DE69232552T2

DE69232552T2 - Tetrapeptide Derivat

Info

Publication number: DE69232552T2
Application number: DE69232552T
Authority: DE
Inventors: Masaaki Gondo; Koichi Miyazaki; Kyoichi Sakakibara
Original assignee: Teikoku Hormone Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Aska Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1991-08-09
Filing date: 1992-08-06
Publication date: 2002-10-31
Anticipated expiration: 2012-08-07
Also published as: US5654399A; EP0598129B1; ATE215962T1; CA2115355C; WO1993003054A1; US6004934A; DE69232552D1; ATE190983T1; AU662551B2; EP0934950B1; KR0185440B1; CA2115355A1; EP0934950A1; AU2415292A; SG87056A1; DE69230824D1; DE69230824T2; KR100202474B1; ES2144421T3; DK0934950T3

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft neue Tetrapeptid-Derivate mit Antitumoraktivität, und sie betrifft insbesondere Tetrapeptid-Derivate, dargestellt durch die folgende Formel, oder Salze davon:

Stand der Technik

Peptide mit cytostatischer Aktivität und/oder einer Antineoplasmaaktivität wurden aus Meeresweichtieren, Seehasen Dolabella auricularia isoliert, und diese Peptide werden als Dolastatine 1 bis 15 bezeichnet. Unter diesen ist Dolastatin 10 ein Pentapeptid, extrahiert aus Dolabella auricularia aus dem Indischen Ozean 1987 von G. R. Pettit et al. Es besitzt die folgende Strukturformel, und es wird berichtet, dass es die derzeit bekannte stärkste cytostatische Substanz ist (vergleiche G. R. Pettit et al., J. Am. Chem. Soc., 109, 6883 (1987) und offengelegte japanische Patentveröffentlichung Nr. 167278/1992). Dolastatin 10
In einer neueren Publikation wird die Totalsynthese von Dolastatin 10 selbst beschrieben (vergleiche US-Patentschrift Nr. 4 978 744), aber seine Derivate waren bis heute nicht bekannt.
Die genannten Erfinder haben die Derivate von Dolastatin 10 intensiv untersucht und als Ergebnis gefunden, dass bestimmte Dolastatin-Analoge, die durch die obige Formel (I) dargestellt werden, eine höhere cytostatische Aktivität als Dolastatin 10 besitzen. Sie haben weiterhin gefunden, dass viele dieser Verbindungen ein größeres therapeutisches Verhältnis (maximale wirksame Dosis zur Dosis bei einer 30%igen Lebensverlängerung) und eine niedrigere Toxizität als Dolastatin 10 besitzen und somit ausgezeichnete Antitumormittel sind.
Sie haben nämlich gefunden, dass die Aminosäuren-Analogen von Dolastatin 10 eine höhere Aktivität besitzen als das native Dolastatin 10.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wurde aufgrund dieser Erkenntnisse gemacht und betrifft Aminosäure-substituierte Verbindungen von Dolastatin 10 und die Synthese davon.
Die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen wird in den folgenden Fließschemata 1, 2 und 3 beschrieben.
Bei der vorliegenden Beschreibung bedeutet "niedrig", dass die Zahl der Kohlenstoffatome einer Gruppe oder einer Verbindung mit diesem Ausdruck 6 oder weniger, bevorzugt 4 oder weniger, beträgt.
In der vorliegenden Beschreibung kann eine "niedrige Alkylgruppe" entweder geradkettig oder verzweigtkettig sein, und es können beispielsweise erwähnt werden eine Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Isobutyl-, selc.-Butyl-, tert.-Butyl-, Isopentyl-, Neopentyl- oder Isohexylgruppe oder ähnliche, und "Aralkylgruppe" bedeutet eine Arylniedrigalkylgruppe, und es kann beispielsweise erwähnt werden eine Benzyl- oder Phenethylgruppe. "Niedrigalkoxy-gruppe" bedeutet eine niedrige Alkyl-O-Gruppe, worin der niedrige Alkylteil die oben gegebene Bedeutung besitzt, und es können beispielsweise erwähnt werden eine Methoxy-, Ethoxy-, n-Propoxy-, Isopropoxy- oder tert.-Butoxygruppe oder eine ähnliche Gruppe, und "Aralkyloxy-gruppe" bedeutet eine Aralkyl-O-Gruppe, worin der Aralkylteil die obige Bedeutung besitzt, und es kann beispielsweise eine Benzyloxy- oder Phenethyloxygruppe oder eine ähnliche Gruppe erwähnt werden. Die "Niedrigalkylengruppe" kann entweder eine geradkettige oder verzweigtkettige sein, und es kann beispielsweise erwähnt werden eine Methylen-, Ethylen-, Trimethylen-, Tetramethylen-, Methylmethylen-, Propylen-, Ethylethylen- oder 1,2- Dimethylethylen-gruppe oder eine ähnliche Gruppe, und als "Cycloalkylgruppe" kann eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis 7 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise eine Cyclopropyl-, Cyclopentyl-, Cyclohexyl- oder Cycloheptylgruppe, erwähnt werden, und als "Arylgruppe" kann beispielsweise eine Phenyl- oder Naphthylgruppe oder eine ähnliche Gruppe erwähnt werden.
