HUT69928A

HUT69928A - Modified platelet factor-4

Info

Publication number: HUT69928A
Application number: HU9302687A
Authority: HU
Inventors: Jai Pal Singh; Shalley Kant Gupta
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1992-09-25
Filing date: 1993-09-23
Publication date: 1995-09-28
Also published as: ES2101237T3; CA2106629A1; MX9305901A; DK0589719T3; FI934183A0; ATE151777T1; DE69309827D1; YU61893A; US5512550A; ZA936925B; NZ248724A; AU665114B2; CZ195193A3; HK100597A; GR3023356T3; JPH06220091A; EP0589719A1; NO933423L; FI934183A; CN1088216A

Description

A találmány tárgyát a humán 4-es vérlemezke faktor egy új, módosított N-terminális régióval rendelkező alakja képezi, melyet a továbbiakban módosított 4-es vérlemezke faktornak (MPF-4-nek) nevezünk. A találmány kiterjed a 4-es vérlemezke faktor egy proteolitikusan hasított, nem redukált alakjára, melyet a továbbiakban hasított 4-es vérlemezke faktornak (CPF-4-nek) nevezünk. Mind az MPF-4, mind a CPF-4 izolálható lipopoliszacharidával stimulált, perifériás vérből származó fehérvérsejtek (PBLs) tápfolyadék felülúszójából.

Aminosav szekvencia vizsgálattal igazolódott, hogy az MPF-4 homológiát mutat a Ser-17-el kezdődő 4-es vérlemezke faktorral (PF-4), így az a PF-4 természetben előforduló hasított alakjának tekinthető. A CPF-4 azonos aminosav szekvenciával rendelkezik mint a PF-4, azzal a különbséggel, hogy abban a 16. és 17. aminosavak közötti peptid kötés hiányzik. Az így kapott két peptid azonban diszulfid hidakon keresztül összeköttetésben marad. A találmány szempontjából legfontosabb megállapítás az, hogy a találmány szerinti vegyületek hatásosan gátolják az endothel eredetű sejtek proliferációját és a PF-4 származása, valamint a közlő laboratóriumtól függően 10-100-szór aktívabbak, mint a natív PF-4.

A PF-4 egy olyan kis méretű, indukálható proteinekből álló egyre szaporodó fehérjecsalád prototípusát képezi, amelyeket mitogénekkel, vagy cytokinekkel való stimulációt követően különböző sejt-típusok bocsátanak ki. Ez az intercrin elnevezésű proteinekből álló család különböző biológiai folyamatok szabá···· ····

- 3 lyozásában vesz részt, például érképződés, sejt-proliferáció, alvadás, gyulladás, és szövet helyreállítás. [Lásd, Oppenheim és munkatársai, Properties of the Növel Proinflammatory Supergene Intercrine Cytokine Family, Ann. Rév. Immunoi., 9, 617-648, (1991); Taylor és munkatársai, Protamine is an Inhibitor of Angiogenesis, Natúré, 297, 307-312, (1982); valamint Maione és munkatársai, Inhibition of Angiogenesis by Recombinant Humán Piatelet Factor-4 and Related Peptides, Science, 247, 77-79, (1990)] .

Az intercrine család további tagjai az interleukin-8 (IL-8), a melanocyta növekedés serkentő aktivitás faktor (hGro/MGSA), a béta-thromboglobulin (béta-TG), a neutroíil aktiváló protein (NAP-2), az IP-10, és a makrofág gyulladásos protein (MIP-2). [Lásd, Lindley és munkatársai, Synthesis and Expression in Escherichia coli of the Gene Encoding Monocyte-derived NeutrophilActivating Factor: Biological Equivalence between Natural and Recombinant Neutrophil-Activating Factor, Proc. Natl. Acad. Sci.,85, 9199-9203, (1988); Walz és munkatársai, A Növel Cleavage

Product of Beta-Thromboglobulin Formed in Cultures of Stimulated Mononuclear Cells Activates Humán Neutrophils, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 159, 969-975, (1989); Luster és munkatársai,

Gamma-interferon Transcriptionally Regulates an Early Response Gene Containing Homlogy to Piatelet Proteins, Natúré, 315, 672676, (1985); valamint Wolpe és munkatársai, Identification and

Characterization of Macrophage Inflammatory Protein 2, Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 612-616, (1989)].

A PF-4 teljes elsődleges szerkezete jól ismert a gyakorlatban [Poncz és munkatársai, Cloning and Characterization of Piatelet • 4 •44» ···· * - - * 4 · 44 • 4 ·· ······· 4·

- 4 Factor-4 cDNA Derived from a Humán Erythroleukemic Cell Line, Blood, 69, 219-223, (1987)]. A PF-4 megfelelői, valamint fragmensei szintén jól ismertek, és azokat a 4,645,828 sz., valamint a 4,737,580 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokban Oncostatin-A néven nevezik. Kimutatták, hogy az intercrine protein család tagjai az N-terminális régióban jellemzően cisztein-X-cisztein (CXC) aminosavkombinációt tartalmaznak. A CXC motívum a molekulán belül a Cys-36, valamint a Cys-51 maradékok között diszulfid kötések képzése révén részt vesz a natív PF-4 másodlagos és harmadlagos szerkezetének kialakításában. [St.

