruht auf der Verwendung von vorsynthetisierten Trinucleotiden, die mit den effizientesten DNA-Syntheseverfahren kompatibel sind. Trinucleotidbausteine wurden bereits vorher in der DNA-Synthese verwendet (siehe beispielsweise Hirose, T., Crea, R. & Itakura, K. (1978) Tet. Lett., 2449–2452; Miyoshi, K. Miyake, T., Hozumi, T. & Itakura, K. (1980) Nucl. Acids Res., 8, 5473–5489), wenn die schrittweisen Kopplungsausbeuten niedrig waren und es wünschenswerter war, bei jedem Schritt die größtmöglichen Oligonucleotidbausteine einzubauen. Diese frühere Arbeit unterscheidet sich von der vorliegenden Erfindung dadurch, daß (i) sie auf der ineffizienten und veralteten Phosphordiester-Chemie beruhte und daher nicht mehrfach Kopplungen erlauben wurde, (ii) sie nicht auf die Herstellung verschiedener nützlicher Sammlungen gemischter Oligonucleotide gerichtet war, und (iii) sie nicht Insertionsmutagenese ermöglichte.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung überwindet die Beschränkung im Stand der Technik und stellt eine neue Technik zur Generierung von Oligonucleotidgemische in einer einzelnen automatisierten Synthese bereit. Das Verfahren ist in der systematischen Mutagenese von Proteinen oder anderen wichtigen genetischen Elementen nützlich. Die verschiedenen Oligonucleotidsammlungen, die unter Anwendung der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, sind besonders in der Herstellung von Peptidbibliotheken nützlich, die auf Moleküle durchsucht werden können, die an eine bestimmte Zielsubstanz binden. Die vorliegende Erfindung kann auch in der Proteinmutagenese verwendet werden, um für alle möglichen Aminosäuresubstitutionen, alle möglichen einzelnen Aminosäure-Insertionen oder jedes gewünschte Gemisch von Substitutionen und Insertionen zu codieren.
In der allgemeinsten Form erlaubt die vorliegende Erfindung die Synthese von DNA-Molekülen unter Verwendung von Trinucleotidbausteinen, die mit Aminosäure-Codons korrespondieren.
Trinucleotide werden so hergestellt, daß sie mit den Standardverfahren automatisierter DNA-Synthese kompatibel sind. Am zweckmäßigsten ist die freie 5'-Position mit einer Säure-labilen Schutzgruppe (typischerweise ein 4,4'-Dimethoxytrityl, DMT) geschützt, die Phosphate als Methyl- oder Cyanoethylester geschützt, die Basen als Benzoyl-(A und C) oder Isobutyryl-(G)Amide geschützt und die freie 3'-Position ist für die Kopplung entweder als ein O-Methyl- oder O-Cyanoethyl-N,N-Diisopropylaminophosphoramidit aktiviert. Wie unten beschrieben ist es in einigen Fällen wünschenswert, daß die 5'-Position anders geschützt ist. Dies kann ohne weiteres während der Trinucleotidsynthese erreicht werden. Das Verfahren steht der Verwendung von Trinucleotiden, die in anderer Art geschützt und aktiviert werden, nicht entgegen.
Die vorliegende Erfindung kann entweder für die stöchiometrische oder die substöchiometrische Kopplung von Trinucleotiden verwendet werden. In jedem Fall geht die automatisierte Synthese-Apparatur schrittweise vor, um ein Oligonucleotid durch die Kopplung einer Sequenz von Monomeren, die die Wildtyp-Sequenz bestimmen, zu synthetisieren. An der gewünschten Position wird das Syntheseprogramm unterbrochen und eine veränderte Schrittabfolge wird wie unten beschrieben ausgeführt.
1. Stöchiometrisches Koppeln
In einer ersten Ausführungsform werden ein oder mehrere Trinucleotide anstelle von Monomeren für chemische DNA-Synthese verwendet. Die Trinucleotide koppeln nahezu quantitativ und können daher für die automatisierte DNA-Synthese in der gleichen Weise wie Monomerbausteine verwendet werden. In einer einzelnen Synthese stellt die stöchiometrische Kopplung von Trinucleotidgemischen eine DNA jeder gewünschten Komplexität bei vollständiger Kontrolle über die Zusammensetzung bereit. Stop-Codons können vermieden werden und jede Aminosäurekombination kann an jeder Position codiert werden. Der Austausch eines Wildtyp-Codons mit jeder Trinucleotid-Kombination ist ohne weiteres dadurch durchzuführen, daß die DNA-Syntheseapparatur an dem gewünschten Syntheseschritt angewiesen wird, auf ein geeignetes Gemisch zuzugreifen. Das Verfahren ist daher für die Herstellung von Peptid-Bibliotheken definierter Zusammensetzungen ideal. Es ist auch gut zur Herstellung mutierter Oligopeptide oder Proteine geeignet, an denen eine besondere Aminosäurenklasse (z. B. hydrophobe) an einer oder mehreren Positionen eingeführt wird.
2. Sub-stöchiometrisches Koppeln
Durch Verringerung der Trinucleotidmenge, die während der DNA-Synthese verwendet wird, kann die sub-stöchiometrische Kopplung von geeignet ge schützten und aktivierten Trinucleotiden angewendet werden, um Substitutions-, Insertions- oder Deletionsmutagenese zu erzielen. In diesem Format ist die vorliegende Offenbarung geeignet, um Proteinmutanten, die einzelne Aminosäuresubstitutionen tragen, für das Studium der Strukturfunktionsbeziehungen herzustellen. Ein oder mehrere Trinucleotide werden in einer Menge zugesetzt, die sub-stöchiometrisch zu der Anzahl der 5'-Termini am festen Träger sind. Wenn ein Codon insertiert werden soll, ist das 5'-Ende des zugefügten Trinucleotids in derselben Weise geschützt, wie die in der Synthese verwendeten Monomere. Wenn Substitution oder Deletion erwünscht ist, trägt das 5'-Ende des Trinucleotids eine speziell ausgewählte stabile Schutzgruppe, im folgenden X genannt. In diesem Zusammenhang ist eine stabile Schutzgruppe X jede Funktionalität, die dazu in der Lage ist, den Bedingungen automatisierter DNA-Synthese zu widerstehen, die aber, wenn notwendig, selektiv gespalten werden kann. Das Trinucleotid kann an verschiedenen Punkten in der Sequenz des Wildtyp-Gens zugefügt werden. Das Endprodukt ist ein komplexes Oligonucleotidgemisch, das auf der Wildtyp-Sequenz basiert, das aber zufällig mit Gemischen einzelner oder degenerierter Trinucleotide versetzt ist. Insertions-, Substitutions- oder Deletionsmutagenese wird während sub-stöchiometrischer Kopplung wie folgt erreicht:
(i) Insertion (siehe 1)
In einer zweiten Ausführungsform zur Erzeugung von Insertionsmutationen wird das Trinucleotid so ausgewählt, daß es eine der häufig verwendeten Schutzgruppen in der 5'-Position, wie DMT, aufweist. Der kleine Anteil wachsender Ketten, die unter sub-stöchiometrischen Kopplungsbedingungen der Hinzufügung eines Trinucleotids unterzogen werden, werden unmittelbar entschützt und dann in allen folgenden Schritten verlängert. Das Gesamtergebnis ist die Hinzufügung von 3 Nucleotiden, die mit einem Codon korrespondieren, das in eine ansonsten Wildtyp-Sequenz insertiert wurde. Die Synthese wird fortgesetzt. An jeder Stelle, an der eine Aminosäure insertiert werden soll, wird eine weitere sub-stöchiometrische Kopplung entweder eines einzelnen Trinucleotids (um eine Art insertierte Aminosäure herzustellen) oder eines Gemisches von Trinucleotid-Phophoramiditen durchgeführt (wenn bis zu 19 verschiedene Reste an einer einzelnen Position eingefügt werden sollen).
