DE69923838T2

DE69923838T2 - Stereoisomere von propyl-isopropylacetamid, verfahren zu deren herstellung sowie diese enthaltende pharmazeutische zubereitungen

Info

Publication number: DE69923838T2
Application number: DE69923838T
Authority: DE
Inventors: Meir Bialer; Boris Yagen; Ofer Spigelstein
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1998-04-16
Filing date: 1999-04-12
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2019-04-13
Also published as: EP1077926A1; WO1999054282A1; US6630602B1; IL124118A; ES2238831T3; DE69923838D1; IL136030A0; EP1077926B1; AU3342899A; ATE289583T1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein Propylisopropylacetamid (PID) in seinen stereospezifischen Formen zur Verwendung bei der Behandlung von neurologischen und psychotischen Störungen und affektiven Psychosen und um Schmerz, einschließlich Kopfschmerzen und Migräneschmerzen, zu behandeln. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Synthese von PID-Stereoisomeren. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, die, als einen Wirkstoff, die razemischen oder stereoisomeren Formen enthalten.
Hintergrund der Erfindung
Kopfschmerzen, insbesondere in Form von Migräneschmerz, sind ein weit verbreitetes Übel.
Valproinsäure (VPA), die auch in der antiepileptischen Therapie verwendet wird, ist ein Arzneistoff, welcher für die Behandlung von Migräne zugelassen wurde und bei der Behandlung von Epilepsie in den letzten 25 Jahren mit einigen Nebenwirkungen genutzt worden ist. Zwei Hauptnebenwirkungen, Teratogenität und Hepatotoxizität, sind mit der Valproat-Therapie in Zusammenhang gebracht worden.
Bei Menschen ist Valpromid (VPD), welches auch als ein antikonvulsives Mittel verwendet wird, ein Prodrug von Valproinsäure (VPA). Von ihm wurde festgestellt, dass es potenter ist als VPA, obwohl es signifikantere sedative Nebenwirkungen entfaltete (Loscher W. und Nau H. (1985) Neuropharmacology 24: 427–435).
Von Isomeren von VPD, wie z.B. Valnoctamid (VCD-Valmethamid oder 2-Ethyl-3-methylpentanamid), wurde festgestellt, dass sie als Antikonvulsiva potenter sind als Valproinsäure (Haj-Yehia A. und Bialer M. (1989) Pharm Res 6: 683–9). Bei der Pharmakokinetik bei Menschen ist für ein Amid einer aliphatischen, kurzkettigen Fettsäure, wie z.B. Valnoctamid (VCD), Stereoselektivität gezeigt worden (Barel S., Yagen B., Schurig V., Soback S., Pisani F., Perucca E. und Bialer M. (1997) Clin. Pharmacol. and Therap. 61 (4): 442–449). Diese Arbeit legte dar, dass die VCD-Pharmakokinetik (PK) bei Menschen stereoselektiv ist, wobei ein Isomer eine viel höhere Clearance und eine kürzere Halbwertszeit aufweist, verglichen mit den anderen drei Stereoisomeren.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Stereoisomere von von PID zur Verwendung bei der Behandlung von neurologischen und psychotischen Störungen und affektiven Psychosen und um Schmerz, wie z.B. Kopfschmerzen, zu behandeln. Obwohl VPA- und VPD-Analoga (wie z.B. VCA und VCD) an der Behandlung von Epilepsie beteiligt waren, gibt es keinen Beweis, dass sie in ihrer razemischen Form oder ihren einzelnen Stereoisomeren bei der Behandlung von neurologischen und psychotischen Störungen, affektiven Psychosen und Schmerz wirksam sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Stereoisomere von Propylisopropylacetamid zur Verwendung bei der Behandlung von neurologischen und psychotischen Störungen und affektiven Psychosen und um Schmerz, Kopfschmerzen und Migräne-Attacken zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur stereoselektiven Synthese des 2R-Stereoisomers von PID, umfassend:

(a) Synthetisieren von (4S)-3-(1'-Oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon aus (4S)-Benzyl-2-oxazolidinon (oder anderen verwandten Oxazolidinon-Hilfsstoffen) und Valeroylchlorid;
(b) Synthetisieren von Isopropyltrifluormethansulfonat (Isopropyltriflat);
(c) Synthetisieren von (4S,2'R)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon
(d) Synthetisieren von (2R)-Propylisopropylessigsäure ((2R-PIA) und anschließend;
(e) Synthese von (2R)-Propylisopropylacetamid.

(a) Synthetisieren von (4R,5S)-3-(1'-Oxopentyl)-4-methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon aus (4R,5S)-4-Methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon (oder anderen verwandten Oxazolidinon-Hilfsstoffen) und Valeroylchlorid;
(b) Synthetisieren von (4R,5S,2'S)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon;
(c) Synthetisieren von (4S,2'R)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon(4S,2'R)-3-(2'-isopropyl-1'-oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon;
(d) Synthetisieren von (2S)-Propylisopropylessigsäure ((2S)-PIA) und anschließend;
(e) Synthese von (2S)-Propylisopropylacetamid.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Arzneimittel, die als einen Wirkstoff ein razemisches Gemisch oder Stereoisomere der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) enthalten, welche für die Behandlung von neurologischen und psychotischen Störungen und affektiven Psychosen, und um Schmerz, Kopfschmerzen und Migräne-Attacken zu behandeln, nützlich sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ganz allgemein Propylisopropylacetamid (PID) in seinen stereospezifischen Formen zur Verwendung bei der Behandlung von neurologischen und psychotischen Störungen und affektiven Psychosen, und um Schmerz, einschließlich Kopfschmerzen und Migräneschmerzen, zu behandeln. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die 2S- und 2R-PID-Stereoisomere und ein Verfahren zu deren Synthese. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Arzneimittel, die, als einen Wirkstoff, diese razemischen Gemische oder Stereoisomere enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur stereoselektiven Synthese der Propylisopropylacetamid (PID))-Stereoisomere (2R und 2S).
Das Syntheseverfahren für die 2R-Stereoisomere, welches in 1 und 2 beschrieben wird, umfasst die folgenden Schritte;

