CZ195193A3

CZ195193A3 - Modified factor-4 of blood platelets, process of its preparation and pharmaceutical preparation in which it is comprised

Info

Publication number: CZ195193A3
Application number: CZ931951A
Authority: CZ
Inventors: Kant Gupta Shalley; Pal Singh Jai
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1992-09-25
Filing date: 1993-09-20
Publication date: 1994-04-13
Also published as: YU61893A; EP0589719B1; AU4757393A; US5935928A; AU665114B2; NO933423L; HU9302687D0; IL107040A0; GR3023356T3; EP0589719A1; DK0589719T3; DE69309827T2; HK100597A; JPH06220091A; BR9303903A; KR940007059A; HUT69928A; CA2106629A1; US5538949A; CN1035257C

Description

Vynález je založen na objevu nové formy faktoru-4 lidských krevních destiček, zpracované v N-terminální oblasti, označované zde jakožto modifikovaný faktor-4 krevních destiček (MPF-4). Vynález se týká proteolyticky štěpené neredukované formy faktoru-4 krevních destiček a tedy štěpeného faktoru-4 krevních destiček (označovaného zde jako CPF-4). Jak modifikovaný faktor-4 krevních destiček (MPF-4) tak štěpený faktor-4 krevních destiček (CPF-4) se mohou izolovat z odpadního kultivačního prostředí lipopol/sacharidem stimulovaných periferálních krevních leukocytů (PBL).

Dosavdni stav techniky

Ze sekvencování aminokyseliny vyplývá, že modifikovaný faktor-4 krevních destiček (MPF-4) je homologem faktoru-4 krevních destiček (PF-4) začínajícím Ser-17, a proto se předpokládá že je štěpným produktem přírodního faktoru-4 krevních destiček (PF-4), Štěpený faktor-4 krevních destiček (CPF-4) má stejnou aminokyselinovou sekvenci jako faktor-4 krevních destiček (PF-4), liší se však tím, žé peptidová vazba mezi zbytkem 16 a 17 chybí.Avšak dva rezultujíci peptidy zůstávají vázány prostřednictvím disulfidických můstků. Je nejvýznamnější, Že sloučeniny podle vynálezu jsou mocnými inhibitory endotheliální buněčné proliferace a každopádně 10 až 100 krát účinnější než nativní faktor-4 krevních destiček (PF-4) v závislosti na zdroji faktoru-4 krevních destiček (PF-4) a na laboratoři, podávající informaciPF-4 je prototypovým členem rostoucího rodu malých navozujících bílkovin, které se uvolňuji z různých typů buněk po stimulaci mitogeny nebo cytokiny. Zjistilo se, že tento rod bílkovin, známých jako intercriny moduluje nejrůznější biologické procesy, například angiogenesy, proliferaci buněk, koagulaci, záněty, obnovu tkáni (Oppenheim a kol., Propertiss of the Novel Proinflammatory Supergene Intercrine Cytokine Family [Vlastnosti no2 vého prozánětlivého supergenu rodu cytokinu intercrine], Ann. Rev. Immunol. 9, str. 617 až 648, 1991; Taylor a kol., Protamine.

is an Inhibitor of Angiogenesis [Prctamin je inhibitorem angiogenese], Nátuře 297, str. 307 až 312, 1982 a Maione a kol.,Inhibition of Angiogenesis by Recombinant Human Plate let Factor-4 and Related Paptides[Inhibice angíogenese rekombinantním lidským £aktorem-4 krevních destiček a příbuznými peptidy], Science .247, str. 77 až 79, 1990).

Jakožto jiné členy rodu. intercrine se uvádějí interleukin-8 (IL-8), růst melanocytu stimulující . .aktivita (hGro/MGSAj, p-thromboglobulin (p-TG), neutrofil aktivační bílkovina (NAP-2), IP-10 a makrofagová zánětlivá bílkovina (MIP-2 (Lindley a kol., Synthesis and Expression in Escherichia coli of the Gene Encoding _ Mono.cyte-derived—Neutrophid-ftctivatThg Factor: Biological Equivalence between Hatural and Recombinant Neutrophi1-activiting Factor [Syntéza a exprese v Escherichia coli genu kódujícího od monocytu odvozený neutrofilaktivační faktor: Biologická ekvivai lence mezi přirozeným a rekombinantním neutrofilaktivačnim faktorem] Proč. nati. Acad. Sci. 85, str. 9199 až 9203, 1988, Walz a kol., A Novel Cleavage Product of B-Thromboglobulin Formed in Cultures of Stimulated Mononuclear Cells Activates Human Reutrophils [Nový štěpný produkt B-thromboglobulinu, vytvořený v kulturách stimulovaných mononukleárnich buněk, aktivuje lidské neutrofily], Biochem. Biophys.Res. Commun., 159, str. 969 až 975, 1989; Luster a kol., Gamma-interferon Transcr íptiona.l ly Regulates an Early Response Gene Containing Homology to Platelet Proteins [Gamm.az.i.ntenfer.on—~tr-a-nsfc-rí-pci-oná‘i’ně“reguTu'je“časnoů. odezvu homologie obsahující gen se zřetelem na bílkovinu krevních destiček]. Nátuře 315, str. 672 až 676, 1985 a Wolpe a kel., Identification and Characterization of Macrophage Inflammatory Protein 2 (Identifikace a charakterizace makrofagové zánětlxvé bílkoviny 2], Proč. nati. Acad., Sci. 86, str. 612 až 616, 1989),

