EP1221044A2 - Monofluorierte polycyclische aromatische verbindungen und ihre verwendung als begleitsubstanzen polycyclischer aromatischer verbindungen - Google Patents

Monofluorierte polycyclische aromatische verbindungen und ihre verwendung als begleitsubstanzen polycyclischer aromatischer verbindungen

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Publication number
EP1221044A2
EP1221044A2 EP00969500A EP00969500A EP1221044A2 EP 1221044 A2 EP1221044 A2 EP 1221044A2 EP 00969500 A EP00969500 A EP 00969500A EP 00969500 A EP00969500 A EP 00969500A EP 1221044 A2 EP1221044 A2 EP 1221044A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
compounds
benzo
monofluorinated
atom
polycyclic aromatic
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00969500A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Gregor Luthe
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Original Assignee
Individual
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Publication date
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Publication of EP1221044A2 publication Critical patent/EP1221044A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N31/00—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods
    • G01N31/22—Investigating or analysing non-biological materials by the use of the chemical methods specified in the subgroup; Apparatus specially adapted for such methods using chemical indicators

Definitions

  • the present invention relates to the new use of monofluorinated polycyclic aromatic compounds (MF-PA) as accompanying substances, as external standards or as model compounds of polycyclic aromatic compounds (PA) in physical, chemical and biological processes. Furthermore, the present invention relates to new methods for the qualitative and quantitative analysis of compounds PA, for the calibration of analysis methods for compounds PA and for the analysis of biochemical reactions with compounds PA, which are carried out using at least one compound MF-PA.
  • MF-PA monofluorinated polycyclic aromatic compounds
  • PA polycyclic aromatic compounds
  • Compounds PA include not only pure polycyclic aromatic hydrocarbons, but also heterocyclic analogues such as derivatives containing oxygen, sulfur and / or nitrogen. They arise, for example, when pyrolytic processes are incomplete.
  • Biogenous compounds PA arise from humic acids through condensation reactions and from amino acids via isoprene metabolism through ring closure in microorganisms, fungi, plants and animals.
  • SRM 1648 Oil samples with petrogenic compounds PA
  • SRM 1649 airborne particles
  • SRM 1950 diesel particles
  • SRM 1941 maritime sediment from a harbor basin
  • SRM 1974 Shell tissue from Mytilus edulis
  • SRM 869 tetrabenzonaphthalene, phenanthro [3,4-c] phenanthrene and benzo [a] pyrene.
  • cosmetics and shampoos can also contain compounds PA.
  • the compounds PA occur not only on Earth, but also in interstellar space, in galactic nebulae and in active galaxies.
  • Compounds PA are characterized by a low polarity and water solubility. Due to the low water solubility and strong adsorption on organic and inorganic material, there is little mobility in the soil. The transport and enrichment in specific soil layers takes place parallel to the enrichment of organic substances such as mineral oils, detergents and solvents.
  • the degradation of compounds PA in the chemosphere and biosphere is both abiotic by photolysis and ozonolysis and biotic by anaerobic and aerobic microbial activity.
  • Compounds PA are very different in their toxic and carcinogenic effects, which is why the qualification of all compounds PA in an environmental sample is of great importance.
  • the absorption of the compounds PA takes place on the one hand by inhalation through tiny particles, on the surface of which the compounds PA are bound by adsorption, on the other hand they are taken up and concentrated via the food chain, since they are accumulated in the adipose tissue.
  • polyhalogenated compounds PA in particular the polyhalogenated oxygen-containing compounds such as dioxins and furans, some of which are superpoisons.
  • Substance class has a higher proportion of carcinogenic substances. Nice In the eighteenth century, an English doctor reported the significantly increased incidence of skin cancer in chimney sweeps, which can today be attributed to the constant exposure to soot.
  • cPAC condensed polycyclic aromatic compounds
  • acenaphthylene acenaphthene
  • phenanthrene fluorene, anthracene, chrysene
  • pyrene fluoranthene
  • benzo [a] anthracene benzo [k] fluoranthene
  • benzo [b] fluoranthene Benzo [a] pyrene, Dibenzo [a: h] anthracene, Benzo [g: hi] perylene and Indeno [l, 2,3-c: d] pyrene, which are also referred to collectively as the EPA-cPAC of the Enviromnental Protection Agency, the carcinogenic potential in mice was verified and quantified in subcutaneous tests.
  • benzo [a] pyrene causes cancer in over 33 percent of the population of exposed mice.