(a) Synthetisieren von (4S)-3-(1'-Oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon (1) aus (4S)-Benzyl-2-oxazolidinon (oder anderen verwandten Oxazolidinon-Hilfsstoffen) und Valeroylchlorid;
(b) Synthetisieren von Isopropyltrifluormethansulfonat (Isopropyltriflat) (2);
(c) Synthetisieren von (4S,2'R)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon(4S,2'R)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon (3);
(d) Synthetisieren von (2R)-Propylisopropylessigsäure (2R-PIA) (4) und anschließend;
(e) Synthese von (2R)-Propylisopropylacetamid (5).

Das Syntheseverfahren für die 2S-Stereoisomere, welches in 3 beschrieben wird, umfasst die folgenden Schritte:

(a) Synthetisieren von (4R,5S)-3-(1'-Oxopentyl)-4-methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon (6) aus (4R,5S)-4-Methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon (oder anderen verwandten Oxazolidinon-Hilfsstoffen) und Valeroylchlorid;
(b) Synthetisieren von (4R,5S,2'S)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon (7);
(c) Synthetisieren von (4S,2'R)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon(4S,2'R)-3-(2'-isopropyl-1'-oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon;
(d) Synthetisieren von (2S)-Propylisopropylessigsäure ((2S)-PIA) (8) und anschließend;
(e) Synthese von (2S)-Propylisopropylacetamid ((2S)-PID) (9).