Kompletní primární struktura PF-4 je dokonale známa (Poncz a kol., Cloning and Characterization of Platelet Factor-4 . cDNA Derived from a Human Erythro1eukemic Cell'Line [Klonováni a cha-, '~ra'kt‘e'r'Í’z'acě^-'faktóru-4, krevních destiček c-DNA-“odvozené od řady lidských erythroleůkemických buněk], Blood 69, str. 219 až 223, 1987. Analogy a fragmenty PF-4 jsou rovněž dobře známy a jsou popsány jakožto Oncostatin-A” v americkém patentovém spise číslo 4 645828 a 4 737580. Studie ukázaly, že rod bílkovin íntercrine zahrnuje charakteristický cystein-X-cysteinový (CXC) motiv N-koncové oblasti. CXC motiv se podílí na produkci sekundární a terciární struktury nativního PF-4 prostřednictvím vytvářeni intramolekulárnich disulfídických vazeb se zbytky Cys-36 a Cys-5l (St. Charles a kol., The Threedimensional Structure o£ Bovine Platelet Factor 4 at 3,0-A Resolution [Trojrozměrná struktura faktoru 4 hovězích krevních destiček při 3,0-A rozlišeni], J. Biol. Chem. 264, str. 2092 až 2098, 1989).

Na základě zveřejněné trojrozměrné struktury hovězího pF-4 se zjistilo, že N-koncový zbytek Qln-9 až Val-19 vytvářejí širokou otevřenou smyčku a Thr-16 vodíkové vazby k Cys-51. Ukázalo se, že tyto N-koncové struktury jsou důležité pro imunoregulační činnost PF-4 (Katz a kol .,· Protease-induced Immunoregulátory Activity of Platelet Factor 4 [Proteázou navozená imunoregulační aktivita faktoru 4 krevních destiček], Proč. Nati. Acad. Sci. 83, str. 3491 až 3495, 1986).

Jakkoliv se PF-4 nalézá hlavně v α-granulích destiček, genomové klonování prokázalo výskyt duplikace lidský PF-4 gen produkujících alternativních forem PF-4, jmenovitě PF-4varI a PF-4-alt (Doi a kol., Structure of the Rat Platelet Factor-4 Gene: A markér for Magakaryocyte Differentiation [Struktura krysího genu faktoru 4 krevních destiček: Signální znak pro diferenciaci magakatyocytů], Mol. Cell Biol. 7, str. 898 až 912, 1987). Odvozená aminokyselinová sekvence variantů ukazuje důležité rozdíly v Nko.ncové vedoucí sekvenci a v lysínem bohaté C-koncové oblasti (Green a kol. Identification and Characterization of PF-4varl, a Human Gene Variant of Platelet Factor-4 [Identikace a charakterizace PF4varl, variantu lidského genu faktoru-4 krevních destiček], Mol.Cell. Biol. 9, str. 1445 až 1451, 1989; Eisman a kol., Structural and Functional Comparison of the Genes for Human Piatelet Faccor-4 and PF4alt [Porovnáni struktury a funkce genů pro faktor-4 a PF4alt lídkých krevních destiček], Biood 76, str. 335 až 344, 1990). Změny vedoucí sekvence naznačují rozdíl způsobu jejich eekrece a typu tkáně, ve kterém dochází k expresi. Proto se také mohou produkovat obměněné formy PF-4 jinými buhkami, než jsou krevní destičky.

Je dobře známo, Že se lysínem bohatá C-koncové oblast PF-4 silně váže na heparin a. příbuzné glykosaminglykany (Pucinski a kol., Human Platelet Factor-4 and its C-terminal Peptides: Heparin Binding and Clearance from the Circulation [Faktor-4 lidských krevních destiček a jeho C-koncové peptidy: Vázání na heparin a odstranění z oběhu) Thrombos, Haemostas, 63, str. 493 až 49.8,. . 1990). ..... “

Mutantové formy PF-4 byly popsány se zřetelem na použiti k ošetřováni angiogenických onemocněni (americký patentový spis čí.sJ-0__5_„086164_a-5 11-2946) .-V-těchto~patenťůvýchspísečh~~se uvádí že modifikace PF-^é v C-koncové oblasti vedou-k analogům, které již nejsou chopny vázat heparin.

Vynález se týká MPF-4 a CPF-4, které jsou formami zpracování PF-4.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je modifikovaný faktor-4 krevních destiček MPF-4 mající aminokyselinový sled NHj-Ser-Gln-Val-Arg-ProArg-His-Ile-Thr-Ser-Leu-Glu- Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-ProThr-Ala-Gln-Leu-lle-Ala-Thr- Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-LeuAsp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys- Lys-Leu-Leu-GluSer-COOH. _______________________—^;------Podstatou vynálezu je rovněž modifikovaný faktor-4 krevních' destiček CPF-4 mající aminokyselinový sled NH;-Ser-Gln-Vai-ArgPro-Arg-His-Ile-Thr-Seř-Leu-Glu- Val-lle-Lys-Ala-Gly-Pro-His-CysPro-Thr-^Aia-Gln-Leu-Ile-Ala-Thr- Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-CysLeu-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-I1e- I1e-Lys-Lys-Leu-LeuG1 u^-Ser-COOH, který je disulfidem vázán na druhou bílkovinu mající aminokyselinový sled NH₂-Glu- Ala-G.lu-Glu-Asp-Gly-Asp-Leu-GÍnCys-Leu-Cys-Val-Lys-Thr-Thr-COOH, přičemž disulfidické vazby přemústkujVCys^žp~MPF-4 na Cys-10. druhé bílkoviny a Gys-36 MPF-4' na

Cys-12 druhé bílkoviny.

