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Die
vorliegende Erfindung betrifft die neue Verwendung monofluorierter
polycyclischer aromatischer Verbindungen (MF-PA) als Begleitsubstanzen,
als externe Standards oder als Modellverbindungen polycyclischer
aromatischer Verbindungen (PA) in physikalischen, chemischen und
biologischen Prozessen. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung
neue Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Verbindungen
PA, zur Kalibrierung von Analyseverfahren für Verbindungen PA und zur Analyse
biochemischer Reaktionen mit von Verbindungen PA, die unter Verwendung
mindestens einer Verbindung MF-PA durchgeführt werden.
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Verbindungen
PA umfassen nicht nur reine polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe,
sondern auch heterocyclische Analoga wie sauerstoff-, schwefel- und/oder stickstoffhaltige
Derivate. Sie entstehen beispielsweise bei unvollständig verlaufenden
pyrolytischen Prozessen.
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Ihr
Ursprung kann natürlicher
Art wie Waldbrand oder Eruptionen oder Exhalationen von Vulkanen oder
anthropogen wie industrielle Verbrennungsprozesse, Motorverkehr
oder Hausbrand sein. Biogen entstehen Verbindungen PA aus Huminsäuren durch
Kondensationsreaktionen und aus Aminosäuren über den Isoprenstoffwechsel
durch Ringschluß in
Mikroorganismen, Pilzen, Pflanzen und Tieren. Die vielfältigen Emissionsquellen
führen
zum ubiquitären
Auftreten in den unterschiedlichsten Matrices, wie dies auch die
SRMs (Standard Reference Materials, Standardreferenzmaterialien)
des NIST (National Institute of Standards and Technology) belegen.
Um dies zu veranschaulichen seien einige SRMs genannt: SRM 1648: Ölproben
mit petrogenen Verbindungen PA; SRM 1649: Luftschwebstoffe; SRM
1950: Dieselpartikel; SRM 1941: maritimes Sediment aus einem Hafenbecken;
SRM 1974: Muschelgewebe von Mytilus edulis; oder SRM 869: Tetrabenzonaphthalin,
Phenanthro[3,4-c]phenanthren und Benzo[a]pyren. Wegen Teerzusätzen können Kosmetika und
Shampoos ebenfalls Verbindungen PA enthalten. Des weiteren kommen
die Verbindungen PA nicht nur auf der Erde, sondern auch im interstellaren
Raum, in galaktischen Nebeln und in aktiven Galaxien vor.
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Verbindungen
PA zeichnen sich durch eine geringe Polarität und Wasserlöslichkeit
aus. Bedingt durch die geringe Wasserlöslichkeit und starke Adsorption
an organisches und anorganisches Material resultiert eine geringe
Mobilität
im Boden. Der Transport und die Anreicherung in spezifischen Bodenschichten
erfolgt parallel zur Anreicherung organischer Substanzen wie Mineralöle, Detergentien
und Lösemittel.
Der Abbau von Verbindungen PA in der Chemosphäre und Biosphäre erfolgt
sowohl abiotisch durch Photolyse und Ozonolyse als auch biotisch
durch anaerobe und aerobe mikrobielle Tätigkeit.
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Verbindungen
PA sind sehr unterschiedlich in ihrer toxischen und karzinogenen
Wirkung, weswegen die Qualifizierung aller Verbindungen PA in einer
Umweltprobe von großer
Bedeutung ist. Die Resorption der Verbindungen PA erfolgt zum einen
auf inhalativem Wege durch Kleinstpartikel, an deren Oberfläche die
Verbindungen PA adsorptiv gebunden sind, zum anderen werden sie über die
Nahrungskette aufgenommen und konzentriert, da sie im Fettgewebe
akkumuliert werden.
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Gleiches
gilt mutatis mutandis für
die polyhalogenierten Verbindungen PA, insbesondere die polyhalogenierten
sauerstoffhaltigen Verbindungen wie Dioxine und Furane, von denen
einige zu den Supergiften zählen.
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Die
Bedeutung der Verbindungen PA für
die Umweltanalytik gründet
in der vielfältigen
Exposition des Menschen durch diese Stoffklasse. Keine andere Stoffklasse
besitzt einen höheren
Anteil an Krebs erzeugenden Substanzen. Schon im achtzehnten Jahrhundert
berichtete ein englischer Arzt über
das signifikant erhöhte Auftreten
von Hautkrebs bei Schornsteinfegern, das heute auf die ständige Exposition
von Ruß zurückgeführt werden
kann.
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Für einige
Verbindungen PA, insbesondere die kondensierten polycyclischen aromatischen
Verbindungen (cPAC) Naphthalin, Acenaphthylen, Acenaphthen, Phenanthren,
Fluoren, Anthracen, Chrysen, Pyren, Fluoranthen, Benzo[a]anthracen,
Benzo[k]fluoranthen, Benzo[b]fluoranthen, Benzo[a]pyren, Dibenzo[a:h]anthracen,
Benzo[g:h.i]perylen und Indeno[1,2,3-c:d]pyren, die zusammenfassend
auch als EPA-cPAC der Environmental Protection Agency bezeichnet
werden, wurde in Subkutantests das karzinogene Potential an Mäusen verifizert
und quantifiziert. So verursacht Benzo[a]pyren in Milligrammdosen
bei über
33 Prozent der Population der exponierten Mäuse Krebs. In dieser Hinsicht
ist die Verwendung von juckreizstillenden und bakteriziden, Verbindungen
PA enthaltenden Teerzusätzen
in Kosmetika und Shampoos besonders problematisch. So sind noch
immer Shampoos mit einem Gehalt an Benzo[a]pyren von 50 mg/kg am
Markt erhältlich.
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Die
Verbindungen PA induzieren die Synthese der sie abbauenden Enzyme
wie Dioxigenase, die beim Säuger
durch Cytochrom P-450 eingeleitet wird. Die Ausscheidung der Abbauprodukte
erfolgt über
den Harn. Der karzinogene Wirkungsmechanismus der Entstehung bösartiger
Tumore durch Verbindungen PA erfolgt durch direkte Reaktion mit
der DNA (Desoxyribonucleinsäure).
