DE69309827T2

DE69309827T2 - Modifizierter Plättchenfaktor-4

Info

Publication number: DE69309827T2
Application number: DE69309827T
Authority: DE
Inventors: Shalley Kant Gupta; Jai Pal Singh
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1992-09-25
Filing date: 1993-09-24
Publication date: 1997-08-28
Anticipated expiration: 2013-09-25
Also published as: YU61893A; EP0589719B1; AU4757393A; US5935928A; AU665114B2; NO933423L; HU9302687D0; IL107040A0; GR3023356T3; EP0589719A1; DK0589719T3; HK100597A; JPH06220091A; BR9303903A; KR940007059A; HUT69928A; CA2106629A1; US5538949A; CN1035257C; MX9305901A

Description

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis einer neuen in der N-terminalen Region prozessierten Form des humanen Blutplättchenfaktors 4, der hierin als modifizierter Blutplättchenfaktor 4 (MPF-4) bezeichnet wird. Die Erfindung umfaßt auch eine proteolytisch gespaltene, nicht-reduzierte Form des Blutplättchenfaktors 4, die hierin gespaltener Blutplattchenfaktor 4 (CPF-4) genannt wird. Sowom MPF-4 als auch CPF-4 können aus dem verbrauchten Kulturmedium von peripheren Blutleukozyten (PBLs) isoliert werden, die mit Lipopolysaccharid stimuliert wurden.
Eine Aminosäuresequenzierung zeigte, daß MPF-4 homolog zum Blutplättchenfaktor 4 (PF-4) ist, mit Ser- 17 beginnt und daher ein natürlich auftretendes Spaltprodukt von PF-4 sein dürfte. CPF-4 enthält dieselbe Aminosäuresequenz wie PF-4, unterscheidet sich aber dadurch, daß die Peptidbindung zwischen den Resten 16 und 17 fehlt. Die zwei entstehenden Peptide bleiben jedoch über Dilsulfidbrücken miteinander verbunden. Am signifikantesten ist, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen starke Inhibitoren der Endothelzellproliferation sind und etwa zwischen 10 - 100 fach aktiver sind als nativer PF-4, was von der Quelle des PF-4 und des berichtenden Labors abhängt.
PF-4 ist der Prototypvertreter einer wachsenden Familie an kleinen induzierbaren Proteinen, die durch verschiedene Zelltypen nach einer Stimulation mit Mitogenen oder Cytokinen freigesetzt werden. Diese Proteinfamilie, bekannt als "Interkrine", moduliert eine Vielzahl an biologischen Prozessen, wie die Angiogenese, die Zellproliferation, die Koagulation, die Entzündung und die Gewebsregeneration. Siehe Oppenheim et al., Properties of the Novel Proinflammatory Supergene "Intercrine" Cytokine Family, Ann. Rev. Immunol. 9: 617-648, 1991, Taylor et al., Protamine is an Inhibitor of Angiogenesis, Nature 297; 307-312, 1982 und Maione et al., Inhibition of Angiogenesis by Recombinant Human Platelet Factor 4 and Related Peptides, Science 247: 77-79, 1990.
Andere Vertreter der Interkrin-Familie sind unter anderem Interleukin-8 (IL-8), die das Melanozytenwachstum stimulierende Aktivität (hGro/MGSA), ß-Thromboglobulin (ß-TG), das Neutrophile-aktivierende Protein (NAP-2), IP-10 und das Makrophagenentzündungsprotein (MIP-2). Siehe Lindley et al., Synthesis and Expression in Escherichia coli of the Gene Encoding Monocyte-derived Neutrophil-Activating Factor: Biological Equivalence between Natural and Recombinant Neutrophil-activating Factor, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 9199-9203, 1988, Walz et al., A Novel Clevage Product of B-Thromboglobulin Formed in Cultures of Stimulated Mononuclear Cells Activates Human Neutrophils, Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 969-975, 1989, Luster et al., Gamma- Interferon Transcriptionally Regulates an Early Response Gene Containing Homology to Platelet Proteins, Nature 315: 672-676, 1985 und Wolpe et al., Identification and Characterization of Macrophage Inflammatory Protein 2, Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 612-616, 1989).
Die vollständige Primärstruktur von PF-4 ist in der Technil: gut bekannt. (Poncz et al., Cloning and Characterization of Platelet Factor 4 cDNA Derived from a Human Erythroleukemic Cell Line, Blood 69: 219- 223,1987. Analoga und Fragmente von PF-4 sind ebenfalls gut bekannt und werden als "Oncostatin-A" in den US- A 4465 828 und 4 737 580 bezeichnet, die hiermit eingeführt werden. Untersuchungen haben gezeigt, daß die Interkrinproteinfamilie ein charakteristitisches Cystein-X-Cystein (CXC) Motiv enthalten, das in der N-terminalen Region liegt. Das CXC Motiv ist bei der Bildung der Sekundär- und Tertiärstruktur des nativen PF-4 über die Bildung von intramolekularen Disulfidbindungen mit den Resten Cys-36 und Cys-51 beteiligt (St. Charles et al., The Threedimensional Structure of Bovine Platelet Factor 4 at 3,0Å Resulution, J. Biol. Chem. 264: 2092-2098, 1989).
