DE69322272T2

DE69322272T2 - Substituierte arginine und substituierte homoarginine und ihre verwendung

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Publication number: DE69322272T2
Application number: DE69322272T
Authority: DE
Inventors: Owen W. Milwaukee Wi 53210 Griffith
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1992-05-28
Filing date: 1993-05-19
Publication date: 1999-04-22
Anticipated expiration: 2013-05-20
Also published as: DE69322272D1; US5453441A; ATE173621T1; ES2123653T3; EP0649303A4; WO1993024126A1; EP0649303A1; JPH07507306A; EP0649303B1; US5281627A

Description

Die Erfindung betrifft neue Inhibitoren der biologischen Stickoxidbildung.
Über mehrere Dekaden wurde Menschen bei der Behandlung von cardiovaskulären Krankheiten Nitroglycerin als ein vasodilatierendes Mittel verabreicht. Es ist gezeigt worden, daß das so verabreichte Nitroglycerin im Körper zu Stickoxid, welches das pharmakologisch aktive Metabolit ist, umgewandelt wird. Kürzlich wurde gezeigt, daß Stickoxid im vaskulären Endothel als normaler Metabolit enzymatisch aus Arginin gebildet wird, wobei eine wichtige Komponente der Endothel-entstammenden Relaxierungsfaktoren (endothelium-derived relaxing factors, EDRFs) bereitgestellt wird, welche gegenwärtig hinsichtlich ihrer Beteiligung an der Regulation des Blutkreislaufs und des Gefäßwiderstandes intensiv untersucht werden. Es wurde auch gezeigt, daß Makrophagen im Körper Stickoxid produzieren, als eine Komponente ihrer zelltötenden und/oder cytostatischen Funktion.
Kürzlicher wurde nachgewiesen, daß das Enzym, welches Stickoxid aus Arginin bildet, d. h. die Stickoxidsynthase, in mindestens zwei unterschiedlichen Formen auftritt, nämlich einer konstitutiven Form und einer induzierbaren Form. Die konstitutive Form kommt in normalen Endothelzellen, Neuronen und einigen anderen Geweben vor. Es wird angenommen, daß die Bildung von Stickoxid durch die konstitutive Form in Endothelzellen bei der normalen Blutdruckregulation eine Rolle spielt. Es wurde gefunden, daß die induzierbare Form der Stickoxidsynthase in aktivierten Makrophagen vorkommt, und in Endothelzellen und vaskulären glatten Muskelzellen, z. B. durch verschiedene Cytokine und/oder mikrobielle Produkte induziert wird. Es wird angenommen, daß bei einer Sepsis oder einem Cytokin-induzierten Schock die Überproduktion von Stickoxid durch die induzierbare Form der Stickoxidsynthase eine wichtige Rolle bei der beobachteten lebensbedrohenden Hypotension spielt. Ferner wird angenommen, daß die Überproduktion von Stickoxid durch die induzierbare Form der Stickoxidsynthase ein Grund für die Unempfindlichkeit gegenüber klinisch verwendeten blutdruckerhöhenden Mitteln, wie α&sub1;- adrenergischen Agonisten, bei der Behandlung von septischen oder Cytokin-induzierten Schockpatienten ist.
Beträchtliche Forschungsanstrengungen wurden unternommen, um Inhibitoren der Stickoxidsynthaseaktivität zu entdecken. Ein großer Teil dieser Forschungsanstrengungen wurde auf die Entdeckung von Argininantagonisten gerichtet, welche derart funktionieren, daß sie die Stickoxidsynthaseaktivität hemmen. Die meisten der bislang entdeckten Inhibitoren blockieren nicht nur die induzierbare Stickoxidsynthaseaktivität sondern auch die konstitutive Stickoxidsynthaseaktivität; und typischerweise ist jede Hemmspezifität irgendeines speziellen Argininantagonisten für die induzierbare Stickoxidsynthaseaktivität nicht so hoch, als daß es möglich ist, die Hypotension-verursachende pathologische Überproduktion von Stickoxid (ein durch das induzierbare Enzym vermittelter Prozess) in einem therapeutisch ausreichenden Umfang (d. h. so da eine klinisch schwere Hypotension, welche normalerweise bei Sepsis oder Cytokin-induziertem Schock auftreten würde, verhindert wird oder so daß die Empfindlichkeit gegenüber Blutdruckerhöhenden Mitteln wiederhergestellt wird) zu blockieren und zur gleichen Zeit nicht die physiologische Stickoxidsynthese, von der angenommen wird, daß sie bei der neuralen Funktion und der normalen Blutdruckregulation (durch das konstitutive Enzym vermittelte Prozesse) eine Rolle spielt, zu blockieren und dadurch die Toxizität (z. B. neuronale Toxizität und Hypertension), welche mit der Störung der physiologischen Stickoxidsynthese verbunden ist, zu vermeiden.
US-A-5 028 627 betrifft ein Verfahren zur Prophylaxe oder Behandlung eines Tieres auf systemische Hypotension, herbeigeführt durch gamma-Interferon, Tumornekrosefaktor, Interleukin-1 oder Interleukin-2, wobei das Verfahren intravaskuläre Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von einem NG-substituierten Arginin oder einem NG,NG-disubstitutierten Arginin an ein Tier umfaßt.
US-A-5 059 712 betrifft ein pharmazeutisch reines physiologisch aktives NG-Aminoarginin oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon, welches in einer die Stickoxidsynthese inhibierenden Menge an ein Subjekt, welches eine solche Inhibition braucht, verabreicht wird.
Es ist eine Aufgabe der hier beschriebenen Erfindung, neue Argininantagonisten bereitzustellen, welche die induzierbare Form der Stickoxidsynthase in vaskulären glatten Muskelzellen und/oder anderen Zellen, welche pathologische Mengen von Stickoxid produzieren, zu hemmen, welche eine Struktur besitzen, förderlich, die genannte Hemmung selektiv, d. h. ohne Hemmung der konstitutiven Isoform der Stickoxidsynthase in einem physiologisch unerwünschten Ausmaß zu hemmen, auszuführen.
Die neuen hierin beschriebenen Argininantagonisten sind Guanidino-substituierte Arginine oder Homoarginine auf der Basis von Monoalkylkohlenstoff substituierten Ornithinen oder Lysinen, welche die folgende Formel besitzen
worin R sich am α-Kohlenstoff befindet und (CH&sub2;)yCH&sub3; oder H ist, R' den β-Kohlenstoff einschließt und CH&sub2; oder C(H)(CH&sub2;)yCH&sub3; ist, und R" den γ-Kohlenstoff einschließt und CH&sub2; oder C(H)(CH&sub2;)yCH&sub3; ist, wobei y von 0 bis 5 reicht, und · 0 oder 1 ist und Q sich am ω-Stickstoff befindet, und eine Alkylgruppe, enthaltend 1 bis 6 Kohlenstoffatome oder NH&sub2; oder NO&sub2; ist, und nur eine von R, R' oder R" einen Alkylsubstituenten auf der Ornithin- (x = 0) oder Lysin- (x = 1)Gruppierung bereitstellt, und Gemische davon mit dem entsprechenden D-Isomeren.