Ursachen hierfür
ist ein Molekülbereich,
in dem sich zwei elektrophile Zentren in Abstand von 280 pm voneinander
befinden (Bay-Region). Dies entspricht dem Abstand der Basenpaare
in der DNA, wodurch es zur Adduktbildung über metabolische Epoxidbildung
kommt.
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Aus
all diesen Gründen
ist die qualitative und quantitative Analytik von Verbindungen PA
von allergrößter Bedeutung,
und es existieren zahlreiche entsprechende physikalische, physikalisch
chemische und chemische Verfahren, die indes weiterentwickelt werden
müssen,
um gerade im Spurenbereich zu verläßlichen Aussagen zu gelangen.
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Zu
diesem Zweck wurden und werden Analoge, Homologe, Isomere, Enantiomere
oder mit Isotopen markierte Analoge der Analyten verwendet. Insbesondere
finden deuterierte Verbindungen PA als interne Standards Verwendung
(vgl. den Artikel von W. E. May und S. A. Wise in Analytical Chemistry,
Band 56, Seiten 225 und folgende, 1984). Des weiteren werden methylierte
Verbindungen PA angewandt, wobei zu beachten ist, daß zahlreiche
Umweltproben bereits methylierte Verbindungen PA enthalten. Außerdem ist
es von Nachteil, daß sich
diese methylierten Verbindungen PA in ihren Eigenschaften häufig stark
von den Stammverbindungen unterscheiden, so daß sie im Grunde nicht als interne
Standards in Betracht kommen.
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Ein
gewisser Fortschritt bietet hier die Zugabe fluorierter Verbindungen
PA als interne Standards zu den Analyten, wie sie beispielsweise
in dem Artikel von J. T. Anderson und U. Weis, "Gas chromatographic determination of
polycyclic aromatic compounds with fluorinated analogues as internal
standards", in Journal of
Chromatography A, Band 659 (1994), Seiten 151 bis 161, beschrieben
wird.
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Es
wird indes hierin nicht gelehrt, wie die internen Standards im Sinne
eines pseudoidentischen Verhaltens den im Analyten enthaltenen Verbindungen
PA angepaßt
werden sollen. Des weiteren wird keine Lehre erteilt, nach welchen
Kriterien fluorierte Verbindungen PA als externe Standards zur Kalibrierung
physikalischer, chemischer und/oder biologischer Prozesse ausgewählt werden
können.
Nicht zuletzt fehlen auch Hinweise darauf, welche fluorierte Verbindungen
PA als Modellverbindungen für
Verbindungen PA in chemischen und/oder biologischen Prozessen verwendet
werden können.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, neue Begleitsubstanzen oder interne
Standards, neue externe Standards und neue Modellverbindungen für polycyclische
aromatische Verbindungen PA, die die Nachteile des Standes der Technik
nicht mehr länger
aufweisen, im Rahmen physikalischer, chemischer und biologischer
Prozesse bereitzustellen. Insbesondere sollen die neuen Begleitsubstanzen
oder internen Standards im Sinne eines pseudoidentischen Verhaltens
gemeinsam mit den Verbindungen PA physikalische, chemische und/oder
biologische Prozesse durchlaufen und anschließend gemeinsam mit diesen oder
getrennt von diesen detektiert und/oder analysiert werden. Des weiteren
sollen die neuen externen Standards im Sinne eines pseudoidentischen
Verhaltens physikalische, chemische und/oder biologische Prozesse
zu Zwecken ihrer Kalibrierung durchlaufen und getrennt von den Verbindungen
PA analysiert und/oder detektiert werden. Nicht zuletzt sollen die
neuen Modellverbindungen ebenfalls im Sinne eines pseudoidentischen
Verhaltens anstelle der Verbindungen PA chemische und/oder biologische
Prozesse zu Zwecken der Aufklärung
von Reaktionsmechanismen durchlaufen, wonach deren Reaktionsprodukte
mit detektiert und/oder analysiert werden.
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Demgemäß wurde
die neue Verwendung monofluorierter polycyclischer aromatischer
Verbindungen (MF-PA) als Begleitsubstanzen oder interne Standards,
als externe Standards oder als Modellverbindungen polycyclischer
aromatischer Verbindungen (PA) in physikalischen, chemischen und
biologischen Prozessen gefunden.
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Im
folgenden wird die neue Verwendung monofluorierter polycyclischer
aromatischer Verbindungen (MF-PA) als „erfindungsgemäße Verwendung" bezeichnet.
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Außerdem wurde
das neue Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von
Verbindungen PA (Analyten) durch
- I) Aufbereitung
mindestens eines Analyten PA und/oder der Probe, worin er enthalten
ist, sowie
- II) Trennung und
- III) Detektion und/oder Analyse des oder der Analyten PA
gefunden,
bei dem mindestens eine Verbindung MF-PA im Verfahrensschritt I,
II und/oder III als Begleitsubstanz in bekannter Konzentration als
interner Standard zugesetzt wird und das im folgenden als „erfindungsgemäßes Verfahren
1 bezeichnet wird.
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Des
weiteren wurde das neue Verfahren zur Kalibrierung von Analyseverfahren
für Verbindungen
PA durch die quantitative Analyse mindestens eines externen Standards
mit dem zu kalibrierenden Analyserfahren, wobei der externe Standard
in unterschiedlichen Konzentrationen analysiert und aus den resultierenden Meßwerten
mindestens eine Eichkurve gebildet wird, gefunden, bei dem man als
externer Standard mindestens eine Verbindung MF-PA verwendet und
das im folgenden als „erfindungsgemäßes Verfahren
2" bezeichnet wird.
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Nicht
zuletzt wurde das neue Verfahren zur Analyse biochemischer Reaktionen
von Verbindungen PA in einem Organismus durch Einführen mindestens
einer Modellverbindung in den Metabolismus des Organismus, Metabolisieren
der Modellverbindungen sowie Isolieren, Trennen und Identifizieren
der Metaboliten gefunden, bei dem man als Modellverbindung eine
Verbindung MF-PA verwendet, die dieselbe Grundstruktur wie die Verbindung
PA aufweist und das im folgenden als „erfindungsgemäßes Verfahren
3" bezeichnet wird.