Darüberhinaus wurde auf der Grundlage der dreidimensionalen Struktur des Rinder PF-4 bestimmt, daß die N-terminalen Reste Gln-9 bis Val-19 eine große offene Schleife bilden und daß Thr-16 über Wasserstoffbrükken an Cys-51 gebunden ist. Diese N-terminalen Strukturen sind für die immunregulatorische Aktivität von PF-4 wichtig (Katz et al., Protease-induced Immunregulatory Activity of Platelet Factor 4, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 3491-3495, 1986).
Obwohl PF-4 vor allem in den alpha-Granula von Blutplättchen gefünden wird, zeigte eine genomische Klonierung das Vorliegen einer Duplizierung des humanen PF-4 Gens, was zu alternativen Formen von PF-4, nämlich PF-4varI und PF-4alt führt (Doi, et al., Structure of the Rat Platelet Factor 4 Gene: A Marker for Magakaryocyte Differentiation, Mol. Cell Biol. 7: 898-912, 1987). Die abgeleitete Aminosäuresequenz der Varianten zeigt wichtige Unterschiede in der N-terminalen Signalsequenz und in der Lysin-reichen C-terminalen Domäne (Green et al., Identification und Characterization of Pf4var1, a Human Gene Variant of Platelet Factor 4, Mol Cell. Biol. 9: 1445-1451, 1989, Eisman et al., Structural and Functional Comparision of the Genes for Human Platelet Factor 4 and Pf4alt, Blood 76: 336-344, 1990). Die Veränderungen in der Signalsequenz lassen einen Unterschied in der Sekretionsart und dem Gewebetyp, wo die Expression stattfindet, vermuten. Daher können auch alternative Formen von PF-4 von anderen Zeilen als Blutplättchen gebildet werden.
Es ist ebenfalls gut bekannt, daß die Lysin-reiche C-terminale Region des PF-4 stark an Heparin und verwandte Glycosaminoglycane bindet (Rucinski et al., Human Platelet Factor 4 and its C-terminal Peptides: Reparin Binding and Clearance from the Circulation, Thrombos. Haemostas. 63: 493-498, 1990).
Mutierte Formen von PF-4 wurden in Verfahren zur Behandlung von angiogenen Erkrankungen beschrieben, in denen die Mutanten verwendet werden. Siehe US-A 5 086 164 und 5 112 946, die hiermit eingeführt werden. Diese Patente beschreiben PF-4 Modifizierungen, die in der C-terminalen Region durchgeführt wurden und zu Analoga führen, die keine Heparin-bindende Fähigkeit mehr aufweisen. Die vorliegende Erfindung beschreibt MPF-4 und CPF-4, die prozessierte Formen von PF-4 darstellen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt eine Zusammensetzung von MPF-4, die im wesentlichen aus einem Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID Nr: 1 besteht, und eine Zusammensetzung von CPF-4, die im wesentlichen besteht aus einem Protein mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr: 1, das über Disulfide an ein Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr:2 gebunden ist. Die Disulfidbindungen verbinden die zwei Proteinketten von CPF-4 von Cys-20 der SEQ ID Nr: 1 zu Cys-10 der SEQ ID Nr:2 und Cys-36 der SEQ ID Nr:1 zu Cys-12 der SEQ ID Nr:2. Die Erfindung umfäßt auch Verfahren zur Reinigung von MPF-4 und CPF-4, die eine Umkehrphasenchromatographie gefolgt von einer Heparinaffinitätschromatographie gefolgt von einer Umkehrphasenchromatographie umfässen. Zusätzlich wird ein Verfahren zur Hemmung der Angiogenese beansprucht, das gekennzeichnet ist durch die Verabreichung einer hemmenden Menge von MPF-4 oder CPF-4. Schließlich umfaßt diese Erfindung rekombinante DNA Verbindungen, die für MPF-4 und CPF-4 kodieren, wie auch Vektoren und Wirtszellen, die solche rekombinante DNA Verbindungen enthalten.
Die Figur 1 ist eine Konzentrations-Wirkangs-Kurve, die die Hemmung der Endothelzellproliferation durch MPF-4, CPF-4 und PF-4 zeigt.
MPF-4 ist ein natürlich auftretendes Protein, das sich aus 54 Aminosäureresten zusammensetzt und ein Molekulargewicht von etwa 7 Kilodalton aufweist, wie dies durch SDS-PAGE bestimmt wurde. MPF-4 ist zu 100 % homolog mit den 54 C-terminalen Resten von PF-4 und dürfte daher eine prozessierte Form von PF-4 sein. Die Aminosäuresequenz von MPF-4 ist in SEQ ID Nr: 1 gezeigt.
CPF-4 ist ein natürlich auftretendes Protein, das sich aus einer Kette mit 16 Aminosäuren (SEQ ID Nr: 2) und der 54 Aminosäuren langen Kette von MPF-4 (SEQ ID Nr: 1) zusammensetzt. CPF-4 hat ein Molekulargewicht von etwa 7,8 bis 8,0 Kilodalton wie dies durch SDS PAGE bestimmt wurde. Die zwei Proteinketten von CPF-4 sind zwischen Cys-20 von SEQ ID Nr: 1 und Cys-10 von SEQ ID Nr: 2 über ein Disulfid verbunden, wobei eine weitere Disulfidbindung Cys-36 von SEQ ID Nr: 1 mit Cys-12 von SEQ ID Nr:2 verbindet.
Der Fachmann erkennt, daß einige konservative Aminosäureaustausche bei diesen Sequenzen durchgeführt werden können, ohne die Erfindung nachteilig zu beeinflussen. Konservative Aminosäureanstausche sind unter anderem Austausche zwischen Gly und Ala, Asp und Glu, Asn und Gin, Phe und Tyr und Lys und Arg.