Podstatou vynálezu je tedy sloučenina MPF-4 sestávající v podstatě z. bílkoviny, mající aminokyselinový sled podle sekvence ID NO: 1 a sloučenina CPF-4 sestávající v podstatě z bílkoviny, mající aminokyselinový sled podle sekvence ID No: 1 disulfidicky vázaný na bílkovinu mající aminokyselinový sled podle sekvence ID No : 2 . Můstek disul fídických vazeb dvou bíIkovinových řetězců CPF4 z Cys-20 Seq ID NO:1 na Cys-10 Seq ID NO: 2. a Cys-36 Seq ID NO: I na Cys-12 Seq ID NO: 2. Podstatou vynálezu je také způsob čištěni MPF-4 a CPF-4 zahrnující reverzní fázovou chromatografi i následovanou heparinovou afinitní chromatografií následovanou reverzní fázovou chromatografií. Vynález se také týká způsobu inhibice angiogeme, při kterém se podává inhibiční množstvi MPF-4 nebo CPF-4 ošetřovanému jedinci. Konečně se vynález týká rekombinantních DNA sloučenin kódujících MPF-4 a CPF-4 jakožto vektorů, a hostujících buněk, které obsahují takové rekombinantní DNA sloučeniny.

Vynález blíže objasňuje připojený obrázek 1, na kterém je diagram vlivu koncentrace MPF-4 a CPF-4 a PF-4 na inhibici proiiferace endotheliálních buněk (na ose x se uvádí koncentrace účinné látky v gg/ml a na oxe y počet buněk (X 10-^).

MPF-4 se zde vždy mini přírodně se vyskytující bílkovina složená z 54 aminokyselinových zbytků o molekulové hmotnosti přibližně 7 kilodaitonů, jak stanoveno 2působem SDS PAGE. MPF-4 je 100% homologický s 54 C-koncovými zbytky PF-4 a je proto pokládán za zpracovanou formu PF-4. Aminokyselinový sled MPF-4 je uveden v SEQ.ID NO:1.

CPF-4 se zde vždy míní přírodně se vyskytující bílkovina složená z řetězce se 16 aminokyselinami (SEQ.ID N0:2) a z 54 aminokyselinového řetězce MPF-4 (SEQ.ID N0:l). CPF-4 má molekulovou hmotnost ' přibližně 7,3 až 8,0 kilodaitonů, jak stanoveno způsobem SDS PAGE. Dva bíikovinové řetězce CPF-4 jsou disulfidicky vázány mezi Cys-20 sekvence SEQ.ID NO:1 a Cys-10 sekvence SEQ,ID· N0:2 jiných disulfidicky spojených můstků Cy3-36 sekvence SEQ.ID NO:i až Cys-12 sekvence SEQ.ID NO:2.

Školenému pracovníkovi v oboru je zřejmé, že se mohou prová6 dět konzervativní aminokyselinové substituce na těchto sekvencích bez nepříznivého ovlivnění podstaty vynálezu. Konzervativní aminokyselinové substituce zahrnují vzájemné záměny mezi Gly a Ala, Asp a Glu, Asn a Gin, Phe a Tyr a Lys a Arg. Podobná jako mateřská bílkovina vážou jak MPF-4 tak CPF-4 heparin a inhibují růst endotheliálních buněk, a proto se jeví jako slibné pro terapeutické použití při ošetřování angiogenických onemocnění a onemocnění s proliferujícími buňkami. Za oblast vázání heparinu se považuje Lys-54 až Lys-5O sekvence SEQ ID.NO.:1.

Informace o daném sledu a známý stav techniky v oboru .syntézy bílkovin v pevné fázi umožňují získat chemickou syntézou v podstatě čistý MPF-4 a CPF-4. Principy chemické syntézy polypeptidů v pevné fázi jsou v oboru dobře známy a jsou popsány v obecné-44-t er at uře— -Přl-k-i-adně— se™uvádí* “~Dúgas~ ~H7*~a * ™Pe nney C7 ’ Bioorganic Chemistry [Bioorganická chemie], 1981, Springer-Verlag, New York, str. 54 až 92.