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Im
Hinblick auf den Stand der Technik war es überraschend und für den Fachmann
nicht vorhersehbar, daß die
außerordentlich
komplexe Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde lag, mit
Hilfe der erfindungsgemäßen Verwendung
gelöst
werden konnte. Insbesondere überraschte,
daß die
erfindungsgemäß zu verwendenden
Verbindungen MF-PA
im Rahmen so zahlreicher komplexer chemischer, physikalischer und
sogar biologischer Systeme und Verfahren anwendbar sind und dabei
bezüglich
der jeweiligen Stammverbindung ein pseudoidentisches Verhalten zeigen.
Dabei bieten die erfindungsgemäß zu verwendenden
Verbindungen MF-PA noch den ganz besonderen Vorteil, daß sie neben
der jeweiligen Stammverbindung PA in einfacher Weise analysiert
und/oder detektiert werden können.
Darüber
hinaus können
die Verbindungen MF-PA einfach und in hohen Ausbeuten hergestellt
werden.
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Im
Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung
und erfindungsgemäßen Verfahren
1 bis 3 resultieren als zusätzliche überraschende
besondere Vorteile die leichte Identifizierbarkeit der erfindungsgemäß zu verwendenden
Verbindungen MF-PA und ihrer Folgeprodukte, insbesondere ihrer Metabolite.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung spricht man von pseudoidentischem
Verhalten einer Verbindung MF-PA, wenn sie sich in physikalischen,
chemischen und/oder biochemischen (in vitro und in vivo) Prozessen
hinsichtlich der zu untersuchenden Merkmale ähnlich, fast genauso oder genauso
verhält
wie die betreffende Stammverbindung PA. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung
als Begleitsubstanz oder interner Standard ist es erfindungsgemäß von Vorteil,
wenn sich die Verbindung MF-PA fast genauso verhält wie die betreffende Stammverbindung
PA, weil hierbei zwischen diesen beiden Verbindungen gut differenziert
werden kann. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung als externer
Standard ist es erfindungsgemäß von Vorteil, wenn
sich die Verbindung MF-PA fast genauso oder genauso verhält wie die
betreffende Stammverbindung PA, weil hierdurch die besonders genaue
Kalibrierung eines Prozesses möglich
ist.
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Erfindungsgemäß handelt
es sich bei den Verbindungen PA um polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe,
die in ihrem Ringsystem
- – frei von Heteroatomen sind
(PAC) oder
- – mindestens
ein Sauerstoffatom (PAOC),
- – mindestens
ein Schwefelatom (PASC),
- – mindestens
ein Stickstoffatom (PANC),
- – mindestens
ein Sauerstoffatom und mindestens ein Schwefelatom (PAOSC),
- – mindestens
ein Sauerstoffatom und mindestens ein Stickstoffatom (PAONC),
- – mindestens
ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom (PANSC) oder
- – mindestens
ein Sauerstoffatom, mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein
Stickstoffatom (PANOSC) enthalten.
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Diese
Verbindungen PA können
synthetischen oder natürliche
Ursprungs sein.
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Beispiele
für Verbindungen
PAC sind Biphenyl, Triphenylene, Polyphenylene und kondensierte
polycyclische aromatische Verbindungen (cPAC).
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Beispiele
für Triphenylene
PAC sind 1,2 -, 1,3- oder 1,4-Diphenylbenzol (Terphenyl).
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Beispiele
für Polyphenylene
PAC sind Quaterphenyl oder 1,3,5-Triphenylbenzol.
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Beispiele
für Verbindungen
cPAC sind die umweltanalytisch und medizinisch besonders bedeutsamen EPA-cPAC
der Environmental Protection Agency Naphthalin, Acenaphthylen, Acenaphthen,
Phenanthren, Fluoren, Anthracen, Chrysen, Pyren, Fluoranthen, Benzo[a]anthracen,
Benzo[k]fluoranthen, Benzo[b]fluoranthen, Benzo[a]pyren, Dibenzo[a:h]anthracen,
Benzo[g:h.i]perylen und Indeno[1,2,3-c:d]pyren oder die SRM 869-cPAC
des NIST Tetrabenzonapthalin oder Phenanthro[3,4-c]phenanthren.
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Beispiele
für Verbindungen
PAOC sind insbesondere Dibenzodioxin oder Dibenzofuran.
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Beispiele
für Verbindungen
PASC sind Benzo[b]thiophen, Dibenzodithiin (Thianthren), Dibenzothiophen
oder Naphtho[2,3-b]thiophen, insbesondere Dibenzodithiin oder Dibenzothiophen.
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Beispiele
für Verbindungen
PANC sind Chinolin, Isochinolin, Benzo[h]isochinolin, Acridin, Carbazol, Naphthyridin,
Phenanthrolin, Phenanthridin oder Pyrazino[2,3-a]acridin.
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Beispiele
für Verbindungen
PAOSC sind Phenoxathiin oder Thieno[2,3-b]furan, insbesondere Phenoxathiin.
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Ein
Beispiel für
Verbindungen PAONC ist Phenoxazin.
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Beispiele
für Verbindungen
PANSC sind Phenothiazin oder Imidazo[2,1-b]thiazol.
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Ein
Beispiel für
Verbindungen PANOSC ist Thieno[2,3-b]oxazol.
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Die
vorstehend beschriebenen Verbindungen PA können mit mindestens einem Chlor-,
Brom- und/oder Iodatom substituiert sein. Umweltanalytisch und medizinisch
bedeutsam sind insbesondere die polychlorierten, polybromierten
sowie polychlorierten und polybromierten Verbindungen PA. Von diesen
sind wiederum die polychlorierten, polybromierten sowie polychlorierten
und polybromierten Biphenyle, Terphenyle oder Quaterphenyle PAC,
wie sie beispielsweise als Transformatorenöle oder Flammschutzmittel für Kunststoffe
verwendet werden, besonders bedeutsam. Des weiteren sind die polychlorierten,
polybromierten sowie polychlorierten und polybromierten Dibenzodioxine
und Dibenzofurane PAOC, die auch als Supergifte oder Seveso-Gifte
bezeichnet werden, von ganz besonderer Bedeutung. Insbesondere können sie
aus den vorstehend genannten Transformatorenölen oder Flammschutzmitteln
durch pyrolytische Prozesse entstehen.