(ii) Substitution (siehe 2)
In einer dritten Ausführungsform zur Erzeugung von Substitutionsmutationen während der sub-stöchiometrischen Kopplung wird das Trinucleotid so ausgewählt, daß es eine stabile 5'-Gruppe X (wie vorangehend definiert) aufweist, und ein differentielles Entschützungsschema wird angewendet. Auf die Einfügung des Trinucleotids folgend wird während der nächsten drei Hinzufügungen von Monomeren die 5'-Schutzgruppe des Trinucleotids nicht durch die Säurebehandlung, die die 5'-DMT-Gruppe der gekoppelten Monomere spaltet, entfernt. Dementsprechend wird der kleine Anteil der wachsenden Ketten, denen ein Trinucleotid hinzugefügt wurde, nicht verlängert. Nach dem Hinzufügen von drei konventionell geschützten Monomeren an alle anderen Ketten, die in der Sequenz mit dem Wildtyp-Codon korrespondieren, wird ein weiterer Schritt durchgeführt, um die Gruppe X am Ende des Trinucleotids zu entfernen. Die Synthese wird fortgesetzt. An jedem Codon, an dem Aminosäure-Substitutionen erzeugt werden sollen, wird eine weitere Kopplung mit entweder einem einzelnen Trinucleotid (um eine Art substituierte Aminosäure herzustellen) oder einem Gemisch von Trinucleotid-Phosphoramiditen durchgeführt (wenn bis zu 19 verschiedene Reste an einer einzelnen Position eingeführt werden sollen).
(iii) Deletion (siehe 3)
Wie auch hier beschrieben können Deletionen unter der Verwendung von Mononucleotiden mit einer stabilen 5'-Schutzgruppe X hergestellt werden. Die stabile 5'-Schutzgruppe X (wie im vorangehenden definiert) bezeichnet eine Grenze der Deletion und verhindert die anschließende Kopplung mit dem kleinen Prozentsatz der Ketten, die es erhalten. Anschließendes stöchiometrisches Koppeln normaler Monomere erfolgt nur an den Ketten, die während der Synthese entschützt werden. Die Entfernung der stabilen Schutzgruppe erlaubt die anschließende Kopplung an alle Ketten und definiert die zweite Grenze der Deletion. Dieser Prozeß kann während einer Runde der Oligonucleotid-Synthese mehrfach wiederholt werden, was zur Herstellung von Oligonucleotid-Populationen mit vielen verschiedenen Deletionen führt.
(iv) Substitution und Insertion
In einer vierten Ausführungsform können während einer einzelnen Synthese sowohl Substitutionen und Insertionen erfolgen. In diesem Fall werden während einer einzigen Oligonucleotid-Synthese sowohl 5'-X- und 5'-DMT-Trinucleotide verwendet. Auf den Einbau verschieden geschützter Trinucleotide folgend, wird das 5'-DMT-Trinucleotid entschützt und kann daher anschließender Verlängerung unterzogen werden, während das 5'-X-Trinucleotid geschützt bleibt und nicht verlängert wird. Spaltung der 5'-X-Gruppe von jenen Ketten, die es erhalten haben, erlaubt die anschließende Verlängerung. In dieser Weise können sowohl Substitutionen und Insertionen in einer einzelnen Synthese erzeugt werden.
Die gemischten Sequenzen, die unter Verwendung von Trinucleotiden für die DNA-Synthese hergestellt werden, können in Standard-Oligonucleotid-Mutagenese-Reaktionen verwendet werden, um ein sehr komplexes Gemisch mutierter Gene herzustellen. Genetische Selektion, genetische Durchsuchung und Nucleotid-Sequenzierung der mutierten Gene wird die einzelnen Mutationen identifizieren und geeignete Expressionssysteme werden die Produktion der korrespondierenden mutierten Oligo- oder Polypeptide oder Proteine ermöglichen.
Trinucleotide (im Gegensatz zu Oligonucleotiden, deren Länge nicht ein Vielfaches von 3 ist) bieten den Vorteil, daß sie an das Oligonucleotid nur an Positionen gekoppelt werden, die zu Codongrenzen korrespondieren. Daher werden alle Sequenzänderungen im richtigen Leseraster sein. Ein weiterer Vorteil ist, daß in derselben Synthese sowohl Substitution und Insertion von Trinucleotiden verwendet werden können, wodurch die Herstellung extrem komplexer Gemische von Oligonucleotiden erlaubt wird, die dazu in der Lage sind, viele Millionen mutante Formen des Proteins zu codieren, das der Mutagenese unterzogen wird. Obwohl das Koppeln von Trinucleotiden in der Wildtyp-Sequenz in der Proteinmutagense nützlich ist, kann das vorliegende Verfahren auch verwendet werden, um Oligonucleotide verschiedener Längen zu koppeln. Dies ist ein Vorteil gegenüber den Techniken des Stands der Technik, bei denen nur Monomersubstitutionen möglich waren.
In ihrer allgemeinsten Form betrifft die Erfindung Kopplung modifizierter, aktivierter Trinucleotide, um Sequenz-Degeneration herzustellen. Die hinzugefügten Trinucleotide sind in der Proteinmutagenese besonders interessant. Zur Herstellung von Insertionsmutationen kann eine konventionelle 5'-DMT-Schutzgruppe verwendet werden. Zur Herstellung von Substitutionsmutationen wird eine stabile 5'-Gruppe mit einem differentiellen oder orthogonalen Entschützungsschema verwendet.
Eine erste Aufgabe dieser Erfindung ist die Herstellung von Oligonucleotidgemischen in einer einzigen automatisierten Synthese.
Eine zweite Aufgabe dieser Erfindung ist die Herstellung einer oder mehrerer Aminosäure-Substitutionen in einer Wildtyp-Sequenz.