Například peptidy nebo bílkoviny, například MPF-4, se mohou připravovat způsobem s pevnou fází za použití syntetizeru peptidů Applied Biosystems 43OA (společností Applied: Biosystems, lne., 850 Lincoln Center Drive, Foster City.CA 94404) a syntetickými cykly společnosti Applied Biosystems. Boc aminokyseliny a jiné reakční složky jsou obchodně dostupné jakožto produkty Applied Biosystems společnosti Applied Biosystems, a jiných chemických organizací. Používá se sekvenciální Boc chemie za použiti kopulačních protokolů k nastartování p-methylbenzhydryiových amínopryskyřic pro výrobu C-kóncových karboxamidů. Pro výrobu C-koncových-kysed-i-n—se—po-u-ž-í-vá—od-po-v-í-dají-cí—PAM-pryskyřics“: AspařáginT glutarain a argínin se kopuluji za použiti předformovanych hydroxybenztriazoIových esterů. Může se použít skupin chránících vedlejší řetězec:

Arg, tosyl <

Asp, cyklohexyl ' .

Glu, cyklohexyl

Ser, benzyl

Thr, benzyl

Tyr? '‘4-’bf’pinkařbobenzo.xy ·, m kyseliny trifluorb)

c) ·

d) e 1

Odstraňování ochrany Soc je možné použi octové v methylenchloridu. Po ukončeni synoezy s? zbavovat chránící skupiny a odštěpit od pryskyřice použitím bezvodého fluorovodíku (HF) obsahujícího 10 % meta-krssolu. Odštěpení skupiny nebo skupin chránících vedlejší řetězec a peptidu od pryskyřice se provádí při teplotě O ’C nebo při nižší teplotě, s výhodou při teplotě -20 ’C po dobu 30 minut s následnou prodlevou na teplotě O ’C po dobu 30 minut. Po odstranění fluorovodíku se systém peptid/pryskyřice promyje etherem a peptid se extrahuje ledovou kyselinou octovou a lyofilizuje se.

Podobně známý stav techniky poskytuje . v oboru molekulární

Ί biologie pracovníkům v oboru další možnosti k získání v podstě čistých MPF-4 a CPF-4. Jakkoliv obě molekuly se mohou připravovat syntézou peptidu, izolací z vyčerpaného kultivačního prostředí nebo rekombinantními způsoby, jsou rekombinantní způsoby výhodné při požadavku vysokých výtěžků. Jakožto základní stupně při rekombinantní produkci bud MPF-4 nebo CPF-4 ae uvádějí:

a) izolace přírodní sekvence DNA kódující MPF-4 nebo konstrukce syntetické nebo polosyntetické DNA kódující sekvence, umístění kódující sekvence do expresního vektoru vhodným způsobem pro expresi bílkovin bud samotných nebo konjugovaných, transformace vhodné eukaryotické nebo prokaryotické hostující buňky expresním vektorem, kultivace transformované hostující buňky za podmínek umožňurl jících expresi MPF-4 nebo CPF-4 a izolace a čištěni rekombinantně produkované bílkoviny a (popřípadě) převedení bílkoviny na její nativní konformaci.

Jak shora uvedeno, kódující sekvence pro dvě bílkoviny mohou být plně syntetické nebo mohou být výsledkem modifikace větší nativní PF-4 kódující DNA. DNA sekvence, která kóduje nativní PF-4 je popsána v americkém patentovém spise číslo 5 096164 a může se jí použít jakožto výchozí látky při rekombinantní produkci MPF-4 nebo prokursorových bílkovin obměnou nativní sekvence k dosaženi žádaných výsledků.

Syntetické geny in vitro a in vivo transkripce a translace, jejichž výsledkem je produkce bud MPF-4 nebo CPF-4, se mohou peptidy mohou kcntrúovar, technikami-v oberu o sobě známými. Následkem přirozené degenerace genetického kódu je pracovníkovi v oboru jasné, že se již může konstruovat výrazné množství rozsáhlého avšak konečného počtu DNA sekvencí, které kódují bud MPF-4 nebo CPF-4,

Metodika konstrukce syntetického genu je v o boru dobře známa (Brown a kol., Methcds ín Enzymology [Metody v enzymologii] 1979, Academie Press, N.Y., svazek 60, str. 109 až 151). DNA sekvence, které kódují bud MPF-4 nebo CPF-4 se mohou konstruovat na bázi aminokyselinových sekvenci označovaných jakožto PF-4 DNA sekvence. Jednou konstruovaná sekvence jako taková se může generovat za.' použití běžných zařízeni pro syntézu DNA jako jsou například syntetizery DNA Applied Biosystems Model 3S0A nebo 3Θ0Β (společnosti Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, —Poster—City—CA--94404-)-------—---;--------' *-----------------------~ *

K dosaženi exprese bud MPF-4 nebo CPF-4 se včleňuje konstruovaná syntetická DNA sekvence do kterékoliv ze vhodných rekombinantnlch DNA expresních vektorů za použiti vhodných restrikčnich endonukleás (Maniatis a kol., Molecular Cloning; A Laboratory Manuál [Molekulární klonování; Laboratorní příručka], 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press,, N.Y., svazek 1 až 3. Restrikčni endonukleazová štěpící místa se mohou konstruovat bud na konec MPF-4 kódující DNA k usnadnění izolace a integrace do známé amplifikace a do expresních vektorů. Určité použité endonukleázy jsou dány obrazcem restrikčního endonukleázového štěpeni mateřského používaného expresního vektoru. Volba restrikčnich míst je taková, aby se vhodně orientovala kódující sekvence s řídící sek„y_e.nc.i.~k.„do.sažení—vhodného—Č-tecá*ho—rámee—a“exprese“žádané“bíl’k'oviny. Kódující sekvence musí být umístěna tak, aby byla ve vhodném čtecím rámci s promotorem a s ribosomovým vázacím místem expresního vektoru, přičemž oba tyto.faktory jsou funkční v hostující buňce, ve které má docházet k expresi bílkoviny.