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Als
Stammverbindungen der erfindungsgemäß zu verwendenden monofluorierten
polycyclischen aromatischen Verbindungen MF-PA kommen grundsätzlich alle
in der Natur vorkommenden oder synthetischen Verbindungen PA in
Betracht. Vorzugsweise werden alle vorstehend beschriebenen Verbindungen
PA als Stammverbindungen angewandt.
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Bei
den vorteilhaften erfindungsgemäß zu verwendenden
monofluorierter polycyclischen aromatischen Verbindungen MF-PA handelt
es sich demnach um monofluorierte polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe,
die in ihrem Ringsystem
- – frei von Heteroatomen sind
(MF-PAC) oder
- – mindestens
ein Sauerstoffatom (MF-PAOC),
- – mindestens
ein Schwefelatom (MF-PASC),
- – mindestens
ein Stickstoffatom (MF-PANC),
- – mindestens
ein Sauerstoffatom und mindestens ein Schwefelatom (MF-PAOSC),
- – mindestens
ein Sauerstoffatom und mindestens ein Stickstoffatom (MF-PAONC),
- – mindestens
ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom (MF-PANSC) oder
- – mindestens
ein Sauerstoffatom, mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein
Stickstoffatom (MF-PANOSC) enthalten.
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Beispiele
geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender
Verbindungen MF-PAC sind monofluorierte Biphenyle, Triphenylene,
Polyphenylene und monofluorierte kondensierte polycyclische aromatische
Verbindungen (MF-cPAC).
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Beispiele
gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender
Triphenylene MF-PAC sind die stellungsisomeren monofluorierten 1,2
-, 1,3- oder 1,4-Diphenylbenzole (Terphenyle).
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Beispiele
gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender
Polyphenylene MF-PAC sind die stellungsisomeren monofluorierten
Quaterphenyle oder 1,3,5-Triphenylbenzole.
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Beispiele
gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender
Verbindungen MF-cPAC sind die stellungsisomeren monofluorierten
Naphthaline, Acenaphthylene, Acenaphthene, Phenanthrene, Fluorene,
Anthracene, Chrysene, Pyrene, Fluoranthene, Benzo[a]anthracene,
Benzo[k]fluoranthene, Benzo[b]fluoranthene, Benzo[a]pyrene, Dibenzo[a:h]anthracene,
Benzo[g:h.i]perylene und Indeno[1,2,3-c:d]pyrene, Tetrabenzonapthaline
oder Phenanthro[3,4-c]phenanthrene.
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Beispiele
gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender
Verbindungen MF-PAOC sind die stellungsisomeren monofluorierten
Dibenzodioxine oder Dibenzofurane.
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Beispiele
gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender
Verbindungen MF-PASC sind die stellungsisomeren monofluorierten
Benzo[b]thiophene, Dibenzodithiine (Thianthrene), Dibenzothiophene
oder Naphtho[2,3-b]thiophene, insbesondere die Dibenzodithiine oder
Dibenzothiophene.
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Beispiele
gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender
Verbindungen MF-PANC sind die stellungsisomeren monofluorierten
Chinoline, Isochinoline, Benzo[h]isochinoline, Acridine, Carbazole,
Naphthyridine, Phenanthroline, Phenanthridine oder Pyrazino[2,3-a]acridine.
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Beispiele
gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender
Verbindungen MF-PAOSC sind die stellungsisomeren monofluorierten
Phenoxathiine oder Thieno[2,3-b]furane, insbesondere die Phenoxathiine.
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Beispiele
gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender
Verbindungen MF-PAONC sind die stellungsisomeren monofluorierten
Phenoxazine.
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Beispiele
gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender
Verbindungen PANSC sind die stellungsisomeren monofluorierten Phenothiazine
oder Imidazo[2,1-b]thiazole.
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Beispiele
gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender
Verbindungen MF-PANOSC sind die stellungsisomeren monofluorierten
Thieno[2,3-b]oxazole.
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Weitere
Beispiele geeigneter Verbindungen MF-PA sind die vorstehend beschriebenen
Verbindungen MF-PA, die mit mindestens einem Chlor-, Brom- und/oder
Iodatom substituiert sind.
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Beispiele
gut geeigneter Verbindungen MF-PA dieser Art sind die stellungsisomeren
polychlorierten, polybromierten sowie polychlorierten und polybromierten
Verbindungen MF-PA. Von diesen sind wiederum die polychlorierten,
polybromierten sowie polychlorierten und polybromierten stellungsisomeren
monofluorierten Biphenyle, Terphenyle oder Quaterphenyle MF-PAC
oder die polychlorierten, polybromierten sowie polychlorierten und
polybromierten stellungsisomeren monofluorierten Dibenzodioxine
und Dibenzofurane MF-PAOC besonders gut geeignet.
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Beispiele
ganz besonders gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender Verbindungen
MF-PA sind 1-Fluornaphthalin, 1-Fluorphenanthren, 1-Fluorchrysen,
1-Fluorpyren, 2-Fluorfluoren,
1-Fluorfluoranthen, 1-Fluoracenaphthylen oder 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen.
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Die
Herstellung der erfindungsgemäß zu verwendenden
Verbindungen MF-PA weist keine methodischen Besonderheiten auf,
sondern erfolgt nach den üblichen
und bekannten Methoden der organischen Fluorchemie durch direkte
Halogenierung der Stammverbindung PA mit einem geeigneten Fluorierungsmittel wie
elementarem Fluor oder Xenondifluorid oder durch die Umsetzung geeigneter
fluorhaltiger Ausgangsverbindungen.