Charles és munkatársai, The Three-dimensional Structure of Bovine Platelete Factor 4 at 3,0-A Resolution, J. Bioi. Chem., 264, 2092-2098, (1989)].

A borjú PF-4 közölt három dimenziós szerkezete alapján megállapították továbbá, hogy a Gln-9-től a Val-19-ig terjedő Nterminális maradékok egy nagy nyitott hurkot képeznek, és a Thr16 hidrogén kötéssel kapcsolódik a Cys-51 -hez. Ezekről az Nterminális struktúrákról kimutatták, hogy fontos szerepet játszanak a PF-4 immunválaszt szabályozó aktivitásának kialakításában [Katz és munkatársai, Protease-induced Immunregulatory Activity of Piatelet Factor 4, Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 3491-3495, (1986)] .

A PF-4 ugyan elsősorban a vérlemezkék alfa-granulumaiban található, genomiális klónozással bebizonyították hogy a humán PF-4 gén megkettőződése révén a PF-4 alternatív formái, nevezetesen a PF-4varI és a Pf-4alt keletkeznek [Dói és munkatársai, Structure of the Rat Piatelet Factor 4 Gene: A Marker fór Megakaryocyte Differentiation, Mól. Cell. Bioi., 7, 898-912, (1987)]. A ···· ·♦··

változatok következtetett aminosav szekvenciája az N-terminális vezető szekvencián és a lizinben gazdag C-terminális doménen belül lényeges eltéréseket mutat [Gree, és munkatársai, Identification and Characterization of PF4varl, a Humán Gene Variant of Piatelet Factor 4, Mól. Cell. Bioi., 9, 1445-1451, (1989); Eisman és munkatársai, Structural and Functional Comparison of the Genes fór Humán Piatelet Factor 4 and PF4alt, Blood, 76, 336-344, (1990)]. A vezető szekvencián belül található eltérések a módosult alak kiválasztódásának eltérő módja, valamint az azt expresszáló szövet típusának különbözőségére utalnak. A PF-4 alternatív formái tehát a vérlemezkéken kívül egyéb sejtekben is termelődhetnek.

Az a tény is jól ismert, hogy a PF-4 lizinben gazdag Cterminális régiója erősen kötődik heparinhoz és az azzal rokon glükózaminoglikánokhoz [Rucinski és munkatársai, Humán Platelet Factor 4 and its C-terminal Peptides: Heparin Binding and Clearance from the Circulation, Thrombos. Haemostas., 63, 493-498, (1990) ] .

Közzétettek PF-4 mutáns formáit, valamint eljárásokat a mutánsok érbetegségek kezelésére szolgáló alkalmazására. (Lásd az itt hivatkozásként szereplő 5,086,164 sz., valamint 5,112,946 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat). Ezek a szabadalmi leírások a C-terminális régióban végrehajtott olyan módosításokat ismertetnek, amelyek heparin kötő kapacitással többé nem rendelkező analóg formákat eredményeznek. A jelen találmány tárgyát a PF-4 módosított formáit képviselő MPF-4, valamint CPF-4 képezi.

A találmány kiterjed az MPF-4 kompozíciójára, amely alapve-

tőén az 1. szekvencia szerinti aminosav szekvenciával rendelkező proteint tartalmaz, valamint a CPF-4 egy kompozíciójára, amely alapvetően az 1. szekvencia szerinti aminosav szekvenciával rendelkező proteint tartalmaz diszulfid kötéssel a 2. szekvencia szerinti aminosav szekvenciával rendelkező proteinhez kötve. A diszulfid kötések hidat képeznek a CPF-4 két protein lánca között az 1. szekvencia szerinti Cys-20-tól a 2. szekvencia szerinti Cys-10-ig, valamint az 1. szekvencia szerinti Cys-36-tól a 2. szekvencia szerinti Cys-12-ig. A találmány ugyancsak kiterjed az MPF-4 és a CPF-4 tisztítására szolgáló eljárásokra, mely eljárások magukba foglalnak reverz fázisú kromatográfiát, amelyet heparin affinitás-kromatográfia, majd újból reverz fázisú kromatográf ia követ. A találmány további tárgyát képezi egy érképződést gátló eljárás, mely eljárás tartalmazza az MPF-4, vagy a CPF-4 gátló mennyiségének adagolását. Végül a találmány kiterjed MPF-4-et, valamint CPF-4-et kódoló rekombináns DNS vegyületekre, valamint ezeket a rekombináns DNS vegyületeket tartalmazó vektorokra és gazdasejtekre.

Az 1. ábrán látható grafikon az MPF-4, CPF-4, valamint PF-4 endotheliális sejt proliferációt gátló hatását mutatja be azok koncentrációjának függvényében.

Az MPF-4 egy természetben előforduló protein, amely 54 aminosav maradékból áll, és SDS PAGE-vel meghatározott molekulatömege 7 kilodalton. Az MPF-4 100 %-ban megegyezik a PF-4 54 C-terminális maradékával, és feltételezhetően a PF-4 módosult formáját képviseli. Az MPF-4 aminosav szekvenciáját az 1. szekvencia mutatja.