Die Erfindung wird durch die folgenden Experimente weiter veranschaulicht werden. Diese Experimente sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken, sondern ihn nur darlegen und klarstellen.
Die beiden Enantiomere von PID, (2S)-PID und (2R)-PID, wurden bei Mäusen und Ratten auf ihre antiepileptische (antikonvulsive) Wirkung und auf Neurotoxizität getestet. Nach i.p.-Verabreichung an Mäuse und peroraler Verabreichung an Ratten war (2R)-PID in dem MES- und sc-Met-Test wirksamer und zeigte bessere Potenz als (2S)-PID.
Bei Hunden wies, nach iv-Verabreichung, (2R)-PID eine niedrigere Clearance und eine längere Halbwertszeit auf als (2S)-PID, eine Tatsache, die zu der besseren antikonvulsiven Wirkung von (2R)-PID beitragen kann. Die bessere antikonvulsive Wirkung (verglichen mit VPA) von PID und seine fehlende Teratogenität erhöhen die Wahrscheinlichkeit, dass andere von VPA entfaltete ZNS-Wirkungen (Behandlung von neurologischen und psychotischen Störungen, affektiven Psychosen, Schmerz) bei PID in seinen razemischen und stereoisomeren Formen ausgeprägter ist.
Das Verfahren für die asymmetrische Synthese der 2R- und 2S-PID- und -PIA-Stereoisomere wird durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben werden:
Synthese von (2R)-Propylisopropylacetamid
1. (4S)-3-(1'-Oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon
Unter N₂ wurde zu einer gekühlten Lösung (–78°C) von (4S)-Benzyl-2-oxazolidinon (25 g) in trockenem THF (150 ml) eine Lösung von n-BuLi (97 ml, 1,6 M in Hexan) zugetropft. Nach Rühren des Reaktionsgemischs für 30 min, wurde Valeroylchlorid (20,1 ml) über eine Kanüle zugetropft, der Reaktionsansatz wurde langsam auf 0°C erwärmt, bei dieser Temperatur für 2,5 Stunden gerührt und mit gesättigter NH₄Cl-Lösung gequencht. Nach Abdampfen von THF wurde der Rückstand mit Dichlormethan (DCM) (3 × 150 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte mit Wasser, gesättigter Salzlösung gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Das Produkt (27,6 g) wurde aus 10% EtOAc in PE kristallisiert, Ausbeute 75%.
2. Isopropyltrifluormethansulfonat (Isopropyltriflat)
Unter N₂ wurde zu einer gekühlten (–15°C) Lösung von trockenem Isopropanol (10,4 ml) und trockenem Et₃N (25,2 ml) in trockenem DCM (200 ml) eine gekühlte (–15°C) Lösung von Tf₂O (triflic anhydride) (49,0 g in 50 ml DCM) zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde für eine Stunde gerührt, danach mit gekühlter (0°C) HCl-Lösung (0,25 M, 2 × 350 ml) gequencht. Die organische Phase wurde mit gekühlter (0°C) NaHCO₃-Lösung (0,5 M, 2 × 175 ml) gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und konzentriert. Die erhaltene gelbliche Flüssigkeit wurde in einer gekühlten (0°C) Pentanlösung (50 ml) gelöst, durch einen kurzen MgSO₄-Pfropfen filtriert und konzentriert. Das Produkt (18,3 g) wurde in 55%iger Ausbeute erhalten, in trockenem Pentan gelöst und bei –20°C bis zur Verwendung aufbewahrt.
3. (4S,2'R)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon
Unter N₂ wurde zu einer gekühlten (–78°C) Lösung von trockenem Diisopropylamin (11 ml) in trockenem THF (40 ml) n-BuLi (49 ml, 1,6 M Lösung in Hexan) zugetropft. Nach Rühren des Reaktionsgemischs für 30 min wird eine gekühlte (–78°C) Lösung von (4S)-3-(1'-Oxopentyl)-4- benzyl-2-oxazolidinon (18,5 g in 70 ml trockenem THF) über eine Kanüle langsam zugegeben. Nach Rühren für 1 Stunde wird eine gekühlte (–78°C) Lösung von Isopropyltriflat (15 g in 40 ml trockenem THF) über eine Kanüle zugegeben. Der Reaktionsansatz langsam auf –20°C erwärmt, über Nacht bei –20°C stehen gelassen und mit gesättigter NH₄Cl-Lösung gequencht. Die gesamte Reaktionszeit betrug 20 Stunden. THF verdampft und der Rückstand mit Et₂O (3 × 150 ml) extrahiert und über MgSO₄ getrocknet. Reinigung des Rohprodukts (23 g eines gelben Öls) mit Säulenchromatographie (Kieselgel, 0,5–3% EtOAc in PE) erbrachte 8,8 g eines gelblichen Öls, 41% Ausbeute.
4. (2R)-Propylisopropylessigsäure ((2R)-PIA)
Zu einer gekühlten (0°C) Lösung von (4S,2'R)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon (8,8 g) in einem Gemisch von THF:DDW (4:1, 550 ml) wurde H₂O₂ (30%, 19,3 ml), gefolgt von einer Lösung von LiOH (2,44 g in 50 ml DDW); zugegeben. Nach Rühren für 3 Stunden wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur (~23°C) erwärmt und über Nacht stehen gelassen. Nach 24 Stunden wurde das Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt mit Natriumsulfit (21 g in 100 ml DDW) gequencht und für eine zusätzliche Stunde gerührt. THF verdampft und die basische wässrige Phase (pH-Wert = 11) mit DCM (3 × 100 ml) extrahiert. Der chirale Hilfsstoff, (4S)-Benzyl-2-oxazolidinon wurde nach Abdampfen des DCMs und Kristallisation aus 20% EtOAc in PE erhalten, 80% Ausbeute. Die wässrige Phase wurde danach mit konzentrierter HCl (pH-Wert = 2) angesäuert und mit EtOAc (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte mit gesättigter Salzlösung gewaschen, an MgSO₄ getrocknet, verdampft und erbrachten das Produkt, ein farbloses Öl (3,49 g), Ausbeute 83%.
5. (2R)-Propylisopropylacetamid ((2R)-PID)