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So
ist beispielsweise 1-Fluorphenanthren oder 1-Fluorchrysen durch
oxidative Photocyclisierung geeigneter Ausgangsverbindungen, 1-Fluornaphthalin,
1-Fluofluoranthen,
1-Fluorpyren oder 2-Fluorfluoren durch die Schiemannreaktion aus
den entsprechenden Diazoniumtetrafluorboraten, 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen
durch [4 + 2]-Cycloaddition
geeigneter Ausgangsverbindungen sowie 1-Fluoracenaphthylen durch
FVT (flash vacuum thermolysis) herstellbar.
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Erfindungsgemäß werden
die Verbindungen MF-PA
- – als interne Standards, die
gemeinsam mit den Verbindungen PA physikalische, chemische und/oder
biologische Prozesse durchlaufen und anschließend gemeinsam mit diesen oder
getrennt von diesen detektiert und/oder analysiert werden,
- – als
externe Standards, die anstelle der Verbindungen PA physikalische,
chemische und/oder biologische Prozesse zu Zwecken der Kalibrierung
dieser Prozesse durchlaufen und getrennt von den Verbindungen PA
analysiert und/oder detektiert werden, und/oder
- – als
Modellverbindungen, die anstelle der Verbindungen PA chemische und/oder
biologische Prozesse zu Zwecken der Aufklärung von Reaktionsmechanismen
durchlaufen und deren Reaktionsprodukte detektiert und/oder analysiert
werden,
verwendet.
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Beispiele
physikalischer Prozesse, in denen die Verbindungen MF-PA erfindungsgemäß mit Vorteil
angewandt werden, sind das Verdampfen, Kondensieren, Gefrieren,
Schmelzen, Sublimieren, Lösen,
Dispergieren, Emulgieren, (Um)Kristallisieren, Ausfällen, Zerkleinern,
Agglomerieren, Vermischen, die Verteilung zwischen mindestens zwei
unterschiedlichen stofflichen Phasen und/oder die Wechselwirkung
mit Schallwellen, elektromagnetischer Strahlung – wie Gammastrahlung, Röntgenstrahlung,
UV-Strahlung, sichtbares Licht, nahes Infrarot (NIR), Infrarot oder
Mikrowellen-, Korpuskularstrahlung – wie Protonen-, Neutronen-
oder Elektronenstrahlen – und/oder
elektrischen und/oder magnetischen Feldern mindestens einer Verbindung
PA und mindestens einer Verbindung MF-PA oder eines Stoffgemischs,
beispielsweise eine Umweltprobe, das diese Verbindungen enthält.
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Beispiele
biologischer Prozesse, in denen die Verbindungen MF-PA erfindungsgemäß mit Vorteil
angewandt werden, sind biochemische oder molekularbiologische Prozesse,
die in vivo oder in vitro ablaufen.
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Besondere
Vorteile resultieren für
die erfindungsgemäße Verwendung,
wenn die Begleitsubstanz oder der interne Standard, der externe
Standard und/oder die Modellverbindung MF-PA oder mindestens eine
Begleitsubstanz oder mindestens ein interner Standard und/oder mindestens
ein externer Standard und/oder mindestens eine Modellverbindungen
MF-PA dieselbe Grundstruktur wie die Verbindung PA oder mindestens eine
der Verbindungen PA (Analyten) aufweist oder aufweisen.
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Erfindungsgemäß werden
die Verbindungen MF-PA in dem erfindungsgemäßen Verfahren 1 angewandt.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
1 geht im Verfahrensschritt (I) von der Aufbereitung mindestens
eines Analyten PA und/oder der Probe, worin er enthalten ist, aus.
Hierbei finden die vorstehend beschriebenen physikalischen Prozesse
Anwendung.
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Erfindungsgemäß folgt
hiernach die Trennung des durch die Aufbereitung (I) resultierenden
Stoffgemischs in seine Bestandteile. Auch hierbei finden die vorstehend
beschriebenen physikalischen Prozesse Anwendung. Beispiele geeigneter
Trennmethoden (II) sind die Soxlethextraktion, ASE (accelerated
solvent extraction; beschleunigte Flüssigextraktion), SFE (supercritial
fluid extraction; superkritische Flüssigextraktion), Extraktion
unter Bestrahlung mit Mikrowellen, LLE (liquid-liquid-extraction;
Flüssig-Flüssig-Extraktion),
SPE (solid phase extraction; Festphasenextraktion) oder Empore Disk.
Diese und weitere Beispiele geeigneter Trennmethoden (Π) werden
beispielsweise von R. E. Majors in dem Artikel "Sample Preparation and Handling for
Environmental and Biological Analysis", LC-GC, Band 13, Nr. 7, 1995 Seiten
542 bis 555, H. L. Lord und J. Pawliszynin dem Artikel "Recent Advances in
Solid-Phase Microextraction",
LC-GC International, Dezember 1998, Seiten 776 bis 785, oder von
S. a. Barker in dem Artikel "Matrix
Solid-Phase Dispersion",
LC-GC International, November 1998, Seiten 719 bis 724, beschrieben.
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Erfindungsgemäß erfolgt
im Verfahrensschritt (III) die Detektion und/oder Analyse des Analyten
PA. Hierbei können
die üblichen
und bekannten Detektionsverfahren wie die Detektion mit UV-Licht,
Diodendetektoren (DAD/UV; diode array detector), Fluoreszenz, Massenspektrometrie
oder Kombinationen dieser Verfahren angewandt werden.
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Die
Begleitsubstanz oder der interne Standard MF-PA wird dabei erfindungsgemäß im Verfahrensschritt
(I), (II) und/oder (III), vorzugsweise in Verfahrensschritt (I),
in bekannter Konzentration zugesetzt. Die Verbindungen MF-PA werden
dabei als Feststoff oder Lösung
vor oder bei den Verfahrensschritten des analytischen Prozesses
zugefügt.
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Oder
aber sie sind in den Matrices, beispielsweise in den Sorbentien
oder festen Phasen enthalten.
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Durch
die erfindungsgemäße Verwendung
der Verbindungen MF-PA in dem erfindungsgemäßen Verfahren 1 ist es möglich, die
Effektivität
und Reproduzierbarkeit der einzelnen Verfahrensschritte eines analytischen
Prozesses in einfacher Weise quantitativ genau zu erfassen, was
ein ganz besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung und des erfindungsgemäßen Verfahrens
1 ist.