A CPF-4 egy természetben előforduló protein, amelyet egy 16 ··«· ·♦·« • · · · • · · · ·««···· · ·

- 7 aminosavból álló lánc (2. szekvencia), valamint az MPF-4 54 aminosavából álló lánc (1. szekvencia) épít fel. A CPF-4 SDS PAGE-vel meghatározott molekulatömege körülbelül 7,8-8,0 kilodalton. A CPF-4 két protein láncát diszulfid hidak kötik össze az 1. szekvencia szerinti Cys-20 és a 2. szekvencia szerinti Cys-10 között, valamint az 1. szekvencia szerinti Cys-36, és a 2. szekvencia szerinti Cys-12 között.

A gyakorlatban járatos személy számára érthető, hogy ezen szekvenciákon belül néhány konzervatív aminosav helyettesítés végrehajtható anélkül, hogy az a találmány szerinti megoldást hátrányosan befolyásolná. Konzervatív aminosav helyettesítések magukba foglalnak Gly-Ala, Asp-Glu, Asn-Gln, Phe-Tyr, és Lys-Arg cseréket.

Az eredeti proteinhez hasonlóan mind az MPF-4, mind a CPF-4 kötődik heparinhoz, és gátolja az endothel sejt szaporodást, mely tulajdonságok előnyösen alkalmazhatók érképződéssel és sejtszaporodással járó betegségek kezelésében. A heparin kötő dómén feltehetően az 1. szekvencia szerinti Lys-45 -tői Lys-50-ig terjedő szakasz.

A találmány szerinti szekvencia ismeretében, valamint a szilárd fázisú protein szintézisről rendelkezésre álló jelenlegi tudásunk alapján kémiai szintézissel alapvetően tiszta MPF-4 és CPF-4 állítható elő. A szilárd fázisú kémiai polipeptid szintézis elve jól ismert a gyakorlatban, és megtalálható a szakterülettel foglalkozó kézikönyvekben [például: Dugas H. és Penney C., Bioorganic Chemistry, Springer-Verlag, New-York, 54-92, (1981)].

Az MPF-4-hez hasonló peptidek, vagy proteinek szilárd fázisú eljárással szintetizálhatok például egy Applied Biosystems 430A peptid szintetizáló készülék (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) és az Applied Biosystems által ajánlott szintézis ciklusok alkalmazásával. Boc aminosavak és egyéb reagensek a kereskedelemben hozzáférhetőek az Applied Biosystems, vagy más vegyszer forgalmazóktól. A Cterminális karboxiamidok előállítása céljából a kezdő p-metilbenzhidril-amin szilárd fázisú hordozóhoz dupla kapcsolási eljárás segítségével szekvenciális Boc vegyi eljárást alkalmaztunk. A C-terminális savak előállítására a megfelelő PAM szilárd fázisú hordozót használtuk. Az Aszparagint, a Glutamint és az Arginint előre gyártott hidroxi-benzotriazol észterek felhasználásával kapcsoltuk a lánchoz. A következő oldallánc-védő csoportok alkalmazhatók:

Arg, Tozil

Asp, ciklohexil

Glu, ciklohexil

Ser, Benzil

Thr, Benzil

Tyr, 4-bromo karbobenzoxi

A Boc védelem megszüntetését metilén-kloridban oldott trifluoroecetsawal végezhetjük. A szintézis befejezését követően a peptidek védelme megszüntethető és a szilárd fázisú hordozóról 10 % metakrezolt tartalmazó vízmentes hidrogén-fluoriddal (HF) lehasíthatók. Az oldalláncokat védő csoport(ok)nak és a pepiidnek a szilárd fázisú hordozóról való lehasítását harminc percig 0 oC-on, vagy az alatt, előnyösen -20 oC-on, ezt követően harminc percig 0 oC-on végeztük. A HF eltávolítását követően a peptid/szilárd fázisú hordozót éterrel mostuk, a peptidet jégé«4 ·· · · ·4·4 • · 4 í ♦♦ • · · · • 4 44 ••»*••4 ·· _ g _ cettel extraháltuk és liofilizáltuk.

Hasolóképpen, a molekuláris biológia jelenlegi ismeretei a gyakorlatban járatos személy számára egyéb eszközökkel is szolgálnak, melyek segítségével alapvetően tiszta MPF-4, és CPF-4 állítható elő. Bár mindkét molekulát előállíthatjuk szilárd fázisú peptid szintézissel, sejttenyészetek felülúszójából való izolálással, vagy rekombináns módszerekkel, nagy mennyiség előállítása céljára a rekombináns eljárások előnyösek. Az MPF-4, vagy a CPF-4 rekombináns eljárás szerinti végzett előállítása a következő alap lépéseket tartalmazza:

a) az MPF-4-et kódoló természetes DNS szekvencia izolálását, vagy egy szintetikus, vagy félszintetikus DNS kódoló szekvencia előállítását,

b) a kódoló szekvenciának egy expressziós vektorba való beépítését oly módon, hogy az vagy egyedül, vagy fúziós proteinként alkalmas legyen proteinek expresszálására,

c) egy megfelelő eukarióta, vagy prokarióta gazdasejt transzformálását az expressziós vektorral,

d) a transzformált gazdasejt tenyésztését az MPF-4, vagy a CPF-4 expresszióját lehetővé tevő feltételek mellett, és

e) a rekombináns ú tón előállított protein visszanyerését és tisztítását, és (ha szükséges), a protein natív szerkezetének helyreállítását.