Eine dritte Aufgabe dieser Erfindung ist die Herstellung einer oder mehrerer Aminosäure-Insertionen in einer Wildtyp-Sequenz.
Eine vierte Aufgabe dieser Erfindung ist die Herstellung eines Gemisches von Aminosäure-Substitution und -Insertion in einer Wildtyp-Sequenz.
Eine fünfte Aufgabe dieser Erfindung ist die Produktion gewaltiger Aminosäure-Sequenz-Variationen in einer Wildtyp-Sequenz, wie in der in vitro Randomisierung der variablen Region klonierter Immunglobulingene, zur Herstellung effizienterer katalytischer Antikörper.
Eine sechste Aufgabe dieser Erfindung ist das Hinzufügen von Trinucleotiden an ausgewählten Positionen in einer Gensequenz als Substitutionen und/oder Insertionen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 ist eine schematische Darstellung der Schritte, die angewendet werden, um ein Oligonucleotidgemisch, das einzelne Codon-Insertionen enthält, während sub-stöchiometrischer Kopplung zu synthetisieren. Das Trinucleotid ist durch drei gefüllte Kreise von einem Rechteck umgeben dargestellt. Monomerbausteine, die vor der Trinucleotid-Kopplung verwendet werden, sind gefüllte Kreise. Die nach Trinucleotid hinzugefügten sind durch schraffierte Kreise angedeutet.
2 ist eine schematische Darstellung der Schritte, die angewendet werden, um ein Oligonucleotidgemisch, das einzelne Codon-Substitutionen enthält, während sub-stöchiometrischer Kopplung zu synthetisieren. Die Trinucleotid- und Monomerbausteine sind wie in 1 definiert. X ist eine besonders stabile Schutzgruppe, wie im Text definiert.
3 ist eine schematische Darstellung der Schritte, die angewendet werden, um ein Oligonucleotidgemisch, das einzelne Codon-Deletionen enthält, während sub-stöchiometrischer Kopplung zu synthetisieren. Der graue Kreis, der von einem Quadrat umgeben ist, ist der X-geschützte Mononucleotidbaustein, wobei X eine besonders stabile Schutzgruppe, wie im Text definiert, ist. Gefüllte Kreise sind konventionelle Monomerbausteine, die vor der Hinzufügung des X-Monomers gekoppelt werden, schraffierte Kreise sind die drei Monomerbausteine, die nach der Hinzufügung des X-Monomers gekoppelt werden, die ein Codon definieren. Graue Kreise sind Monomerbausteine, die nach der Entschützung des X-Monomers gekoppelt werden.
4 ist ein Histogramm, das die Verteilung und die Frequenzen der Alanin- und Glycin-Codon-Insertions-Mutationen zeigt, die von dem Staphylokokken-Nukleasegen gewonnen wurden. Zwei Experimente wurden durchgeführt, bei denen Insertionen auf verschiedene Teile des Gens gerichtet wurden (4A und 4B). Die horizontale Achse definiert die Codon-Grenzen, die vertikale Achse die Zahl der Mutanten. Alanin-Mutanten sind schattiert und Glycin-Mutanten die offenen Teile der Balken.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung stellt eine effiziente Methode zur Synthese von Oligonucleotiden gemischter Sequenz bereit, und auch für die Herstellung von Insertion und Substitution in Wildtyp-Sequenzgenen. Die Erfindung erlaubt die Verwendung von konventionellen Festphasen-Synthesegeräten, um Oligonucleotidgemische in einer einzigen automatisierten Synthese herzustellen. Die Erfindung erlaubt Insertion und/oder Substitution von Trinucleotiden über ein definiertes Segment eines klonierten Gens. Wenn ein Trinucleotid (oder ein kleines Oligonucleotid, das eine Nucleotidlänge eines Vielfachen von 3 hat) verwendet wird, werden In-Phase-Codon-Insertion oder -Substitution im richtigen Leseraster erhalten.
Die erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das stöchiometrische Koppeln von einem oder mehreren Trinucleotiden während automatisierter DNA-Synthese. Typischerweise wird die Synthese unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen automatisierten Synthese-Apparatur durchgeführt. Das normale Syntheseprogramm wird verwendet bis es notwendig wird, das Trinucleotid zu koppeln. An diesem Punkt wird das Programm ausgesetzt, die Syntheseapparatur wird instruiert, auf eine Flasche zuzugreifen, die an einem weiteren Einlaß angefügt ist, die eine weitere Trinucleotid-Lösung enthält. Das Trinucleotid trägt Schutzgruppen und eine aktivierte 3'-Position, die mit konventioneller chemischer DNA-Synthese kompatibel sind. Beispielsweise kann die 5'-Position des Trinucleotides als DMT-Ether geschützt sein und die 3'-Position als ein Phosphoramidit aktiviert sein. Danach wird die Synthese in der üblichen Weise fortgesetzt. Bei Abschluß der Synthese wird das Oligonucleotid von der Säule freigesetzt und die Basen und Phosphatester entschützt. Wenn die Basen die konventionellen Benzoyl- und Isobutyrylamide und die Phosphate als β-Cyanoethylester geschützt sind, kann eine Behandlung mit heißem konzentrierten Ammoniak verwendet werden, um vollständige Entschützung herbeizuführen. Wenn die Phosphate als Methylester geschützt sind, muß ein weiterer Schritt vor der heißen Ammoniakbehandlung eingeschlossen werden, in dem die Phosphatentschützung durch beispielsweise Thiophenol unter Verwendung gut-etablierter Bedingungen erreicht wird. In einer bevorzugten Ausführungsform können Gemische von Oligonucleotiden unter Verwendung von Trinucleotidgemischen, anstelle von einzelnen Trinucleotiden während des Syntheseprotokolls hergestellt werden. Synthese von Oligonucleotiden gemischter Zusammensetzungen wird genauso erreicht wie oben beschrieben mit dem Unterschied, daß wenn gewünscht auf eine Lösung zurückgegriffen wird, die zwei oder mehr Trinucleotide enthält.