In den erfindungsgemäßen Verbindungen der zuvor erwähnten Formel (I) sind die Kohlenstoffatome, an die die Substituenten R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4;, R&sub5; und die Methoxygruppe gebunden sind, asymmetrische Kohlenstoffatome und können beliebig R- oder S-Konfiguration annehmen, und alle werden vom Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst. Im Hinblick auf die pharmakologischen Eigenschaften sind jedoch Verbindungen, die die gleiche Konfiguration wie Dolastatin 10 besitzen, bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der obigen Formel (I) werden in der folgenden Tabelle aufgeführt:
In den obigen Gruppen bedeuten Me, Pr, Bu und Bzl eine Methylgruppe, eine Propylgruppe, eine Butylgruppe bzw. Benzylgruppe.
Die Tetrapeptid-Derivate der obigen Formel (I) können als Salz vorliegen, und als Beispiele solcher Salze können erwähnt werden Hydrochloride, Hydrobromide, Trifluoracetate, p- Toluolsulfonate und Acetate.
Erfindungsgemäß kann ein Tetrapeptid-Derivat der obigen Formel (I) durch Kondensation von Aminosäuren oder Peptidfragmenten, beispielsweise dem Flüssigkeitsphase- Syntheseverfahren (vergleiche E. Schröder und K. Lübke, "The Peptides", Band 1, Seiten 76- 136, 1965, veröffentlicht von Academic Press), das auf dem Gebiet der Peptidchemie gut bekannt ist, hergestellt werden. Es ist jedoch am meisten bevorzugt, diese Tetrapeptid-Derivate durch Kondensation eines Tripeptidfragmentes der folgenden Formel (II)
worin R&sub1;, R&sub2; und R&sub3; die gleichen Bedeutungen wie oben definiert besitzen, mit einem Fragment der folgenden Formel (III)
worin R&sub4; und R&sub5; die gleichen Bedeutungen wie oben definiert besitzen, herzustellen, da jedes Fragment der Formeln (II) und (III) leicht zu synthetisieren ist und frei von der Razemisierung bei der Kondensationsstufe ist.
Die Reaktion kann allgemein durch Behandlung der obigen Fragmente (II) und (III) mit einem Kondensationsmittel, beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), Diphenylphosphorylazid (DPPA) oder diethylphosphorcyanidat (DEPC), einem sogenannten BOP- Reagens, oder ähnlichen, in einem inerten Lösungsmittel, wie beispielsweise Chloroform, Ethylacetat, Tetrahydrofuran (THF), Dimethylformamid (DMF) oder Acetonitril, sofern erforderlich, in Anwesenheit einer organischen Base, wie beispielsweise Triethylamin, N- Methylmorpholin oder Diisopropylethylamin (DIEA) durchgeführt werden.
Die Reaktionstemperatur beträgt üblicherweise -10ºC bis Raumtemperatur und liegt bevorzugt um 0ºC, und für die Reaktionsraten der Verbindung Formel (III), der organischen Base und des Kondensationsmittels, bezogen auf die Verbindung der Formel (II), ist es vorteilhaft, die Verbindung der Formel (III) in einer Menge von mindestens einem Mol, bevorzugt in der Größenordnung von 1,0 bis 1,1 Mol, die organische Base in der Größenordnung von 2 Mol und das Kondensationsmittel in äquimolarer Menge, bezogen auf die Mol der Verbindung der Formel (II), zu verwenden.
Wenn so die gewünschten Tetrapeptid-Derivate der Formel (I) gebildet werden, können die Isolierung und Reinigung davon aus dem Reaktionsgemisch durch Umkristallisation, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie usw., erfolgen.
Die Verbindungen der obigen Formeln (II) und (III), die als Ausgangsmaterial bei der obigen Reaktion verwendet werden, sind neue Verbindungen, die in der Literatur nicht beschrieben wurden, und sie können leicht durch Kondensation von Aminosäuren, die deren Bestandteile sind, gemäß dem Flüssigkeitsphasen-Syntheseverfahren hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Tetrapeptid-Derivate der Formel (I) besitzen eine höhere cytostatische Aktivität als Dolastatin 10 und sind nützlich für die Behandlung von akuter myeloischer Leukämie, akuter lymphocytischer Leukämie, chronischem Melanom, Lungenadenocarcinom, Neuroblastoma, Lungencarcinom mit kleinen Zellen, Brustkrebs, Colonkrebs, Ovarienkrebs, Blasenkrebs, usw.
Das Screening der cytostatischen Aktivität erfolgte unter Verwendung von lymphocytischen Leukämie-P388-Zellen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.

