DE69219220T2

DE69219220T2 - Trennung von Taxanen unter überkritischen Bedingungen

Info

Publication number: DE69219220T2
Application number: DE69219220T
Authority: DE
Inventors: Jayaprakash B Nair
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1991-07-05
Filing date: 1992-06-29
Publication date: 1997-11-20
Anticipated expiration: 2012-06-30
Also published as: CA2072400A1; ATE152106T1; US6737254B2; EP0521675B1; US20030181737A1; EP0521675A1; DK0521675T3; GR3024105T3; JP3062349B2; CA2072400C; ES2101034T3; US20020051827A1; JPH05202016A; DE69219220D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Taxanen aus Gemischen, die diese Verbindungen enthalten, und insbesondere zur Extraktion von Taxanen aus Pflanzen oder aus von einer Pflanze stammenden Materialien. Die extrahierten Taxane können als pharmazeutisch wirksame Stoffe oder als Zwischenverbindungen zur Herstellung von pharmakologisch aktiven Taxanen verwendet werden.
Taxane sind Diterpenverbindungen, die in der Pharrnazie verwendet werden. Es wurde beispielsweise festgestellt, daß Taxol, ein Taxan mit der Struktur
ein wirksames Antikrebsmittel ist, das besonders zur Behandlung von Ovarialkrebs verwendet werden kann. Cephalomannin, ebenfalls ein Taxan, wurde als Chemotherapeutikum zur Remission von Leukämie im US-Patent Nr.4,206,221 beschrieben.
Taxane, wie die vorstehend beschriebenen, können in Pflanzenmaterialien gefunden werden und wurden daraus isoliert. Beispielsweise wurde die Extraktion von Taxol aus Bäumen der Gattung Taxus unter Verwendung von flüssigem Methanol beschrieben. Taxane sind jedoch normalerweise in Pflanzenmaterialien in relativ kleinen Mengen vorhanden, so daß beispielsweise im Fall von Taxol zahlreiche langsam wachsende Eibenbäume als Quelle der Verbindung zerstört werden müßten. Ferner müßten große Mengen von organischen Lösungsmitteln in einer üblichen Flüssigextraktion, die auch noch zeitintensiv sein kann, verwendet werden. Daher wurde in der Wissenschaft weiter nach effizienteren und umweltverträglichen Verfahren zum Erhalt von Taxanen gesucht, die die Verwendung von Pflanzenmaterialien und organischen Lösungsmitteln minimieren.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Extraktion eines Taxans aus einem Gemisch, das ein solches Taxan enthält, und insbesondere zur Extraktion eines Taxans aus einer Pflanze oder einem von einer Pflanze stammenden Material bereit, das den Schritt des Inkontaktbringens des Gemisches mit einer überkritischen Flüssigkeit umfaßt, die mindestens einen Teil des darin enthaltenen Taxans extrahieren kann.
Als Hintergrund muß erwähnt werden, daß das US-Patent US-A-4,964,995 die Abtrennung von Bestandteilen mit geringem Molekulargewicht aus komplexen wäßrigen organischen Gemischen unter Verwendung von überkritischem Kohlendioxid und eines Schleppers, wie einem organischen Lösungsmittel mit niedrigem Siedepunkt, offenbart.
Die vorliegende Erfindung stellt ein effizientes Verfahren zum Erhalt von Taxanen aus Gemischen mit anderen Verbindungen oder Materialien bereit und kann insbesondere zur Abtrennung von Taxol, einem wirksamen Antikrebsmittel, aus Bäumen der Gattung Taxus verwendet werden.
Taxane sind Diterpenverbindungen, die das Kohlenstoffgerüst von Taxan enthalten:
das nicht-gesättigte Ethylenstrukturen in seinem Ringsystem enthalten kann. Die Extraktion eines beliebigen Taxans aus einem ein solches Taxan enthaltenden Gemisch ist im erfindungsgemäßen Schutzbereich. Von besonderem Interesse ist die Abtrennung von Taxanen, die das vorstehend beschriebene Kohlenstoffgerüst aufweisen, in dem zwischen den Positionen 11 und 12 eine Ethylenbindung besteht. Beispiele flir solche Taxane sind Taxol, Cephalomannin, Baccatin III, 10-Desacetylbaccatin III und 10-Desacetylcephalomannin. Der Begriff "Taxan", wie er in dieser Beschreibung verwendet wird, schließt Salze und Solvate von Taxanverbindungen ein. Die Extraktion von Taxol ist eine besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform.