Die zweite Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, die in 1 gezeigt ist, wird verwendet, um Trinucleotide während sub-stöchiometrischer Kopplung in eine Wildtyp-Sequenz einzufügen. Diese Ausführungsform ist für die Herstellung von In-Phase-Codon-Insertion wertvoll, die verwendet werden können, um Proteine mit modifizierten Strukturen und funktionellen Aktivitäten zu erzeugen. Wie in 1 gezeigt, wird die Oligonucleotid-Synthese von einem Nucleotid, das an dem Festphasen-Träger befestigt ist, begonnen und setzt sich von rechts nach links durch die Kopplung von Mononucleotiden fort. Wenn die Synthese eine Position in der Wildtyp-Sequenz erreicht, wo eine Insertion gemacht werden soll (d. h. an einer Codon-Grenze) wird ein Trinucleotid, das zu dem spezifischen Codon korrespondiert, an einen kleinen Prozentsatz aller wachsenden Oligonucleotid-Ketten (~1%) gekoppelt. Die DMT-Schutzgruppe am 5'-Ende des Trinucleotids wird dann abgespalten und drei weitere Mononucleotide werden an alle Oligonucleotidketten angefügt. An diesem Punkt ist die Synthese bis zur nächsten Codon-Grenze der Wildtyp-Sequenz fortgeschritten und der Zyklus von (i) sub-stöchiometrischen Koppeln eines Trinucleotids gefolgt von (ii) Entfernung der DMT-Schutzgruppe wird wiederholt, wodurch ein Trinucleotid an der nächsten Zielstelle in der Kette insertiert wird. Im Ergebnis wird die Wildtyp-„Hintergrund"-Sequenz durch Mononucleotid-Kopplung synthetisiert, wohingegen alle Kopplungen, die ein Trinucleotid einschließen, eine Insertionsmutante ergeben.
Somit wird durch das Überlagern sub-stöchiometrischer Kopplungen des Trinucleotidgemisches an Codon-Grenzpositionen in einer ansonsten konventionellen automatisierten Synthese eines Wildtyp-Oligonucleotids der Länge n ein heterogenes Gemisch von Oligonucleotiden erzeugt. Die genaue Zusammensetzung dieses Gemisches wird von der Anzahl der Trinucleotid-Kopplungen und ihrer Kopplungseffizienz abhängen. Wie auch immer deren Zusammensetzung ist, Harnstoff-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese kann zur Fraktionierung des Gemisches auf Grundlage der Länge verwendet werden, was erlaubt die n + 3 Bande, die für alle einzelnen Codon-Insertionen codiert, von der Wildtyp-Bande zu separieren und von anderen Banden, die für mehrfache Insertionen codieren. Wenn gewünscht können die Oligonucleotide, die für mehrfache Insertionen codieren, auch auf Harnstoff-Polyacrylamid-Gelen separiert werden.
Eine dritte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die sub-stöchiometrische Kopplung von Trinucleotiden zur Erzeugung von Substitutionsmutationen. Obwohl diese Ausführungsform auch gut für die Substitution eines kleinen Oligonucleotids jeder Länge funktionieren würde, wird aufgrund seiner Nützlichkeit in der Proteinmutagenese ein Trinucleotid diskutiert. Wie in 2 dargestellt, ist die einzige benötigte Modifikation der Austausch der 5'-DMT-Schutzgruppe des Trinucleotids durch eine Schutzgruppe 5' X, die gegenüber schwachen Säuren und den anderen Bedingungen, die in DNA-Synthese verwendet werden, stabil ist, aber labil gegenüber anderen milden Entschützungsbedingungen ist (verschiedene Schutzgruppen können verwendet werden; die folgende Liste ist eine Teilliste: (i) Levulinat (siehe van Boom, J. H. & Burgers, P. M. J. (1976) Tetrahedron Lett. 4875–4878), (ii) Silylether (siehe Ogilvie, K. K., Schifman, A. L., & Penny, C. (1979) Can. J. Chem. 57, 2230–2238), (iii) Fluoren-9-ylmethoxycarbonyl (Fmoc) (siehe Xu, Y., Lehmann, C., Slim, G., Christodoulou, C., Tan, Z. & Gait, M. J. (1989) Nucl. Acid Res. Symp. Ser. 21, 39–40), (iv) Tert-Butyldimethylsilyl, (v) Allyloxycarbonyl, (vi) Dibrommethylbenzoyl, (vii) 5'-O-b-substitutiertes Ethylsulfonyl, (viii) Tetrahydropyranyl (Thp), (ix) Methoxytetrahydropyranyl (Mthp), (x) 1-[(2-Chlor-4-Methyl)-Phenyl)-4-Methoxypiperidin-4-yl (Ctmp), (xi) Trityloxyacetyl und (xii) Tetraisopropyldisiloxy). Nach Kopplung eines X-blockierten Trinucleotids an 1–3% der Ketten fügen die drei folgenden Monomerkopplungen die nächsten Wildtyp-Codons an die 97–99% Ketten an, die nicht das Trinucleotid erhalten haben, aber nicht an die Ketten, die an das Trinucleotid gekoppelt haben. An diesem Punkt der Synthese wird die Entschützung aller Ketten (milde Säure um DMT freizusetzen; verdünntes wässeriges Hydrazin, wenn X Levulinat ist; Fluorid, wenn X ein Silylether ist; verdünnte Base, wenn X Fmoc ist) zu 1–3% Ketten mit einer Substitution des Codons, das durch das Trinucleotid bestimmt wurde, und 97–99% Ketten, in der die Sequenz immer noch Wildtyp ist, führen. Wie bei der Insertions-erzeugenden Strategie kann die Wiederholung des Grundzyklus von 1 sub-stöchiometrischen Trinucleotid-Kopplung gefolgt von 3 stöchiometrischen Monomerkopplungen verwendet werden, um Mutationen an jeder Position über das Gensegment, das durch seine Oligonucleotid-Sequenz definiert ist, einzuführen. Obwohl es nicht möglich ist, die mutierten Oligonucleotide aufgrund der Größe von denen mit Wildtyp-Sequenz zu reinigen, ist es möglich Trinucleotid-Bausteine zu verwenden, die eine oder zwei Phosphonat- oder Thiophosphat-Verknüpfungen enthalten, die die Reinigung aufgrund der Ladung oder chromatographischer Eigenschaften erlauben.
Hierin ist auch die Verwendung von unterschiedlich geschützten Monomeren zur Deletionsmutagenese beschrieben. Wie in 3 gezeigt, können Codon-Deletion durch die Verwendung von X-geschützten Mononucleotiden durch substöchiometrische Kopplungen gefolgt von vier DMT-Monomer-Additions-Zyklen vor der vollständigen Entschützung erzeugt werden. Wiederum schreitet diese Synthese normal fort bis die Grenze eine Codons, das deletiert werden soll, erreicht wird. An der Codon-Grenze wird eine sub-stöchiometrische Menge von 5'-X-Mononucleotid-Phosphoramidit gekoppelt, das dazu in der Lage ist, die Wildtyp-Aminosäuresequenz des angrenzenden Codons zu bewahren. Vier Zyklen konventioneller stöchiometrischer Mononucleotid-Kopplung an alle Ketten, die nicht die differentiell geschützten Mononucleotide erhielten, ermöglicht das Codon hinzuzufügen, das schließlich deletiert wird, plus ein zusätzliches Mononucleotid. An diesem Punkt wird die 5'-X-Schutzgruppe entfernt und zwei weitere Runden konventioneller Mononucleotid-Kopplung schließen die Synthese des Codons, das an die Deletionsstelle angrenzt, ab. Der gesamte Zyklus kann wiederholt werden. Schließlich wird eine große Population von Oligonucleotiden produziert, die für einzelne Codon-Deletionen codieren, die dann wie vorangehend beschrieben verwendet werden können, um Mutationen auszulösen.