Wie das Ausgangsprotein binden sowohl MPF-4 als auch CPF-4 Heparin und hemmen das Endothelzellwachstum, was sie zu attraktiven Kandidaten für die therapeutische Verwendung bei der Behandlung von angiogenen und Zellproliferationserkrankungen macht. Die Heparinbindungsdomäne dürfte sich von Lys-45 bis Lys-50 der SEQ ID Nr: 1 erstrecken.
Mit der hierin angegebenen Sequenzinformation und dem Stand der Technik in der Festphasenproteinsythese können im wesentlichen reines MPF-4 und CPF-4 durch chemische Synthese erhalten werden. Die Prinzipien der chemischen Festphasensynthese von Polypeptiden sind in der Technik gut bekannt und können in allgemeinen Texten des Fachbereichs gefünden werden, wie H. Dugas und C. Penney., Bioorganic Chemistry (1981) Springer Verlag, New York, Seiten 54-92.
Beispielsweise können Peptide oder Proteine, wie MPF-4, durch Festphasenverfahren mittels eines Applied Biosystems 430A Peptidsynthesegeräts (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) und Synthesezyklen, die von Applied Biosystems bereitgestellt werden, synthetisiert werden. BOC- Aminosäuren und andere Reagenzien sind im Handel von Applied Biosystems und anderen chemischen Herstellern erhältlich. Sequentielle BOC-Chemie mittels Doppelkupplungsprotokollen werden auf die p-Methylbenzhydrylaminausgangsharze zur Herstellung der C-terminalen Carboxamide angewendet. Zur Herstellung der C-terminalen Säuren wird das entsprechende PAM Harz verwendet. Asparagin, Glutamin und Arginin werden mittels vorgefertigter Hydroxybenzotriazolester gekuppelt. Die folgenden Seitenkettenschutzgruppen können verwendet werden:
Arg, Tosyl
Asp, Cyclohexyl
Glu, Cyclohexyl
Ser, Benzyl
Thr, Benzyl
Tyr, 4-Bromcarbobenzoxy
Die Abspaltung der BOC-Gruppe kann mit Trifluoressigsäure in Methylenchlorid erreicht werden. Nach der Vervollständigung der Synthese können mit wasserfreiem Fluorwasserstoff (HF), der 10 % meta-Kresol enthält, die Schutzgruppen entfernt und die Peptide vom Harz abgespalten werden. Die Abspaltung der Seitenkettenschutzgruppen und des Peptids vom Harz wird bei Null Grad Celsius oder darunter, vorzugsweise bei -20ºC für dreißig Minuten gefolgt von dreißig Minuten bei 0ºC durchgeführt. Nach der Entfernung des HF wird das Peptid/Harz mit Ether gewaschen und das Peptid wird mit Eisessig extrahiert und lyophilisiert.
Ähnlich liefert der Stand der Technik in der Molekularbiologie dem Fachmann ein weiteres Mittel, durch das im wesentlichen reines MPF-4 und CPF-4 erhalten werden kann. Obwohl beide Moleküle durch Festphasenpeptidsynthese hergestellt werden können, ist eine Isolierung aus verbrauchtem Kulturmedium oder durch rekombinante Verfahren möglich, wobei rekombinante Verfahren bevorgugt werden, falls eine hohe Ausbeute gewünscht wird. Die grundlegenden Schritte bei der rekombinanten Herstellung von entweder MPF-4 oder CPF-4 umfassen:
a) Isolierung einer natürlichen DNA Sequenz, die für MPF-4 kodiert, oder durch die Konstruktion einer synthetischen oder semisynthetischen kodierenden DNA Sequenz,
b) Plazieren der kodierenden Sequenz in einen Expressionsvektor in einer Weise, die zur Expression der Proteine entweder alleine oder als Fusionsproteine geeignet ist,
c) Transformation einer geeigneten eukaryotischen oder prokaryotischen Wirtszelle mit dem Expressionsvektor,
d) Kultivierung der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression von MPF-4 oder CPF-4 erlauben, und
e) Gewinnung und Reinigung der rekombinant hergestellten Proteine und (falls erforderlich) Zurückfalten des Protein in dessen native Konformation.
Wie vorher erwähnt können die kodierenden Sequenzen für die zwei Proteine vollkommen synthetisch sein oder das Ergebnis einer Modifizierung der längeren, für nativen PF-4 kodierenden DNA sein. Eine DNA Sequenz, die für nativen PF-4 kodiert, ist in US-A 5 086 164 beschrieben und kann als Ausgangsmaterial bei der rekombinanten Herstellung von MPF-4 oder von Vorläuferproteinen durch Veränderung der nativen Sequenz zur Erreichung der gewünschten Ergebnisse verwendet werden.
Synthetische Gene, deren in vitro oder in vivo Transkription und Translation zur Bildung von entweder MPF-4 oder CPF-4 führt, können durch Techniken konstruiert werden, die in der Technik gut bekannt sind. Aufgrund der natürlichen Degeneriertheit des genetischen Codes erkennt der Fachmann, daß eine beträchtliche aber definierte Anzahl an DNA Sequenzen konstruiert werden kann, die entweder für MPF-4 oder CPF-4 kodieren.