Es ist eine Aufgabe einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, eine Zusammensetzung zur Hemmung pathologischer Überexpression von Stickoxid aus Arginin durch die induzierbare Form der Stickoxidsynthase bereitzustellen, wobei die Zusammensetzung eine Menge eines neuen, oben beschriebenen Argininantagonisten, welche therapeutisch in der Weise wirksam ist, daß sie die genannte Stickoxidsynthase hemmt (und dadurch die genannte pathologische Überexpression verhindert) und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Es ist eine Aufgabe einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, ein ex vivo-Verfahren zur Hemmung der Fähigkeit der induzierbaren Stickoxidsynthase, die Umwandlung von Arginin in Stickoxid zu katalysieren, bereitzustellen, wobei das Verfahren das Versetzen des Enzyms mit einer Menge eines neuen oben beschriebenen Argininantagonisten wirksam die Katalyse zu blockieren, umfaßt.
Es ist eine Aufgabe einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, die obige Verbindung zur Verwendung bei einem Verfahren zur Hemmung der Fähigkeit der induzierbaren Stickoxidsynthase die Umwandlung von Arginin in Stickoxid zu katalysieren, bereitzustellen.
Die Erfindung betrifft überdies die obige Verbindung zusammen mit einem α&sub1;-adrenergischen Agonisten zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Subjekts, welches infolge pathologischer Überproduktion von Stickoxid aus Arginin systemische Hypotension hat, wobei die Menge der obigen Verbindung in der Weise wirksam ist, daß es die vaskuläre Empfindlichkeit gegenüber der Wirkung des αl-adrenergischen Agonisten wiederherstellt, wobei die Menge des a1-adrenergischen Agonisten in der Weise wirksam ist, daß es den Blutdruck auf ein klinisch annehmbares Niveau erhöht und die Verwendung der obigen Verbindung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der pathologischen Überproduktion von Stickoxid aus Arginin durch die induzierbare Form der Stickoxidsynthase und bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung systemischer Hypotension infolge pathologischer Überproduktion von Stickoxid aus Arginin.
Fig. 1 und 2 sind graphische Darstellungen der Stickoxidsyntheseaktivität, ausgedrückt als "NO SYNTHETISIERT" (% DER KONTROLLE)", gegen die Konzentration des Inhibitors und stellen die Ergebnisse von Beispiel VI dar. NO steht für Stickoxid.
Wir kommen jetzt zu den neuen hierin beschriebenen Argininantagonisten, wobei in der oben angegebenen Strukturformel y vorzugsweise 0 ist.
Die neuen hierin beschriebenen Argininantagonisten schließen z. B. α-Methyl-Nω-methylarginin, α-Ethyl-Nω-methylarginin, α-Hexyl-Nω-methylarginin, RS-β-Methyl-Nω-methylarginin, RS-β-Propyl-Nω-methylarginin, RS-β-Hexyl-Nω-methylarginin, RS-γ-Methyl-Nω-methylarginin, RS-γ-Butyl-Nω-methylarginin, RS-γ-Pentyl-Nω-methylarginin, RS-γ-Hexyl-Nω-methylarginin, α- Methyl-Nω-ethylarginin, α-Methyl-Nω-hexylarginin, RS-β-Methyl-Nω-propylarginin, RS-β-Propyl-Nω-propylarginin, RS-γ-Butyl-Nω-ethylarginin, RS-γ-Hexyl-Nω-hexylarginin, α-Methyl-Nω- aminoargirun, α-Pentyl-Nω-aminoarginin, RS-β-Methyl-Nω-aminoarginin, RS-β-Ethyl-Nω-aminoarginin, RS-γ-Methyl-Nω-aminoarginin, RS-γ-Hexyl-Nω-aminoarginin, α-Methyl-Nω-nitroarginin, α-Butyl-Nω-nitroarginin, RS-β-Methyl-Nω-nitroarginin, RS-β-Hexyl-Nω-nitroarginin, RS- γ-Methyl-Nω-nitroarginin, RS-γ-Propyl-Nω-nitroarginin, α-Methyl-Nω-methylhomoarginin, RSβ-Methyl-Nω-methylhomoarginin, RS-γ-Methyl-Nω-methylhomoarginin, α-Methyl-Nω-aminohomoarginin, RS-β-Methyl-Nω-aminohomoarginin, RS-γ-Methyl-Nω-aminohomoarginin, α-Methyl-Nω-nitrohomoarginin, RS-β-Methyl-Nω-nitrohomoarginin, RS-γ-Methyl-Nω-nitrohomoarginin, α-Ethyl-Nω-ethylhomoarginin, RS-β-Methyl-Nω-hexylhomoarginin, α-Propyl-Nω-aminohomoarginin, RS-γ-Butyl-Nω-nitrohomoarginin ein.
Die aktive Form der neuen hier beschriebenen Argininantagonisten besitzen am α-Kohlenstoff, wie in der obigen Struktur dargestellt, die L-Konfiguration und werden hier im folgenden als L-Isomere bezeichnet. Die entsprechenden DL-Gemische besitzen eine Aktivität, welche der Menge an vorhandenem L-Isomeren entspricht.
Wir kommen nun zu den Verfahren zur Bereitstellung der neuen hier beschriebenen Verbindungen. Die neuen hier beschriebenen Verbindungen, bei denen · 0 ist und Q für Alkyl steht, werden durch Umsetzung des entsprechenden Ornithins mit N-Alkyl-S-methylthiopseudo-uroniumiodid in alkalischer Lösung in Gegenwart eines Kupfersalzes hergestellt.
Die neuen hier beschriebenen Verbindungen, bei denen · 0 ist und Q für Amino steht, werden durch Umsetzung des entsprechenden Ornithins mit S-Methylisothiosemicarbazid in alkalischer Lösung hergestellt.
Die neuen hier beschriebenen Verbindungen, bei denen · 0 ist und Q für Nitro steht, werden durch Umsetzung des entsprechenden Ornithins mit S-Methylthiopseudouroruumiodid in alkalischer Lösung in Gegenwart eines Kupfersalzes, um das Argininderivat zu bilden und durch anschließende Nitrierung unter Verwendung eines Gemisches rauchender Salpetersäure und rauchender Schwefelsäure (wie zuvor für L-Arginin von Greenstein, J. P. et al. Chemistry of Amino Acids, Bd. 3, Seite 1852, John Wiley & Sons, Inc. 1961 beschrieben) hergestellt.
Die neuen hier beschriebenen Verbindungen, bei denen · 1 ist, werden wie oben für die Verbindungen, bei denen · 0 ist, hergestellt, außer, daß das entsprechende Lysin anstelle des Ornithins verwendet wird.
Wir kommen jetzt zu den Ausgangssubstanzornithinen. Wo R Methyl ist und R' und R" CH&sub2; sind, ist das Ornithin α-Methylornithin und dieses ist im Handel erhältlich. Die anderen α- Alkylornithine werden aus dem γ-Ketonitril mit der Struktur
worin R wie zuvor definiert ist, durch Aminosäuresynthese nach Strecker und Reduktion der Nitrilgruppe durch katalytische Hydrierung und Hydrolyse des reduzierten Produkts hergestellt. Alternativ können α-Alkylornithine durch einfache Erweiterung des Verfahrens, welches für die α-Methylornithine, wie in Demny et al U. S. Patent Nr. 4 061 542 beschrieben, verwendet wurde, synthetisiert werden. Die β-Alkylornithine werden durch Umsetzung von Ethylacetamidomalonat mit dem geeigneten β-substituierten Acrylnitril in schwach alkalischem Ethanol bei 25-70ºC, gefolgt von der katalytischen Reduktion der Nitrilgruppe, gefolgt von saurer Hydrolyse, synthetisiert. Die γ-Alkylornithine werden in der gleichen Weise wie die β-Alkylornithine synthetisiert, außer daß α-substituierte Acrylnitrile anstelle der β-substituierten Acrylnitrile verwendet werden.
Wir kommen jetzt zu den Ausgangssubstanzlysinen. Die α-Alkyllysine werden aus dem β-Ketonitril mit der Struktur R
worin R wie zuvor definiert ist, durch Aminosäuresynthese nach Stecker und Reduktion der Nitrilgruppe durch katalytische Hydrierung, gefolgt von Hydrolyse, hergestellt. Die β-Alkyllysine werden in der gleichen Weise wie die β-Alkylornithine hergestellt, außer daß γ-Brom-γ-alkylbutyronitril anstelle des β-substituierten Acrylnitrils verwendet wird, und 1 Moläquivalent Base (z. B. Natriumethoxid) in das Reaktionsgemisch eingeschlossen wird. Die γ-Alkyllysine werden in der gleichen Weise wie die γ-Alkylornithine hergestellt, außer daß β-Alkyl-γ-brombutyronitril anstelle des α-substituierten Acrylnitrils verwendet wird, und 1 Moläquivalent Base (z. B. Natriumethoxid) in das Reaktionsgemisch eingeschlossen wird. Alternative Synthesen von β- und γ- Alkyllysinen sind gut in der Literatur bekannt.