Tabelle

Verbindung ED&sub5;&sub0;(ug/ml)

(a) 3,1 · 10&supmin;&sup6;
(b) 1,7 · 10&supmin;&sup6;
(c) 3,1 · 10&supmin;&sup5;
Dolastatin 10 7,0 · 10&supmin;&sup4;
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können, wenn sie als Arzneimittel verwendet werden, zu irgendeiner Dosisform in fester Form (beispielsweise Tabletten, harte Kapseln, weiche Kapseln, Granulat, Pulver, feines Granulat, Pillen, Lutschbonbons, usw.), semifesten Formen (beispielsweise Suppositorien, Salben, usw.), und flüssigen Formen (beispielsweise Injektionen, Emulsionen, Suspensionen, Lotionen, Sprays, usw.) formuliert werden. Als nichttoxische Additive, die in den obigen Zubereitungen verwendet werden können, können beispielsweise erwähnt werden Stärken, Gelatine, Glucose, Lactose, Fructose, Maltose, Magnesiumcarbonat, Talcum, Magnesiumstearat, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder die Salze davon, Gummi arabicum, Polyethylenglykol, p-Hydroxybenzoesäure, Alkylester, Sirupe, Ethanol, Propylenglykol, Vaseline, Carbowachs, Glycerin, Natriumchlorid, Natriumsulfit, Natriumphosphat, Zitronensäure, usw. Das Arzneimittel kann ebenfalls andere therapeutisch wirksame Arzneimittel enthalten.
Der Gehalt an erfindungsgemäßer Verbindung in dem Arzneimittel variiert abhängig von der Dosisform, aber es ist im Allgemeinen bevorzugt, dass das Arzneimittel die Verbindung in einer Konzentration von 0,1 bis 50 Gew.-% im Falle fester und semifester Formen und in einer Konzentration von 0,05 bis 10 Gew.-% im Falle einer flüssigen Form enthält.
Die Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung kann stark variieren, abhängig von der Art des warmblütigen Tieres, einschließlich der Menschen und anderen Subjekten, den Verabreichungswegen, der Stärke der Symptome, der Diagnose der Ärzte, usw., aber sie liegt im Allgemeinen in der Größenordnung von 0,01 bis 50 mg/kg pro Tag. Es ist natürlich möglich, die Verbindung in einer Menge zu verabreichen, die kleiner ist als es der unteren Grenze des obigen Bereichs enspricht, oder in einer Menge, die größer ist als es dem oberen Bereich davon entspricht, entsprechend der Stärke der Symptome des Patienten und der Diagnose des Arztes, wie oben erwähnt. Die obige Dosis kann einmal täglich oder in unterteilten mehrfachen Portionen pro Tag verabreicht werden.
Die folgenden Bezugsbeispiele und Beispiele erläutern die Erfindung.
Hinsichtlich der Struktur der Verbindungen, die den Verbindungszahlen, die in den Bezugsbeispielen und Beispielen verwendet werden, entsprechen, wird auf die folgenden Fließschemata 1 bis 3 verwiesen. Darin bedeuten Z, Me, But, Boc und Bzl eine Benzyloxycarbonylgruppe, eine Methylgruppe, eine tert.-Butylgruppe, eine tert.-Butoxycarbonylgruppe beziehungsweise eine Benzylgruppe, und besitzen R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5; die gleichen Bedeutungen wie oben gegeben. Fließschema 1 Fließschema 2 Fließschema 3

Bezugsbeispiel 1-A

Herstellung der Verbindung 1-A (Verbindung 1, worin R&sub3; = CH&sub3;)

11,15 g (50 mmol) Z-Alanin werden in 140 ml Tetrahydrofuran gelöst, 9,72 g (60 mmol) Carbonyldiimidazol werden zugegeben, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur 4 bis 5 Stunden gerührt.
Andererseits werden 17,16 g (110 mmol) Malonsäuremonomethylesterkaliumsalz und 7,60 g (80 mmol) wasserfreies Magnesiumchlorid in 150 ml Tetrahydrofuran suspendiert und 6 Stunden unter Erhitzen auf einem Wasserbad von 55ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit Eis gekühlt. Die obige Reaktionslösung wird auf einmal dazugegossen, das Kühlbad wird sofort entfernt, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur 24 bis 48 Stunden gerührt.
Eine geringe Wassermenge wird zu der Reaktionslösung zugegeben, und ein klarer Überstand wird von dem abgeschiedenen wachsartigen Präzipitat abdekantiert und bei verringertem Druck konzentriert, wobei ein öliges Material erhalten wird. Ethylacetat und eisgekühlte 4 N Chlorwasserstoffsäure werden zu jedem obigen wachsartigen Rückstand zugegeben, und dieses ölige Material wird in den Gemischen geschüttelt, um es zu lösen, und die beiden Lösungen werden vereinigt, die Schichten werden getrennt, und die wässrige Schicht wird erneut mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wird mit eisgekühlter 2 N Chlorwasserstoffsäure und gesättigtem wässrigen Natriumbicarbonat gewaschen und getrocknet, und das Lösungsmittel wird abdestilliert, wobei 13,50 g schwachgelbes, öliges Material erhalten werden. Dies wird durch Silicagelsäulenchromatographie (Eluierungsmittel: Ethylacetat-n-Hexan (1 : 1)) gereinigt, wobei die gewünschte Verbindung 1-A als farbloses, schwachgelbes, öliges Material erhalten wird. 12,96 g (92,9%)
[α]D²&sup6; = -17,7 (c = 1,01, MeOH)
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δ): 1,38 (3H, d, J = 7,1 Hz), 3,55 (2H, s), 3,72 (3H, s), 4,45 (1H, m, J = 7,1 Hz), 5,11 (2H, s), 5,25~5,55 (1H, m), 7,34 (5H, s)
Die Bezugsbeispiele 1-B, 1-C, 1-D und 1-E wurden auf gleiche Weise wie Bezugsbeispiel 1-A durchgeführt, wobei die Verbindungen 1-B, 1-C, 1-D und 1-E jeweils als ölige Materialien erhalten wurden.
*) c = 1,00, MeOH