Takže k dosažení účinné transkripce syntetického genu, musí být tento gen operativně spojen s oblastí promotor-operátor. Proto oblast prometer-operátor syntetického genu je ve stejné sekvenciální orientaci se . zřetelem na ATG startovací kodon 'syntytickéKáT'gěnu—

V choru jscu známy nejrůznějsi expresní vektory, vhodné pro transformaci prokaryotických a eukaryotických buněk (The Promeda Biochemícal Research Products Cataloque,- [Katalog produktů biochemického výzkumu Promeda], 1992, Promeda Corp., 2300 Noods Hollow Road, Madison, tfl, 53711 - 5399) a The Stratagene Cloning

Systems Cataloque [Katalog klonovacích systémů společnosti Stratagene], 1992, Stratagene Corp., 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037). Také v americkém patentovém spise číslo 4 710473 jsou popsány kruhové DNA plasmidové transformační vektory vhodné pro expresi exogennich genů v E. coli ve vysoké míře. Tyto plasmidy jsou užitečné jakožto transformační vektory v rekombínantnich DNA procedurách a

a) zvyšují plasmidovou kapacitu pro autonomní replikaci v hostující buňce,

b) řídí autonomní plasmidovou replikaci ve vztahu k teplotě, na které se udržuje buněčná kultura,

c) stabilizuji udrženi plasmidů v populaci hostujících buněk,

ď) v přímé synteze biIkovinových produktů jsou indikativni pro urženi plasmidů v hostující populaci,

e) poskytuji v sériích restríkčnich endonukleáz rekognizačni místa jedinečná pro plasmid a

f) ukončují mRNA transkripci.

Tyto kruhové DNA plasmidy jsou užitečné jakožto vektory v rekombinantnich DNA procesech pro zajišťování vysokých hladin exprese exogennich genů.

Po zkonstruováni expresního vektoru je dalším stupněm umis- . tění vektoru do vhodné buňky a tak kontruovavání rekombinantní hostující buňky užitečné pro expresi žádaného vektoru. Techniky pro transformace buněk rekombinantnimi DNA vektory jsou v oboru dobře známy a obecně jsou popsány například ve shora uvedené publikaci (Maniatis a kol.). Hostující buňky se mohou konstruovat bud z eukaryotických nebo z prokaryotických buněk.

Eukaryotické hostující buňky jsou schopné provádět posttranslacionálni glykosylace bílkovin, získaných expresí, a některé jsou schopné sekrece žádané bílkoviny do kultivačního prostředí.

Prokaryotické hostující buňky produkují¹ obecně bílkovinu ve větších množstvích, snadněji se kultivuji, nejsou však schopny glykosylace konečné bílkoviny* Bílkoviny, které se získají ve velké míře prostřednictvím bakteriálních expresních systémů, se charakteristicky shlukují do granulí nebo do inkluzních útvarů, které obsahují velké množství bílkoviny získané nadexpresí, Takové bilkovinlové shluky se musí solubilisovat, denaturovat a ohýbat o sobě známými způsoby (Kreuger a kol., Protein Folding [Vytváření vláksenkové struktury bílkovin], 1990, Gierasch a King, vyd., str. 136 až 142, Ammerican Association for the Advancement of Science Publícation NO. 89 -18S, Washington, D.C. a americký patentový spis číslo 4 923967).

MPF-4 a CPF-4 se také mohou izolovat z vyčerpaného kultivačního prostředí mitogenem stimulovaných příprav períferálnich krevních leukocytů (PBLX_ne.bo__j.akékoL-í“V—buněčrté“třacly která je produkuje, v případě lidských períferálnich krevních leukocytů (PBL) se PBL izolují z povlaku utvořeného ze sražených leukocytů krve jako celku za použití četných způsobů v oboru dobře známých. Jako příklad jednoho z četných způsobů přípravy lidských periferálních krevních leukocytů (PBL) se uvádí Singh a kol., Purification and Biochemical Properties of a Human Monocyte'Derived Growth Factor [Čištěni a biochemické vlastnosti lidského monocytového odvozeného růstového faktoru], Proč. Nati. Acad. Sci. 85, str. 6374 až 6378, 1985. Izolovaný PBL preparát se důkladně promyje ve vyváženém roztoku soli k odstranění nebuněčného materiálu Preparát PBL se' pak očkuje do definovaného růstového prostředí prostého sera obsahujícího mitogen. Běžnému pracovníkovi v oboru jsou známa nejrůg.něj.š.i_po-psaná--a~0'b'cho5h’ělÍ05tupňá “TůšVová~~prcstředí vhodná pro kultivaci PBL preparátů. Podobně je v oboru o sobě znám počet mitogenů schopných stimulovat PBL aktivitu. Pro objasnění, nikoliv však jako jakékoliv omezení se uvádějí následující příklady mitogenů, vhodných pro způsob podle νγ~. nálezu: Lipopc1ysacharid (LPS), phytohemoaggiutinín (PHA), Concsnavalin A (ConA), zymozan a určité protilátky zaměřené na mitogenní determinanty.·

Preparát PBL se pak kultivuje za vhodných podmínek po dobu umožňující_v:y_ty.o.ř.e-ní— --M-PF— 4~a^—CPF~4 zpravidla, po dobu několika dni v závislosti na počáteční nacčkcvaci hustotě. Vyčerpané růstové prostředí se pak shromáždí a oddělí od buněk bud filtrací nebo odstředěním nebo jinými způsoby.