Unter N₂ wurde zu einer gekühlten (0°C) Lösung von (2R)-PIA (3,3 g), gelöst in trockenem DCM (100 ml) und trockenem DMF (1,77 ml), eine Lösung von Oxalylchlorid (34,3 ml, 2,0 M Lösung in DCM) zugetropft. Nach einer Stunde Rühren wurden das DCM und überschüssiges Oxalylchlorid durch einen N₂-Strom verdampft. Um Spuren von Oxalylchlorid zu entfernen, wurde das Rohprodukt mit trockenem DCM (2 × 20 ml) behandelt, welches durch einen N₂-Strom verdampft wurde. Zu dem rohen Reaktionsgemisch, gelöst in gekühltem (0°C), trockenem DCM (100 ml), wurde NH₄OH (20 ml, 25%ige Lösung in Wasser) zugegeben und das Reaktionsgemisch für eine Stunde gerührt. Die organische Phase mit Wasser und zur Hälfte gesättigter Salzlösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und konzentriert. Das Produkt wurde aus 20% EtOAc in PE kristallisiert, was 2,14 g erbrachte, 65% Ausbeute.
Synthese of (2S)-Propylisopropylacetamid
1. (4R,5S)-3-(1'-Oxopentyl)-4-methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon
(4R,5S)-3-(1'-Oxopentyl)-4-methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon wurde aus (4R,5S)-4-Methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon und Valeroylchlorid mit dem gleichen Verfahren wie (4S)-3-(1'-Oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon synthetisiert. Das Produkt (29,55 g) wurde in 84%iger Ausbeute erhalten.
2. (4R,5S,2'S)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxonentyl)-4-methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon
(4R,5S,2'S)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon wurde aus (4R,5S)-3-(1'-Oxopentyl)-4-methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon und Isopropyltriflat mit dem gleichen Verfahren wie (4S,2'S)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon synthetisiert. Das Produkt (5,53 g) wurde in 32%iger Ausbeute erhalten.
3. (2S)-Propylisopropylessigsäure ((2S)-PIA)
(2S)-PIA wurde aus (4R,5S,2'S)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon mit dem gleichen Verfahren wie (2R)-PIA synthetisiert. Das Produkt (2,33 g) wurde in 89%iger Ausbeute erhalten.
4. (2S)-Propylisopropylacetamid ((2S)-PID)
(2S)-PID wurde aus (2S)-PIA mit dem gleichen Verfahren wie (2R)-PID synthetisiert. Das Produkt (1,54 g) wurde in 67%iger Ausbeute erhalten.
Pharmakokinetische Studien
Pharmakokinetische Experimente wurden an sechs Bastard-Hunden mit einem Gewicht von 18–25 kg ausgeführt. Die Hunde waren in einer Tierzuchtfarm untergebracht und wurden wiederholt alle zwei - drei Wochen nach Fasten über Nacht für Überkreuzungs-Experimente zu dem Labor gebracht. Jedem Hund wurde ein Harn- (Levin's tube, Pennine Healthcare, Derby, UK) und zwei Venen- (20G/32 mm Venflon 2, Ohmeda, Helsingborg, Schweden) Katheter, die an verschiedenen Beinen angebracht waren, eingeführt. Die Hunde wurden vier Stunden nach der Arzneistoffinjektion mit im Handel erhältlichem Hundefutter gefüttert und hatten während des ganzen Experiments freien Zugang zu Wasser.
Jedem Hund wurden 70 nmol/kg (10 mg/kg) jedes getrennt vorliegenden Enantiomers oder 140 nmol/kg des Racemats, gelöst in 2 ml 96%igem Ethylalkohol, intravenös injiziert. Venöse Blutproben (6 ml) wurden über einen Verweilkatheter von dem anderen Bein als dem für die Injektion verwendeten entnommen und mit Heparin versetzte Röhrchen überführt. Die Blutproben wurden bei 3000 g für 10 Minuten zentrifugiert, das Plasma wurde danach abgetrennt und bei 20°C bis zur Analyse gelagert. Die Blutgewinnung begann bei 5 Minuten und dauerte bis zu 12 Stunden nach der Injektion an. Urinproben wurden in 1–2 Stunden-Abständen gesammelt, beginnend bei 1 Stunde und bis zu 12 Stunden nach der Injektion. Das Harnvolumen wurde aufgezeichnet und ein Aliquot wurde bis zur Analyse bei 20°C gelagert.
Test der Plasmaproben: zu Teströhrchen, die 2 μg des internen Standards (Diisopropylacetamid) enthielten, wurden 0,5 ml Plasma (aufgetaut bei Raumtemperatur) und 5 ml tert-Butylmethylether (TBME) zugegeben. Die Teströhrchen wurden für 30 sec kräftig verwirbelt und bei 3000 g für 10 Minuten zentrifugiert. Die organische Phase wurde abgetrennt und, unter Verwendung eines Wirbelevaporators unter vermindertem Druck getrocknet. Die Proben wurden danach mit 150 μl Chloroform wieder aufgelöst und unter vermindertem Druck ohne Verwirbeln getrocknet. Die Probe wurde noch einmal mit 30 μl Chloroform wieder aufgelöst, wovon 2 μl in den GC-Apparat injiziert wurden.
Die für die chromatographische Analyse der PID-Enantiomere verwendete Säule war eine Mosandl-Methyl-Kapillarsäule (10 m, 0,25 mm, 0,25 μm), beschichtet mit: Heptakis-(2,3-di-O-methyl-6-O-tert-butyldimethylsilyl)-β-cyclodextrin als stationäre Phase und Stickstoff als Trägergas (takeo carbohydr res). Der Säulenkopfdruck wurde auf 50 KPa eingestellt, das Spaltverhältnis auf 1:30, die Ofentemperatur auf 120°C, die Injektortemperatur auf 250°C und die Detektortemperatur auf 250°C. Bei diesen Bedingungen hatte S-PID eine Retentionszeit von 4,6 min, R-PID von 5,1 min.
Die Ergebnisse (4 und 5) zeigen, dass, wenn die Enantiomere einzeln gegeben werden, PID eine deutliche stereospezifische Kinetik aufweist. Aber, wenn PID in einem razemischen Gemisch gegeben wird, wird keine Sterospezifität beobachtet und die pharmakokinetischen Parameter sind denjenigen des einzelnen R-Enantiomers sehr nahe.
Die pharmakokinetischen Parameter der einzelnen Enantiomere und des razemischen Gemischs werden in Tabelle 1 beziehungsweise Tabelle 2 zusammengefasst.
(CL = Clearance, V_β = Verteilungsvolumen, Vss = V_β im Gleichgewicht, MRT = mittlere Verweildauer, E = Leberextraktionsverhältnis, fe = unverändert im Urin ausgeschiedener Anteil) Tabelle 1: Pharmakokinetische Parameter der PID-Enantiomere bei Hunden, als einzelne Enantiomere gegeben (10 mg/kg, i.v.)