Der Begriff "Extraktion", wie in dieser Beschreibung verwendet, umfaßt die Isolierung und/oder Reinigung einer Taxanverbindung. Beliebige Gemische, die ein oder mehrere Taxane in einem Gemisch mit anderen Verbindungen oder Materialien enthalten, können im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Die Extraktion eines einzigen Taxans oder die gleichzeitige Extraktion von zwei oder mehreren Taxanen können erfindungsgemäß erreicht werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die Abtrennung eines oder mehrerer Taxane aus Pflanzen oder aus von einer Pflanze stammenden Materialien. Beispiele für verwendbare, Taxane enthaltende Pflanzenmaterialien sind Pflanzen der Gattungen Amentotaxus, Austrotaxus, Cephalotaxus, Pseudotaxus, Taxus und Torreya. Bevorzugte Pflanzenmaterialien sind Bäume der Gattung Taxus wie T. brevifolia, T. baccata, T. media, T. wallichiana, T. canadensis und besonders T. cuspidata.
Alle beliebigen, ein oder mehrere Taxane enthaltende Teile der Pflanze, wie Rinde, Wurzeln, Blätter oder Nadeln, Äste, Zweige, Holz, Samen oder ganze Sämlinge, können verwendet werden. Vor dem Kontakt mit der überkritischen Flüssigkeit wird das Pflanzenmaterial vorzugsweise erst zu einer geeigneten Partikelgröße zerkleinert. Das Zerkleinern des Pflanzenmaterials kann durch übliche Verfahren wie durch Verwendung einer Hackmaschine und/oder eines Mahlwerks erreicht werden.
Von den vorstehend beschriebenen Pflanzenmaterialien stammende Materialien können ebenfalls im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Der Begriff "von Pflanzen stammendes Material", wie in dieser Beschreibung verwendet, meint jedes beliebige Material, das von einer pflanzlichen Quelle erhalten wird und ein oder mehrere Taxane im Gemisch mit anderen Verbindungen enthält. Daher kann beispielsweise eine Taxan enthaltenden Pflanzenquelle zuerst durch ein Verfahren wie Flüssigextraktion extrahiert und das so erhaltene Rohextrakt durch das erfindungsgemäße überkritische Extraktionsverfahren zur Abtrennung von Taxan behandelt werden.
Der Begriff "überkritische Flüssigkeit" meint Flüssigkeiten, die sowohl oberhalb ihrer kritischen Temperatur (Tc) als auch ihres kritischen Drucks (Pc) sind, und schließt sowohl einzelne Flüssigkeiten als auch flüssige Gemische ein. Der Fachmann kann ermitteln, ob eine Flüssigkeit überkritisch ist, das heißt, ob sie bei oder über einer Temperatur ist, bei der sie durch Druck nicht verflüssigt werden kann. Die Art und Menge der erfindungsgemäß verwendeten überkritischen Flüssigkeit ist so, daß sie mindestens einen Teil des Taxans, das im damit in Kontakt gebrachten Gemisch enthalten ist, selektiv solubilisieren kann. Besonders bei hohem Druck kann die Verwendung einer höheren Dichte der überkritischen Flüssigkeit eine verbesserte Extraktion bewirken. Die Bedingungen innerhalb des überkritischen Bereichs werden vorzugsweise so gewählt, daß der Abbau des Taxans oder der Taxane, das (die) extrahiert werden soll(en), minimiert oder vollständig vermieden wird.
Beispiele für verwendbare überkritische Flüssigkeiten sind entweder allein oder im Gemisch miteinander oder gegebenenfalls mit einem modifizierenden Mittel Stickoxid (N&sub2;O), Ammoniak (NH&sub3;), Alkane wie n-Butan und n-Pentan, Schwefelhexafluorid (SF&sub6;), Inertgase wie Xe, Halogenalkane, besonders Fluoralkane oder Chlorfluoralkane wie CCl&sub2;F&sub2; und CHF&sub3; und Freon-Verbindungen und am meisten bevorzugt Kohlendioxid (CO&sub2;), das vom Sicherheits- und Umweltgesichtspunkt wunschenswert ist. Der Begriff "modifizierendes Mittel", wie in dieser Beschreibung verwendet, meint jede beliebige Verbindung, die bei der Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren die Fähigkeit der überkritischen Flüssigkeit zur selektiven Extraktion eines oder mehrerer Taxane aus dem damit in Kontakt gebrachten Gemisch erhöht. Bei der Verwendung von Pflanzenmaterialien im erfindungsgemäßen Verfahren kann das modifizierende Mittel beispielsweise die Zeliwand des Pflanzenmaterials durchdringen und den Kontakt zwischen der überkritischen Flüssigkeit und dem Taxan erleichtern.