Wir kommen jetzt zu der hier beschriebenen Zusammensetzung, welche einen neuen Argininantagorusten und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt. Solche Träger schließen steriles Wasser oder physiologische Kochsalzlösung zur parenteralen Verabreichung ein. Zur oralen Verabreichung können Tabletten den Wirkstoff mit Beimengungen von herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen Exzipientien einschließlich inerten Streckmitteln, wie Calciumcarbonat, Natriumcarbonat, Lactose und Talcum enthalten.
Wir kommen nun zum hier beschriebenen ex vivo-Verfahren zur Hemmung der Fähigkeit der induzierbaren Stickoxidsynthase, die Umwandlung von Arginin in Stickoxid zu katalysieren, umfassend das Versetzen des Enzyms mit einer Menge eines neuen Argininantagonisten, welche in der Weise wirksam ist, daß sie die Katalyse blockiert. Konzentrationen der Argininantagonisten im Bereich von 1 uM bis 10 mM sind für diesen Zweck nützlich. In Tieren (einschließlich Menschen) können solche Konzentrationen typischerweise durch Dosen im Bereich von 0,1 bis 100 mg/kg (Körpergewicht) auf der Basis des enthaltenen L-Isomeren erreicht werden.
Wir kommen nun zu der neuen Verbindung zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung pathologischer Überproduktion von Stickoxid aus Arginin.
Eine Gruppe von Subjekten für die Anwendung umfaßt solche mit pathologisch niedrigem Blutdruck.
Eine Klasse innerhalb dieser Gruppe sind solche mit idiopathischer Hypotension.
Eine weitere Klasse innerhalb dieser Gruppe sind solche mit systemischer Hypotension einschließlich solcher mit septischem Schock (einschließlich toxischem Schocksyndrom) oder mit Schock, induziert durch die Verabreichung von Arzneimitteln, einschließlich biologischer Reaktionsmodifikatoren, wie Tumornekrosefaktor, Interleuken-1 und Interleuken-2.
Eine weitere Klasse innerhalb dieser Gruppe sind solche mit hämorrhagischem Schock.
Eine andere Gruppe von Subjekten umfaßt solche mit Immunstörungen, bei denen eine Herunterregulation der Stickoxidbildung vorteilhaft ist, z. B. bei Autoimmunstörungen oder bei therapeutischer Immunsuppression für Transplantationszwecke.
Wir kommen nun zur Dosierung, welche vom angestrebten Effekt und der Reaktionsfähigkeit des einzelnen Subjekts abhängt. Zum Anheben des Blutdrucks wird z. B. eine Menge, welche derart wirksam ist, daß sie den Blutdruck anhebt, verabreicht. Bei Störungen, welche eine Immunsuppression erfordern, wird eine immunsuppressiv wirksame Menge verabreicht. Allgemein ist ein Dosierungsbereich von 10 Mikrogramm pro kg bis 100 mg/kg, vorzugsweise 1 bis 10 mg/kg nützlich. Die Dosierungen erfolgen auf der Basis des enthaltenden L-Isomeren. Solche Dosierungen können zur Erhaltung des Blutdrucks, wie notwendig, wiederholt werden.
Die Verabreichung wird z. B. auf oralem oder parenteralem Weg, am meisten bevorzugt intravenös, mit der Zusammensetzung einschließlich eines pharmazeutisch verträglichen Trägers, wie oben beschrieben, leicht ausgeführt.
Wir kommen nun zu der obigen Verbindung zusammen mit einem α&sub1;-adrenergischen Agonisten zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Subjekts, welches infolge pathologischer Überexpression von Stickoxid aus Arginin systemische Hypotension hat. Geeignete α&sub1;-adrenergische Agonisten schließen z. B. Phenylephrin, Thromboxananaloga, Angiotensin II und Norepinephrin ein.
Dosierungen eines neuen Argininantagonisten, welcher in Kombination mit den α&sub1;-adrenergischen Agonisten verwendet wird, liegt im Bereich von 0,1 bis 100 mg/kg (Körpergewicht) auf der Basis des enthaltenden L-Isomeren. Die Dosierungen der α&sub1;-adrenergischen Agonisten sind die gleichen, wie diejenigen, welche in Subjekten, welche nicht infolge einer Überproduktion von Stickoxid reaktionsschwach sind, blutdruckerhöhend wirksam sind.
Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise auf oralem oder parenteralem Weg, am meisten bevorzugt intravenös.
Bei den hier beschriebenen Verfahren, welche eine intravenöse Verabreichung einschließen, können entweder Bolusinjektion(en)- oder kontinuierliche Infusionsverfahren verwendet werden. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
In den unten aufgeführten Beispielen werden die Aminosäuren durch Chirale-Phasen- HPLC, wie von O. W. Griffith und E. B. Campbell, Methods in Enzymology, Bd. 143, 166-172 (1987), beschrieben, analysiert, außer, daß die Durchflußgeschwindigkeiten von 0,5 ml/min auf 1,0 ml/min erhöht wurden. Die Elutionszeiten der verschiedenen Verbindungen werden in der folgenden Tabelle gezeigt. Puffer A, welcher in der folgenden Tabelle genannt wird, wird in dem Artikel in Methods in Enzymology beschrieben. Puffer A' war ein Gemisch aus 75% Puffer A und 25% Puffer C (beschrieben im Artikel in Methods of Enzymology). Tabelle
In den unten ausgeführten Beispielen I-III wurde das N,S-Dimethylthiopseudo-uroniumiodid wie folgt hergestellt:
Ein 500 ml 3-Hals-Rundkolben wurde mit einem Thermometer, einem Kühler und einem Tropftrichter ausgestattet. In ihn wurden 25 g 1-Methyl-2-thioharnstoff (0,277 mol, Aldrich Chemicals) und 150 ml Aceton eingebracht. Die Suspension wurde magnetisch gerührt, während Iodmethan (39,4 g = 0,2774 mol = 17,2 ml) in kleinen Portionen über 20 Minuten tropfenweise hinzugefügt wurde. Die Temperatur stieg auf etwa 35ºC. Das Ölbad wurde dann auf 75-80ºC erwärmt, und die Lösung wurde unter Rückflußkühlung erhitzt. Während der Zugabe von Iodmethan begann Produkt auszufallen. Die Umsetzung wurde für 10 Minuten unter Rückflußkühlung erhitzen gelassen und dann wurden 50 ml Ethanol durch den Kühler hinzugegeben. Das Produkt ging vollständig in Lösung, und das Reaktionsgemisch wurde heiß filtriert. Das Produkt kristallisierte bei Abkühlung. 100 ml Hexan wurden unter Rühren zu den Kristallen gegeben, und das gesamte Gemisch wurde für 3 Stunden auf 0ºC abgekühlt. Die Kristalle wurden dann durch Filtration gesammelt und mit Ethylether gewaschen. Das Produkt war nicht hygroskopisch. Es wurde in ein Becherglas überführt, abgedeckt und zur Entfernung der letzten Lösungsmittelspuren unter Vakuum getrocknet. Die Zugabe von Ethylether zur Mutterlösung ergab einen geringen zweiten Ertrag. Die Ausbeute war wie folgt: erster Ertrag -58,1 g; zweiter Ertrag -3,8 g; Gesamtausbeute - 61,9 g (95%, bezogen auf 1-Methyl-2-thioharnstoff).