Die Methodik der Konstruktion von synthetischen Genen ist in der Technik gut bekannt. Siehe Brown et al., (1979) Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Band 68, Seiten 109-151. DNA Sequenzen, die entweder für MPF-4 oder CPF-4 kodieren, können aufgrund der hierin beschriebenen Aminosäuresequenzen und der veröffentlichten PF-4 DNA Sequenz entworfen werden. Einmal entworfen, kann die Sequenz an sich mittels herkömmlicher DNA Synthesegeräte hergestellt werden, wie dem Applied Biosystems Model 380A oder 380B DNA Synthesegeräten (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404).
Um die Expression von entweder MPF-4 oder CPF-4 zu bewirken, inseriert man die hergestellte synthetische DNA Sequenz in einem von vielen geeigneten rekombinanten DNA Expressionsvektoren durch die Verwendung von geeigneten Restriktionsendonukleasen. Siehe allgemein Maniatis et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Band 1-3. Es werden Restriktionsschnittstellen an jedes Ende der für MPF-4 kodierenden DNA angebracht, um die Isolierung von und die Integration in bekannte Amplifizierungs- und Expressionsvektoren zu erleichtern. Die im einzelnen verwendeten Endonukleasen werden durch das Restriktionsmuster des verwendeten Ausgangsexpressionsvektors vorgegeben. Die Wahl der Restriktionsschnittstellen erfolgt so, daß die kodierende Sequenz mit den Kontrollsequenzen richtig orientiert wird, um eine im Leserahmen korrekte Ablesung und Expression des Proteins von Interesse zu erreichen. Die kodierende Sequenz muß so positioniert werden, daß sie im richtigen Leserahmen mit dem Promotor und der Ribosomenbindungsstelle des Expressionsvektors liegt, die beide in der Wirtszelle fünktionsfähig sind, in der das Protein exprimiert werden soll.
Um eine effiziente Transkription des synthetischen Gens zu erreichen, muß das Gen fünktionsfähig mit einer Promotor-Operator Region verbunden sein. Daher muß die Promotor-Operator Region des synthetischen Gens in derselben aufeinanderfolgenden Orientierung in Bezug auf das ATG Startcodon des synthetischen Gens plaziert werden.
Es ist eine Vielzahl an Expressionsvektoren in der Technik gut bekannt, die zur Transformation von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen brauchbar sind. Siehe The Promega Biological Research Products Catalogue (1992) (Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, 53711-5399) und The Stratagene Cloning Systems Catalogue (1992) (Stratagene Corp., 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037). Die US-A 4 710473 beschreibt ebenfalls Plasmidtransformationsvektoren aus zirkulärer DNA, die zur Expression von exogenen Genen in E. coli in hohen Mengen brauchbar sind. Diese Plasmide sind als Transformationsvektoren in rekombinanten DNA Verfähren brauchbar und
(a) verleihen dem Plasmid die Fähigkeit zur autonomen Replikation in einer Wirtzelle,
(b) kontrollieren die autonome Plasmidreplikation in Bezug zur Temperatur, bei der die Wirtszellkulturen gehalten werden,
(c) stabilisieren den Erhalt des Plasmids in den Wirtszellpopulationen,
(d) steuern die Synthese eines Proteinprodukts, das den Plasmiderhalt in einer Wirtszellpopulation anzeigt,
(e) liefern eine Reihe von Restriktionsschnittstellen, die in dem Plasmid nur einmal vorkommen, und
(f) beenden die mRNA Transkription.
Diese zirkulären DNA Plasmide sind als Vektoren in rekombinanten DNA Verfahren zur Sicherstellung von hohen Expressionsspiegeln von exogenen Genen brauchbar.
Nach der Konstruktion eines Expressionsvektors ist der nächste Schritt die Plazierung in eine geeignete Zelle und die Konstruktion einer rekombinanten Wirtszelle hierdurch, die bei der Expression des Gens von Interesse brauchbar ist. Techniken zur Transformation von Zellen mit rekombinanten DNA Vektoren sind in der Technik gut bekannt und können in allgemeinen Literaturen, wie Maniatis et al., siehe obige Literaturstelle gefünden werden. Wirtszellen können entweder aus eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen konstruiert werden. Eukaryotische Wirtszellen sind zur Durchführung von posttranslationalen Glykosylierungen an exprimierten Proteinen fähig und einige sind zur Sekretion des gewünschten Proteins in das Kulturmedium fähig.
Prokaryotische Wirtszellen bilden im allgemeinen das Protein mit größeren Geschwindigkeiten, sind leichter zu kultivieren aber sind nicht zur Glykosylierung des fertigen Proteins fähig. Proteine, die in hohem Maß in bakteriellen Exressionssystemen exprimiert werden, aggregieren charakteristischerweise in Granula oder Einschlußkörperchen, die hohe Mengen des überexprimierten Proteins enthalten. Solche Proteinaggregate müssen typischerweise mittels in der Technik gut bekannten Verfahren aufgelöst, denaturiert und rückgefältet werden. Siehe Kreuger et al., (1990) in Protein Folding, Gierasch und King, Herausgeber, Seiten 136-142, American Association for the Advancement of Science Publication Nr. 89-185, Washington, D.C. und US-A 4 923 967.