Amint azt korábban említettük a két protein kódoló szekvenciája lehet teljesen szintetikus, vagy a nagyobb, natív PF-4-et kódoló DNS módosításának eredménye. A natív PF-4-et kódoló DNS szekvenciát a 5,086,164 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismerteti, amely szekvencia a kívánt eredmény elér«· *··· ···· • «44·· • · · · • · · · ···*·«« · ·

- 10 ése érdekében a natív szekvencia módosításával kiindulási anyagként használható az MPF-4, vagy prekurzor proteinek rekombináns előállítására. Olyan szintetikus géneket, amelyek in vitro, vagy in vivő transzkripciója és transzlációja vagy MPF-4 vagy CPF-4 termelődését eredményezi, a gyakorlatban jól ismert eljárások szerint állíthatunk elő. A genetikai kód természetes degeneráltsága következtében a gyakorlatban járatos személy számára világos, hogy számos, de véges számú MPF-4-et, vagy CPF-4-et kódoló DNS szekvencia állítható elő.

Szintetikus gének előállítására szolgáló eljárások jól ismertek a gyakorlatban. [Lásd, Brown és munkatársai, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., 68. kötet, 109-151, (1979).]

MPF-4-et, vagy CPF-4-et kódoló DNS szekvenciákat a találmány szerinti aminosav szekvencia, valamint a PF-4 közölt DNS szekvenciája alapján tervezhetünk. A tervezést követően magát a szekvenciát szokásos DNS szintetizáló készülék, például az Applied Biosystems Model 380A, vagy 380B szintetizáló készülékek (Applied Biosystems, Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404) segítségével állíthatjuk elő.

Az MPF-4, vagy a CPF-4 expresszálása céljából a géntechnikai úton előállított szintetikus DNS szekvenciát megfelelő restrikciós enzimek segítségével számos arra alkalmas rekombináns DNS expressziós vektorba inszertálhatjuk. [Lásd, általában Maniatis és munkatársai, (1989), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, N.Y., 1-3 kötet.] Az MPF-4-et kódoló DNS mindkét végén restrikciós endonukleáz hasítási helyeket hozunk létre, hogy annak egy ismert amplifikációs és expressziós vektorból való izolálását, valamint abba való • ·· «··« ···· ·« · · · · • · * · r « · · ··· ··?« « · beépítését megkönnyítsük. A felhasználandó endonukleázokat az alkalmazott eredeti expressziós vektor restrikciós endonukleáz hasítási térképe határozza meg. A restrikciós helyeket úgy választjuk meg, hogy a kódoló szekvencia a szabályozó szekvenciákhoz képest megfelelő orientációban helyezkedjen el oly módon, hogy lehetővé tegye az illető protein helyes olvasási keretbe illeszkedő leolvasását és expresszálását. A kódoló szekvenciát úgy kell elhelyezni, hogy az megfelelő olvasási keretbe essék az expressziós vektornak a proteint expresszáló gazdasejtben működőképes promoterével és riboszóba kötő helyével.

A szintetikus gén hatékony transzkripciójának elérésére az említett gént mesterségesen egy promoter-operátor szakaszhoz kell kapcsolni. E célból a szintetikus gén promoter-operátor szakaszát a szintetikus gén ATG kezdő kódonjához viszonyítva azonos szekvencia orientációba kell illesztenünk.

Különböző, prokarióta és eukarióta sejtek transzformálására alkalmas expressziós vektorok ismeretesek a gyakorlatban. [Lásd, The Promega Biological Research Products Catalogue, (1992), (Promega Corp., 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI, 53711-5399); valamint The Stratagene Cloning Systems Catalogue, (1992), (Stratagene Corp., 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA, 92037.] A 4,710,473 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás szintén exogén gének nagy mennyiségben való expresszálására alkalmazható, körkörös DNS plazmid transzformációs vektorokat ismertet. Ezek a plazmidok alkalmasak rekombináns DNS eljárásokban transzformációs vektorokként, és

a) a gazdasejtben autonóm replikációs képességgel rendelkeznek;

λ ···» ·· · · · · < * · · • « » » ··· ···· » ·

b) ellenőrzik az autonóm plazmid replikációt a gazdasejt tenyészet fenntartásánál alkalmazott hőmérséklet függvényében;

c) stabilizálják a plazmid fennmaradását a gazdasejt populációban;

d) irányítják a gazdasejt populációban a plazmid fennmaradására utaló protein termék szintézisét;

e) a plazmidban egyedi restrikciós endonukleáz felismerő helyek sorát szolgáltatják; és

f) befejezik az mRNS transzkripcióját.

Ezek a körkörös DNS plazmidok vektorokként alkalmazhatók a rekombináns DNS eljárások során az exogén gén nagy mennyiségben való expresszálásának biztosítására.