Bezugsbeispiel 2-A

Herstellung der Verbindung 2-A (Verbindung 2, worin R&sub3; = CH&sub3;)

12,96 g (46,45 mmol) Verbindung 1-A, erhalten gemäß Bezugsbeispiel 1-A, werden in 380 ml Methanol gelöst, und 3,56 g (93,67 mmol) Natriumborhydrid werden auf einmal unter Rühren bei -78ºC zugegeben. Es wird weiter für 6 Stunden gekühlt und gerührt, eisgekühlte 1 N Chlorwasserstoffsäure wird allmählich zugegeben, und nach Bestätigung, dass das Gemisch sauer reagiert, wird das Gemisch bei verringertem Druck konzentriert, und das abgeschiedene ölige Material wird mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wird mit gesättigtem wässrigen Natriumbicarbonat gewaschen und getrocknet, und das Lösungsmittel wird abdestilliert, wobei 12,93 g Kristalle erhalten werden. Die Kristalle werden aus Isopropylether umkristallisiert, wobei die gewünschte Verbindung 2-A als farblose Nadeln mit einem Schmelzpunkt von 78ºC erhalten werden. 11,09 g (85,0%).
[α]D²&sup8; = -4,4º (c = 1,00, MeOH)
Als C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub9;NO&sub5;
Berechnet C = 59,77% H = 6,81% N = 4,98%
Gefunden C = 59,83% H = 6,92% N = 5,07%
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δ): 1,15 (3H, d, J = 6,8 Hz), 2,35~2,55 (2H, m), 3,70 (3H, s), 3,85~4,15 (1H, m), 5,09 (2H, s), 7,34 (5H, s)
Die Bezugsbeispiele 2-B, 2-C, 2-D und 2-E wurden alle auf gleiche Weise wie Bezugsbeispiel 2-A durchgeführt, wobei die Verbindungen 2-B, 2-C, 2-D bzw. 2-E erhalten wurden. Bezugsbeispiel 2 (Fortsetzung)
*) c = 1,00, MeOH
Berechnet
Gefunden

Bezugsbeispiel 3-A

Herstellung der Verbindung 3-A (Verbindung 3, worin R&sub3; = CH&sub3;)

9,78 g (34,80 mmol) der Verbindung, erhalten gemäß Bezugsbeispiel 2-A, werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst, 40,0 g (172,41 mmol) Silberoxid und 50 ml Methyliodid werden zugegeben, und das Gemisch wird 5 Stunden in einem Wasserbad bei 35ºC gerührt. Das Gemisch wird filtriert, das Silberoxid wird mit Dimethylformamid gewaschen, das Filtrat und die Waschlösung werden vereinigt und bei verringertem Druck bei 50ºC oder darunter konzentriert. Der Rückstand wird gut mit Ethylacetat extrahiert, die Ethylacetatschicht wird mit 5%igem Natriumthiosulfat und gesättigtem wässrigen Natriumbicarbonat gewaschen und getrocknet, und das Lösungsmittel wird abdestilliert, wobei 10,43 g gelbes öliges Material erhalten werden. Das ölige Material wird durch Silicagelsäulenchromatographie (Eluierungsmittel: Benzol-Ethylacetat (5 : 1)) gereinigt, wobei die gewünschte Verbindung 3-A als schwachgelbes öliges Material erhalten wird.
[α]D²&sup5; = -39,8º (c = 1,03, MeOH)
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δ): 1,21 (3H, d, J = 6,8 Hz), 2,47 (2H, d, J = 6,2 Hz), 2,80 (3H, s), 3,38 (3H, s), 3,64 (3H, s), 5,13 (2H, s), 7,34 (5H, s)
Die Bezugsbeispiele 3-B, 3-C, 3-D und 3-E wurden alle auf gleiche Weise wie Bezugsbeispiel 3-A durchgeführt, wobei die Verbindungen 3-B, 3-C, 3-D bzw. 3-E erhalten wurden.
*) c = 1,00, MeOH

Bezugsbeispiel 4-A

Herstellung von Verbindung 4-A (Verbindung 4, worin R&sub3; = CH&sub3;)