Beispiele für modifizierende Mittel sind Verbindungen, die für das abzutrennende Taxan Lösungsmittel sind, vorzugsweise gute Lösungsmittel, in denen das abzutrennende Taxan gut löslich ist. Beispiele für bevorzugte modifizierende Mittel sind organische Lösungsmittel wie Alkanole, beispielsweise Methanol, Ethanol und Isopropanol; aromatische Kohlenwasserstoffe wie Toluol; Ester wie Ethylacetat; Chloralkane wie Chloroform (CHCl&sub3;) und Methylenchlorid; Ketone wie Aceton; Propylencarbonat; und Acetonitril. Aceton und Acetonitril sind besonders bevorzugt. Wenn eine pharmazeutische Verwendung für das oder die zu extrahierende(n) Taxan(e) beabsichtigt ist, ist die Verwendung eines pharmazeutisch verträglichen modifizierenden Mittels wünschenswert. Aceton ist im letzten Fall bevorzugt.
Das modifizierende Mittel kann vor dem Kontakt mit der überkritischen Flüssigkeit und/oder als Teil der überkritischen Flüssigkeit mit dem Gemisch, beispielsweise einer Pflanze oder einem von einer Pflanze stammenden Material, in Kontakt gebracht werden. Im letzteren Fall kann das modifizierende Mittel beispielsweise zuvor mit der überkritischen Flüssigkeit vermischt werden, so daß er ein Teil davon ist.
In einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Pflanze oder ein von einer Pflanze stammendes Material zuvor mit dem modifizierenden Mittel in Kontakt gebracht, beispielsweise durch vorheriges Durchtränken (pre-soaking) des ersteren mit dem flüssigen modifizierenden Mittel vor dem Inkontaktbringen des so gebildeten Gemisches mit der überkritischen Flüssigkeit. Die Pflanze oder das von einer Pflanze stammende Material kann ferner nach dem vorherigen Durchtränken und vor dem Kontakt mit der überkritischen Flüssigkeit mit einem flüssigen modifizierenden Mittel angefeuchtet werden. Das vorherige Durchtränken kann über einen nur wenige Sekunden dauernden Zeitraum durchgeführt werden, das heißt, durch einen fast sofortigen Kontakt des Gemisches mit dem modifizierenden Mittel und der überkritischen Flüssigkeit, oder über einen längeren Zeitraum, falls gewünscht. Bevorzugte Zeiten für ein vorheriges Durchtränken sind etwa 1 bis 5 Sekunden bis etwa 1 Stunde.
Bevorzugte Mengen des modifizierenden Mittels liegen im Bereich von Spurenprozent wie 0,001 % oder weniger bis etwa 15%, wobei es sich um Gewichtsprozent modifizierendes Mittel zu dem Gewicht einer Flüssigkeit wie CO&sub2; handelt. Es ist wünschenswert, daß die Menge an modifizierendem Mittel nicht die Menge übersteigt, bei der überkritische Bedingungen bei einer Temperatur und einem Druck, die unter praktischen Gesichtspunkten geeignet sind, erreicht werden.
Die verwendete Menge an überkritischer Flüssigkeit ist eine Funktion der Art der Flüssigkeit, der Temperatur und des Drucks oberhalb der überkritischen Bedingungen, der verwendeten Extraktionsvorrichtung und der zu extrahierenden Menge an Taxan. Allgemein gesagt bringen längere Kontaktzeiten zwischen der überkritischen Flüssigkeit und dem Taxan enthaltenden Gemisch eine erhöhte Ausbeute.
Die Begriffe "Alkan" und "Alkylrest", wie hier verwendet, meinen vorzugsweise Verbindungen oder Gruppen mit geradkettigen oder verzweigten aliphatischen Kohlenwasserstoffketten mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen.