Egy expressziós vektor előállítását követően a következő lépés a vektornak egy alkalmas sejtbe való bejuttatása, és így az illető gén expresszálására alkalmas rekombináns gazdasejt előállítása. Rekombináns DNS vektorokkal sejtek transzformálására szolgáló eljárások jói ismertek a gyakorlatban, és megtalálhatók olyan közismert hivatkozási helyeken, mint például Maniatis és munkatársai kézikönyve (lásd fent). Gazdasejteket mind eukarióta, mind prokarióta sejtekből előállíthatunk. Az eukarióta gazdasejtek képesek a transzlációt követően az expresszált proteinek glükozilezésére, és néhányuk képes a kívánt proteinnek a tápfolyadékba való kiválasztására.

A prokarióta gazdasejtek általában nagyobb mennyiségben termelik a proteint, könnyebb tenyészteni őket, azonban nem képesek a végső protein glükozilezésére. A nagy teljesítményű bakteriális expressziós rendszerekben expresszált proteinek jellemzően granulumokba, vagy zárványtestekbe aggregálódnak, amelyek nagy mennyiségben tartalmazzák az expresszált proteint. Az ilyen protein aggregátumokra jellemző, hogy azokat fel kell oldani, denaturálni, és eredeti szerkezetüket helyreállítani a gyakorlatban szokásos eljárások szerint. [Lásd, Kreuger és munkatársai, (1990), Protein Folding, Gierasch és King, szerk., 136-142, American Association fór the Advancement of Science Publication No. 89-18S, Washington, D.C.; valamint a 4,923,967 sz. amerikai egyesült államokban szabadalmi leírás.)

Az MPF-4 és a CPF-4 mitogénnel stimulált PBL készítmények, vagy bármely azokat termelő sejtvonal tenyésztő folyadékának felülúszójából izolálható. Humán PBL-ek esetében a PBL-ek teljes vérből nyert fehérvérsejt rétegből izolálhatok bármely a gyakorlatban szokásos eljárás szerint. A humán PBL-ek előállítására szolgáló számos eljárás egyikét ismertetik például Singh és munkatársai, [Purification and Biochemical Properties of a Humán Monocyte Derived Growth Factor, Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 6374-6378, (1985)]. Az izolálást követően a PBL sejteket a nem sejtes anyagok eltávolítása céljából pufférés sóoldattal alaposan mossuk.

A PBL sejteket ezután meghatározott szérum mentes, növekedést serkentő, mitogént tartalmazó tápfolyadékba oltjuk. A gyakorlatban járatos személy számára a PBL kultúrák tenyésztésére alkalmas, közölt, a kereskedelemben rendelkezésre álló növekedést serkentő tápfolyadékok széles választéka ismeretes. Hasonlóképpen, a gyakorlatban számos PBL aktivitást serkentő mitogén ismert. A szemléltetés kedvéért, de korlátozás nélkül, például a következő mitogének alkalmazhatók a találmány szerinti megoldásnál: lipopoliszacharida (LPS), phytohemoagglutinin (PHA),

Concanavalin A (ConA), zymozan, és mitogén determinánsok ellen termelt bizonyos ellenanyagok.

A PBL kultúrát ezután megfelelő feltételek mellett annyi ideig tenyésztjük, amely elegendő a MPF-4 és CPF-4 termelődéséhez, ez a beoltáshoz használt kiinduló sejtsűrűségtől függően rendszerint egytől néhány napig tart. Ezt követően a használt tenyésztő folyadékot összegyűjtjük, és vagy szűréssel, ülepitéssel, vagy egyéb módszerrel elválasztjuk a sejtektől.

Az MPF-4, vagy a CPF-4 előállításánál alkalmazott eljárástól függetlenül azokat tisztítanunk kell. A gyakorlatban fehérjék tisztítására szolgáló eljárások nagy választéka ismeretes, közülük sok megfelel, és a gyakorlatban járatos személy számára a találmány szerinti új ismeretek szerint nyilvánvaló. A fehérje tisztítási technikák gyakorlatának jelen állását ismertető egyik alapmű a Janson és Ryden, Protein Purification, VCH Publishers Inc., New York (1989).

Egy különösen előnyös tisztítási eljárás szerint a használt tenyésztő folyadékot először egy reverz fázisú kromatográfiás oszlopra visszük fel. Ezek az oszlopok jól ismertek a gyakorlatban és számos kereskedelmi cégtől beszerezhetők, például a Pharmacia-tól, a BioRad-tól, és az Amicon-tól. Miután a protein kölcsönhatásba került az oszloppal, az illető proteint trifluorecetsavban (TFA-ban) oldott szerves oldószer növekvő lineáris gradiensével eluáljuk. Előnyös szerves oldószer az acetonitril és az MPF-4-et, valamint a CPF-4-et tartalmazó frakciók a gradiens 30-50 %-os acetonitril koncentrációt tartalmazó frakcióiban találhatók. A gradiens legelőnyösebb része a 33-39 %-os acetonitril koncentrációt tartalmazó rész.

Az eluált proteineket ezután egy heparin affinitás szilárd fázisra visszük. A gyakorlatban járatos személy számára érthető, hogy ez a lépés legkönnyebben oszlop kromatográfiás eljárással valósítható meg. Heparin affinitásos oszlopok a kereskedelemben hozzáférhetők a fent említett forgalmazók valamelyikétől. Ennél a lépésnél az illető MPF-4, vagy CPF-4 molekulák a heparin oszlophoz kötődnek, és növekvő sókoncentrációt tartalmazó lineáris grádienssel eluálhatók. Előnyösen alkalmazható só a NaCl, és az előnyösen összegyűjtendő gradiens frakciók a 0,01-2,0 mol/1 koncentrációk közé esnek. A gradiens előnyösebben összegyujtendő része a 0,7-2,0 mol/1 koncentrációk között található.