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Erfindungsgemäß werden
die Verbindungen MF-PA in dem erfindungsgemäßen Verfahren 2 angewandt.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
2 dient der Kalibrierung von Analyseverfahren für Verbindungen PA durch die
quantitative Analyse mindestens eines externen Standards mit dem
zu kalibrierenden Analyserfahren, wobei mindestens eine Verbindung
MF-PA in unterschiedlichen Konzentrationen analysiert und aus den resultierenden
Meßwerten
mindestens eine Eichkurve gebildet wird. Besondere Vorteil resultieren
auch hier, wenn die Verbindung MF-PA dieselbe Grundstruktur wie
die quantitativ zu bestimmende Verbindung PA aufweist. Zur Detektion
können
beispielsweise die vorstehend genannten Verfahren angewandt werden.
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Beispiele
für Analyseverfahren,
die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
2 in vorteilhafter Weise kalibriert werden können, sind LC (liquid chromatography;
Flüssigchromatographie),
GC (Gaschromatographie), SFC (supercritical fluid chromatography;
superkritische Flüssigphasenchromatographie),
CE (capillary electrophoresis; Kapillarelektrophorese) oder Techniken
der direkten Detektion wie die Shpol'skii Spektroskopie, die synchrone Fluoreszenzspektroskopie,
DAD oder Massenspektrometrie.
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Hierbei
erweist es sich als ein weiterer besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens
2, daß hiermit
die Analyseverfahren nicht nur hinsichtlich der korrespondierenden
Stammverbindung PA, sondern auch hinsichtlich der konespondierenden
Stoffgruppe, wie beispielsweise die entsprechenden Metaboliten, etwa
die Hydroxyderivate, die Sulfate oder die Glycoside, kalibriert
werden können.
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Erfindungsgemäß werden
die Verbindungen MF-PA bei dem erfindungsgemäßen Verfahren 3 angewandt.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
3 dient der Aufklärung
der Mechanismen biochemischer Reaktionen von Verbindungen PA, die
in vitro oder in vivo, vorzugsweise in vivo ablaufen. In der erfindungsgemäßen Verwendung
ersetzen die Modellverbindungen MF-PA deuterierte oder radioaktiv markierte
Verbindungen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
3 umfaßt
das Einführen
mindestens einer Modellverbindung MF-PA in den Metabolismus des
Organismus, beispielsweise mittels direkter Injektion, Nahrungsaufnahme,
Hautresorption und/oder Atmungsresorption. Hiernach werden die Modellverbindungen
MF-PA im Organismus anstelle der konespondierenden Stammverbindungen
PA metabolisiert. Hiernach erfolgt das Isolieren, Trennen und Identifizieren
der Metaboliten. Hierbei werden die Metaboliten und die Modellverbindungen
MF-PA in ihrer Isomerenverteilung zur Aufklärung des Metabolismusses herangezogen.
Hierbei erweist sich als besonderer Vorteil, daß die fluorhaltigen Metaboliten
in einfacher Weise durch AED (atomic emmission detection; Atomemissionsdetektion)
oder Massenspektrometrie identifiziert werden können.
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Nicht
zuletzt können
die vorstehend beschriebenen Verbindungen MF-PA in standardisierter
abgepackter Form als sogenannte „kits" vorliegen. In diesen kits liegen Verbindungen
MF-PA in einer dem jeweiligen Anwendungszweck, beispielsweise den
erfindungsgemäßen Verfahren
1, 2 oder 3, angepaßten
Zusammensetzung, Menge und Darrreichungsform, beispielsweise als
Lösung,
als pulverförmiger
Feststoff oder an Trägermaterial
adsorbiert, vor. Die Verpackungen selbst können von beliebiger, dem jeweiligen
Anwendungszweck angepaßter
Form, beispielsweise Beutel, Ampullen, Hohlkugeln oder Mikrokapseln,
sein und aus beliebigen Materialien, insbesondere Glas oder Kunststoffen,
bestehen. Des weiteren können Öffnungsvorrichtungen,
beispielsweise Sollbruch- oder Sollrißstellen, vorhanden sein. Die
Möglichkeit,
die MF-PA in standardisierter abgepackter Form als sogenannte „kits" zu verwenden, stellt
einen weiteren besonderen Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung
dar.
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Beispiele
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Beispiel 1
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Die Verwendung von 1-Fluorpyren
zur Untersuchung der Metabolisierung von Pyren in Flundern (Platichtys
flesus)
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Ausgewachsenen
Flundern eines Gewichts von 200 bis 400 Gramm wurden pro 1 kg Körpergewicht jeweils
eine Lösung
einer Mischung von 1-Fluorpyren und Pyren im Gewichtsverhältnis 1
: 1 in Dimethylsulfoxid mit einer Konzentration von 200 μg/ml in die
Bauchdecke injiziert. Die Expositionszeit betrug sieben Tage. Hiernach
wurde den Flundern die Galle entnommen, und die Gallenflüssigkeit
wurde mit Methanol verdünnt und
direkt in einen Hochdruckflüssigchromatographen
(HPLC) injektiert. Als stationäre
Phase der HPLC-Säule wurde
C-18 Polymer Vydack
® verwendet. Die Tabelle
1 gibt eine Übersicht über den
Gradientenverlauf. Die eluierten Verbindungen wurden bei einer Wellenlänge von
339 nm mit DAD (diode array detector) detektiert. Tabelle
1: Gradientenverlauf bei der Hochdruckflüssigchromatographie
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Die
Tabelle 2 gibt eine Übersicht über die
eluierten Verbindungen und die Reihenfolge ihrer Elution in den
Chromatogrammen. Tabelle
2: Die eluierten Verbindungen und die Reihenfolge ihrer Elution
in den Chromatogrammen
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Pyren,
1-Fluorpyren, 1-Hydroxypyren (Metabolit erster Ordnung) sowie 1-Fluor-6-hydroxid-pyren und 1-Fluor-8-hydroxy-pyren
(Metaboliten erster Ordnung) waren in der Probe enthalten. Sie konnten
jedoch wegen ihrer zu niedrigen Konzentration nicht direkt durch
ihre Spektren, sondern nur anhand der Retensionszeiten nachgewiesen
werden.