Der Begriff "Halogenalkan", wie hier verwendet, meint vorzugsweise Alkane, wie vorstehend beschrieben, die durch ein oder mehrere aus Chlor, Fluor, Brom und bd ausgewählte Halogenatome substituiert sind. Der Begriff "Chloralkan", wie hier verwendet, meint vorzugsweise die Verbindungen, die durch ein oder mehrere Chloratome substituiert sind.
Der Begriff "Alkanol", wie hier verwendet, meint vorzugsweise Alkane, wie vorstehend beschrieben, die mit einer oder mehrerer Hydroxylgruppen substituiert sind.
Die Begriffe "aromatische Kohlenwasserstoffe" und "aromatische Kohlenwasserstoffreste", wie hier verwendet, bezeichnen vorzugsweise Verbindungen oder Reste mit einem aromatischen Ringsystem von 6 bis 12 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls mit einem oder mehreren Alkylresten, wie vorstehend beschrieben, substituiert ist.
Der Begriff "Ester", wie hier verwendet, meint vorzugsweise Verbindungen der Formel
R- C-O-R¹
in der R und R¹ unabhängig voneinander aus Alkylresten und aromatischen Kohlenwasserstoffresten, wie vorstehend beschrieben, ausgewählt werden.
Der Begriff "Keton", wie hier verwendet, meint vorzugsweise Verbindungen der Formel
R- C-R¹
in der R und R¹ wie vorstehend beschrieben sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einem kontinuierlichen, halbkontinuierlichen oder Batch-Modus durchgeführt werden.
In einer besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird Taxol aus einem Gemisch, vorzugsweise aus einer Pflanze oder einem von einer Pflanze stammenden Material, unter Verwendung einer überkritischen Flüssigkeit und eines modifizierenden Mittels extrahiert. Die überkritische Flüssigkeit ist vorzugsweise Kohlendioxid und das modifizierende Mittel ist vorzugsweise Aceton oder Acetonitril. Kohlendioxid wird vorzugsweise bei einem Druck von mehr als 72,9 atm (7,38 MPa), stärker bevorzugt von 300 bis 700 atm (30,4 bis 72,1 MPa), insbesondere von 400 bis 500 atm (40,5 bis 50,7 MPa) und Temperaturen von mehr als 31,3ºC, stärker bevorzugt von 32ºC bis 55ºC, insbesondere von 35ºC bis 45ºC verwendet.
Nach dem Kontakt mit dem Gemisch, beispielsweise der Pflanze oder einem von einer Pflanze stammenden Material, enffiält die überkritische Flüssigkeit eine bestimmte Menge an Taxan. Die Taxan enthaltende überkritische Flüssigkeit kann anschließend vom Gemisch abgetrennt werden. Die Trennung des Taxans von der überkritischen Flüssigkeit kann durch Verringerung des Drucks und/oder der Temperatur der Flüssigkeit auf unterkritische Bedingungen, bei der das Taxan weniger löslich ist, erreicht werden. Die Taxan enthaltende überkritische Flüssigkeit kann in einem oder mehreren Schritten auf Außendruck gebracht werden, wobei bei mehr als einem Schritt der anschließende Schritt bei einem geringeren Druck als der vorhergehende Schritt erfolgt. Die Taxan enthaltende überkritische Flüssigkeit wird bevorzugt durch Einleiten in eine offene Kammer oder in ein flüssiges Lösungsmittel, die (das) bei einem unterkritischen Druck und einer unterkritischen Temperatur, am meisten bevorzugt bei atmosphärischem Druck und Raumtemperatur, gehalten wird, auf Außendruck gebracht. Wenn die Taxan enthaltende überkritische Flüssigkeit in die Kammer oder das Lösungsmittel gelangt, äquilibriert die Flüssigkeit mit der oder nähert sich den unterkritischen Bedingungen an, bei denen die Kammer oder das flüssige Lösungsmittel gehalten wird, und im ersten Fall wird das Taxan abgeschieden, während im letzten Fall das Taxan durch Auflösen im flüssigen Lösungsmittel aufgenommen wird. Die unterkritischen Bedingungen werden vorzugsweise so gewählt, daß die ursprünglich überkritische Flüssigkeit gasförmig wird, wobei sich das Gas beispielsweise von dem das gelöste Taxan enthaltenden flüssigen Lösungsmittel abtrennt.