Diese allgemeinen Schemata können in Fällen nützlich sein, in denen enorme Sequenzvariation erwünscht ist, wie in in vitro Randomisierung der variablen Region von klonierten Immunglobulin-Genen, um effizientere katalytische Antikörper herzustellen. Gleichermaßen können Projekte, die versuchen fest bindende Liganden über Phagendisplay-Bibliotheken und Peptidsegmentdisplay auf Enzymen zu entwickeln, die enorme Sequenz-Komplexität, die unter Verwendung von Trinucleotiden erzeugt werden kann, verwenden, insbesondere in den späteren Schritten der Optimierung einer anfänglich nur mittelmäßig festen Bindungs-Sequenz. Aus Gründen der Einfachheit lehrte die oben beschriebene Substitutions-Ausführungsform und Insertions-Ausführungsform eine Trinucleotid-Insertion oder -Substitution. Wie im vorangehenden diskutiert ist die Verwendung von Trinucleotiden von besonderem Interesse, wenn Aminosäuresubstitution oder -insertion durchgeführt werden. Es ist jedoch möglich, die Sequenz-Degeneration mit kleinen Oligonucleotiden jeder Länge einzuführen. Die vorangehende Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung allgemein. Ein genaueres Verständnis kann durch Verweis auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden, die hier nur zum Zwecke der Erläuterung angegeben sind und für die nicht beabsichtigt ist, daß sie den Umfang der Erfindung beschränken.
Beispiel 1: Synthese von Trinucleotiden
A. Synthese von 5'-DMT-dCBz-[PO(OMe)]-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-[P(OMe)(NiPr₂)].
Zu einer Lösung von dT-3'-Fmoc (930 mg, 2,0 mmol), (aus dem korrespondierenden 5'-DMT-Derivat durch Trichloressigsäure katalysierte Detritylierung zubereitet) und 5'-DMT-dT-3'[P(OMe)(NiPr₂)] (1,5 g, 2,1 mmol) in wasserfreiem Acetonitril, wurde Tetrazol (150 mg, 2,1 mmol) zugefügt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Phosphit mit t-Butylhydroperoxid (0,31 ml einer 80%igen Lösung in Di-t-Butylhydroperoxid, 2,5 mmol) oxidiert und überschüssiges Tetrazolphosphoramidit wurde mit Methanol gequencht. Die Lösung wurde eingedampft und die DMT-Gruppe durch Behandlung mit einer Lösung einer Trichloressigsäurelösung (0,82 g, 5,0 mmol) in Dichlormethan gespalten. Das DMT-Kation wurde mit 10 mM Natriumbicarbonat Lösung gequencht und das 5'-HO-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-Fmoc wurde mit Dichlormethan extrahiert. Die organische Schicht wurde getrocknet (Na₂SO₄), filtriert und eingedampft und der Rückstand durch Silicagel-Chromatographie unter Verwendung eines Gradienten von 0–8% Methanol in Dichlormethan (Rf = 0,30 in 10% Methanol/Dichlormethan) gereinigt, was zu 1,1 g (70%) 5'-HO-dT-3'-[PO(OMe)]-dT-3'-Fmoc führte.
Zu einer Lösung von gereinigtem 5'-HO-dT-3'-[PO(OMe)]-dT-3'-Fmoc (780 mg, 1,0 mmol) und 5'-DMT-dCBz-3'-[P(OMe)(NiPr₂)] (950 mg, 1,2 mmol) in wasserfreiem Acetonitril wurde Tetrazol (83 mg, 1,2 mmol) hinzugefügt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde das Phosphit mit t-Butylhydroperoxid (0,19 ml einer 80%igen Lösung in Di-t-Butylhydroperoxid, 1,5 mmol) oxidiert und überschüssiges Tetrazolphosphoramidit wurde mit Methanol gequencht. Die Lösung wurde eingedampft und der Rückstand durch Chromatographie auf basischem Aluminiumoxid unter Verwendung eines Grandienten von 0–8% Methanol in Dichlormethan (Rf = 0,42 in 10% Methanol/Dichlormethan) gereinigt, was zu 790 mg (53%) 5'-DMT-dCBz-[PO(OMe)]-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-Fmoc führte.
Das gereinigte voll geschützte Trinucleotid (300 mg, 0,2 mmol) in Dichlormethan wurde mit Triethylamin (100 mg, 1,0 mmol) bei Raumtemperatur für 90 Minuten behandelt, um die 3'-Fmoc-Gruppe zu entfernen. Das 3'-OH Trinucleotid (Rf = 0,26 in 10% Methanol/Dichlormethan) wurde dann bei Raumtemperatur mit Chlor-N,N-Diisopropylaminomethoxyphosphin (40 mg, 0,3 mmol) für 30 Minuten behandelt. Überschüssiges Chlorphosphin wurde mit Methanol gequencht, die Lösung wurde mit Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und das Trinucleotidphosphoramidit wurde durch Prezipitation aus Hexan gewonnen, was zu 230 mg (80%) 5'-DMT-dCBz-[PO(OMe)]-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-[P(OMe)(NiPr₂)] führte.
B. Herstellung von DNA unter Verwendung von 5'-DMT-dCBz-[PO(OMe)]-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-[P(OMe)(NiPr₂)].
In allen Fällen wurde die automatisierte DNA-Synthese entweder auf einem Applied Biosystems ABI 340B oder 380B Syntheseapparat durchgeführt. Das Phosphoramidit wurde in wasserfreiem Acetonitril in einer Konzentration von 10 mM gelöst und an den fünften Einlaß der Syntheseapparatur angeschlossen. Auf die Kopplung der drei Monomere an die Säule folgend wurde das Trinucleotid in einem doppelten Kopplungsverfahren zugefügt. Die Kopplungsausbeute wurde durch die Messung der Freisetzung des DMT-Kations bestimmt. Es wurde eine Ausbeute, die 95% überschritt, erhalten. Zum Abschluß der Synthese wurde das Heptanucleotid vom festen Träger freigesetzt und die Basen durch Behandlung mit konzentrierten wässerigen Ammoniak in dem üblichen Wege entschützt. Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (20%) und HPLC (C18 Säule, 0,1 M Triethylammoniumacetat/Acetonitril) bestätigten die Bildung des Heptanucleotids und die Abwesenheit irgend welcher mißlungenen Sequenzen.