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Was
das Retensionsverhalten betraf, eluierten die nicht substituierten
Verbindungen und die fluorierten Verbindungen auf der C-18-Phase
später,
weil sie lipophiler waren als die substituierten Verbindungen. Die Verbindungen
mit dem 1,6-Substitutionsmuster waren unpolarer als die Verbindungen
mit dem 1,8-Substitutionsmuster, weswegen letztere eine kürzere Retensionszeit
aufwiesen. Der weitere Vergleich der HPLC-Chrmatogramme ergab, daß sowohl
Pyren als auch 1-Fluorpyren und deren Metaboliten erster und zweiter
Ordnung nebeneinander qualitativ und quantitativ nachgewiesen werden
konnten.
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Die
Bildung der 1,6-Isomeren ist gegenüber der Bildung der 1,8-Isomeren
energetisch begünstigt. Dies
spiegelte sich auch bei der hier untersuchten Metabolisierung wider.
Die hieran beteiligten Enzyme waren in ihrem Substratverhalten nicht
ausgeprägt
ortsspezifisch, sondern eher energiespezifisch. Der Substrat-Enzym-Mechanismus
war indes so ortsspezifisch, daß keine
Substitution am fluorierten Ring stattfand.
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Beispiel 2
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Die Verwendung von 2-Fluorpyren
zur Untersuchung der Metabolisierung von Pyren in Semipoden (Porcellio scaber)
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Erwachsene
Semipoden eines Alters von einem Jahr nahmen 1-Fluorpyren und Pyren über die
Nahrung auf. Hierzu wurde die Nahrung Folsomia candida mit den Verbindungen
kontaminiert. Hierzu wurde eine Lösung von 1-Fluorpyren und Pyren
im Verhältnis
1 : 1 in Aceton (Konzentration: 50 mg/ml) verwendet, womit die Nahrung
getränkt
wurde. Die Expositionszeit betrug ein Tag.
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Hiernach
wurden den Semipoden der Hepatopancreas vom Kopf abgetrennt und
in Ethanol/Wasser (Volumenverhältnis
1 : 1) mit Protease K zusammengegeben. Die Proben wurden in Eppendorfhütchen während 30
min bei 30°C
gerührt
und nachfolgend mit Ultraschall behandelt. Die resultierenden Lösungen wurden direkt
in einen Hochdruckflüssigchromatographen
(HPLC) injektiert. Für
die Messungen wurden die in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen angewandt.
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Die
Tabelle 3 gibt eine Übersicht über die
eluierten Verbindungen und die Reihenfolge ihrer Elution in den
Chromatogrammen. Tabelle
3: Die eluierten Verbindungen und die Reihenfolge ihrer Elution
in den Chromatogrammen
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Hinsichtlich
des Elutionsverhaltens der 1,6- und 1,8-Isomeren gilt das bei Beispiel
1 Gesagte. Die 1,3-Isomeren waren etwas polarer als die 1,8-Isomeren,
weswegen sie z. T. mit den letzteren coeluiert wurden. Die Länge/Breite-Verhältnisse
der Isomeren eines Konjugats waren vergleichbar, so daß dieses
Verhältnis
keinen Einfluß auf
das Retentionsverhalten hatte. Der weitere Vergleich der Chromatogramme
ergab, daß sowohl Pyren
als auch 1-Fluorpyren und deren Metaboliten erster und zweiter Ordnung
nebeneinander quantitativ und qualitativ nachgewiesen werden konnten.
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Hinsichtlich
der Bildung der 1,6- und 1,8-Isomeren gilt das bei Beispiel 1 Gesagte.
Der Vergleich der beteiligten Enzyme von Platichthys flesus einerseits
und Porcellio scaber andererseits wurde indes deutlich, daß die Enzyme
des Semipoden nicht so ortsspezifisch waren wie die der Flunder.
Dies zeigt sich an der Bildung von 1,3-Isomeren. Die Verteilung
der Isomeren entsprach in etwa der einer Mononitrierung von 1-Flurpyren.
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Beispiel 3
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Die Verwendung von Verbindungen
MF-PA zur Kalibrierung einer GC-MS-Kopplung
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GC-MS
wurde auf einem Hewlett-Packard-Gaschromatograph HP 6890 und einem
massenspektrometrischen Detektor HP 7972A durchgeführt. Der
Gaschromatograph war mit einem HP 7673 (G1523A) Autosampler ausgerüstet. Die
Injektionen von jeweils 1 μl
in die Trennkapillare wurden mit einer 10 μl Autosampler-Mikroinjektionsspritze
mit einer Nadel für
Injektionen in 0,32 mm Trennkapillaren durchgeführt. Ein 30 m × 250 μm × 0,25 μm starker
Film aus 5 % Diphenyl- 95% Dimethylpolysiloxan wurde verwendet.
Trägergas
war Helium 5.0 (Reinheit: 99,999 %) bei einem Druck von 92 kPa.
Der massenspektrometrische Detektor HP 7972A wurde bei einer Scan-Rate
von 9 Scans/s im m/z-Bereich von 50 bis 350 betrieben. Die Ofentemperatur wurde
von 60°C
(3,5 min) bis 290 °C
(4,5 min) während
35 min in Schritten von 6,57 °C/min
variiert. Die Verbindungsleitung wurde bei einer Tempeartur von
290 °C gehalten.
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Die
Konzentration der angewandten Verbindungen MF-PA 1-Fluornaphthalin,
1-Fluorphenanthren, 1-Fluorchrysen,
1-Fluorpyren, 2-Fluorfluoren, 1-Fluorfluoranthen und 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen
sowie der 16 EPA-PA Naphthalin, Acenaphthylen, Acenaphthen, Phenanthren,
Fluoren, Anthracen, Chrysen, Pyren, Fluoranthen, Benzo[a]anthracen,
Benzo[k]fluoranthen, Benzo[b]fluoranthen, Benzo[a]pyren, Dibenzo[a:h]anthracen,
Benzo[g:h.i]perylen und Indeno[1,2,3-c:d]pyren lag bei 4 ng/μl. Jede Probe
wurde zwölfmal
injektiert. Als Lösemittel
wurde Methylacetat verwendet.