Eine weitere Reinigung des erhaltenen Taxans kann, falls gewünscht, durch Verwendung eines oder mehrerer weiterer Schritte der erfindungsgemäßen überkritischen Extraktion erreicht werden. Übliche Reinigungsverfahren wie Hochleistungsflüssigchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Säulenchromatographie oder Flüssigextraktion können ebenfalls verwendet werden. Die überkritische Flüssigkeits chromatographie (SFC) kann ebenfalls verwendet werden. Ein weitere Reinigung kann durchgeführt werden, beispielsweise zur Trennung der Taxane untereinander, wenn zwei oder mehr Taxane aus einem weitere Verbindungen oder Materialien enthaltenden Gemisch erfindungsgemäß extrahiert werden. Vorzugsweise wird das Taxan zuletzt in im wesentlichen reiner Form erhalten.
Wie vorstehend beschrieben sind Taxane Verbindungen, die in der Pharmazie, besonders als Antikrebsmittel, verwendet werden. Taxol ist ein Beispiel für pharmakologisch aktive Taxane, die beispielsweise auch Cephalomannin einschließen. Die pharmakologisch aktiven Taxane können zur Behandlung von Patienten, die an Krebsarten wie Ovarial-, Haut-, Brust-, Darm- oder Lungenkrebs und Leukämie leiden, verwendet werden. Weitere pharmakologisch aktive Verbindungen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden können, sind Taxane, die eine Xyloseeinheit an Position C-7 tragen, beispielsweise die von Senilh et al., Journal of Natural Products, Bd. 47, Nr. 1, (Jan. - Febr. 1984), 131-137, beschriebenen.
Der Begriff "Patienten", wie hier verwendet, meint vorzugsweise Säuger, wie Hunde, Katzen und andere Haustiere, und am stärksten bevorzugt Menschen. Pharmakologisch aktive Taxane können durch vom Fachinann gewählte Mittel, wie orale oder parenterale Mittel, und in wirksamen Dosierungen, die auch gemäß den dem Fachinann bekannten Verfahren gewählt werden können, verabreicht werden. Wirksame Dosierungen sind die, die eine Linderung oder Heilung der Krankheit, für die eine Behandlung gesucht wird, ermöglichen, beispielsweise Dosierungen, die die Größe eines Tumors erhalten oder verringern. Üblicherweise liegt eine effektive Dosis im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 5,0 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Das pharmakologisch aktive Taxan kann allein oder zusammen mit anderen für die Behandlung wirksamen Verbindungen und/oder inerten Substanzen wie pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln oder Trägern verwendet werden.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Taxane können auch als Zwischenverbindungen zur Herstellung weiterer pharmakologisch aktiver Taxane verwendet werden, wobei letztere wie vorstehend beschrieben verwendet werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher die Herstellung dieser pharmakologisch aktiven Taxane durch Bereitstellung eines effizienten Verfahrens zum Erhalt des Taxan- Ausgangsmaterials erleichtern.
Beispiele für Taxane, die durch das effindungsgemäße Verfahren erhalten und als Zwischenverbindungen zur Herstellung von pharmakologisch aktiven Taxanen verwendet werden können, sind Cephalomannin, Baccatin III, 10-Desacetylbaccatin III und 10-Desacetylcephalomanmn. Dem Fachmann bekannte Verfahren können zur Umwandlung des Taxan-Zwischenprodukts in das gewünschte pharmakologisch aktive Taxan verwendet werden. Denis et al., J. Am. Chem. Soc. 110 (1988), 5917-5919, beschreiben beispielsweise ein Verfahren zur Umwandlung von 10-Desacetylbaccatin III in Taxol. Eine reduktive Spaltung der C-13-Seitenkette beispielsweise, die die Umwandlung von Cephalomannin in Taxol ermöglicht, wird von Magri et al., J. Org. Chem. Bd. 51 Nr.16 (1986), 3239-3242, beschrieben. Das umzuwandelnde Taxan kann inaktiv sein, obwohl die Umwandlung eines aktiven Taxans in ein anderes Taxan beabsichtigt ist, wobei das letzte bei der Behandlung einer anderen Krankheit effektiv ist oder eine größere Wirksamkeit als das Ausgangsmaterial aufweist.
Die folgenden Beispiele sollen das erfindungsgemäße Verfahren erläutern.