Eez zřetele na prostředky pro produkci MPF-4 nebo CPF-4 je zapotřebí čištění. V oboru jsou známy velmi četné způsoby čištění bílkovin, z nichž jsou mnohé vhodné a snadno proveditelné pro pracovníky v oboru. Jakožto základní publikace popisující známý stav techniky se zřetelem na čištění bílkovin se uvádí Janson a Ryden, Protein Purification [Čištění bílkoviny], VCH Publishers lne., New York, 1989.

Podle obzvláště výhodného způsobu čištění se vyčerpaná kultivační prostředí zavádí na reverzní fázový čisticí sloupec. Takové sloupce jsou. v oboru velmi dobře známy a jsou obchodně dostupné u četných společností, například Pharmacia, BioRad a Amicon. Za vzájemného působení se sloupcem se žádaná bílkovina eluuje za použiti vzrůstajícího lineárního gradientu organického rozpouštědla v trifluoroctové kyselině (TFA). Jakožto výhodné organické rozpouštědlo pro tento účel se uvádí acetonitril a frakce, obsahující MPF-4 a CPF-4, jsou v 30 až 50% acetonitrilovém podílu gradientu. Nejvýhodnějším podílem gradientu je oblast 33 až 39 %.

Eluované bílkoviny se pak uvádějí do styku s heparinovou afinitní pryskyřici. Normální pracovník v oboru může nejlépe tuto operaci provádět způsobem sloupcové chromatografie. Heparinové afinitní sloupce jsou obchodně dostupné například u shora uvedených společností. Při tomto stupni se žádané molekuly jak MPF-4 tak CPF-4 váží na heprainový sloupec a eluují se vzrůstajícím lineárním gradientem soli. Výhodnou soli je chlorid sodný a podíl gradientu, který se především shromažďuje, je 0,1 až 2,0M. Ještě výhodnějším podílem gradientu pro shromažďování je podíl 0,7 až

2, OK.

Konečný stupeň, se provádí vedením 0,7 až 2,0M eluátu na druhý reverzní fázový sloupec a eluováním lineárním gradientem acetonitrilu v trifluoroctové kyselině. Výhodným je gradient 25 až 75 % acetonitrilu a nejvýhodnějším je gradient 27 až 57 % acetonitrilu. Výstup z kolony se monitoruje pro absorbanci při 220 nm.

Pikové bílkovincvé frakce se zkoušejí, na buněčnou antíproliferativní účinnost (na bioaktivitu). Časnější eluční pík vykazující bíoatívitu patří CPF-4 a pozdější eluční pík vykazující bioativitu patři MPF-4.

Nsledujíci praktické příklady objasňují způsob čistění a blíže objasňují vynález. Nejsou však míněny jako jakékoliv omezení vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Přiklad 1

Spojené povlaky utvořené ze sražených leukocytů, připravené __ze zdravé clonorové krve,, se zi3kajt..-.v...me.zinár.odni .krevni -bance--·-----— (Interstate Blood Bank). PBL buněčný preparát se izoluje ze spojených povlaků utvořených ze sražených leukocytů za použití graj dientového odstředění histopaque™ (Sigma Chemical Co., St.

Louis, MO 63178) při teplotě 4 °C. PEL preparát še promyje Bankovým vyváženým solným roztokem (GIBCO, Grand Island, N.Y.) a nanáší se za hustoty 3 x 10^b buněk/ral (celkový objem 4 litry) do sera prostého, minimálně esenciálního prostředí (GIBCO, Grand Island,

N.Y.), doplněného 2mM L-glutaminem, neesenciálními mastnými kyselinami, 0,8 mM D-glukosou, 100 J/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu a 20 μ/ml lipopolysacharidu (Sigma Chemical Co., St.

Louis, MO 63178). PBL preparát se inkubuje po dobu 30 hodin pří teplotě 37 ^JC v 5 % oxidu uhličitého a 95 % vzduchu. Vyčerpané kultivační prostředí~ se shromažďuje a PBL,.se...odstraní—~f.i-ltr-.aci------------přes O,2 pm fi 1tr.

Příklad 2

Čtyři litry vyčerpaného .kultivačního prostředí se okyselí přidáním O,1¾ (objem/objem) vnáší na semipreparativní x 21,5 mm) sloupec (BioEad, — --------, _ 1-i-ž-ně—l-S-ml-Z-mi-h-r - —-Sd-o-upeč-se' kyseliny tri f luoroctové' a přímo sé reverzní fázový C4-RF-304^?* (250

Sichmond.. CA 94804) rychlosti přibeŤuu'j*e~Tinéárnim gradientem O až 50 % acetonitrilu v 0,1¾ kyselině trifluoroctové po dobu 40 minut a pak po dobu 10 minut při 50 % acetonitrilu, 0,1 % trif1uoroctová kyseliny. Průtoková rychlost je 15 ml/min. Shromáždí se přibližně 50 15 ml frakcí. Eluční profii se monitoruje při 220 nm a frakce, které se eluují s 33 až 39 % acetonitrilu, se shromáždí a spojí (C4-pooI).