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Charakteristisch
für die
Fragmetierung der Verbindungen MF-PA sind die m/z = [M]
+•, [M+1]
+•, [M-HF]
+•,
[M]
++• und
[HF]
+•.
Die Tabelle 4 gibt einen Überblick über die
entsprechenden m/z-Werte. Tabelle
4. m/z-Werte der verwendeten Verbindungen MF-PA
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Die
Standardabweichungen der GC-MS-Messungen an den EPA-PA wurden ermittelt.
Sie lagen bei 18 bis 20%.
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Wurde
dagegen die korrespondierende Verbindung MF-PA (1-Fluornaphthalin,
1-Fluorphenanthren, 1-Fluorchrysen,
1-Fluorpyren, 2-Fluorfluoren, 1-Fluorfluoranthen oder 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen)
eines gegebenen EPA-PA als Standard verwendet, resultierte eine
besonders geringe Standardabweichung.
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Die
Standardabweichung eines gegebenen EPA-PA, für den keine korrespondierende
Verbindung MF-PA zur Verfügung
stand, konnte bereits durch die Verwendung von 1-Fluorphenanthren als Standard signifikant
verbessert werden.
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Eine
weitere signifikante Verbesserung resultierte aus der Verwendung
der drei Verbindungen MF-PA 1-Fluornaphthalin, 1-Fluorphenanthren
und 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen,
die in der angegebenen Reihenfolge eluierten und deren Peaks am
Anfang, in der Mitte und am Ende des Chromatogramms auftauchten.
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Die
Verwendung aller sieben Verbindungen MF-PA brachte dagegen keine
weitere nennenswerte Verbesserung mehr mit sich. Mit anderen Worten:
die Verwendung von drei Standards war völlig ausreichend.
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Die
Tabelle 5 gibt einen Überblick über die
ermittelten Standardabweichungen. Die EPA-PA eluierten in der angegebenen Reihenfolge.
Korrespondierende Verbindungen MF-PA eluierten unmittelbar mit der
jeweiligen Stammverbindung. Tabelle
5: Die ermittelten Standardabweichungen (%) der 16 EPA-PA
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Die
Untersuchung untermauerte, daß die
Verbindungen MF-PA hervorragend zur Kalibrierung von Analyseverfahren
für Verbindungen
PA geeignet waren.
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Beispiel 4
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Die Verwendung von Verbindungen
MF-PA als Begleitsubstanzen in der Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)
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Als
stationäre
Phase der HPLC-Säule
wurde C-18 Polymer Vydack
® verwendet. Die Tabelle
6 gibt eine Übersicht über den
Gradientenverlauf. Die eluierten Verbindungen wurden mit UV-DAD
(diode array detector) detektiert. Die Tabelle 7 gibt einen Überblick über das
Wellenlängenprogramm. Tabelle
6: Gradientenverlauf bei der Hochdruckflüssigchromatographie
Tabelle
7: Wellenlängenprogramm
UV-DAD
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Es
wurde eine Mischung aus 1-Fluornaphthalin, 1-Fluracenaphthylen 1-Fluorphenanthren,
1-Fluorchrysen, 1-Fluorpyren, 2-Fluorfluoren, 1-Fluorfluoranthen
und 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen
sowie der korrespondierenden Stammverbindungen PA analysiert. Die
Verbindungen eluierten in der folgenden Reihenfolge:
- 1. Naphthalin
- 2. 1-Fluornaphthalin
- 3. Acenaphthylen
- 4. 1-Fluoracenaphthylen
- 5. Fluoren
- 6. 1-Fluorfluoren
- 7. Pyren
- 8. 1-Fluorpyren
- 9. Fluoranthen
- 10. Phenanthren
- 11. 1-Fluorfluoranthen
- 12. 1-Fluorphenanthren
- 13. Chrysen
- 14. 1-Fluorchrysen
- 16. Benzo[k]fluoranthen
- 17. 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen.
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Die
Untersuchung untermauerte, daß die
Verbindungen MF-PA hervorragend als Begleitsubstanzen bzw. interne
Standards für
ihre korrespondierenden Stammverbindungen PA waren.
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Beispiel 5
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Die
Verwendung der Verbindungen MF-PA als Begleitsubstanzen bzw. interne
Standards in der Festphasenextraktion (SPE; solid phase extraction)
Mischungen von 1-Fluornaphthalin und Naphthalin, 1-Fluracenaphthylen
und Acenaphthylen, 1-Fluorphenanthren und Phenanthren, 1-Fluorchrysen
und Chrysen, 1-Fluorpyren
und Pyren, 2-Fluorfluoren und Fluoren, 1-Fluorfluoranthen und Fluoranthen
sowie 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen und Benzo[k]fluoranthen wurden
der SPE unterworfen und durch HPLC analysiert und detektiert.
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Hierbei
wurden die folgenden Bedingungen angewandt: Bedingungen
1:
Phase: | C8-Polymer |
Durchbruchvolumen: | 100
ml |
Durchfluß: | 0,5
ml/min |
Bedingungen
2:
Phase: | Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat |
Durchbruchvolumen: | 100
ml |
Durchfluß: | 0,5
ml/min |
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Unter
den Bedingungen 2 war die Verdünnung
von Benzo[k]fluoranthen bei den nötigen Elutionsvolumina so hoch,
daß die
Verbindung nicht mehr detektiert werden konnte.
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Ansonsten
zeigte eine gegebene Verbindung MF-PA und ihre korrespondierende
Stammverbindung PA in allen Fällen
ein im wesentlichen identisches Elutionsverhalten.
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Untersuchungen
der einzelnen Verbindungen MF-PA und PA durch SPE mit jeweils drei
Phasen einer Charge unter den Bedingungen 1 zeigte, daß die Abweichungen
der Phasen untereinander signifikant größer war, als die zwischen Analyt
PA und internem Standard MF-PA. Dies unterstreicht weiter, daß die Verbindungen
MF-PA hervorragend als interne Standards bzw. Begleitsubstanzen
geeignet sind.