Beispiel

Überkritische Extraktion von Taxol aus Taxus cusnidata

A. Extraktionsvorrichtung

Figur 1 zeigt die Anordnung der für die nachstehenden Extraktionen verwendeten Bestandteile. Flüssiges Kohlendioxid wurde durch das Pumpe/Steuerungsgerät (1) (Suprex SFE-50 Microextraktor mit einer Einspritzpumpe der Suprex Corp.) unter inneren Druck gesetzt. Durch Öffnen des Auslaßventils auf der Pumpe wird das überkritische Kohlendioxid in den Extraktionsbehälter (2) (HPLC-Sicherheitssäule (21,2 mm x 100 mm) aus rostfreiem Stahl mit einer Nennleistung von 6 000 psi (41,4 MPa) mit Fritten aus rostfreiem Stahl und Zugang zu beiden Enden der Säule) geleitet. Der Extraktionsbehälter wurde in einem Ofen (3) bei einer konstanten Temperatur gehalten. Im Ofen war das flüssige Kohlendioxid über seiner kritischen Temperatur und über seinem kritischen Druck und blieb daher im überkritischen Zustand. Ein Sechs-Wege- Ventil (4) kontrollierte und steuerte das überkritische Kohlendioxid vom Extraktionsbehälter. Bei Einstellung des Ventilschalters (5) auf den Injektionsmodus füllte sich der Extraktionsbehälter mit der überkritischen Flüssigkeit für eine statische Extraktion. Bei Einstellung des Ventils auf den Lademodus wurde die überkritische Flüssigkeit für eine dynamische Extraktion in den Restriktor (ein Rohr aus rostfreiem Stahl mit einer Länge von 30 cm bei einem inneren Durchmesser von 0,020 Inch (0,508 mm), das zur Beschrähkung des Kohlendioxidflusses am äußersten Ende mit Sicken versehen war) geleitet. Das Restriktorende (6) tauchte in die im Kollektor (7) (ein Depot mit 1 Liter HPLC-Lösungsmittel) enthaltene Flüssigkeit ein.
Der Restriktor wurde zur Aufrechterhaltung von hohen Drücken im Extraktionsbehälter bei der Ableitung der überkritischen Flüssigkeit aus dem System verwendet. Bei der Extraktion von Pflanzenmaterial kann der kleine innere Durchmesser von im Handel erhältlichen Restriktoren verstopfen. Zur Herstellung eines reproduzierbaren Restriktors zur Aufrechterhaltung von hohen Gegendrücken mit einem Minimum an Verstopfüng wurde eine Modifikation der im Handel erhältlichen Restriktorausbildung hergestellt.
Ein 20 mm langes Stück eines 5 µm-Rohrs aus rostfreiem Stahl wurde mit einem Rohrschneider glatt geschnitten. Das Rohr war mit einer Zwinge aus rostfreiem Stahl ausgestattet, die an dem Rohr über einen aufnehmenden Adaptor befestigt war. Ein männliches Anschlußstück wurde auf dem Restriktor befestigt und das Ende gegenüber der Zwinge wurde mit einem großen Tischschraubstock eingedrückt, der das äußerste Ende des Endes (2 mm) gleichmäßig mit Sicken versah.
Das Ende des Restriktors wurde, wie nachstehend beschrieben, angepaßt. An das Ende eines 20 µm-Rohrs aus rostfreiem Stahl wurde die männliche Verbindung angeordnet und mit einem doppelten aufnehmenden Anschlußstück, das auf einen Innendurchmesser von 20 µm ausgebohrt war, verbunden. Der Restriktor wurde am Anschlußstück angeordnet und das Ende mit einem digitalen Blasenströmungsmeßgerät verbunden. Die Strömung durch den Restriktor wurde bei einem Betriebsdruck von 430 atm (43,6 MPa) überwacht. Der weite Teil der Sicken wurde wie benötigt mit einer Zange geöffnet, um eine Strömungsrate aufrechtzuerhalten, die schnell genug war, um die interessierenden Verbindungen auszuspülen, jedoch langsam genug, damit es keine Aerosolbildung gab, die zu einem Verlust der Verbindung führen könnte. Eine Restriktorströmung von 400 ml/min wurde dazu verwendet.