MPF-4 und CPF-4 können auch aus dem verbrauchten Kulturmedium von Mitogen-stimulierten PBL Präparationen oder jeder Zellinie, die sie bildet, isoliert werden. Im Fall der humanen PBLS werden die PBLS aus dem Buffy Coat von Vollblut mittels eines von vielen in der Technik bekannten Verfahren isoliert. Ein Beispiel der vielen veröffentlichten Verfahren zur Präparation von humanen PBLs ist Singh et al., Purification and Biochemical Properties of a Human Monocyte Derived Growth Factor, Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 6374-6375, 1985. Nach der Isolierung wird die PBL Präparation sorgfältig in einer ausgeglichenen Salzlösung gewaschen, um das nichtzelluläre Material zu entfernen.
Die PBL Präparation wird dann in ein definiertes, serumfreies Wachstumsmedium geimpft, das ein Mitogen enthält. Dem Fachmann ist eine große Vielzahl an veröffentlichten und im Handel erhältlichen Wachstumsmedien bekannt, die zur Kultivierung von PBL Präparationen geeignet sind. Ähnlich sind viele Mitogene in der Technik bekannt, die zur Stimulierung der PBL Aktivität geeignet sind. Zur Erläuterung und nicht als Beschränkung werden im folgenden zur Erfindung passende Beispiele für Mitogene angeführt: Lipopolysaccharid (LPS), Phytohämagglutinin (PHA), Concanavalin A (Cona), Zymozan und bestimmte Antikörper, die gegen mitogene Determinanten gerichtet sind.
Die PBL Präparation wird dann unter geeigneten Bedingungen für eine gewisse Zeit inkubiert, um die Bildung von MPF-4 und CPF-4 zu erlauben, in Abhängigkeit von der Animpfdichte gewöhnlich ein bis sieben Tage. Das verbrauchte Wachstumsmedium wird dann gesammelt und durch Filtration, Zentrifügation oder anderen Verfahren von den Zellen getrennt.
Unabhängig vom Mittel, das zur Herstellung von MPF-4 oder CPF-4 verwendet wird, ist eine Reinigung erforderlich. Es ist eine große Vielzahl an Proteinreinigungstechniken in der Technik bekannt, von denen viele geeignet sind und die der Fachmann in Anbetracht der neuen hierin gegebenen Beschreibungen leicht erkennt. Ein Basistext, der den Stand der Technik in der Proteinreinigung beschreibt, ist Janson und Ryden, Protein Purification, VCH Publishers Inc., New York 1989.
Es wurde ein besonders brauchbares Reinigungsverfahren erkannt und das besteht aus einem anfanglichen Beladen des verbrauchten Kulturmediums auf eine Umkehrphasensäule. Solche Säulen sind in der Technik gut bekannt und können von verschiedenen Herstellern bezogen werden, einschließlich Pharmacia, Biorad und Amicon. Nach der Wechselwirkung mit der Säule wird das Protein von Interesse mit einem ansteigenden linearen Gradienten eines organischen Lösemittels in Trifluoressigsäure CFFA) eluiert. Das bevorzugte organische Lösemittel ist Acetonitril und die MPF-4 und CPF-4 enthaltenden Fraktionen findet man im 30-50% Acetonitrilteil des Gradienten. Der bevorzugtere Teil des Gradienten ist der 33-39 % Bereich.
Die eluierten Proteine werden dann mit einem Heparinaffinitätsharz zusammengebracht. Der Fachmann erkennt, daß dieser Schritt am besten mit einem Säulenchromatographiemodus durchgeführt wird. Heparinaffinitätssäulen sind im Handel von einigen der oben genannten Hersteller erhältlich. In diesem Schritt binden die Moleküle von Interesse, sowohl MPF-4 als auch CPF-4, an die Heparinsäule und werden mit einem ansteigenden linearen Salzgradienten eluiert. Das bevorzugte Salz ist NaCl und der Teil des Gradienten, der bevorzugt gesammelt wird, ist der 0,1-2,0 M Teil. Der bevorzugtere Teil des zu sammelnden Gradienten ist der 0,7-2,0 M Teil.
Der letzte Schritt ist das Auftragen des 0,7-2,0 M Eluats auf eine zweite Umkehrphasensäule und die Elution mit einem linearen Acetonitrilgradienten in TFA. Der bevorzugte Gradient ist 25-75 % Acetonitril und 27- 67 % sind bevorzugter. Der Säulenausgang wird mit einer Absorption bei 220 nm überwacht. Die Peakproteinfraktionen werden auf eine zelluläre antiproliferative Aktivität (Bioaktivität) getestet. Der früher eluierende Peak mit Bioaktivität ist CPF-4 und der später eluierende bioaktive Peak ist MPF-4.
Die folgenden Beispiele sind als Anleitung im Reinigungsverfahren und zum Verständnis der Erfindung brauchbar. Diese Beispiele dienen nur der Erläuterung und sollen die Erfindung in keiner Weise beschränken.