* P < 0,05.

Tabelle 2: Pharmakokinetische Parameter der PID-Enantiomere bei Hunden, in einem razemischen Gemisch gegeben (20 mg/kg, i.v.)
Epoxidhydrolase-Hemm-Test
Von PID ist bekannt, dass es ein Hemmstoff für die Epoxidhydrolase(EH)-Aktivität ist. Eine Studie wurde durchgeführt, um die Möglichkeit der Stereospezifität von PID bei der EH-Hemmung zu untersuchen. Die Studie wurde folgendermaßen durchgeführt:
Die inhibitorische Potenz von razemischem PID und seinen einzelnen Enantiomeren für mikrosomale EH in vitro wurde in humanen Lebermikrosomen mit S-(+)-Styroloxid (SO) als Substrat gemessen. Die Mikrosome wurden aus humaner Leber #135 (HL-135), genotypisch als Wildtyp-EH klassifiziert, gemäß dem zuvor veröffentlichten Verfahren (Rattie (1989) Drug Metabolism and Disposition, 17: 265–270) hergestellt. Die Rate der S-(+)-1-Phenyl-1,2-ethandiol (PED)-Bildung wurde in mikrosomalen Inkubationen gemessen, wie zuvor beschrieben, mit geringfügigen Abwandlungen (Kerr (1989) Clinical Pharm. Therp. 46: 82–93). Kurz: Razemisches PID, S-PID, R-PID oder 0,1 M Natriumphosphatpuffer mit pH-Wert 7,4 wurden mit mikrosomalem Protein für 1,5 min bei 37°C vorinkubiert, bevor die Reaktion durch die Zugabe von SO gestartet wurde. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 3 ml n-Hexan, schnelles Verwirbeln für 30 sec und Platzieren der Röhrchen auf Eis, bis zur weiteren Verarbeitung beendet. Die Hintergrund-Hydrolyserate für SO wurde durch Austausch des mikrosomalen Proteins gegen eine gleiche Menge von denaturiertem mikrosomalen Protein gemessen. Alle berichteten PED-Bildungsraten sind um die nicht-enzymatische Hydrolyse korrigiert worden. Die End-Proteinkonzentration betrug 5,34 μg/ml. SO wurde in 15 μl Acetonitril-Lösung zugegeben, so dass die End-SO-Konzentration 25 μM (entspricht der K_m von SO) betrug. PID und seine einzelnen Enantiomere wurden in 15 μl methanolischer Lösung zugegeben, so dass die Endkonzentration des organischen Lösungsmittels 1% betrug. Die Hemmreaktionen wurden bei fünf Konzentrationen im Bereich von 4 bis 30 μM untersucht. Eine positive Kontrolle für 50%-Hemmung wurde durch Verwenden von 5 μM VPD (entspricht der IC₅₀ von VPD) durchgeführt. Alle Bestimmungen wurden dreifach ausgeführt.
PED wurde extrahiert und unter Verwendung eines zuvor veröffentlichten Umkehrphasen-HPLC-Verfahrens, mit geringfügigen Abwandlungen, getestet (Kerr. (1989) Clinical Pharm. Therp. 46: 82–93). Der interne Standard war Felbamat 1,6 μg in 100 μl methanolischer Lösung. Die mikrosomalen Inkubationen wurden mit 7 ml TBME extrahiert. Zusammensetzung der mobilen Phase: zweifach destilliertes Wasser/Acetonitril/Methanol 70:20:10. Die Fließgeschwindigkeit wurde auf 1,2 ml/min eingestellt und die Verbindungen durch UV-Absorption bei 210 nm detektiert. Die chromatographische Trennung wurde an einer Zorbax C₈-Säule (5 μM, 4,6 × 25 cm), ausgestattet mit einer C₈-Schutzsäule (5 μM, 4,6 × 1,0 cm), ausgeführt.
Die Hemmung der EH-vermittelten SO-Hydrolyse durch PID und die einzelnen Enantiomere: S-PID und R-PID, wurde in mikrosomalen Suspensionen untersucht, die aus einer einzelnen humanen Leber, HL-135, hergestellt wurden. Die PED-Bildungsraten sind im 6 dargestellt. Aus Diagrammen der prozentualen Rest-Aktivität von EH vs. Inhibitorkonzentration konnten IC₅₀-Werte für jede der getesteten Verbindungen abgeleitet werden. Razemisches PID hatte eine IC₅₀ von 8,55 μM, S-PID eine IC₅₀ von 7,60 μM und R-PID eine IC₅₀ von 11,20 μM.
Die durchschnittlichen nicht-enzymatischen SO-Hydrolyseraten betrugen 6,67 ± 0,47% der enzymatischen Kontroll-Hydrolyseraten. VPD (5 μM) als Positiv-Kontrolle hemmte die SO-Hydrolyse zu 51,5 ± 2,4% der enzymatischen Kontroll-Hydrolyseraten. QC von vier verschiedenen PED-Konzentrationen innerhalb des PED-Konzentrationsbereichs wies eine Genauigkeit von 0,55–2,70% und eine Reproduzierbarkeit (VK („CV", Variationskoeffizient) (%)) von 1,49–5,61% auf.
Biologische Wirkung
1. Teratogenitäts-Studie
1a. Teratogenitäts(Finnel)-Studie an SWV-Mäusen
Die Teratogenität wurde an dem durch hohe Inzucht erzeugten SWV-Mäusestamm auf der Basis ihrer bekannten Suszeptibilität für VPA-induzierte NTDs ermittelt (Finnel et al. (1988) Teratology 38: 313–320). Die Mäuse wurden in der Animal Resources Facility am College of Veterinary Medicine, Texas A&M University in einem 12-h-Helligkeitszyklus gehalten. Die Mäuse waren pathogenfrei und erhielten freien Zugang zu Wayne-TekLad-Nagetierfutter und Leitungswasser. Jungfräuliche Weibchen, 40–60 Tage alt, wurden über Nacht befruchtet und am nächsten Morgen auf das Vorhandensein von vaginalen Pfropfen untersucht. Der Beginn der Trächtigkeit (Tag 0) wurde auf 10 Uhr des vorhergehenden Abends, die Mitte des Dunkelzyklus, festgesetzt (Finnel et al. (1988) Teratology 38: 313–320). Zehn Muttertieren wurde zufällig jede der getesteten Verbindungen: razemisches PID, S-PID und R-PID, zugeteilt. An Tag 8,5 der Trächtigkeit wurde jedes Muttertier einer einmaligen intraperitonealen (ip) Injektion der getesteten Verbindung (500–600 mg/kg) oder des Vehikels (1%ige Carboxymethylcellulose-CMC) ausgesetzt. Nach der Verabreichung wurden die Muttertiere bis Tag 18,5 der Trächtigkeit in ihre Käfige zurückgebracht. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Muttertiere durch zervikale Dislokation geopfert, der Unterleib wurde geöffnet und der Gebärmutterinhalt entnommen. Die Lage von ganz lebensfähigen Embryos oder Foeten und Resorptionsstellen wurde aufgezeichnet und die Embryos wurden auf das Vorhandensein von Exenzephalie untersucht.
Die Teratogenität bei dem SWV-Mäusestamm wurde nach einer einmaligen ip-Verabreichung von PID, S-PID und R-PID an Tag 8,5 der Trächtigkeit an zehn Muttertiere ermittelt.
Die Teratogenitätsdaten sind in Tabelle 1 dargestellt. Sowohl PID als auch R-PID wurden mit Dosen von 600 mg/kg verabreicht. Infolge mehrfachen Vorkommens mütterlicher Letalität nach 600 mg/kg-Verabreichung von S-PID wurde die Teratogenität mit 500 mg/kg weiter untersucht. Sowohl razemisches als auch R-PID induzierten keine Exenzephalie bei den SWV-Embryos. S-PID verursachte 0,8% Exenzephalie, aber dies war nicht verschieden von den Kontrollen (0%).
Die von PID, S-PID und R-PID induzierten Resorptionsraten betrugen 6,3%, 6,1% beziehungsweise 10,4%, was nicht von den Kontrollen, 8,6%, verschieden ist. Tabelle 3: Teratogene Wirkungen von PID, R-PID und S-PID bei SWV-Mäusen