Beispiel I

Herstellung von α-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin

α-Methyl-DL-ornithin (1,0 g, 5,49 mmol), Sigma Chemical Co. Catalog # M3511, wurde in 11 ml konz. (25%) Ammoniumhydroxid aufgelöst. Zu dieser Lösung wurde Cu(OAc)&sub2; H&sub2;O (0,547 g, 2,74 mmol) hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 2 Stunden bei 25ºC röhrengelassen. Zu der Lösung wurde dann N,S-Dimethylthiopseudouroniumiodid (1,27 g, 5,49 mmol), hergestellt wie oben beschrieben, hinzugefügt, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht (18 Stunden) gerührt.
Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um ausgefallene Kupfersalze zu entfernen, und die zurückgehaltenen Feststoffe wurden mit 25% Ammoniumhydroxid gewaschen. Das kombinierte Filtrat wurde unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde zweimal wieder in Wasser aufgelöst und erneut verdampft, um alle Spuren von Ammoniak zu entfernen. Der finale Rückstand wurde in einer minimalen Menge Wasser (5 ml) aufgelöst und auf eine Säule mit Dowex 50 W (H+ Form, 200-400 Mesh, 3 · 20 cm) aufgetragen. Das Harz wurde mit 112,0 M HCl um Kupfersalze zu eluieren und dann mit 113,0 M HCl, um restliches α-Methyl- DL-ornithin zu eluieren, und dann mit 113,8 M HCl, um das Produkt zu eluieren, gewaschen. Fraktionen von jeweils 20 ml wurden gesammelt und durch Standard-HPLC-Aminosäureanalyse untersucht, um diejenigen Fraktionen zu identifizieren, welche α-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin enthalten (Elutionszeiten von 13,80 und 15,06 Minuten). Produkt-enthaltende Fraktionen wurden unter reduziertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde zweimal in Wasser aufgelöst und erneut eingedampft, um Spuren von HCl zu entfernen. Der finale klare ölige Rückstand wurde wieder in 10 ml Wasser aufgelöst, und diese Stammlösung wurde im Kühl schrank gelagert und für die Inhibitionsstudien verwendet. Die Reinheit von α-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin in der Stammlösung war gemäß HPLC > 99%; die Konzentration der Stammlösung wurde durch Vergleich der HPLC-Peakgröße von Aliquots der Lösung mit HPLC-Peakgrößen von Aliquots aus einer α-Aminoisobuttersäure-Standardlösung bestimmt. Die Gesamtausbeute, bezogen auf α-Methyl-DL-ornithin, betrug 50 bis 60% in mehreren Präparationen.
α-Ethyl-Nω-methyl-DL-arginin wurde in der gleichen Weise wie das obige α-Methyl-Nω- methyl-DL-arginin hergestellt, außer daß das α-Methyl-DL-ornithin durch eine äquimolare Menge von α-Ethyl-DL-ornithin ersetzt wurde. Das α-Ethyl-DL-ornithin wurde durch Umsetzung von γ-Ketohexanonitril mit Ammoniumsulfat und Natriumcyanid in Ethanol/Wasser bei 50ºC und Reduktion der Nitrilgruppe des resultierenden Hydantoins in Essigsäure durch katalytische Hydrierung über Platinoxid, gefolgt von Hydrolyse, hergestellt.
α-Methyl-Nω-ethyl-DL-arginin wurde in der gleichen Weise wie das obige α-Methyl-Nω- methyl-DL-arginin hergestellt, außer daß das N,S-Dimethylthiopseuouroniumiodid durch eine äquimolare Menge von N-Ethyl-S-methylthiopseudouroniumiodid ersetzt wurde. Das N-Ethyl- S-methylthiopseudouroniumiodid wurde in der gleichen Weise wie das obige N-Dimethylthiopseudouroniumiodid hergestellt, außer daß der 1-Methyl-2-thioharnstoff durch 1-Ethyl-2-thioharnstoff ersetzt wurde.
α-Methyl-Nω-methyl-DL-homoarginin wurde in der gleichen Weise wie das obige α- Methyl-Nω-methyl-DL-arginin hergestellt, außer daß das α-Methyl-Nω-DL-ornithin durch eine äquimolare Menge von α-Methyl-DL-lysin ersetzt wurde. Das α-Methyl-DL-lysin wurde in der gleichen Weise wie das α-Ethyl-DL-ornithin hergestellt, außer daß das γ-Ketohexanonitril durch das δ-Ketohexanonitril ersetzt wurde.