6,60 g (21,36 mmol) der Verbindung 3-A, erhalten gemäß Bezugsbeispiel 3-A, werden in 100 ml Dioxan gelöst, 23,5 ml (23,5 mmol) 1 N Natriumhydroxid werden zugegeben, und das Gemisch wird bei Raumtemperatur 2 bis 3 Stunden gerührt. 20%ige Zitronensäure wird zu der Reaktionslösung zur pH-Einstellung von 4,0 zugegeben, das Gemisch wird bei verringertem Druck konzentriert, und das abgeschiedene ölige Material wird mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wird mit gesättigter Salzlösung gewaschen und getrocknet, und das Lösungsmittel wird abdestilliert, wobei ein farbloses, schwachgelbes öliges Material erhalten wird.
Dieses wird in 60 ml Dichlormethan gelöst, 0,8 ml konzentrierte Schwefelsäure werden zugegeben, und das Gemisch wird mit 25 ml Isobuten in einer Druckflasche bei Raumtemperatur 48 bis 96 Stunden geschüttelt. Die Reaktionslösung wird in gesättigtes wässriges Natriumbicarbonat gegossen, Stickstoffgas wird zur Entfernung des Isobuten und des größeren Teils des Dichlormethans durchgeblasen, das abgeschiedene ölige Material wird mit Ethylacetat extrahiert, und die Ethylacetatschicht mit gesättigtem wässrigen Natriumbicarbonat gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wird abdestilliert, und das verbleibende gelbe ölige Material (7,32 g) wird durch Silicagelsäulenchromatographie (Eluierungsmittel: Benzol-Ethylacetat (10 : 1)) gereinigt, wobei 6,31 g (84,1%) der gewünschten Verbindung 4-A als farbloses, schwachgelbes öliges Material erhalten werden.
[α]D²&sup7; = -33,0º (c = 1,02, MeOH)
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δ): 1,21 (3H, d, J = 6,8 Hz), 1,44 (9H, s), 2,38 (2H, d, J = 6,2 Hz), 2,82 (3H, s), 3,38 (3H, s), 3,5~3,85 (1H, m), 3,85~4,4 (1H, m), 5,13 (2H, s), 7,34 (5H, s)
Die Bezugsbeispiele 4-B, 4-C, 4-D und 4-E wurden alle auf gleiche Weise wie Bezugsbeispiel 4-A durchgeführt, wobei die Verbindungen 4-B, 4-C, 4-D bzw. 4-E erhalten wurden.
*) c = 1,00, MeOH **) CHCl&sub3;