Beispiel 1

Vereinigte Buffy Coat Zellen, die aus gesundem Spenderblut präpariert wurden, werden von der Interstate Blood Bank bezogen. Es wird mittels einer Histopaque (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178) Gradientenzentrifügation bei 4ºC eine PEL Zellpräparation aus den vereinigten Buffy Coat Zellen isoliert. Die PEL Präparation wird in Hank's ausgeglichener Salzlösung (GIBCO, Grand Island, N.Y.) gewaschen und mit einer Dichte von 3 x 10&sup6; Zellen/ml (Gesamtvolumen 4 l) in serumfreies essentielles Minimalmedium (GIBCO, Grand Island, N.Y.) ausgebracht, das versetzt ist mit 2 mM L-Glutamin, nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,8 mM D-Glucose, 100 E/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin und 20 µg pro ml Lipopolysaccharid (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178). Die PBL Präparation wird für 30 Stunden bei 37ºC in 5 % CO&sub2;, 95 % Luft inkubiert. Das verbrauchte Kulturmedium wird geerntet und die PBLS werden durch Filtration durch ein 0,2 µm Filter entfernt.

Beispiel 2

Vier Liter zellfreies verbrauchtes Kulturmedium werden durch die Zugabe von 0,1 % (VIV) TFA angesäuert und dann direkt auf eine halbpräparative Umkehrphasensäule C4-RP-304 (250 x 21,5 mm) (Biorad, Richmond, CA, 94804) bei einer Flußrate von etwa 15 ml/min aufgetragen. Die Säule wird mit einem linearen Gradienten von 0 bis 50 % Acetonitril in 0,1 % TFA über 40 Minuten und dann für 10 Minuten mit 50 % Acetonitril, 0,1 % TFA eluiert. Die Flußrate beträgt 15 ml/min. Etwa 50 15 ml enthaltende Fraktionen werden gesammelt. Das Elutionsprofil wird bei 220 nm verfolgt und Fraktionen, die mit 33-39 % Acetonitril eluieren, werden gesammelt und vereinigt (C4-Pool).