Beispiel II

Herstellung von RS-b-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin

RS-β-Methyl-DL-ornithin wurde wie folgt hergestellt: Zu einer Lösung von 0,25 g (11 mmol) Natriummetall in 125 ml absolutem Ethanol wurden 54,25 g (250 mmol) Ethylacetamidomalonat (bezogen von Sigma Chemicals) hinzugefügt. Die resultierende Aufschlämmung wurde gerührt und gekühlt, während 19 g (23 ml; 280 mmol) Crotononitril (Aldrich Chemicals) über 20 Minuten tropfenweise hinzugefügt wurden. Die Lösung klärte sich nicht, als für 1 Stunde bei 25ºC gerührt wurde, und das Gemisch wurde deshalb auf einem warmen Wasserbad (50ºC) erwärmt, bis es sich klärte. Die gesamte Reaktionszeit betrug 2,25 Stunden. Das klare Reaktionsgemisch wurde dann auf Eis abgekühlt, und der Feststoff, welcher sich bei der Abkühlung bildete, von dem angenommen wurde, daß es Ausgangsmaterial war, wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, und das resultierende klare Öl (30 g) wurde in 100 ml Eisessig aufgelöst. Die Lösung wurde in eine 500 ml Parr-Flasche eingebracht und wurde über 0,5 g PtO&sub2; bei 60ºC hydriert. Die Wasserstoffabsorption war heftig und nach 5 Stunden abgeschlossen. Im Anschluß an die Hydrierung wurde die Lösung filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das resultierende klare Öl (39 g) wurde in 200 ml Wasser aufgelöst und auf eine Dowex 50 (H+-Form, 200-400 Mesh) (5 · 30 cm) geladen. Das Harz wurde mit 2 l Wasser gewaschen, und der Durchfluß wurde verworfen. Das Produkt wurde mit 113 M Ammoniumhydroxid eluiert. Der Eluent bzw. das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das Öl wurde in 250 ml konz. HCl aufgelöst, und die Lösung wurde für 4 Stunden unter Rückflußkühlung erhitzt. Die Lösung wurde abgekühlt, und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Es wurde zweimal Wasser hinzugefügt, und erneut eingedampft, um die Entfernung von allem HCl sicherzustellen. Es wurde auch zweimal Ethanol hinzugefügt und durch Verdampfung unter vermindertem Druck entfernt, um das Produkt zu trocknen. Das finale weiße amorphe Pulver wog 11,9 g und war gemäß HPLC reines RS-β-Methyl-DL-ornithin HCl. Die Ausbeute betrug 66 mmol oder 26,4%, bezogen auf das Ausgangsmaterial Ethylacetamidomalonat.
RS-β-Methyl-DL-ornithin (5,16 g; 30 mmol) wurde in 60 ml 25% Ammoniumhydroxid mit 3,02 g Kupfer(II)-acetat (15 mmol) aufgelöst und für 1 Stunde bei 25ºC magnetisch gerührt. Zu der Lösung wurden 7,14 g N,S-Dimethylisothiopseudouroniumiodid (30 mmol) hinzugefügt, und die Lösung wurde mit Parafilm dicht abgedeckt und über Nacht gerührt. Der gelbe Niederschlag, welcher sich gebildet hatte, wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde durch Verdampfung unter vermindertem Druck zu einem Öl konzentriert. Es wurde zweimal zu dem resultierenden Öl Wasser hinzugefügt und wieder entfernt, um sicherzustellen, daß alle Spuren von Ammoniak entfernt wurden. Der finale Rückstand wurde in 20 ml Wasser aufgelöst und auf eine Säule mit Dowex 50 (H+, 200-400 Mesh, 2,5 · 30 cm) geladen. Nach Waschen des Harzes mit einem Liter Wasser wurden die Aminosäuren mit 500 ml 3 M Ammoniumhydroxid eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingedampft, was ein Öl ergab. Das Öl wurde in 50 ml Wasser aufgelöst, und mit Flaviansäure (Aldrich Chemicals) auf pH 3 eingestellt. Nach Übernachtkühlung hatte sich ein gelber Niederschlag gebildet und wurde durch Filtration gesammelt, und mit kaltem Wasser, Ethanol und Ethylether gewaschen. Das gelbe Pulver wurde unter Vakuum getrocknet und wog 5,23 g. Es enthielt 10% β-Methyl-DL-ornithin.
Um das Methylornithin zu entfernen, wurde das Pulver (5,23 g) in 40 ml Wasser suspendiert, und der pH-Wert wurde mit Natriumhydroxid auf 7 eingestellt. Das Pulver löste sich, wobei sich eine gelbe Lösung ergab. Der pH-Wert wurde dann mit Eisessig zurück auf 3 eingestellt, und Flavianatsalz rekristallisierte bei Abkühlung. Das Material wurde gesammelt, und wie oben beschrieben, mit Wasser, Ethanol und Ethylether gewaschen. Das Rekristallisationsverfahren wurde zwei weitere Male wiederholt. Die finale Ausbeute an RS-β-Methyl-Nω-methyl-DL-argininfiavianat betrug 3,5 g. Das Material enthielt < 5% Methylornithin.
Das Flavianat wurde durch Suspendieren von 3,5 g des gelben Feststoffs in 40 ml Wasser und Rühren mit Dowex 1 (OAc'-Salz, 200-400 Mesh) entfernt. Dowex-Portionen (jeweils etwa 0,5 g) wurden hinzugegeben, bis die Lösung klar war, und das gesamte Flavianatsalz aufgelöst war. Die klare Suspension wurde filtriert, um Dowex zu entfernen, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das resultierende Öl wurde in Ethanol wieder aufgelöst, und die Lösung wurde auch durch Eindampfen getrocknet. Die Zugabe und das Entfernen von Ethanol wurde 3 mal wiederholt. Der finale Rückstand war ein weißer hygroskopischer Feststoff. Er wurde gesammelt und über P&sub2;O&sub2; im Vakuum vollständig getrocknet. Das Produkt wog 1,26 g (5 mmol); 17% Ausbeute, bezogen auf das Ausgangsmaterial Methylornithin. Gemäß HPLC-Analyse betrug die Reinheit bei der Verbindung, welche bei 12,43 und 13,32 Minuten eluierte, > 97%.
RS-β-Hexyl-Nω-methyl-DL-arginin wurde in der gleichen Weise wie das obige RS-β- Methyl-W-methyl-DL-arginin hergestellt, außer, daß das RS-β-Methyl-DL-ornithin durch eine äquimolare Menge von RS-β-Hexyl-DL-ornithin ersetzt wurde. Das RS-β-Hexyl-DL-ornithin wurde in der gleichen Weise wie das obige RS-β-Methyl-DL-ornithin hergestellt, außer, daß das Crotononitril durch β-Hexylacrylnitril ersetzt wurde.
RS-β-Methyl-Nω-ethyl-DL-arginin wurde in der gleichen Weise wie das obige RS-β- Methyl-Nω-methyl-DL-arginin hergestellt, außer daß das N,S-Dimethylthiopseudouroniumiodid durch eine äquimolare Menge N-Ethyl-S-methylthiopseudouroniumiodid wie oben beschrieben hergestellt, ersetzt wurde.
RS-β-Methyl-Nω-methyl-DL-homoarginin wurde in der gleichen Weise wie das obige RS-β-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin hergestellt; außer daß das RS-β-Methyl-DL-ornithin durch eine äquimolare Menge von RS-β-Methyl-DL-lysin ersetzt wurde. Das RS-β-Methyl-DL-lysin wurde in der gleichen Weise wie das obige RS-β-Methyl-DL-ornithin hergestellt, außer daß die Menge Natrium auf 5,75 g erhöht wurde und das Crotononitril durch γ-Bromvaleronitril ersetzt wurde.