¹ Prozent der gesamten Einnistungen
² Prozent der lebenden Foeten
³ Den Kontrollen wurde das Vehikel: CMC 1%, verabreicht
* Signifikant verschieden mit Bezug auf die Kontrollen (P < 0,05)

1b. Teratogenitäts(Nau)-Studie an Mäusen des NMRI-Stamms
Mäuse des NMRI-Stamms (Harlan-Winkelmann GmbH, 33176 Borchen, Deutschland) wurden unter kontrollierten Bedingungen gehalten: Raumtemperatur (21 ± 1°C), relative Feuchtigkeit (50 ± 5%) und ein 12-Stunden-Hell-Dunkelzyklus, wobei der Helligkeitszeitraum von 10 Uhr vormittags bis 10 Uhr abends dauerte. Weibchen mit einem Gewicht von 28 bis 36 g wurden für 3 Stunden (von 6 Uhr vormittags bis 9 Uhr vormittags) mit Männchen den gleichen Stamms gepaart. Tiere mit vaginalen Pfropfen wurden abgetrennt und der folgende 24-Stunden-Zeitraum wurde als Tag 0 der Trächtigkeit bestimmt. Man gab den Tieren freien Zugang zu Futter (Altromin-1324-Ernährung, Lage, Deutschland) und Leitungswasser. Die Genehmigung für die Studie wurde vom Department of Health erhalten.
Natrium-Valproat (VPA-Na), razemisches PID, (2R)-PID und (2S)-PID wurden in einer wässrigen, 25%igen Cremophor EL-Lösung suspendiert. Für eine andere Behandlungsgruppe wurde VPA-Na in destilliertem Wasser gelöst. Den trächtigen Muttertieren wurde eine einmalige, subkutane 3 mmol/kg-Dosis (10 ml/kg-Volumen verabreicht) am Morgen von Tag 8 der Trächtigkeit injiziert. Mäusen der Kontrollgruppe wurde das Vehikel, 25%ige Cremophor EL-Lösung (10 ml/kg-Volumen verabreicht), injiziert. An Tag 18 der Trächtigkeit wurden die Muttertiere durch zervikale Dislokation geopfert, die Uteri entnommen und die Anzahl der Einnistungen, Resorptionen und toten Foeten aufgezeichnet. Die lebenden Foeten wurden einzeln gewogen und auf das Vorhandensein von externen Missbildungen untersucht.
Die teratogene Potenz von razemischem PID und den einzelnen Enantiomeren wurde bei NMRI-Mäusen nach einer einmaligen, subkutanen 3 mmol/kg-Injektion an Tag 8 der Trächtigkeit an trächtige Muttertiere ermittelt, wie in Tabelle 4 dargestellt. Razemisches PID und die einzelnen Enantiomere induzierten keine Exenzephalie in den sich entwickelnden Mausembryos, wohingegen VPA 37% und 73% Exenzephalie bei lebenden Foeten verursachte, wenn es in wässriger Lösung beziehungsweise Cremophorsuspension verabreicht wurde. Intrauteriner Fruchttod und frühzeitige Resorptionen, ausgedrückt als Embryoletalität, waren bei VPA-behandelten Tieren signifikant erhöht, wohingegen alle PID-Gruppen und Kontrollen vergleichbare Raten aufwiesen. Alle Behandlungsgruppen (PID und VPA) wiesen eine signifikante Verminderung des fötalen Gewichts auf. Tabelle 4: Teratogenität von razemischem PID, (2R)-PID und (2S)-PID bei NMRI-Mäusen an Tag 14 der Trächtigkeit.