Přiklad 3

Dále se frakcionuje C-4 pool heparinovou afinitní chromatografií na Écono-pac™ 5 ml heparin/sepharosovou patronou (BioRad, f

Řichmond, CA 94804). Vázané bílkoviny se eluují lineárním gradientem O až 2,0M NaCl ve fosfátové pufrové solance (PBS) za průtokové rychlosti 2,0 ml/min. Bílkoviny, které se eluují ze sloupce, se spojí do tří frakcí: (1) nevázané heparinem (průtok), (2) nízko afinitní heparinové vázání (O až 0,711 NaCl) a (3) vysoce afinitní heparinové vázání (0,7 až 2,0M NaCl) frakce.

Příklad 4

Frakce (3) s vysoce afínítnim heparinovým vázánírri (0,7 až 2;0M NaCl) se nanesou na Vydac™ 0,46 x 10 cm C-4 HPLC sloupec (The Marshall Co,, Worthington, OH 43085) předem vyvážený 27 % acetonitrilu, 0,1 % kyseliny trifiuoroctové·. Sloupec se eluuje lineárním gradientem 27 % acetonitrilu až 67 %. acetonitrilu v 0,1% kyselině trifiuoroctové po dobu 40 minut. Monitoruje se absorbance při 1220 nm a píkové bílkovinové frakce se ručně shromažďují. Fíkové frakce se pak zkoušejí se zřetelem na bioaktivitu způsobem podle příkladu 5. Dva píky dokládají schopnost inhibovat proiiferacl buněk. Po rutinním aminokyselinovém sekvencování se dříve eluující, bioaktivní pik identifikuje jakožto CPF-4 a později eiuujicí bioaktivní pik jako MPF-4.

Přiklad 5

Primární sítnicové kapilární endotheliální buněčné kultury se připraví v podstatě způsobem, který popsal Buznev a kol., Retinai Vascuiar endotheiial Cells and Pericytes: Differential Growth Characteristic in vitro- [Sítnicové vaskulárni endotheliáiní buňky a perícyty: Diferenciální růstvé charakteristiky in vitro ] Invest. Ophthalmol, Visual Sci. 24, str. 470 až 483, 1983), a oddělí se od kontaminujících buněk způsobem, který popsal Voyta a kol., Identification and isolation of Endotheiial Cells Based on their Increased Uptake of Acetylatsd-low density Lípoprotein, [Identifikace a izolace endotheliálních buněk na bázi jejich zvýšeného přijímání acetylovaného lipoproteinu o nízké hustotě] J. Cell Biol.-99, str. 2034 až 2040, 1981).- - - ----- ----- ----Nebo se pro zkoušku získají endotheliální buňky hovězího srdce (American Type Culture Collection; Rockville MD 20852). Bez zř_e±je_l js__na~.zdroj se endotheliálni buňky naočkují do 24 dálkových tkáňových kultivačních destiček za hustoty buněk 10000 buněk/důlek v kultivačního módífíkovaného prostředí Dulbecco's modified Eagle Medium (GIBCO; Grand Island, N.Y.) doplněného 5 % hovězího sérového albuminu, 1 % systému pěnici i lin-strptomycin, 1 % L-gl.utaminu a 20 ng/ml fibroblastového růstového faktoru. Bezprostředně po naočkování buněk se do jednotlivých růstových důlků přidají různá množství PF-4 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178), MPF-4 nebo CPF-4 (izolovaných jak popsáno v předšlých příkladech). MPF-4 a CPF-4 se zkoušejí při konečných koncentracích 0,001 až 1 pg/ml. Pro srovnání se zkouši nativní PF-4 v koncentracích 0,001 až .3 pg/ml a doplněné prostředí samotné jakožto negativní kontrola. Endotheliální buněčné kultury se nechávají růst pc dobu 4 dnů při ,teplotě 37 °C, při 5 % oxidu uhličitého ve vlhkém tkáňovém kultivačním inkubátoru. Kultury se pak jednotlivě sklidí trypšinizací a počítají za použití čítaciho zařízení Zra-Couiter Counter (Coulter Electronics. Ind., Opa Locka FL 33 054).

Výsledk jsou uvedeny na obr. 1, přičemž každý bod grafu je střed čtyř údajů. To znamená jeden růstový důlek na jeden bod.. Výsledky dokládají, že'PF-4 inhibovaná endotheliální 'buněčná proliferace má IC·.·,;,· přibližně 300 až 1000 ng/ml (přibližně 130 nří) . Tyto výsledky uvádějí do vztahu důlek s nejnovějsími studiemi -publ-kko'van-ými---o--antúprQ-i-i-£-a-r-a-t-i-v-ná----aktí-v.i.tě—Γ^.Κ.ο.Γη^ύ.ηα.η±.η,.ίλ.ο._Ρ?--4„ (Science 247, ser. 77 až 79, 1990;. Kc/incoy taká dokládáji, že za stejných, podmínek jak MPF-4 tak CPF-4 jsou mocnějšími inhibitory endo tehei i ál ní buněčné pro i. i fsrace . HPF-4 ukazuje IO.,-. 30 až 50 ng/mi (přibližně 7 nm.) a CPF-4 IC;.;· přibližná ISO ng/mi (20 nm). Inhibíční koncentrace MFF-4 je těsná k fyziologická oblastí PF-4 zjištěné v lidské plasmě (Id.).