Bezugsbeispiel 5-A

Herstellung der Verbindung 5-A (Verbindung 5, worin

0,70 g (2,00 mmol) der Verbindung 4-A, erhalten gemäß Bezugsbeispiel 4-A, werden in 20 ml t-Butanol-Wasser (9 : 1) gelöst, 0,1 g 5%iges Palladium auf Kohle werden zugegeben, und das Gemisch wird unter einem Wasserstoffstrom 2 Stunden gerührt. Nach der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und gewaschen, und das Filtrat und die Waschlösung werden bei verringertem Druck konzentriert. Das verbleibende ölige Material wird in 30 ml Benzol gelöst, die Lösung wird erneut bei verringertem Druck konzentriert, und der Vorgang wird nochmal wiederholt. Das entstehende ölige Material wird zusammen mit 0,56 g (2,23 mmol) Z-Valin in 10 ml Acetonitril gelöst, und 0,43 g (2,09 mmol) DCC werden unter Eiskühlung und Rühren zugegeben. Es treten schnell Kristalle auf. Es wird bei 0ºC mindestens 3 weitere Stunden gerührt und dann über Nacht, wobei sich während dieser Zeit die Temperatur erhöhen kann, wenn das Eis schmilzt, weitergerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit Ethylacetat verdünnt, und die Kristalle werden filtriert und mit Ethylacetat gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösung werden bei verringertem Druck konzentriert, der sirupartige Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, das unlösliche Material, wenn vorhanden, wird abfiltriert, die Ethylacetatlösung wird mit eisgekühlter 2 N Chlorwasserstoffsäure und gesättigtem wässrigen Natriumbicarbonat gewaschen und getrocknet, das Lösungsmittel wird abdestilliert, wobei 1,01 g farbloses, öliges Material zurückbleiben. Dieses wird durch Silicagelsäulenchromatographie (Eluierungsmittel: Benzol- Ethylacetat (5 : 1)) gereinigt, wobei 0,67 g (74,4%) der gewünschten Verbindung 5-A als farbloses, öliges Material erhalten werden.
[α]D²&sup8; = -31,4º (c = 1,02, MeOH)
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δ): 0,81,1 (6H, m), 1,17 (3H, d, J = 6,8 Hz), 1,45 (9H, s), 2,25~2,45 (2H, m), 3,00 (3H, s), 3,37 (3H, s), 3,68 (1H, dd, J = 12,1 Hz, 6,2 Hz), 4,35~4,75 (2H, m), 5,09 (2H, s), 5,56 (1H, br, d), 7,33 (5H, s)
Die folgenden Verbindungen werden alle auf gleiche Weise wie bei Bezugsbeispiel 5-A erhalten. Bezugsbeispielen 5 (Fortsetzung)
* c = 1,00, MeOH Bezugsbeispiel 6-A Herstellung der Verbindung 6-A (Verbindung 6, worin
0,65 g (1,44 mmol) Verbindung 5-A, erhalten gemäß Bezugsbeispiel 5-A, werden in 15 ml t-Butanol-Wasser (9 : 1) gelöst, 50 mg 5%iges Palladium auf Kohle werden zugegeben, und das Gemisch wird unter Wasserstoffstrom 2 Stunden gerührt. Nach der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert und gewaschen, und das Filtrat und die Waschlösung werden bei verringertem Druck konzentriert. Der ölige Rückstand wird in 30 ml Benzol gelöst, und die Lösung wird erneut bei verringertem Druck konzentriert, und dieser Vorgang wird nochmal wiederholt. Das entstehende ölige Material wird in 6 ml Dimethylformamid gelöst, 0,25 g (1,72 mmol) N,N- Dimethylvalin und 0,29 g (1,78 mmol) DEPC werden zugegeben, das Gemisch wird bei Raumtemperatur gerührt, bis eine klare Lösung erhalten wird, dann wird die Lösung mit Eis gekühlt, und die Lösung von 0,17 g (1,68 mmol) Triethylamin in 1 ml Dimethylformamid wird tropfenweise im Verlauf von 4 Minuten zugegeben. Es wird weiter bei 0ºC während mindestens 4 Stunden und dann über Nacht gerührt, wobei während dieser Zeit die Temperatur steigen kann, wenn das Eis schmilzt. Das entstehende klare Reaktionsgemisch wird mit Ethylacetat verdünnt, und die Ethylacetatlösung wird gut mit gesättigtem wässrigen Natriumbicarbonat gewaschen und dann getrocknet. Das Lösungsmittel wird abdestilliert, und 0,66 g des verbleibenden schwachbraunen öligen Materials werden durch Silicagelsäulenchromatographie (Eluierungsmittel: Ethylacetat-Hexan (1 : 1)) gereinigt, wobei 0,46 g (71,9%) der gewünschten Verbindung 6-A als farbloses, öliges Material erhalten werden.
[α]D²&sup7; = -56,5º (c = 1,00, MeOH)
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δ): 0,8~1,1 (12H, m), 1,15 (3H, d, J = 7,0 Hz), 1,45 (9H, s), 2,27 (6H, s), 3,05 (3H, s), 3,38 (3H, s), 3,55~3,85 (1H, m), 4,35~4,65 (1H, m), 4,65~4,95 (1H, m), 0,88 (1H, br, d)
Die folgenden Verbindungen werden alle auf gleiche Weise wie bei Bezugsbeispiel 6-A erhalten. Bezugsbeispiel 6 (Fortsetzung) Bezugsbeispielen 6 (Fortsetzung) Bezugsbeispiel 6 (Fortsetzung)
* c = 1,00, MeOH
** CHCl&sub3; (c = 0,315)

Bezugsbeispiel 7

Herstellung der Verbindung 7-A (Verbindung 7, worin R&sub4; = H)

7 ml (15,5 mmol) einer 23,8%igen LDA-Tetrahydrofuran : Hexan (1 : 1)-Lösung werden tropfenweise zu 10 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran bei -20ºC unter Stickstoffatmosphäre und Rühren gegeben. Das Gemisch wird dann auf -78ºC in einem Trockeneis-Acetonbad abgekühlt. 2,3 g (15 mmol) Benzylacetat werden tropfenweise im Verlauf von 30 Minuten zugegeben, und das Gemisch wird bei -78ºC während 5 Minuten gerührt, und eine Lösung aus 2,0 g (10 mmol) Boc-L-prolinal in 10 ml Tetrahydrofuran wird tropfenweise im Verlauf von 1 Stunde zugegeben. Das Gemisch wird bei -78ºC während 10 Minuten gerührt, 30 ml eisgekühlte 1 N Chlorwasserstoffsäure werden zugegeben, und die Temperatur wird auf Raumtemperatur erhöht. Das Gemisch wird mit Ethylacetat extrahiert, der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und getrocknet, und das Lösungsmittel wird bei verringertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wird durch Silicagelflashchromatographie unter Verwendung von Hexan : Ethylacetat (5 : 1) als Eluierungsmittel gereinigt, wobei 1,12 g (32,0%) der gewünschten Verbindung 7-A als öliges Material erhalten werden.
[α]D²&sup5; = 23,7º (c = 1,26, CHCl&sub3;)
MS 331, 276
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δ): 1,46 (9H, s), 2,47 (2H, d, J = 6,8 Hz), 3,7~4,3 (2H, m), 5,15 (2H, s), 7,2~7,4 (5H, m)

Bezugsbeispiel 8

Herstellung der Verbindung 8-A (Verbindung 8, worin R&sub4; = H)