B. Extraktionsverfahren

Zerkleinertes Pflanzenmaterial (Taxus cuspidata, 10 ± 0,1 g) wurde in einem Wägeschiffchen aus Plastik ausgewogen. Mit einem Meßzylinder wurden 10 ml Acetonitril abgemessen, über das Pflanzenmaterial verteilt und mit einem Spatel gut vermischt. Das Wägeschiffchen wurde zur Vermeidung der Verdampfüng von Acetonitril abgedeckt. Man ließ die Probe 20 Minuten durchtränken.
Etwas silanisierte Glaswolle wurde in den Extraktionsbehälter gegeben und auf dessen Boden geschoben. Es wurde ausreichend Glaswolle für eine etwa 1 cm dicke Schicht verwendet.
Mittels eines Pulvertrichters wurde der Extraktionsbehälter mit dem durchtränkten Material gefüllt und mit einem Glasstab verdichtet. Nach dem Transfer des gesamten Materials in den Extraktionsbehälter wurden weitere 5 ml Acetonitril der Probe im Behälter zugesetzt. Das Material füllte den Extraktionsbehälter so, daß etwa 2 cm an freiem Raum über der Probe waren. Dieser Freiraum wurde mit einem weiteren Stopfen aus Glaswolle (etwa 2 cm dick) ausgefüllt.

Statische Extraktion

Die Pumpe wurde auf Betriebsdruck gebracht und das Auslaßventil geöffnet, um den Extraktionsbehälter mit überkritischem Kohlendioxid zu füllen. Die Bedingungen waren jetzt so, daß flüssiges Kohlendioxid im Extraktionsbehälter vorhanden war. Das System konnte mit dem überkritischen Betriebsdruck und der überkritischen Betriebstemperatur, die in Tabelle 1 dargestellt sind, äquilibrieren. Nach Erreichen der vorgesehenen Temperatur und des vorgesehenen Drucks begann die Zeitmessung der statischen Extraktion. Die auf dem Steuerungsgerätmonitor angezeigten Dichteangaben wurden abgelesen.

Dynamische Extraktion

Nach einer 30-minütigen statischen Extraktion wurde das Ventil umgestellt, um die überkritische Flüssigkeit in den Kollektor freizusetzen. Der Kollektor enthielt 50 ml Acetonitril, in das das Ende des Restriktors etwa 1,5 bis 2,0 Inch (3,8 bis 5,1 cm) eingetaucht war. Der Zeitnehmer wurde auf weitere 30 Minuten eingestellt, währenddessen Blasenbildung am Ende des Restriktors beobachtet wurde. Nach 30 Minuten wurde das Ventil erneut umgeschaltet und der Restriktor wurde auf Außendruck gebracht. Die Farbe des Acetonitrils im Kollektor war jetzt dunkelgrün.

Gewinnung der Probe

Der Inhalt des Kollektors wurde in zwei 50 ml-Röhrchen transferiert. Der Kollektor wurde mit 5 ml Acetonitril, das mit dem Inhalt der Röhrchen vermischt wurde, gewaschen. Das Probenvolumen wurde durch Rotationsverdampfüng bis zur Trockne reduziert und die Menge des Rückstands gewogen. Der Rückstand wurde in 1, ml Acetonitril gelöst. Diese extrahierte Taxollösung wurde bis zur HPLC-Analyse bei -20ºC gehalten.

C. Ergebnisse

Doppelte Extraktionen wurden bei jedem in Tabelle I dargestellten Satz von Bedingungen zur Überprüfüng der Reproduzierbarkeit der Extraktion durchgeführt. Tabelle II zeigt die extrahierten Taxolmengen unter den verschiedenen Temperatur- und Druckbedingungen.
Figur 2 erläutert den Zusammenhang zwischen der extrahierten Taxolmenge und der Dichte bei zwei Drücken. Die Extraktion bei hohem Druck und niedriger Temperatur liefert die höchste Dichte und bei 430 atm (43,6 MPa) die höchste Taxolausbeute. Eine Temperatur von 35ºC und ein Druck von 430 atm (43,6 MPa) waren die besten Bedingungen für diese Extraktion in den untersuchten Temperatur- und Druckbereichen. Figur 3 erläutert den Zusammenhang zwischen der extrahierten Taxolmenge und der Temperatur. Figur 4 zeigt den erhöhten Einfluß der Dichte auf die Taxolausbeute bei einer Verringerung der festgelegten Temperatur.
Extraktionen von zerkleinertem Pflanzenmaterial ohne eine Anfeuchtung mit Acetonitril lieferten keine nachweisbaren Taxolmengen. Eine Modifikation von überkritischem Kohlendioxid wurde daher verwendet. Tabelle 1 Extraktionsbedingungen Tabelle II
1 atm = 0.1013 MPa