Beispiel III

Herstellung von RS-γ-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin

RS-γ-Methyl-DL-ornithin wurde wie folgt hergestellt: Zu einer Lösung von 0,25 g (11 mmol) Natriummetall in 125 ml absolutem Ethanol wurden 54,25 g (250 mmol) Ethylacetamidomalonat (bezogen von Sigma Chemicals) hinzugefügt. Die resultierende Aufschlämmung wurde gerührt und gekühlt, während 19 g (23,7 ml; 280 mmol) Methacrylsäurenitril (Aldrich Chemicals) über 20 Minuten tropfenweise hinzugefügt wurden. Die Lösung klärte sich nicht als sie 1 Stunde bei 25ºC gerührt wurde, und das Gemisch wurde deshalb auf einem warmen Wasserbad (50ºC) erwärmt, bis es sich klärte. Die Gesamtreaktionszeit betrug 2,25 Stunden. Das klare Reaktionsgemisch wurde dann auf Eis abgekühlt, und der Feststoff welcher sich beim Abkühlen bildete, von dem angenommen wurde, daß es sich um Ausgangsmaterial handelte, wurde durch Filtration entfernt (Gewicht = 21,2 g). Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, und das resultierende klare Öl (49,05 g) wurde in 100 ml Eisessig aufgelöst. Die Lösung wurde in eine 500 ml Parr-Flasche eingebracht und über 0,5 g PtO&sub2; bei 60ºC hydriert. Die Wasserstoffabsorption war heftig, und nach 5 Stunden abgeschlossen. Im Anschluß an die Hydrierung wurde die Lösung filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zu Trockene eingedampft. Das resultierende klare Öl (42,07 g) wurde in 200 ml Wasser aufgelöst und auf eine Dowex 50 (H+-Form, 200-400 Mesh) (5 · 30 cm) geladen. Das Harz wurde mit 2 l Wasser gewaschen, und der Durchfluß wurde verworfen. Das Produkt wurde mit 113 M Ammoniumhydroxid eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das Öl wurde in 250 ml konz. HCl aufgelöst, und die Lösung wurde für 4 Stunden unter Rückflußkühlung erhitzt. Die Lösung wurde gekühlt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Es wurde zweimal Wasser hinzugefügt und wieder eingedampft, um die Entfernung des gesamten HCl sicherzustellen. Es wurde auch zweimal Ethanol hinzugefügt und durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt, um das Produkt zu trocknen. Das finale weiße amorphe Pulver wog 13,7 g und war gemäß HPLC reines RS-γ-Methyl-DL-ornithin HCl. Die Ausbeute betrug 75 mmol oder 30,0%, bezogen auf das Ausgangsmaterial Ethylacetamidomalonat.
RS-γ-Methyl-DL-ornithin (1,00 g; 5,81 mmol) wurde in 6 ml 25% Ammoniumhydroxid mit 0,5% g Kupfer(II)-acetat (2,9 mmol) aufgelöst und für 1 Stunde bei 25ºC magnetisch gerührt. Zu dieser Lösung wurden 1,38 g N,S-Dimethylisothiopseudouroniumiodid (5,81 mmol) hinzugefügt, und die Lösung wurde mit Parafilm dicht abgedeckt und über Nacht gerührt. Der gelbe Niederschlag, welcher sich gebildet hatte, wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck zu einem Öl konzentriert. Es wurde zweimal Wasser zu dem resultierenden Öl hinzugefügt und entfernt, um sicherzustellen, daß jede Spur von Ammoniak entfernt wurde. Der finale Rückstand wurde in 5 ml Wasser aufgelöst und auf eine Säule mit Dowex 50 (H+, 200-400 Mesh, 1, 2 · 30 cm) geladen. Nach Waschen des Harzes mit 250 ml Wasser wurden die Aminosäuren mit 250 ml 3 M Ammoniumhydroxid eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingedampft, was ein Öl ergab. Das Öl wurde in 10 ml Wasser aufgelöst und mit Flaviansäure (Aldrich Chemicals) auf pH 3 eingestellt. Nach Übernachtkühlung hatte sich ein gelber Niederschlag gebildet und wurde durch Zentrifugation gesammelt und durch Suspension in kaltem Wasser mehrere Male gewaschen, gefolgt von Reisolierung durch Zentrifugation. Das resultierende gelbe Pulver, welches RS-γ-Methyl-Nω-methyl-DL-argininflavianatsalz darstellte, wurde nicht weiter charakterisiert und wurde nicht rekristallisiert. Gemäß HPLC war es > 90% rein und seine Isomere eluierten bei 14,81 und 15,93 Minuten.
Das Flavianat wurde durch Suspendieren des gelben Feststoffs in 3 ml Wasser und Rühren mit 0,5 g Dowex 1 (OAc--Salz, 200-400 Mesh) entfernt. Die klare Suspension wurde filtriert, um Dowex zu entfernen, und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das resultierende Öl wog 0,86 g (3,5 mmol); 59% Ausbeute bezogen auf das Ausgangsmaterial Methylornithin. Gemäß HPLC-Analyse betrug die Reinheit > 90% und seine Isomere eluierten mit 14,81 und 15,93 Minuten.
RS-γ-Propyl-Nω-methyl-DL-arginin wurde in der gleichen Weise hergestellt wie das obige RS-γ-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin, außer, daß das RS-γ-Methyl-DL-ornithin durch eine äquimolare Menge von RS-γ-Propyl-DL-ornithin ersetzt wurde. RS-γ-Propyl-DL-ornithin wurde in der gleichen Weise wie RS-γ-Methyl-DL-ornithin hergestellt, außer, daß das Methacrylsäurenitril durch α-Propylacrylnitril ersetzt wurde.
RS-γ-Methyl-Nω-ethyl-DL-arginin wurde in der gleichen Weise hergestellt wie das obige RS-γ-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin, außer, daß das N,S-Dimethylthiopseudouroniumiodid durch eine äquimolare Menge von N-Ethyl-S-methylthiopseudouroniumiodid hergestellt, wie oben beschrieben, ersetzt wurde.
RS-γ-Methyl-Nω-methyl-DL-homoarginin wurde in der gleichen Weise hergestellt wie das obige RS-γ-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin, außer daß das RS-γ-Methyl-DL-ornithin durch eine äquimolare Menge von RS-γ-Methyl-DL-lysin ersetzt wurde. Das RS-γ-Methyl-DL-lysin wurde in der gleichen Weise wie das oben beschriebene RS-γ-Methyl-DL-ornithin hergestellt, außer, daß die Menge an Natrium auf 5,75 g erhöht wurde, und daß Methacrylsäurenitril durch γ-Bromo-β-methylbutyronitril ersetzt wurde.

Beispiel IV

Herstellung von α-Methyl-Nω-amino-DL-arginin

S-Methylisothiosemicarbazid wurde durch Umsetzung von Thiosemicarbazid und Methyliodid wie folgt hergestellt: (Das allgemeine Verfahren wurde von Tomcufcik, A. S., Chemical Abstracts, 72: 90113c. beschrieben). In einer Druckflasche wurde 1,0 g Thiosemicarbazid in 10 ml absolutem Ethanol suspendiert, und dazu wurden 1,64 g Iodmethan hinzugefügt. Die Flasche wurde fest verschlossen und 1 Stunde auf 105ºC erwärmt. Dies ergab eine klare Lösung. Nach Abkühlung wurde die Flasche geöffnet und 40 ml Ethylacetat hinzugefügt. Die weißen Kristalle, welche sich bildeten, wurden durch Filtration gesammelt, und nut einem Gemisch aus Ethanol und Ethylacetat (50/50) gewaschen und unter Vakuum getrocknet. S-Methylisothiosemicarbazid wurde in einer Ausbeute von 83% erhalten.
250 mg α-Methyl-DL-ornithin (1,37 mmol) wurden in 1 ml Wasser aufgelöst. Zu der Lösung wurden 137 ul 10 M NaOH hinzugefügt, um α-Methylornithin in Form seiner freien Base zu erzeugen. Die Lösung wurde dann auf 80ºC erwärmt, und dazu 319,1 mg S-Methylisothiosemicarbazid (1,37 mmol) in 4 gleichen Portionen in 30 Minuten Intervallen hinzugefügt. Jeder Zugabe folgte die Zugabe von 34 ul 10 M NaOH. 15 Minuten nach der letzten Zugabe wurde das Reaktionsgemisch durch Zugabe von konz. HCl bis zur Neutralität angesäuert.
Das rohe neutrale Reaktionsgemisch wurde auf eine kleine (1,0 · 20 cm) Säule mit Dowex 50 (H+, 200-400 Mesh) geladen. Das Harz wurde mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen und dann der Reihe nach mit 2,0 M HCl (200 ml), 3,0 M HCl (250 ml) und 3,8 M HCl (250 ml) eluiert. Das Eluat von der 3,8 M HCl-Waschung wurde in Fraktionen gesammelt, und jede Fraktion wurde auf α-Methyl-Nω-amino-DL-arginin durch HPLC (Elutionszeit = 12,11 Minuten) geprüft. Produkt-enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das zurückgebliebene Öl wurde in einem kleinen Volumen (10 ml) Wasser wieder aufgelöst und die Lösung wurde wieder durch Verdampfen zur Trockene eingeengt. Diese Prozedur wurde ein weiteres Mal wiederholt, um sicherzustellen, daß das gesamte HCl entfernt wurde. Das zurückgebliebene Öl kristallisierte nicht und wurde deshalb in einem kleinen Volumen Wasser (5 ml) aufgelöst und als Stammlösung gefroren gelagert. Die Konzentration der Lösung wurde durch HPLC unter Verwendung von α-Aminoisobutyrat-Lösungen bekannter Konzentration als Standards bestimmt.
RS-β-Methyl-Nω-amino-DL-arginin wurde in der gleichen Weise hergestellt wie α-Methyl-Nω-aminoarginin, außer daß das α-Methyl-DL-ornithin durch eine äquimolare Menge von RS-β-Methyl-DL-ornithin, wie oben beschrieben hergestellt, ersetzt wurde.
RS-γ-Methyl-Nω-amino-DL-arginin wurde in der gleichen Weise hergestellt wie α-Methyl Nω-aminoarginin, außer daß das α-Methyl-DL-ornithin durch eine äquimolare Menge von γ-Methyl-DL-ornithin, wie oben beschrieben hergestellt, ersetzt wurde.
α-Methyl-Nω-amino-DL-homoarginin wurde in der gleichen Weise hergestellt wie α- Methyl-Nω-amino-DL-arginin, außer daß das α-Methyl-DL-ornithin durch eine äquimolare Menge von α-Methyl-DL-lysin, wie oben beschrieben hergestellt, ersetzt wurde.