² Prozent der gesamten Einnistungen
³ Prozent der lebenden Foeten
⁴ Subkutan verabreicht, in dem Vehikel: 25% Cremophor EL.
⁵ Intraperitoneal verabreicht, gelöst in destilliertem Wasser.
⁶ Kontrollen erhielten das Vehikel: 25% Cremophor EL.
* Signifikant verschieden von den Kontrollen (p < 0,0001, exakter Fisher Test)
** Signifikant verschieden von den Kontrollen (p < 0,0001, Student-t-Test)

2. Anti-Migräne Wirkung von PID
Der GABA-Transaminaseinhibitor und -aktivator, von Glutaminsäure, die Decarboxylase, Valproinsäure wird zur Behandlung von Migräne verwendet. In dieser Studie wurde ein Valproylamid-Analogon (PID) in razemischer Form in Tiermodellen (Ratten) auf die Behandlungen von Migräne und Schmerz, im Vergleich mit VPA, getestet.
Das in dieser Studie verwendete Tiermodell ist das von Moskowitz et al. (F M. Cutrer, V. Limmroth und M. A. Moskowitz: Possible mechanisms of valproate in migraine prophylaxis, Cephalalgia 17: 93–100 (1997)) entwickelte. Moskowitz et. al. untersuchten die Extravasation von Plasmaprotein nach elektrischer Stimulation des Gasser'-Ganglions oder intravenöser Verabreichung von Substanz P. Man kam zu dem Schluss, dass in diesem Modell Valproinsäure die Extravasation von Plasma in die Meningen durch GABA_A-vermittelte postjunktionale Rezeptoren, wahrscheinlich innerhalb der Meningen, blockiert. Die erforderlichen Dosierungen sind mit den klinisch verwendeten vergleichbar. Folglich können Agonisten und Modulatoren am GABA_A-Rezeptor für die Entwicklung selektiver Arzneistoffe für Migräne und Clusterkopfschmerz nützlich werden (W. S. Lee et. al.: Peripheral GABAA receptor mediated effects of sodium valproate on durnal plasma Protein extravasation to substance P and trigeminal stimulation, Toward Migraine 2000, F C. Rose Hrsg. Elsevier, Amsterdam, 1996, S. 289–319).
Wir testeten die Wirkungen von PID auf die durale Extravasation von Plasmaprotein (Rinderserumalbumin – BSA), hervorgerufen durch unilaterale Stimulation des Gasser'-Ganglions bei betäubten Ratten. Die Ergebnisse dieser Studie, gezeigt in 7, zeigen, dass PID hemmende Wirkungen auf die durale Extravasation von Plasmaprotein aufweist, d.h., es besitzt die Potenz für anti-Migräne- und anti-Schmerzwirkung.
3. Antikonvulsive Wirkung und Neurotoxizität von PID bei Mäusen
Einzelne Enantiomere von PID wurden bei Mäusen auf ihre antikonvulsive Wirkung (durch die NIH Epilepsy Branch) nach intraperitonealer Verabreichung an Mäuse durch Einsatz eines Durchmusterungs-Verfahrens überprüft, welches einbezieht: (i) den maximalen Elektroschock(MES)-Test, welcher die Anfallsausbreitung misst; (ii) den subkutanen Pentylentetrazoltest sc. Met.-Test), welcher die Anfallsschwelle misst und (iii) den Rotorod-ataxia-Test, welcher die Neurotoxizität bewertet.
Tabelle 6 zeigt die in dieser Studie erhaltenen Ergebnisse:
Tabelle 6: Antikonvulsive Wirkung und Neurotoxizität von PID bei Mäusen (intraperitoneale Verabreichung)
4. Antikonvulsive Wirkung und Neurotoxizität von PID bei Ratten
Einzelne Enantiomere von PID wurden bei Ratten mit dem in dem vorhergehenden Abschnitt beschriebenen Verfahren auf ihre antikonvulsive Wirkung nach oraler Fütterung überprüft. Die in dieser Studie erhaltenen ED₅₀-Werte sind folgendermaßen:
ED₅₀ für (2R)-PID: 16 mg/kg
ED₅₀ für (2S)-PID: 26 mg/kg
ED₅₀ für das Racemat: 22 mg/kg