Beispiel 3

Der C4-Pool wird weiter durch eine Heparinaffinitätschromatographie auf einer Econo-pac 5 ml Heparinsepharosekartusche (Biorad, Richmond, CA 94804) fraktioniert. Die gebundenen Proteine werden mit einem linearen Gradienten von 0 bis 2,0 M NaCl in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei einer Flußrate von 2,0 ml/min eluiert. Die Proteine, die von der Säule eluieren, werden in drei Fraktionen aufgeteilt: (1) nicht-Heparinbindend (Durchfluß), (2) mit einer niedrigen Affinität Heparin-bindend (0 bis 0,7 M NaCl) und (3) mit einer hohen Affinität Heparin-bindend (0,7 M bis 2,0 M NaCl).

Beispiel 4

Die mit hoher Affinität Heparin-bindende Fraktion (3) (0,7 M bis 2,0 M NaCl) wird auf eine Vydac 0,46 x 10 cm C-4 HPLC Säule (The Marshall Co., Worthington, OH 43085) aufgetragen, die vorher mit 27 % Acetonitril, 0,1 % TFA äquilibriert wurde. Die Säule wird mit einem linearen Gradienten von 27 % Acetonitril bis 67 % Acetonitril in 0,1 % TFA über einen Zeitraum von 40 Minuten eluiert. Die Absorption wird bei 220 nm verfolgt und die Peakproteinfraktionen werden manuell gesammelt. Die Peakfraktionen werden dann gemäß Beispiel 5 auf Bioaktivität getestet. Zwei Peaks zeigen die Fähigkeit zur Hemmung der Zellproliferation. Nach einer routinemäßigen Aminosäuresequenzierung wird festgestellt, daß der früher eluierende bioaktive Peak CPF-4 ist und der später eluierende bioaktive Peak MPF-4 ist.

Beispiel 5

Primäre Retinalkapillarendothelzellkulturen werden im wesentlichen gemäß dem in Buzney et al., Retinal Vascular Endothelial Cells and Pericytes: Differential Growth Characteristics in vitro, Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 24: 470-483 (1983) hergestellt und von kontaminierenden Zellen abgetrennt, wie dies in Voyta et al., Identification and Isolation of Endothelial Cells Based on their Increased Uptake of Acetylated-low density Lipoprotein, J. Cell. Biol. 99: 2034-2040 (1981) beschrieben ist.
Alternativ dazu erhält man Rinderherzendothelzellen zur Verwendung im Test (American Type Culture Collection, Rockville MD 20852). Unabhängig von der Quelle werden die Endothelzellen in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefüngen mit einer Zelldichte von 10 000 Zellen/Vertiefung in Dulbecco's modifiziertem Eagle Medium (GIBCO; Grand Island, N.Y.) geimpft, das versetzt ist mit 5 % Rinderserumalbumin, 1 % Penicillin-Streptomycin, 1 % L-Glutamin und 20 ng/ml Fibroblastenwachstumsfaktor. Unmittelbar nach dem Ausbringen der Zellen werden verschiedene Mengen PF-4 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178), MPF-4 oder CPF-4 (isoliert, wie in den obigen Beispielen beschrieben) zu den einzelnen Kulturvertiefüngen gegeben. MPF-4 und CPF-4 werden in Endkonzentrationen getestet, die von 0,001 bis 1 µg/ml reichen. Zum Vergleich wird nativer PF-4 über einen Bereich von 0,001 bis 3 µg/ml getestet und supplementiertes Medium alleine dient als Negativkontrolle. Die Endothelzellkulturen können für vier Tage bei 37ºC und 5 % CO&sub2; in einem befeuchteten Gewebekulturinkubator wachsen. Die Kulturen werden dann einzeln durch Trypsinisierung geerntet und mittels eines Zm-Coulter Counter (Coulter Electronics Inc., Opa Locka FL 33054) gezählt.
Die Ergebnisse sind in Figur 1 aufgezeichnet und jeder Punkt auf der Kurve ist das Mittel aus 4 Datenpunkten, das heißt eine Wachstumsvertiefüng pro Datenpunkt. Die Ergebnissse zeigen, daß PF-4 die Endothelzellproliferation hemmt und einen HK&sub5;&sub0; von etwa 800-1000 ng/ml aufweist (etwa 130 nM). Diese Ergebnisse korrelieren gut mit kürzlichen Untersuchungen, die über die antiproliferative Aktivität von rekombinantem PF-4 veröffentlicht wurden (Science 247: 77-79 (1990)). Die Daten zeigen ebenfalls, daß unter identischen Bedingungen sowohl MPF-4 als auch CPF-4 stärkere Inhibitoren der Endothelzellproliferation sind. MPF-4 zeigt eine HK&sub5;&sub0; von 30-50 ng/ml (etwa 7 nM) und CPF-4 zeigt eine HK&sub5;&sub0; von etwa 150 ng/ml (20 nM). Die Hemmkonzentration für MPF-4 liegt nahe am physiologischen Bereich von PF-4, wie er in humanem Plasma vorkommt (siehe obige Literaturstelle).