Beispiel 2

Überkritische Extraktion von Taxol aus Taxus cuspidata:

Verwendung von höherem Druck

Das Extraktionsverfahren von Beispiel 1 wurde verwendet, ausgenommen daß ein Druck von 680 atm (68,9 MPa) und eine Temperatur, wie in Tabelle III angegeben, verwendet wurden, und das verwendete Gerät war ein überkritischer Extraktor-Model 703 Dionex. Taxol wurde in den ebenfalls in Tabelle III dargestellten Mengen extrahiert. Tabelle III

Beispiel 3

Überkritische Extraktion von Taxol aus Taxus cuspidata:

Methanol als modifizierendes Mittel

Das Extraktionsverfahren von Beispiel 1 wurde verwendet, ausgenommen daß Methanol anstelle von Acetonitril als modifizierendes Mittel verwendet wurde. Die verwendete Temperatur, der verwendete Druck und die extrahierte Taxolmenge sind in Tabelle IV dargestellt. Tabelle IV
1 atm = 0.1013 MPa

Claims

1. Verfahren zur Extraktion eines Taxans aus einem das Taxan enthaltenden Gemisch, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des Gemisches mit einer überkritischen Flüssigkeit, die mindestens einen Teil des darin enthal tenen Taxans extrahieren kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein oder mehrere Taxane, ausgewählt aus Taxol, Cephalomannin, Baccatin III, 10-Desacetylbaccatin III oder 10-Desacetylcephalomannin, extrahiert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei Taxol extrahiert wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gemisch Pflanzenmaterial oder von einer Pflanze stammendes Material ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Pflanzenmaterial ausgewählt ist aus einer Pflanze der Gattung Amentotaxus, Austrotaxus, Cephalotaxus, Pseudotaxus, Taxus oder Torreya.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Pflanzenmaterial von einem Baum der Gattung Taxus ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Baum ausgewählt ist aus T. brevifolia, T. baccata, T. media, T. wallichiana, T. canadensis oder cuspidata.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5, 6 oder 7, wobei das Pflanzenmaterial einen oder mehrere Teile der Pflanze, ausgewählt aus Rinde, Wurzeln, Blättern oder nadeln, Ästen, Zweigen, Holz, Samen oder ganzen Sämlingen, einschließt.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die überkritische Flüssigkeit allein oder im Gemisch miteinander oder mit einem modifizierenden Mittel Distickstoffoxid, Ammoniak, ein Alkan, Schwefelhexafluorid, ein inertes Gas, ein Habalkan oder Kohlendioxid einschließt, wobei das modifizierende Mittel eine Verbindung ist, die die Fähigkeit der überkritischen Flüssigkeit zur Extraktion des Taxans aus dem Gemisch erhäht.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die überkritische Flüs sigkeit Kohlendioxid im Gemisch mit einem modifizierenden Mittel ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das modifizierende Mittel ein organisches Lösungsmittel für das zu extrahierende Taxan ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das modifizierende Mittel ein Alkanol, ein aromatischer Kohlenwasserstoff, ein Ester, ein Chloralkan, ein Keton, Propylencarbonat oder Acetonitril ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das modifizierende Mittel Aceton oder Acetonitril ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei das modifizierende Mittel zuvor mit einem Pflanzenmaterial oder mit von einer Pflanze stammendem Material in flüssiger Form in Kontakt gebracht wird und anschließend das so gebildete Gemisch mit überkritischem Kohlendioxid in Kontakt gebracht wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei der angewandte Druck des Kohlendioxids größer als 72,9 atm (7,38 MPa) ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der angewandte Druck des Kohlendioxids 400 bis 500 atm (40,5 bis 50,7 MPa) ist.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei die Temperatur des eingesetzten Kohlendioxids höher als 31,3ºC ist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Temperatur des eingesetzten Kohlendioxids 35 bis 45ºC beträgt.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Taxan-enthaltende überkritische Flüssigkeit nach dem Kontakt mit dem Gemisch davon abgetrennt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Taxan-enthaltende überkritische Flüssigkeit durch Einleiten in eine offene Kammer oder in ein flüss ges Lösungsmittelfür das Taxan auf Außendruck gebracht w rd.