Beispiel V

Herstellung von α-Methyl-Nω-vitro-DL-arginin
α-Methyl-DL-arginin wurde wie in Beispiel I für α-Methyl-I~-methyl-DL-arginin beschrieben, hergestellt, außer daß N,S-Dimethylpseudouroniumiodid durch eine äquimolare Menge von S- Methylpseudothiouroniumiodid ersetzt wurde. α-Methyl-DL-arginin wurde durch einen großen molaren Überschuß rauchender Salpeter- und Schwefelsäure, wie in Greenstein, J. P., et al. Chemistry of Amino Acids, Bd. 3, Seite 1852, John Wiley & Sons, Inc. (1961) beschrieben, in α-Methyl-Nω-vitro-DL-arginin überführt. Das Reaktionsgemisch wurde dann mit Wasser 10- fach verdünnt, und auf eine Säule mit Dowex 50 (H+) aufgetragen. Das Harz wurde mit 10 Säulenvolumina Wasser eluiert, um Salpeter- und Schwefelsäure zu eluieren, und α-Methyl-Nω- nitro-DL-arginin wurde dann mit 3 M Ammoniumhydroxid eluiert. Produkt-enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde aus Wasser kristallisiert.
RS-β-Methyl-Nω-nitro-DL-arginin wurde in der gleichen Weise hergestellt wie das obige α-Methyl-Nω-nitro-DL-argirun, außer daß α-Methyl-DL-ornithin durch RS-β-Methyl-DL-ornithin ersetzt wurde.
RS-γ-Methyl-Nω-nitro-DL-arginin wurde in der gleichen Weise hergestellt wie das obige α-Methyl-Nω-nitro-DL-arginin, außer daß α-Methyl-DL-ornithin durch RS-γ-Methyl-DL-ornithin ersetzt wurde.

Beispiel VI

Es wurden Reaktionsgemische hergestellt, enthaltend SO ul einer Arbeitslösung, 10 ul Myoglobinlösung (3 mg/ml), 10 ul Inhibitor, 20 ul Stickoxidsynthase und 10 ul Wasser.
Das Arbeitsgemisch wurde so hergestellt, daß es 160 mM Tris-Puffer, 200 uM L-Arginin, 1 mM NADPH, 20 uM Flavinadenindinucleotid, 20 uM Tetrahydrobiopterin in destilliertem Wasser enthielt (pH durch Zugabe von 10 N NaOH auf 7,6 eingestellt).
Die Stickoxidsynthase wurde wie folgt erhalten: Aortische glatte Muskelzellen wurden dadurch kultiviert, daß Segmente der mittleren Schicht der Aorten von adulten männlichen Fischer-344-Ratten als Gewebekultur angelegt wurden. Die Aorten wurden aseptisch entfernt und von Zellen der Adventitia und des Endothels durch Ausschaben sowohl der luminalen als auch der abluminalen Oberflächen befreit. Mittlere Fragmente (1-2 mm) wurden an trockene Primaria 25 cm²-Gewebekulturflaschen (Falcon; Oxnard, CA) sich anheften gelassen, welche mit Wachstumsmedium feucht gehalten wurden, bis sich Zellen entwickelten. Die Kulturen wurden zweimal wöchentlich mit Medium 199, enthaltend 10% fötales Kälberserum, 25 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 40 ug/ml Endothelzellenwachstumssupplement (Biomedical Technologies; Stoughton, MA) und 10 ug/ml Gentamycin (GIBCO; Grand Island, NY) versorgt. Wenn die Primärkulturen zusammenflossen, wurden sie mittels Trypsirusierung passagiert. Zellen in Passage 10-15 wurden mit 20.000/Vertiefung angeimpft. Wenn die Zellen zusammenflossen (Dichte von 60-80 · 103 Zellen in einer Vertiefung) wurde das Medium durch Absaugen entfernt, und frisches Medium, bestehend aus 200 ul von RPMI 1640 (Whittaker Laboratories), enthaltend 10% Rinderkälberserum, 25 mM HEPES Puffer (pH 7,4), 2 mM Glutamin, 80 U/ml Penicillin, 80 ug/ml Streptomycin, 2 ug/ml Fungizon, 40 ng/ml Interleuken-1 und 50 ng/ml Interferongamma, wurde hinzugefügt.. (Unter diesen Bedingungen wurde die induzierbare Form der Stickoxidsynthase induziert.)
Die Inhibitoren wurden zu den Reaktionsgemischen in Konzentrationen in uM wie angegeben hinzugefügt.
Die Ergebnisse werden in Fig. 1 und 2 gezeigt. In Fig. 1 stehen die offenen Kreise für N-Methyl-DL-arginin als Inhibitor, die gefüllten Kreise stehen für α-Methyl-Nω-methyl-DLarginin als Inhibitor und die offenen Dreiecke stehen für α-Methyl-Nω-amino-DL-arginin als Inhibitor. In Fig. 2 stehen die offenen Kreise für Nω-Methyl-DL-arginin als Inhibitor, die gefüllten Kreise stehen für α-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin als Inhibitor, die offenen Dreiecke stehen für β-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin als Inhibitor und die gefüllten Dreiecke stehen für γ-Methyl- Nω-methyl-DL-arginin als Inhibitor. Das Nω-Methyl-DL-arginin ist im Handel erhältlich.
Die Werte zeigen, daß alle vier getesteten neuen Inhibitoren eine Hemmfähigkeit besitzen, welche vergleichbar ist zu der des im Handel erhältlichen Nω-Methyl-DL-arginin. Es wird gezeigt, daß das α-Methyl-Nω-amino-DL-arginin etwa zweimal wirksamer als die kommerzielle Verbindung ist, bezogen auf die Konzentration, welche notwendig ist, 50% zu hemmen.