Az utolsó lépésben a 0,7-2,0 mol/1 koncentrációk közé eső eluátumot egy második reverz fázisú oszlopon futtatjuk, és TFAban oldott lineáris acetonitril gradienssel eluáljuk. Az előnyös gradiens 25-75 % közé eső acetonitril gradiens, előnyösebben 2767 % közé eső acetonitril gradiens. Az oszlopról lejövő anyag abszorbcióját 220 nm-en követjük. A protein csúcsot alkotó frakciókat sejt proliferációt gátló aktivitásra (bioaktivitásra) nézve vizsgáljuk. A korábban eluálódó bioaktivitást mutató csúcs CPF-4-nek, a később eluálódó bioaktivitást mutató csúcs MPF-4-nek felel meg.

A következő példák a tisztítási eljárás ismertetését, és a találmány megértését szolgálják. Az alábbi példák csupán a találmány szerinti megoldás szemléltetésére szolgálnak, és semmilyen módon nem korlátozzák a annak tárgykörét.

1. példa

Egészséges donorok vérbéől nyert, gyűjtött fehérvérsejt réteget az Interstate Blood Bank-tói szereztünk be. A gyűjtött fehérvér• · · · · • · « · · · ·· · • · · · ······· · ·

- 16 sejt rétegből PBL sejt készítményt izoláltunk histopaqueTM (Sigma Chemical Co.; St Louis, MO 63178) gradiens centrifugálással 4 oC-on. A PBL készítményt ezután Hank féle pufférőit sóoldattal (GIBCO; Grand Island, N.Y.) mostuk, és 3 x 106 sejt/ml sűrűségben 2 mmol/1 L-glutamint, nem-esszenciális aminosavakat, 0,8 mmol/1 D-glükózt, 100 egység/ml penicillint, 100 egység/ml streptomycint és 20 mikrogramm/ml lipopolysaccharidot (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO 63178) tartalmazó szérum mentes minimális alap tápfolyadékba (össztérfogat: 4 liter) (GIBCO; Grand Island, N.Y.) oltottuk. A PBL készítményt 30 órán át, 37 oC-on, 5 %-os CO2, valamint 95 %-os levegő koncentráció mellett inkubáltuk. A használt tenyésztő folyadékot összegyűjtöttük és a PBL sejteket 0,2 mikrométer pórusátmérőjű szűrőn átszűrve eltávolítottuk.

2. példa

Négy liter használt sejt mentes tenyésztő folyadékot 0,1 % (térfogat/térfogat) TFA sav hozzáadásával savas pH-ra állítottunk be, majd közvetlenül egy C4-RP-304TM reverz fázisú fél-preparatív oszlopra (250 x 21,5 mm) (BioRad, Richmond, CA 94804) vittünk fel körülbelül 15 ml/perc átfolyási sebesség mellett. Az oszlopot 40 perc alatt 0,1 %-os TFA-ban oldott 0-50 % acetonitril koncentrációjú lineáris gradienssel, majd 10 percen át 0,1 %-os TFA-ban oldott 50 %-os acetonitrillel eluáltuk. Az átfolyási sebesség 15 ml/perc volt. Körülbelül 50, egyenként 15 ml térfogatú frakciót gyűjtöttünk. Az eluátum abszorbcióját 220 nm-en követtük, és a 33 %~39 % közé eső acetonitril koncentrációk között eluálódó frakciókat összegyűjtöttük és összeöntöttük (C4-keverék).

3. példa

A C-4 keveréket egy 5 ml térfogatú Econo-pacTM heparin• · · · ··♦·

- 17 sepharose oszlopon (BioRad, Richmond, CA 94804) heparin affinitásos kromatográfiával további frakciókra bontottuk. A kötődött proteint foszfát pufferes fiziológiás sóoldatban lineáris 0-2,0 mol/1 koncentrációjú NaCl gradienssel 2,0 ml/perc átfolyási sebesség mellett eluáltuk. Az oszlopról eluálódott proteineket három frakcióba gyűjtöttük: (1) heparint nem kötő proteinek (átfolyó frakció); (2) alacsony affinitású heparin kötő proteinek (0-0,7 mol/1 NaCl); (3) nagy affinitású heparin kötő proteinek (0,7 mol/1-2,0 mol/1 NaCl) frakció.

4. példa

A nagy affinitású heparin kötő frakciót (3) (0,7 mol/1-2,0 mol/1 NaCl) egy előzőleg 27 %-os acetonitrillel, és 0,1 %-os TFA-val ekvilibrált VydacTM 0,46 x 10 cm méretű C-4 HPLC oszlopra (The Marshall Co.; Worthington, OH 43085) vittük fel. Az oszlopot 0,1 %-os TFA-ban oldott lineáris 27-67 %-os acenonitril gradienssel eluáltuk 40 percen át. Az abszorbciót 220 nm-en követtük, és a csúcsokat alkotó protein frakciókat kézi módszerrel összegyűjtöttük. A csúcsokat alkotó frakciók bioaktivitását ezután az 5. példában ismertetettek szerint vizsgáltuk. Két frakció mutatott sejt proliferációt gátló aktivitást. Szokásos aminosav szekvenálásos eljárás szerint a korábban eluálódott bioaktivitást mutató csúcs CPF-4-nek, a később eluálódott bioaktivitást mutató csúcs MPF-4-nek felelt meg.