Claims

(R)- oder (S)-Stereoisomere von Propylisopropylacetamid zur Verwendung bei der Behandlung von neurologischen und psychischen Störungen, und affektiven Psychosen und um Schmerz, Kopfschmerzen und Migräne zu behandeln.
Verfahren zur stereoselektiven Synthese des 2R-Stereoisomers von Propylisopropylacetamid umfassend: (a) Synthetisieren von (4S)-3-(1'-Oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon aus (4S)-Benzyl-2-oxazolidinon oder anderen Oxazolidinon-Hilfsstoffen, und Valeroylchlorid; (b) Synthetisieren von Isopropyltrifluormethansulfonat (Isopropyltriflat); (c) Synthetisieren von (4S,2'R)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon (d) Synthetisieren von (2R)-Propylisopropylessigsäure ((2R)-PIA) und danach: (e) Synthese von (2R)-Propylisopropylacetamid.
Verfahren zur stereoselektiven Synthese des 2S-Stereoisomers von Propylisopropylacetamid umfassend: (a) Synthetisieren von (4R,5S)-3-(1'-Oxopentyl)-4-methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon aus (4R,5S)-4-Methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon oder anderen Oxazolidinon-Hilfsstoffen, und Valeroylchlorid; (b) Synthetisieren von (4R,5S,2'S)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon; (c) Synthetisieren von (4S,2'R)-3-(2'-Isopropyl-1'-oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon(4S,2'R)-3-(2'-isopropyl-1'-oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon; (d) Synthetisieren von (2S)-Propylisopropylessigsäure ((2S)-PIA) and danach: (e) Synthese von (2S)-Propylisopropylacetamid.
Verfahren zur stereoselektiven Synthese des 2R-Stereoisomers von Propylisopropylacetamid gemäß Anspruch 2, wobei Schritt (a) die Zugabe von n-BuLi zu einer Lösung von (4S)-Benzyl-2-oxazolidinon bei etwa –78°C, Rühren und Zugabe von Valeroylchlorid, Erwärmen auf etwa 0°C, Rühren und Quenchen umfasst, wobei man Verbindung (1) erhält, und wobei Schritt (b) die Zugabe einer Lösung von Triflatanhydrid zu einer Lösung von Isopropanol und Et₃N bei etwa –15°C, Rühren, Quenchen umfasst, wobei man die Verbindung (2) in einer organischen Phase erhält; und wobei Schritt (c) die Zugabe von n-BuLi zu einer Lösung von Diisopropylamin bei etwa –78°C, Rühren und Zugabe einer Lösung von (4S)-3-(1'-Oxopentyl)-4-benzyl-2-oxazolidinon, Rühren und Zugabe einer Lösung von Isopropyltriflat, Erwärmen der Lösung auf –20°C und Quenchen umfasst, wobei man Verbindung (3) erhält; und wobei Schritt (d) die Zugabe von H₂O₂ gefolgt von einer Lösung von LiOH zur Verbindung (3), Rühren und Erwärmen auf etwa 23°C, Abkühlen auf 0°C und Quenchen, wobei man eine basische wässrige Phase erhält, ferner Extrahieren mit Dichlormethan, wobei man (4S)-Benzyl-2-oxazolidinon erhält, ferner Ansäuern des (4S)-Benzyl-2-oxazolidinons, wobei man Verbindung (4) erhält, umfasst; und wobei Schritt (e) die Zugabe einer Lösung von Oxalylchlorid zu einer Lösung von Verbindung (4) bei etwa 0°C, Rühren und Zugabe von NH₄OH, Rühren und Erhalt der Verbindung (5) in einer organischen Phase umfasst.
Verfahren zur stereoselektiven Synthese des 2S-Stereoisomers von Propylisopropylacetamid gemäß Anspruch 3, wobei Schritt (a) die Zugabe von n-BuLi zu einer Lösung von (4R,5S)-4-Methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon bei etwa –78°C, Rühren und Zugabe von Valeroylchlorid, Erwärmen auf 0°C, Rühren und Quenchen umfasst, wobei man Verbindung (6) erhält; und wobei Schritt (b) die Zugabe einer Lösung von Triflatanhydrid zu einer gekühlten Lösung von Isopropanol und Et₃N bei etwa –15°C, Rühren, Quenchen und den Erhalt von Verbindung (2) in einer organischen Phase umfasst; und Schritt (c) die Zugabe von n-BuLi zu einer Lösung von Diisopropylamin bei etwa –78°C, Rühren und Zugabe einer Lösung von (4R,5S)-3-(1'-Oxopentyl)-4-methyl-5-phenyl-2-oxazolidinon, Rühren und Zugabe einer Lösung von Isopropyltriflat, Erwärmen der Lösung auf –20°C und Quenchen umfasst, wobei man Verbindung (7) erhält; und wobei Schritt (d) die Zugabe von H₂O₂ gefolgt von einer Lösung von LiOH zur Verbindung (7), Rühren und Erwärmen auf etwa 23°C, Abkühlen auf 0°C und Quenchen, wobei man eine basische wässrige Phase erhält, ferner Extrahieren mit Dichlormethan, Ansäuern des Extrakts, wobei man Verbindung (8) erhält, umfasst; und wobei Schritt (e) die Zugabe einer Lösung von Oxalylchlorid zu einer Lösung von Verbindung (4) bei etwa 0°C, Rühren und Zugabe von NH₄OH, Rühren und den Erhalt von Verbindung (9) in einer organischen Phase umfasst.
Arzneimittel, die als einen Wirkstoff ein Stereoisomer von Propylisopropylacetamid gemäß der Definition in Anspruch 1 umfassen.
Arzneimittel gemäß Anspruch 6, wobei die Mittel zur Behandlung von neurologischen und psychischen Störungen, und affektiven Psychosen und um Schmerz, Kopfschmerzen und Migräne zu behandeln, nützlich sind.