Beispiel 2: Insertions-Mutagenese
A. Allgemeines Verfahren zur Insertion eines einzelnen Trinucleotids in das Gen für Staphylokokken-Nuclease.
Die Synthese verwendete die Standard 0,2 mmol Synthese Routine, die verändert wurde, um den Schutzschritt nach der sub-stöchiometrischen Addition des Trinucleotids zu eliminieren. Trinucleotid-Phosphoramidit (25 mg) wurde in wasserfreiem Acetonitril gelöst und das Gefäß wurde an dem 5. Injektionseinlaß der Syntheseapparatur befestigt. Kopplungseffizienzen der einzelnen Monomer- und Trinucleotid-Additionen wurden durch die Freisetzung der 5'-DMT-Gruppe überwacht. Die Konzentration des ungereinigten Oligonucleotids wurde aufgrund der Absorption bei 260 nm geschätzt.
Nach der Synthese wurden 10–15 nmol unreines Oligonucleotid mit Phenol extrahiert, vakuumgetrocknet und in 5 μl 5 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris.HCl, pH 8,1 bei 65°C für 30 Minuten resuspendiert. Ein gleiches Volumen von 95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,1% Bromphenolblau und 0,1% Xylencyanol wurde hinzugefügt, die Proben wurden für 2 Minuten auf 100°C erhitzt, auf ein 0,4 mm dickes 42 cm langes 15–20% Polyacrylamidgel geladen und bei 750 V elektrophoriert bis das Xylencyanol auf dem Gel zur Hälfte heruntergewandert war. Das Gel wurde für 30 Minuten in 2 mg/ml Ethidiumbromid gefärbt, Oligonucleotid-Banden wurden durch UV-Beleuchtung visualisiert und ein 0,5–1,0 cm Abschnitt des Gels unmittelbar über der Hauptbande wurde ausgeschnitten und über Nacht in 300 mM Natriumacetat, 5 mM EDTA bei 37°C eluiert. Nach kurzer Zentrifugation, um die Festbestandteile zu entfernen, wurde das Oligonucleotidgemisch mit Ethanol präzipitiert.
Das unreine Oligonucleotidgemisch wurde mit γ-³²P-ATP unter Verwendung von Polynucleotidkinase radioaktiv markiert, um die Gegenwart der n + 3 Bande zu bestätigen und die Ausbeute zu quantifizieren. Ungefähr 1 pmol gereinigtes n + 3 Oligonucleotid wurde verwendet, um einen Uracil-enthaltenden von M13-abgeleiteten Phagen, der das Gen für Staphylokokkennuclease trägt, zu mutagenesieren. Die mutierten Plaques wurden unter Verwendung eines chromogenen Indikator-Agars identifiziert und die Nucleasegene jedes mutierten Phagens wurden in ihrer Gesamtheit durch das Dideoxy-Verfahren sequenziert.
B. Allgemeine Verfahren zur Insertion von ein oder zwei Codons.
Eine sub-stöchiometrische Kopplung eines Gemisches von DMT-dGdCdT-Phosphoramidit und DMT-dGdGdT-Phosphoramidit wurde während der Synthese mutagener Oligonucleotide für das Staphylokokkennukleasegen durchgeführt. Auf diese Reaktion, die zu 1–3% Kopplung führte, folgend wurde der Standard-Schutzschritt mit Acetanhydrid ausgelassen. (Andernfalls wären die 97–99% der Ketten, die nicht an der Reaktion teilgenommen haben, für weitere Kopplungen inaktiviert worden.) Die nachfolgenden Schritte der Phosphitoxidation und Entschützung der 5'-DMT-Gruppe wurden genau wie in konventionellen Monomer-Additionszyklen durchgeführt. An diesem Punkt der Synthese hatten 1–3% der Ketten ein zusätzliches dGdCdT oder dGdGdT Codon an ihren 5'-Enden, die übrigen 97–99% hatten hingegen Wildtyp-Sequenz. Als nächstes wurden drei Monomer-Additionszyklen durchgeführt, so daß sowohl die Ketten normaler Länge und die Ketten mit einem Extra-Codon das nächste Wildtyp-Codon erhielten. Wiederum wurde eine Codon-Grenze erreicht; um Einzelcodon-Insertion an dieser Position durchzuführen wurde eine weitere Runde sub-stöchiometrischen Koppelns des Trinucleotidgemisches unter Auslassung der 5'-Schutzsreaktion durchgeführt. An diesem Punkt der Synthese hatten 1–3% der Ketten eine zweite Insertion von entweder dGdCdT oder dGdGdT erhalten, 1–3% hatten die erste erhalten, weniger als 0,1% hatten beide Insertionen und die übrige Mehrheit eine Sequenz des Wildtyps. Drei weitere Monomer-Additionszyklen wurden dann durchgeführt, um das nächste Wildtyp-Codon an allen Ketten zu befestigen. Weitere Kopplungen des Trinucleotidgemisches wurden nach jedem dritten Monomerkoppeln durchgeführt, bis an allen Zielpositionen Codons insertiert worden waren. Abschließende 6–9 Monomerkopplungen folgten, um die Menge der Wildtyp-Sequenzhomologie zu erhöhen, die für das Starten einer Zweitstrang-Synthese durch das Oligonucleotid an einer einzelsträngigen DNA-Vorlage benötigt wird.
C. Verwendung eines dGdCdT Trinucleotids zur Einzelcodon-Insertions-Mutagenese.
Die Insertion des Trinucleotids dGdCdT wurde an den Codon-Grenzen 64/65, 65/66 und 66/67 des Staphylokokkennucleasegens durchgeführt. Wenn das gereinigte Oligonucleotidgemisch zur Mutagenisierung des einzelsträngigen Phagen verwendet wurde, waren 15% der sich ergebenden Phagen-Plaques Nucleaseaktivitäts-defizient. Von den 24 mutierten Isolaten, die sequenziert wurden, hatten 11 eine dGdCdT Insertion an 65/66, 11 eine dGdCdT Insertion an 66/67, eine hatte Wildtyp-Sequenz, eine hatte eine einzige Nucleotid-Deletion innerhalb der Oligonucleotid-Sequenz, vermutlich aufgrund eines kontaminierenden n – 1 Oligonucleotids, das nicht durch den Gel-Elektrophorese-Reinigungsschritt entfernt wurde. Ein identisches Experiment, das dGdGdT Insertionen auf dieselben drei Positionen richtete, ergab 5 dGdGdT Insertionen an 64/65, 10 an 65/66, 3 an 66/67, eine Wildtyp, eine einzelne Nucleotid-Deletion und vier Mutationen aufgrund der Oligonucleotid-Fehlpaarung an anderen Stellen in dem Nucleasegen.