Sekvenční seznam

Informace pro SEQ ID NO:1:

(i) ' Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 54 aminokyselinových zbytků (B) typ: aminokyselina (C) topologie: lineární (ii) Typ molekuly: bílkovina (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1:

Ser Gin Val Arg Pro Arg HÍ3	Ile
1				5
Gly	Pro	His	Cys	Pro	Thr	Al a	Gin
			20
Arg	Lys	Ile	Cys	Leu	Asp	Leu	Gin
		35					40
Lys	Lys	Leu	Leu	Glu	Se r

Thr Ser	Leu	Glu	Val	Ile	Lys 15	Ala
	10
Leu	Ile	Ala	Thr	Leu	Lys	Asn	Gly
25					30
Al a	Pro	Leu	Tyr	Lys	Lys	Ile	Ile

Informace pro SEQ ID NO:2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) délka: 15 aminokyselinových zbytků (B) typ: aminokyselina (ii) (xi)

Olu (C) topologie: Lineární Typ molekuly: bílkovina Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:'

Gin Cys Leu 10 lys Val •73 Tb r Th r

Průmyslová využitelnost

Dvě nové modifikované formy faktoru-4 lidských krevních destiček označované jako MPF-4 a CPF-4 se izoluji ze sera prostého kultivačního prostředí 1 ipopo 1 '/sacharid stimulujících periferálních krevních leukocytú. Obě modifikované formy jsou mocnými inhibitory endotheliálni buněčné prolifsrace, přibližně 10 až 100 krát mocnější než nativní nebo rekombinntní faktor-4 krevních destiček a jsou proto vhodné pro ošetřování angiogenických onemocněni .

Claims

X. Modifikovaný faktor-4 krevních destiček MPF-4 mající aminokyse1 lnový sled NH
2-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-11e-Thr-Ser-LeuGlu- Va i - Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-Leu-1le-AlaThr- Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-tle-Cys-Leu-Asp-Leu-GIn-Ala-Pro-LeuTyr-Lys-Lys-Ile-I1e-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-COOH2. Štěpený faktor-4 krevních destiček CPE-4 mající aminokyselinový sled NHa-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr-Ser-LeuGlu- Va1-1le-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-Leu-Ile-AlaThr- Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-LeuTyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-COOH, který je disulfidem vázán na druhou bílkovinu mající aminokyselinový sled NH2Glu- Ala-Glu-Glu-Asp-Gly-Asp-Leu-Gln-Cys-Leu-Cys-Val-Lys-Thr-ThrCOOH, přičemž disulfidické vazby přemflstkují Cys-20 MPF-4 na Cys-10 druhé bílkoviny a Cys-36 MPE-4 na Cys-12 druhé bílkoviny

3. Farmaceutický prostředek použitelný jakožto inhibiční činidlo angiogenese, vyznačující se tím, že obsahuje jakožto účinnou látku MPF-4 nebo CPF-4 podle nároku 1 nebo 2 spolu s jedním nebo s několika farmaceuticky vhodnými nosiči, excipienty nebo ředidly.

4. Způsob přípravy MPF-4 nebo CPF-4 podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že

a) se připravuje kapalná směs obsahující MPF-4 nebo CPF-4,

b) tato směs se vnáší na reverzní fázovou čisticí kolonu a shromažďuje se první eluát, který se eluuje s 30 až 50 % acetonitrilu,

c) uvádí se do styku shromážděný eluát podle odstavce Cb) s heparinovou afinitní pryskyřicí, takže se MPF-4 nebo CPF-4 váze na heparlnovou afinitní pryskyřici a odstraňuje se tato pryskyřice, vázaná na MPF-4 nebo CPF-4 ze shromážděného eluátu,

... d> eluuje se druhý eluát z heparinové afinitní pryskyřice za po- 13 užití 0,7M až 2.OH NaCl,

θ) , druhý eluát podle odstavce Cd) se vede na druhý reverzní fázový analytický vysokotlakový kapalinový chromatografický sloupec za monitorování výstupu při 220 nm vlnové délce a

f) shromažďují se frakce, které obsahují MPF-4 nebo CPF-4 na bázi biqaktivity a absorbance při vlnové délce 220 nm

5- Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že se připravuje kapalná směs obsahující MPF-4 a CPF-4 za použití rekombinantní DNA sloučeniny, která kóduje MPF-4 nebo CPF-4 podle nároku 1 á 2.

6- Rekombinantní DNA sloučenina podle nároku 57- Rekombinantní DNA vektor tvořený DNA sioučeniou podle nároku &, přičemž je vektor schopný navodit expresi DNA sloučeniny podle nároku 6 při transformování do vhodné hostitelské buňky
3.

Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle nároku 7.