5. példa

Elsődleges retina kapilláris endotheliális sejt tenyészetet készítettünk, alapvetően a Buzney és munkatársai által ismertetett eljárás szerint [Buzney és munkatársai, Retinái Vascular Endothelial Cells and Pericytes: Differential Growth Characteris18 tics in vitro, Invest. Ophtalmol. Visual Sci., 24, 470-483, (1983)], és azt a kontamináló sejtektől megtisztítottuk [Voyta és munkatársai, Identification and Isolation of Endothelial Cells Based on their Increased Uptake of Acetylated-low density Lipoprotein, J. Cell Bioi., 99, 2034-2040, (1981)].

Más eljárás szerint borjú szív endothél sejteket használtunk (American Type Culture Collection; Rockville MD 20852) a vizsgálat céljára. A sejtek eredetétől függetlenül az endothél sejteket 10,000 sejt/rekesz sűrűségben, 5 % borjúszérummal, 1 % penicillin- streptomycinnel 1 % glutaminnal, valamint 20 nanogramm/ml fibroblaszt növekedési faktorral kiegészített Dulbecco féle módosított Eagle tápfolyadékban (GIBCO; Grand Island, N.Y.) 24 rekeszű szövettenyésztő lemezekbe oltottuk. Közvetlenül a leoltást követően az egyes rekeszekhez változó mennyiségű PF-4-et (Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO 63178), illetve (a fenti példákban ismertetettek szerint tisztított) MPF-4-et, vagy CPF-4-et adtunk. Az MPF-4-et és a CPF-4-et a 0,001-1 mikrogramm/ml közé eső koncentáció sávon belül vizsgáltuk. Összehasonlításképpen natív PF-4-et vizsgáltunk a 0,001-3 mikrogramm/ml közé eső koncentáció sávon belül, negatív kontrollként önmagában alkalmazott kiegészített tápfolyadék szolgált. Az endothél sejt-tenyészeteket négy napig, 37 oC-on, 5 % CO2 koncentráció mellett, nedvesített szövettenyésztő inkubátorban szaporodni hagytuk. A tenyészeteket ezután tripszin kezeléssel egyenként összegyűjtöttük, és Zm-Coulter Counter készülék (Coulter Electronics. Inc.; Opa Locka FL 33054) segítségével számoltuk.

Az eredményeket az 1. ábra grafikonján ábrázoltuk, a grafikon • · ♦ ···· ···· • · · · · · mindegyik pontja 4 adatpont átlagát képviseli; ahol egy adatpont egy szövettenyésztő rekesznek felelt meg. Az eredmények azt mutatták, hogy a PF-4 gátolta az endotheliális sejt proliferációt, és körülbelül 800-1000 nanogramm/ml (körülbelül 130 nanomol/1) 50 %-os gátlást létrehozó koncentrációval (IC50) rendelkezett. Ezek az eredmények jól megfelelnek a rekombináns PF-4 proliierációt gátló aktivitásáról nemrégen közzétett adatoknak [Science, 247, 77-79, (1990)]. Az adatok azt is mutatták, hogy azonos feltételek mellett mind az MPF-4, mind a CPF-4 hatásosabban gátolta az endothél sejt proliierációt. Az MPF-4 30-50 nanogramm/ml (körülbelül 7 nanomol/1), a CPF-4 körülbelül 150 nanogramm/ml (20 nanomol/1) IC50 koncentrációkkal volt jellemezhető. Az MPF-4 gátló koncentációja közel esik a humán plazmában található fiziológiás PF-4 koncentrációsávhoz (Id.).

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Módosított vérlemezke faktor-4 (MPF-4), amely a következő aminosav szekvenciával rendelkezik: NH2-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-ArgHis-Ile-Thr-Ser-Leu-Glu-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-ThrAla-Gin-Leu - Ile - Alá-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Leii-AspLeu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-SerCOOH.
2. Hasított vérlemezke faktor-4 (CPF-4), amelyben egy a következő aminosav szekvenciával rendelkező protein láncot: NH2-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr-Ser-Leu-Glu-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-COOH, diszulfid híd köt össze egy második, a következő aminosav szekvenciával rendelkező proteinnel:

NH2-Glu-Ala-Glu-Glu-Asp-Gly-Asp-Leu-Gln-Cys-Leu-Cys-Val-Lys-Thr-Thr-COOH, azzal jellemezve, hogy az említett diszulfid hidak az MPF-4 Cys20 aminosava és a második említett protein Cys-10 aminosava, valamint az MPF-4 Cys-36 aminosava és az említett második protein Cys-12 aminosavak között találhatók.
3. Aktív összetevőként az 1., vagy a 2. igénypont szerinti MPF-4-et, vagy CPF-4-et, valamint egy, vagy több gyógyszerészetben szokásos hordozóanyagot, kötőanyagot, vagy hígítóanyagot tartalmazó gyógyszerészeti formula.
4. Eljárás az 1., vagy a 2. igénypont szerinti MPF-4, vagy CPF-4 előállítására, amely eljárás tartalmazza:

a) MPF-4-et, vagy CPF-4-et tartalmazó folyadék elegy előállítását;

b) az említett elegynek egy reverz fázisú kromatográfiás oszlopra való vitelét, és a 30-50 %-os acetonitril koncentrációk között eluálódó első eluátum összegyűjtését;

c) a b) lépésben gyűjtött eluátum reagáltatását egy heparin affinitás szilárd fázissal, oly módon, hogy az MPF-4, vagy a CPF-4 a heparin affinitás fázishoz kötődjék, és tartalmazza az összegyűjtött eluátumból az MPF-4-hez, vagy a CPF-4-hez kötődött említett szilárd fázis eltávolítását.

d) a heparin affinitás szilárd fázisról egy második eluátum eluálását 0,7-2,0 mol/1 NaCl felhasználásával;

e) a d) lépésben kapott második eluátum futtatását egy második reverz fázisú analitikai nagy nyomású folyadék kromatográfiás oszlopon, a lejövő anyag 220 nanométeres hullámhosszon való követése mellett; és

f) az MPF-4-et, vagy a CPF-4-et tartalmazó frakciók összegyűjtését bioaktivitásuk, valamint 220 nanométeren mért abszorbciójuk alapján.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az MPF-4-et, vagy CPF-4-et tartalmazó folyadék elegyet az 1., vagy a 2. igénypont szerinti MPF-4-et, vagy CPF-4-et kódoló rekombináns DNS vegyület felhasználásával állítjuk elő.
6. A 4. vagy az 5. igénypont szerinti eljárás szerint előállított MPF-4, vagy CPF-4.
7. A 6. igénypont szerinti rekombináns DNS vegyület.
8. A 7. igénypont szerinti DNS vegyületet tartalmazó rekombináns DNS vektor, amely megfelelő gazdasejtbe transzformálva képes a 7. igénypont szerinti DNS vegyület expresszióját irányítani.
9. A 8. igénypont szerinti vektorral transzformált gazdasejt.
10. Eljárás MPF-4 előállíására, mely eljárás tartalmazza:

a) MPF-4-et tartalmazó folyadék elegy előállítását;

b) az említett elegynek egy reverz fázisú kromatográfiás oszlopra való vitelét, és a 30-50 %-os acetonitril koncentrációk között eluálódó első eluátum összegyűjtését;

c) ab) lépésben gyűjtött eluátum reagáltatását egy heparin affinitás szilárd fázissal, oly módon, hogy az MPF-4 a heparin affinitás szilárd fázishoz kötődjék, és tartalmazza az összgyűjtött eluátumból az MPF-4-hez kötődött említett szilárd fázius eltávolítását.

d) a heparin affinitás szilárd fázisról egy második eluátum eluálását 0,7-2,0 mol/1 NaCl felhasználásával;

e) a d) lépésben kapott második eluátum futtatásást egy második reverz fázisú analitikai nagy nyomású folyadék kromatográfiás oszlopon, az átfolyó anyag 220 nanométeres hullámhosszon való követése mellett; és

f) bioaktivitása alapján az MPF-4-et tartalmazó frakciók • ··«« ····

- 23 összegyűj tését.
11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első gyűjtött eluátum 33-39 %-os acetonitril koncentrációk között eluálódik.
12. Eljárás CPF-4 előállíására, mely eljárás tartalmazza:

a) CPF-4-et tartalmazó folyadék elegy előállítását;

b) az említett elegynek egy reverz fázisú kromatográfiás oszlopra való vitelét, és a 30-50 %-os acetonitril koncentrációk között eluálódó első eluátum összegyűjtését;

c) ab) lépésben gyűjtött eluátum reagáltatását egy heparin affinitás szilárd fázissal, oly módon, hogy a CPF-4 a heparin affinitás szilárd fázishoz kötődjék, és tartalmazza az összgyűjtött eluátumból az CPF-4-hez kötődött említett szilárd fázis eltávolítását.

d) a heparin affinitás szilárd fázisról egy második eluátum eluálását 0,7-2,0 mol/1 NaCl felhasználásával;

e) a d) lépésben kapott második eluátum futtatását egy második reverz fázisú analitikai nagy nyomású folyadék kromatográfiás oszlopon, a lejövő anyag 220 nanométeres hullámhosszon való követése mellett; és

f) bioaktivitása alapján az CPF-4-et tartalmazó frakciók összegyűj tését.
13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első gyűjtött eluátum 33-39 %-os acetonitril koncentrációk között eluálódik.
14. A 10.-13. igénypontok szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az az MPF-4-et, vagy CPF-4-et tartalmazó folyadék elegyet MPF-4et, vagy CPF-4-et kódoló rekombináns DNS vegyület felhasználásával állítjuk elő.
15. Eljárás MPF-4-et, vagy CPF-4-et, valamint egy, vagy több gyógyszerészetben szokásos hordozóanyagot, kötőanyagot, vagy hígítóanyagot tartalmazó gyógyszerészeti készítmény előállítására .