560 mg (1,6 mmol) Verbindung 7-A, erhalten gemäß Bezugsbeispiel 7, werden in 27 ml Dichlormethan gelöst, 202 ul (1,6 mmol) BF&sub3;·Et&sub2;O werden unter Kühlen in einem Eis-Salzbad zugegeben, und eine Etherlösung von Diazomethan (32 mmol) wird tropfenweise im Verlauf von 30 Minuten zugegeben. Nach dem Rühren während weiterer 2 Stunden unter Kühlen in einem Eis-Salzbad, werden 2 ml gesättigtes wässriges Natriumbicarbonat zugegeben. Das unlösliche Material wird durch Filtration entfernt, das Filtrat wird mit Ethylacetat extrahiert, und der Extrakt wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wird bei verringertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wird durch Silicagelflashchromatographie unter Verwendung von Hexan : Ethylacetat (5 : 1) als Eluierungsmittel gereinigt, wobei 378 mg (65,0%) der gewünschten Verbindung 8-A als öliges Material erhalten werden.
[α]D²&sup5; = -58,7º (c = 0,52, CHCl&sub3;)
MS 241, 218
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δ): 1,46 (9H, s), 2,47 (2H, d, J = 7,5 Hz), 3,34 (3H, s), 3,6~4,3 (2H, m), 5,14 (2H, s), 7,2~7,4 (5H, m)

Bezugsbeispiel 9

Herstellung der Verbindung 9-A (Verbindung 9, worin R&sub5; = CH&sub3;)

6,82 g (60 mmol) Cysteaminhydrochlorid werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird mit 8,4 ml Triethylamin neutralisiert. Die Lösung wird mit einer Lösung aus rohem Boc-L-alaninal, erhalten durch Oxidation von 8,75 g (50 mmol) Boc-Alaninol, in 50 ml Dimethylformamid vermischt, und das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird bei verringertem Druck abdestilliert. Die gebildeten Kristalle werden in Ethylacetat gelöst, und die Lösung wird mit 10%iger Zitronensäure und gesättigtem wässrigen Natriumbicarbonat gewaschen, und die Ethylacetatschicht wird getrocknet. Das Lösungsmittel wird bei verringertem Druck abdestilliert, wobei 4,93 g (42,6%) der gewünschten Verbindung 9-A als farblose Kristalle erhalten werden.
Schmelzpunkt 81,0-84,1ºC
MS 232 (M&spplus;), 159
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δ): 1,24 (3H, d, J = 6,6 Hz), 1,45 (9H, s), 2,1 (1H, br), 4,42 (1H, d, J = 8,1 Hz)

Bezugsbeispiel 10

Herstellung der Verbindung 10-A (Verbindung 10, worin R&sub3; = CH&sub3;)

1,34 g (5,77 mmol) der Verbindung 9-A, erhalten gemäß Bezugsbeispiel 9, und 12,5 g Mangandioxid werden in 58 ml Benzol bei 55ºC während 1,5 Stunden gerührt. Die Suspension wird filtriert, das Lösungsmittel wird bei verringertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wird durch Silicagelflashchromatographie unter Verwendung von Hexan : Ethylacetat (5 : 1) als Eluierungsmittel gereinigt, wobei 118 mg (9,0%) der gewünschten Verbindung 10-A als öliges Material erhalten werden.
[α]D²² = -36,0º (c = 1,29, CH&sub2;Cl&sub2;)
MS 228 (M&spplus;), 172
¹H-NMR (CD&sub2;Cl&sub2;, δ): 1,43 (9H, s), 1,56 (3H, d, J = 7,2 Hz), 4,9~5,2 (2H, m), 7,26 (1H, d, J = 3,3 Hz), 7,67 (1H, d, J = 3,3 Hz)

Bezugsbeispiel 11

Herstellung der Verbindung 11-A (Verbindung 11, worin R&sub4; = H und R&sub5; = PhCH&sub2;)

220 mg (0,604 mmol) der Verbindung 8-A, erhalten gemäß Bezugsbeispiel 8, werden in 9 ml t-Butanol : Wasser (9 : 1) gelöst, 50 mg Palladium auf Kohle werden zugegeben, und das Gemisch wird unter Wasserstoffstrom gerührt. Nach Beendigung der Reaktion wird die Reaktionslösung filtriert, und das Lösungsmittel wird bei verringertem Druck abdestilliert, wobei 165 mg (0,604 mmol) festes Material erhalten werden. Dieses wird in 3 ml Acetonitril gelöst, 267 mg (0,604 mmol) des BOP-Reagens und 192 mg (0,604 mmol) Trifluoracetatsalz, erhalten aus einer bekannten Verbindung 10-B (Verbindung 10, worin R&sub5; = CH&sub2;Ph) werden zugegeben, und dann werden 195 mg (1,51 mmol) Diisopropylethylamin tropfenweise unter Eiskühlung zugegeben. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, das Lösungsmittel wird bei verringertem Druck abdestilliert, der Rückstand wird in Dichlormethan gelöst, und die Lösung wird nacheinander mit 10%iger Zitronensäure, gesättigtem wässrigen Natriumbicarbonat und gesättigter Salzlösung gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wird bei verringertem Druck abdestilliert, und das entstehende Rohprodukt wird durch Silicagelsäulenchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan-Methanol (50 : 1) als Eluierungsmittel gereinigt, wobei 262 mg (94,4%) der gewünschten Verbindung 11-A als amorphes Pulver erhalten werden.
[α]D²&sup7; = -86,4º (c = 0,43, MeOH)
MS 428, 368
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δ): 1,47 (9H, s), 2,29 (2H, d, J = 6,2 Hz), 3,27 (3H, s), 5,63 (1H, m), 7,1~7,3 (6H, m), 7,40 (1H, d, J = 3,3 Hz)