SEQUENZLISTE

(1) Allgemeine Information:
(i) Anmelder: Eli Lilly and Company
(B) Straße: Lilly Corporate Center
(C) Stadt: Indianapolis
(D) Staat: Indiana
(E) Land: Vereinigte Staaten von Amerika
(F) Postleitzahl: 46285
(ii) Titel der Erfindung: Modifizierter Blutplättchenfaktor 4
(iii) Anzahl an Sequenzen: 2
(iv) Korrespondenzadresse:
(A) Adressat: C.M. Hudson
(B) Straße: Erl Wood Manor
(C) Stadt: Windlesham
(D) Staat: Surrey
(E) Land: Vereinigtes Königreich
(F) Postleitzahl: GU20 6PH
(v) Computerlesbare Form:
(A) Mediumtyp: Diskette
(B) Computer: Macintosh
(C) Betriebssystem: Macintosh 7.
(D) Software: Microsoft Word
(2) Information für SEQ ID Nr: 1
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 54 Aminosäurereste
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii) Molekultyp: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr: 1
(3) Information für SEQ ID Nr: 2
(i) Sequenzeigenschaften:
(A) Länge: 16 Aminosäurereste
(B) Typ: Aminosäure
(D) Topologie: linear
(ii)Molekültyp: Protein
(xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID Nr:2

Claims

1. Modifizierter Blutplättchenfaktor 4 (MPF 4) mit der Aminosäuresequenz NH&sub2;-Ser-GlN-Val-Arg-Pro-Arg-His- Ile-Thr-Ser-Leu-Glu-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly- Arg-Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-COOH.

2. Gespaltener Blutplättchenfaktor 4 (CPF 4) mit der Aminosäuresequenz NH&sub2;&submin;Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile- Thr-Ser-Leu-Glu-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg- Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-COOH, der über Disulfide an ein zweites Protein mit der Aminosäuresequenz NH&sub2;-Glu-Ala-Glu-Glu-Asp-Gly-Asp-Leu-Gln-Cys- Leu-Cys-Val-Lys-Thr-Thr-COOH gebunden ist, wobei diese Disuffidbindungen Cys-20 von MPF-4 mit Cys-10 dieses zweiten Proteins und Cys-36 MPF-4 mit Cys-12 dieses zweiten Proteins verbinden.

3. Pharmazeutische Formulierung, die als Wirkstoff MPF-4 oder CPF-4 nach einem der Ansprüche 1 und 2 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Hilfsstoffen oder Verdünnungsmitteln hierfür enthält.

4. MPF-4 oder CPF-4 nach einem der Ansprüche 1 und 2 zur Verwendung als Hemmstoff in der Angiogenese.

5. Verfahren zur Herstellung von MPF-4 oder CPF-4 nach einem der Ansprüche 1 und 2, gekennzeichnet durch

a) Bereitstellung eines flüssigen Gemisches, das MPF-4 oder CPF-4 enthält,

b) Auftragen dieses Gemisches auf eine Umkehrphasenreinigungssäule und Sammeln eines ersten Eluats, das mit 30-50 % Acetonitril eluiert,

c) Zusammenbringen des gesammelten Eluats von b) mit einem Heparinaffinitätsharz, so daß MPF-4 oder CPF-4 an das Heparinaffinitätsharz bindet und Entfernen des an MPF-4 oder CPF-4 gebundenen Harzes aus dem gesammelten Eluat,

d) Elution eines zweiten Eluats vom Heparinaffinitätsharz mittels 0,7 M bis 2,0 M NACl,

e) Auftragen des zweiten Eluats von d) auf eine zweite analytische Umkehrphasensäule einer Hockdruckflüssigchromatographie, während der Auslaß bei einer Wellenlänge von 220 nm verfolgt wird und

f) Sammeln von Fraktionen, die MPF-4 oder CPF-4 enthalten, auf der Grundlage von Bioaktivitat und Absorption bei einer Wellenlänge von 220 nm.

6. Verfahren nach Anspruch 5 worin das flüssige Gemisch, das MPF-4 oder CPF-4 enthält, mittels einer rekombinanten DNA Verbindung hergestellt wird, die für MPF-4 oder CPF-4 nach einem der Ansprüche 1 und 2 kodiert.