D. Verwendung von dGdCdT und dGdGdT Trinucleotiden für Mehrfach-Codon-Insertions-Mutagenese.
4 zeigt die Ergebnisse von zwei Experimenten, in denen equimolare Gemische (4,1 mM) 5'-DMT-dGdCdT-Phosphoramidit und 5'-DMT-dGdGdT-Phosphoramidit für Insertions-Mutagenese verwendet wurden. Das Histogramm zeigt die Verteilung und die Häufigkeit von Alanin (in dem schraffierten Teil des Baldendiagramms gezeigt) und Glycin (in dem offenen Bereich des Balkendiagramms gezeigt) Codon-Insertions-Mutationen, die für das Staphylokokken-Nucleasegen wiedergewonnen wurden. Im ersten Experiment wurde ein Oligonucleotid mit der Wildtyp-Länge n = 29 hergestellt mit Insertionen, die auf jede der 5 Codon-Grenzen zwischen Codon 98 und 103 des Staphylokokken-Nucleasegens gerichtet waren. 24 der 38 mutierten Plaques enthielten einzelne Codon-Insertionen, wobei alle Positionen außer 99/100 repräsentiert wurden (4A). 13 der verbleibenden Mutanten zeigten eine einzelne Nucleotid-Deletion innerhalb der Oligonucleotid-Sequenz, was mit einer Mutagenese in Oligonucleotid von der kontaminierenden n – 1-Bande übereinstimmt. Zusätzlich wurde eine Einzel-Nucleotid-Insertion gefunden.
Im zweiten Experiment wurde ein Oligonucleotid mit der Wildtyp-Länge n = 46 synthetisiert, um Insertionen auf neun der zehn Codon-Grenzen zwischen Codons 31 und 43 des Staphylokokken-Nucleasegens zu richten. In diesem Fall enthielten 21 der 37 sequenzierten mutierten Plaques eine einzelne dGdGdT oder dGdCdT Insertion an einer der Zielpositionen; die Verteilung dieser Insertion wird in 4B gezeigt. Wiederum waren einzelne Nucleotid-Deletionen innerhalb der Oligonucleotide die Hauptkontamination (12 Isolate), wobei zwei einzelne Nucleotid-Insertionen und zwei größere Deletionen den Rest ausmachten.
Beispiel 3: Substitutions-Mutagenese
A. Synthese eines Trinucleotid-Phosphoramidits mit einer Fmoc (Fluoren-9-yl-methoxycarbonyl) Schutzgruppe, das für Leucin codiert.
Ein Trinucleotid, das ein Leucin-Codon spezifiziert kann individuell unter Verwendung von Standard-Flüssigphasen-Chemie synthetisiert werden. Die Resuspension des 5'-OH-Trinucleotids in trockenem Pyridin gefolgt von Inkubation mit 1,5-Äquivalenten von Fmoc-Cl bei 0°C für eine Stunde kann zur Herstellung eines 5'-Fmoc-geschützten Trinucleotids in einer Ausbeute, die größer als 50% ist, führen. RP-HPLC kann zur Reinigung des 5'-Fmoc-Trinucleotids verwendet werden und seine Struktur kann durch die Verwendung von ¹H-NMR-Spektroskopie unterstützt werden (Lehmann, C., Xu, Y. Christodoulou, C., Tan, Z. und Gait, M. J. (1989) Nucl. Acids Res. 17, 2379–2389). Standard-Verfahren (siehe Balgobin, N. und Chattopadhyaya, J. (1987) Nucleosides and Nucleotides 6, 461–463) können verwendet werden, um das 5'-Fmoc-Trinucleotid zu phosphitylieren und die sich daraus ergebenden Phosphoramidite zu reinigen. Die Struktur des Endprodukts 5'-Fmoc-dCBz-[PO(OMe)]-dT-[PO(OMe)]-dT-3'-[P(OMe)(NiPr₂)] kann durch die Verwendung von ¹H- und ³¹P-NMR-Spektroskopie unterstützt werden und durch DNA-Sequenzierung der Mutationen, die durch das Trinucleotid induziert werden, bestätigt werden. Das lyophilisierte Produkt sollte in 25 mg Portionen in gelb-getönten Gefäßen unter Argon bei –70°C aufbewahrt werden.
B. Codon-Substitution mit 5'-O-Fmoc-dCdTdT-Phosphoramidit.
Oligonucleotide können auf einer 340B Applied Biosystems DNA-Syntheseapparatur unter Verwendung der kommerziell erhältlichen 0,2 μmol Synthese-Routine synthetisiert werden. Die Routine ist modifiziert, um den Schutzschritt nach der sub-stöchiometrischen Addition des Trinucleotids auszulassen. Ein Schritt wird hinzugefügt, in dem 100 mM DBU (1,8-Diazabicyclo-[5.4.0]-undec-7-en) in einem separaten Gefäß zugefügt wird, um die Entfernung der 5'-Fmoc-Schutzgruppe des gekoppelten Trinucleotids nach den drei darauf folgenden Mononucleotid-Kopplungszyklen zu bewirken. Mononucleotid und Trinucleotid Kopplungseffizienzen können durch Überwachung der Absorption der freigesetzten DMT- und Fmoc-Gruppen bei 498 bzw. 305 nm gemessen werden. Das endgültige Oligonucleotid-Produkt, das eine 5'-DMT-Gruppe enthält kann vom festen Träger gespalten werden und von verkürztem Produkt vor der Standard-Entfernung der verbleibenden Schutzgruppen durch RP-HPLC gereinigt werden.
Die Oligonucleotid-Konzentration kann aus der Absorption bei 260 nm abgeschätzt werden. Ungefähr 1 pmol des gereinigten Oligonucleotids kann verwendet werden, um einen Uracil-enthaltenden M13-Phagen (siehe Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488–492), der das Gen für Staphylokokken-Nuclease trägt, zu mutieren. Mutierte Plaques können unter Verwendung eines chromogen Indikator-Agars identifiziert werden (siehe Shortle, D. (1983) Gene 22, 181–189) und das Nucleasegen jedes mutanten Phagens kann in seiner Gesamtheit durch das Dideoxynucleotid-Ketten-Abbruchverfahren (siehe Sanger, F. Nicklen, S. & Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467) sequenziert werden.
Beispiel 4: Deletionsmutagenese (nicht beansprucht)
A. Synthese eines Deoxythymidin-Mononucleotid-Phosphoramidits mit einer 5'-Fmoc-(Fluoren-9-yl-methoxycarbonyl)-Schutzgruppe.