Bezugsbeispiel 11-B

Herstellung der Verbindung 11-B (Verbindung 11, worin R&sub4; = CH&sub3; und R&sub5; = CH&sub3;)

Die Verbindung 8-B (die Verbindung 8, worin R&sub4; = CH&sub3;), nämlich eine bekannte Verbindung, und die Verbindung 10-A, erhalten gemäß Bezugsbeispiel 10, werden alle auf gleiche Weise wie in Bezugsbeispiel 11-A beschrieben behandelt, wobei die gewünschte Verbindung, Ausbeute 62%, als öliges Material erhalten wird.
[α]D²&sup6; = -100º (c = 1,3, MeOH)
MS 365, 324, 309
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δ): 1,26 (3H, d, J = 6,7 Hz), 1,48 (9H, s), 1,63 (3H, d, J = 6,7 Hz), 3,43 (3H, s), 5,2~5,6 (1H, m), 7,23 (1H, d, J = 3,3 Hz), 7,69 (1H, s, J = 3,3 Hz) Beispiel 1 Herstellung einer Verbindung (a) (Verbindung der Formel (I), worin
1 ml konzentrierte Chlorwasserstoffsäure wird unter Eiskühlung zu 108 mg (0,222 mmol) Verbindung 6-G, erhalten gemäß Bezugsbeispiel 6-G, gegeben, und das Gemisch wird 1 Stunde gerührt. Das Gemisch wird zur Trockene bei verringertem Druck eingedampft, der Rückstand wird in 2 ml Dimethylformamid gelöst, und 0,15 ml Triethylamin werden unter Eiskühlung zugegeben. Obgleich sich Triethylaminhydrochlorid abscheidet, wird das Gemisch zur Trockne bei verringertem Druck eingedampft und dann getrocknet. Andererseits werden 105 mg (0,222 mmol) der bekannten Verbindung 11-C (Verbindung 11, worin R&sub4; = CH&sub3; und R&sub5; = PhCH&sub2;) in 0,4 ml Ethylacetat gelöst, und 3,8 ml 2 N Chlorwasserstoff/Ethylacetat werden unter Eiskühlung zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt, das Lösungsmittel wird bei verringertem Druck abdestilliert und der Rückstand wird getrocknet. Die entstehenden hygroskopischen Kristalle werden in 1,6 ml Dimethylformamid gelöst und zu der obigen Tripeptidcarbonsäure zugegeben, und 40 mg (0,222 mmol) 90% DEPC und 62 ul (0,444 mmol) Triethylamin werden unter Eiskühlung zugegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde unter Eiskühlung und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird bei verringertem Druck abdestilliert, und der Rückstand wird in Dichlormethan gelöst und die Lösung mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonat und gesättigter Salzlösung gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wird abdestilliert, der Rückstand wird durch Silicagelflashchromatographie unter Verwendung von Dichlormethan-Methanol (20 : 1) als Eluierungsmittel gereinigt, und die Fraktionen, die die gewünschte Verbindung enthalten, werden weiter durch Sephadex LH-20-Chromatographie unter Verwendung von Hexan : Dichlormethan : Methanol (2 : 7,5 : 2,5) als Eluierungsmittel gereinigt, wobei 137 mg (78,4%) der gewünschten Verbindung (a) als amorphes Pulver erhalten werden.
[α]D²&sup7; = -89,0º (c = 0,60, MeOH)
MS 741, 693
¹H-NMR (CDCl&sub3;, δ): 2,32 (6H, s), 2,96 (3H, s), 3,32 (3H, s), 3,40 (3H, s), 5,56 (1H, m), 6,8~7,3 (9H, m), 7,73 (1H, d, J = 3,3 Hz)

Beispiele 2 bis 8

Die folgenden Verbindungen werden erhalten, indem die Beispiele 2 bis 8 auf gleiche Weise wie Beispiel 1 durchgeführt werden. Beispiele 2 bis 8 (Fortsetzung) Beispiele 2 bis 8 (Fortsetzung)

Claims

1. Tetrapeptidderivat, dargestellt durch die folgende Formel oder ein Salz davon

2. Antitumormittel, enthaltend ein Tetrapeptidderivat oder ein Salz davon nach Anspruch 1 als wirksamen Bestandteil