Beispiel VII

Fünf vorbereitete Bastardhunde (monogrel dogs), bezeichnet als Hunde 1, 2, 3, 4 und 5, mit einem Gewicht von 28 bis 30 kg, wurden untersucht. Die Pflege der Tiere erfolgte in Übereinstimmung mit der Empfehlung der American Association for Accreditation of Laboratory Ani mals [DHEW (DHHS) Veröffentlichungsnummer (NIH) 78-23, überarbeitet, 1978]. Am Tag des Experiments wurden die Hunde über Nacht fasten gelassen. Sie wurden mit Phenobarbital (10 mg/kg) anästhesiert. Sie wurden dann mit einem Trachialtubus oral intubiert, und mit einem Harvard Pumpenventilator mit einer Geschwindigkeit von 12 Atemzügen pro Minute und einem Atemzugsvolumen von 15 ml/kg ventiliert. Am Tag des Experiments wurde ein arterieller Katheder (arterial line) perkutan in der femoralen Arterie plaziert.
Rekombinanter humaner Tumornekrosefaktor (TNF), spezifische Aktivität 2 · 107 Einheiten/mg wird an jedes Tier mit einer Dosis von 10 mcg/kg in einem Volumen von 10 ml Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, enthaltend 2 mg/ml Hundealbumin, verabreicht.
Innerhalb einer Stunde fiel der Blutdruck um mindestens 30-40 mm Hg.
Zu diesem Zeitpunkt wird eine der Verbindungen oder physiologische Kochsalzlösung mittels intravenöser Bolusinjektion an einen Hund mit einer Dosis von 20 mg/kg gegeben. α- Methyl-Nω-methyl-DL-arginin wird an Hund 1 verabreicht; RS-β-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin wird an Hund 2 verabreicht; γ-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin wird an Hund 3 verabreicht; α- Methyl-Nω-amino-DL-arginin wird an Hund 4 verabreicht, und physiologische Kochsalzlösung wird an Hund 5 verabreicht.
Innerhalb von 3 Minuten nach dem Zeitpunkt der Inhibitorinjektionen stieg der Blutdruck in den Hunden 1, 2, 3 und 4 um mindestens 20 mm Hg. Die Injektion physiologischer Kochsalzlösung in Hund 5 zeigte keine blutdruckerhöhende Reaktion.

Beispiel VIII

Um nachzuweisen, daß Stickoxidüberproduktion zu einer verminderten Empfindlichkeit gegen blutdruckerhöhende Mittel führen kann, wurden Studien in einem Rattenmodell für septische Hypotension, d. h. die endotoxische, rückenmarksangebohrte Ratte durchgeführt.
Die Tiere wurden entweder nicht behandelt (Kontrolle) oder mit Endotoxin behandelt (Lipopolysaccharid-behandelt; 15 mg/kg, i. p.), 6 Stunden vor ihrer Rückenmarksanbohrung und Instrumentierung zur Blutdruckaufzeichnung. Vor dem Rückenmarksanbohren betrug der mittlere systematische arterielle Druck in den Kontrollratten etwa 120 mm Hg. Der Druck fiel um etwa 50% nach dem Rückenmarksanbohren der Kontrolltiere und verminderte sich auf etwa 25% des normalen in den rückenmarksangebohrten Endotoxin-behandelten Tieren.
Die Verabreichung von Phenylephrin (Dosen im Bereich von 0,1 bis 10 ug/kg) oder von Angiotensin II (Dosen im Bereich von 0,01 bis 1 ug/kg) hatte eine starke blutdruckerhöhende Wirkung in den rückenmarksangebohrten Kontrollratten, aber eine unwesentliche Wirkung in rückenmarksangebohrten endotoxischen Ratten.
Die Verabreichung der Inhibitoren (die gleichen, wie an die Hunde 1-4 in Beispiel VII verabreicht) 5 Minuten vor der Verabreichung von blutdruckerhöhenden Mitteln mit einer Dosis von 20 mg/kg hatte eine geringe Wirkung auf die blutdruckerhöhende Reaktion von Phenylephrin und Angiotensin II in rückenmarksausgebohrten Kontrollratten, aber steigerte wesentlich die Reaktion auf diese Mittel in rückenmarksangebohrten endotoxischen Ratten. Die Reaktionsfähigkeit wurde auf mehr als 50% der Reaktionsfähigkeit, welche bei den rückenmarksausgebohrten Kontrollratten beobachtet wurde, wiederhergestellt.
Viele Variationen von erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind dem Fachmann ersichtlich. Demgemäß werden die erfindungsgemäßen Ausführungsformen durch die Patentansprüche definiert.

Claims

1. Guanidino-substituierte Arginine oder Homoarginine auf der Basis von Monoalkyl-kohlenstoffsubstituierten Ornithinen oder Lysinen, welche die folgende Formel besitzen:

worin R (CH&sub2;)yCH&sub3; oder H ist, R' CH&sub2; oder C(H) (CH&sub2;)YCH&sub3; ist, und R" CH&sub2; oder C(H) (CH&sub2;)yCH&sub3; ist, wobei y von 0 bis 5 reicht, und · 0 oder 1 ist und Q eine Alkylgruppe, enthaltend 1 bis 6 Kohlenstoffatome oder NH&sub2; oder NO&sub2;, ist und nur eine von R, R' und R" einen Alkylsubstituenten an der Ornithin- oder Lysingruppierung bereitstellt, und Gemische davon mit dem entsprechenden D-Isomeren.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie α-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin ist.

3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie RS-β-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin ist.

4. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie RS-γ-Methyl-Nω-methyl-DL-arginin ist.

5. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie α-Methyl-Nω-amino-DL-arginin ist.

6. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie RS-β-Methyl-Nω-amino-DL-arginin ist.

7. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie RS-γ-Methyl-Nω-amino-DL-arginin ist.

8. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie α-Methyl-Nω-nitro-DL-arginin ist.

9. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie RS-β-Methyl-Nω-nitro-DL-arginin ist.

10. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie RS-γ-Methyl-Nω-nitro-DL-arginin ist.

11. Mittel zur Hemmung von pathologischer Überproduktion von Stickoxid aus Arginin durch die induzierbare Form der Stickoxidsynthase, umfassend eine Menge einer Verbindung, wie in Anspruch 1 beschrieben, welche die Stickoxidsynthase therapeutisch wirksam hemmt und dadurch die pa thologische Überproduktion von Stickoxid verhindert, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

12. Ex-vivo-Verfahren zur Hemmung der Fähigkeit der induzierbaren Stickoxidsynthase, die Umwandlung von Arginin in Stickoxid zu katalysieren, wobei das Verfahren das Versetzen des Enzyms mit einer Menge einer Verbindung, wie in Anspruch 1 beschrieben, welche die Katalyse wirksam blockiert, umfaßt.

13. Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Hemmung der Fähigkeit der induzierbaren Stickoxidsynthase, die Umwandlung von Arginin in Stickoxid zu katalysieren.

14. Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung bei einem Verfahren zur Hemmung von pathologischer Überproduktion von Stickoxid aus Arginin in einem Subjekt, welches die genannte Hemmung braucht.

15. Verbindung nach Anspruch 1 zusammen mit einem α&sub1;- adrenergischen Agonisten zur Verwendung bei einem Verfahren zur Behandlung eines Subjekts, welches infolge einer pathologischen Überproduktion von Stickoxid aus Arginin eine systemische Hypotension hat, wobei die Menge der Verbindung wie in Anspruch 1 beschrieben in der Weise wirksam ist, daß die Gefäßempfindlichkeit gegenüber der Wirksamkeit des α&sub1;-adrenergischen Agonisten wiederhergestellt wird und wobei die Menge des α&sub1;-adrenergischen Agonisten in der Weise wirksam ist, daß sich der Blutdruck auf ein klinisch annehmbares Niveau erhöht.

16. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der pathologischen Überproduktion von Stickoxid aus Arginin durch die induzierbare Form der Stickoxidsynthase.

17. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von systemischer Hypotension infolge einer pathologischen Überproduktion von Stickoxid aus Arginin.