Die Suspension von Deoxythymidin in getrocknetem Pyridin gefolgt von der Inkubation mit 1,5-Äquivalenten Fmoc-Cl bei 0°C für eine Stunde kann zur Herstellung des 5'-Fmoc-geschützten Mononucleotids mit einer Ausbeute, die größer als 50% ist, führen. RP-HPLC kann zur Reinigung des 5'-Fmoc Mononucleotids verwendet werden und seine Struktur kann durch die Verwendung von ¹H-NMR-Spektroskopie (Lehmann, C., Xu, Y., Christodoulou, C., Tan, Z. & Gait, M. J. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 2379–2389) unterstützt werden. Standardverfahren (siehe Balgobin, N. & Chattopadhyaya, J. (1987) Nucleosides and Nucleotides 6, 461–463) können verwendet werden, um das 5'-Fmoc Mononucleotid zu phosphitylieren und das sich ergebende 3'-Phosphoramidit zu reinigen. Die Struktur des endgültigen Produkts, 5'-FmocO-dT-3'-[P(OMe)(NiPr₂)], kann durch die Verwendung von ¹H-NMR und ³¹P-NMR-Spektroskopie unterstützt werden und durch DNA-Sequenzierung der Mutationen, die durch die Verwendung des Mononucleotids induziert wurden, bestätigt werden. Das lyophilisierte Produkt sollte in 25 mg Portionen in gelb-gefärbten Gefäßen unter Argon bei –70°C aufbewahrt werden.
B. Oligonucleotid-Synthese mit Codon-Deletion.
Die Oligonucleotide können auf einer 340B Applied Biosystems DNA-Syntheseapparatur unter Verwendung der kommerziell erhältlichen 0,2 μmol Synthese-Routinen synthetisiert werden. Die Routine wird dahingehend modifiziert, daß der Schutzschritt nach der substöchiometrischen Addition des Mononucleotids ausgelassen wird. Ein Schritt wird hinzugefügt, in dem 100 mM DBU aus einem separaten Gefäß hinzugefügt wird, um die Entfernung der 5'-Fmoc-Schutzgruppe des gekoppelten Trinucleotids nach vier darauf folgenden Mononucleotid-Kopplungszyklen herbeizuführen. Die 5'-Fmoc-Mononucleotid- und 5'-DMT-Mononucleotid-Kopplungseffizienzien können durch Überwachung der Absorption der freigesetzten DMT- und Fmoc-Gruppen bei 498 bzw. 305 nm gemessen werden. Das endgültige Oligonucleotid-Produkt kann von dem festen Träger abgespalten werden und vor Standard-Entfernung der verbleibenden Schutzgruppen basierend auf der Größe gereinigt werden.
Die Oligonucleotid-Konzentration kann aus der Absorption bei 260 nm abgeschätzt werden. Ungefähr 1 pmol des gereinigten Oligonucleotids kann verwendet werden, um einen Uracil-enthaltenden M13-Phagen, wie vorher beschrieben, zu mutagenisieren. Mutierte Plaques können unter Verwendung eines chromogen Indikator-Agars identifiziert werden und das Nucleasegen jedes mutierten Phagen kann in seiner Gesamtheit durch das Dideoxynucleotid-Ketten-Abbruchverfahren, wie vorher beschrieben, sequenziert werden.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer DNA-Molekülpopulation gemischter Sequenzen in einer einzigen automatisierten DNA-Synthese umfassend: Unterdrücken des schrittweisen Koppelns von Monomeren und Einsetzen einer gemischten Population von Trinucleotiden, wobei jedes Trinucleotid ein 3'-Phosphoramidit umfaßt, für den stöchiometrischen Einbau an einer oder mehreren Codongrenze(n) unter Ausbildung einer DNA-Molekülpopulation gemischter Sequenzen.
Verfahren zum Einfügen von Trinucleotidsequenzen an einer oder mehreren Codongrenze(n) während der chemischen DNA-Synthese, wobei das Verfahren die Schritte (a) substöchiometrisches Koppeln einer Trinucleotidsequenz, die eine 3'-Phosphoramidit- und einer 5'-Schutzgruppe trägt, die unter den Bedingungen abgespalten wird, die zur Entfernung der 5'-Schutzgruppen der Monomerbausteine verwendet werden, (b) Abspalten aller 5'-Schutzgruppen, (c) Fortführen der DNA-Synthese durch Kopplung von entweder Monomeren oder weiteren Trinucleotidsequenzen, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei eine Mischung aus Trinucleotiden verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–3, wobei die Trinucleotidsequenz eine 5'-DMT-Gruppe trägt.
Verfahren zum Ersatz einer Trinucleotidsequenz an einer oder mehreren Codongrenze(n) während der chemischen DNA-Synthese, wobei das Verfahren die Schritte (a) stöchiometrisches Koppeln einer Trinucleotidsequenz, die ein 3'-Phosphoramidit und eine 5'-Schutzgruppe trägt, die unter den Bedingungen stabil ist, die verwendet werden, um die 5'-Schutzgruppen der Monomerbausteine abzuspalten, (b) Hinzufügen von ausgewählten Monomeren, die konventionelle 5'-Schutzgruppen tragen, in drei Mononucleotidsynthese-Zyklen an die DNA-Moleküle, die die Trinucleotide, die eine stabile 5'-Schutzgruppe tragen, nicht erhielten, (c) Spalten der 5'-Schutzgruppe an den DNA-Molekülen, welche die genannte Trinucleotidsequenz erhielten und entweder – Koppeln zusätzlicher Monomere oder – Wiederholen der Sequenz der Schritte von (a), umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei eine Mixtur von Trinucleotiden verwendet wird.
Verwendung eines Trinucleotids in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6, wobei das Trinucleotid eine geschützte 5'-Position, geschützte Phosphatester, geschützte Basen und ein 3'-Phosphoramidit trägt, wobei die Schutzgruppen mit konventioneller chemischer DNA-Synthese kompatibel sind und wobei die 5'-Schutzgruppe unter den Bedingungen, die während der chemischen DNA-Synthese verwendet werden, stabil ist, aber selektiv gespalten werden kann, wenn gewünscht.
Verwendung eines Gemisches aus Trinucleotiden in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei jedes Trinucleotid eine geschützte 5'-Position, geschützte Phosphatester, geschützte Basen und ein 3'-Phosphoramidit trägt, wobei die Schutzgruppen mit konventioneller chemische DNA-Synthese kompatibel sind.
Verwendung eines Gemisches aus Trinucleotiden n einem Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei jedes Trinucleotid eine geschützte 5'-Position, geschützte Phosphatester, geschützte Basen und ein 3'-Phophoramidit trägt, wobei die Schutzgruppen kompatibel mit konventioneller chemische DNA-Synthese sind und wobei die 5'-Schutzgruppe unter Bedingungen, die verwendet werden, um 5'-Schutzgruppen von Monomerbausteinen abzuspalten, stabil ist.
Verwendung eines Trinucleotids in der Herstellung eines Gemisches aus Trinucleotiden zur Verwendung in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei jedes Trinucleotid eine geschützte 5'-Position, geschützte Phosphatester, geschützte Basen und ein 3'-Phosphoramidit trägt, wobei die Schutzgruppen mit konventioneller chemischer DNA-Synthese kompatibel sind.