  • the use of antipruritic and bactericidal tar compounds containing compounds PA in cosmetics and shampoos is particularly problematic.
  • Shampoos with a benzo [a] pyrene content of 50 mg / kg are still available on the market.
  • the compounds PA induce the synthesis of the degrading enzymes such as dioxigenase, which is initiated in mammals by cytochrome P-450.
  • the breakdown products are excreted in the urine.
  • the carcinogenic substance is excreted in the urine.
  • PA occurs through direct reaction with the DNA (deoxyribonucleic acid).
  • deuterated compounds PA are used as internal standards (cf. the article by W. E. May and S. A. Wise in Analytical Chemistry, volume 56, pages 225 and following, 1984).
  • methylated compounds PA are used, whereby it should be noted that numerous environmental samples already contain methylated compounds PA. It is also disadvantageous that these methylated compounds PA often differ greatly in their properties from the parent compounds, so that they are basically not suitable as internal standards.
  • the object of the present invention is to create new accompanying substances or internal standards, new external standards and new model connections for to provide polycyclic aromatic compounds PA, which no longer have the disadvantages of the prior art, in the context of physical, chemical and biological processes.
  • the new accompanying substances or internal standards in the sense of a pseudo-identical behavior are to undergo physical, chemical and / or biological processes together with the compounds PA and are then to be detected and / or analyzed together with them or separately from them.
  • the new external standards in the sense of a pseudo-identical behavior are to go through physical, chemical and / or biological processes for the purpose of their calibration and are to be analyzed and / or detected separately from the compounds PA.
  • the new model compounds should also undergo chemical and / or biological processes instead of the compounds PA in the sense of pseudo-identical behavior for the purpose of elucidating reaction mechanisms, after which their reaction products are also detected and / or analyzed.
  • MF-PA monofluorinated polycyclic aromatic compounds
  • MF-PA monofluorinated polycyclic aromatic compounds
  • process 1 in which at least one compound MF-PA is added in process step I, II and / or HI as an accompanying substance in a known concentration as an internal standard and which is referred to below as “process 1 according to the invention.
  • the new method for calibrating analytical methods for compounds PA was found by the quantitative analysis of at least one external standard using the analytical method to be calibrated, the external standard being analyzed in different concentrations and at least one calibration curve being formed from the resulting measured values, in which at least one compound MF-PA is used as the external standard and is referred to below as "inventive method 2".
  • the new method for analyzing biochemical reactions of compounds PA in an organism was introduced by introducing at least one model compound into the metabolism of the organism, metabolizing the model compounds and isolating, separating and identifying the metabolites, using a compound MF-PA as a model compound used, which has the same basic structure as the compound PA and which is hereinafter referred to as "inventive method 3".
  • the extraordinarily complex object on which the present invention was based could be achieved with the aid of the use according to the invention.
  • the compounds MF-PA to be used according to the invention in the context of this Numerous complex chemical, physical and even biological systems and processes are applicable and show a pseudo-identical behavior with respect to the respective parent compound.
  • the compounds MF-PA to be used according to the invention offer the very particular advantage that they can be analyzed and / or detected in a simple manner in addition to the respective parent compound PA.
  • the compounds MF-PA can be prepared easily and in high yields.
  • the additional surprising special advantages are the easy identification of the compounds MF-PA to be used according to the invention and their secondary products, in particular their metabolites.
  • the compounds PA are polycyclic aromatic hydrocarbons in their ring system
  • PAOC oxygen atom
  • PANC sulfur atom
  • PAOSC sulfur atom
  • PANSC or - contain at least one oxygen atom, at least one sulfur atom and at least one nitrogen atom (PANOSC).
  • These compounds PA can be of synthetic or natural origin.
  • Examples of compounds PAC are biphenyl, triphenylenes, polyphenylenes and condensed polycyclic aromatic compounds (cPAC).
  • triphenylenes PAC are 1,2 -, 1,3- or 1,4-diphenylbenzene (terphenyl).
  • polyphenylenes PAC are quaterphenyl or 1,3,5-triphenylbenzene.
  • Examples of compounds cPAC are the environmentally analytically and medically important EPA-cPAC from the Enviromnental Protection Agency naphthalene, acenaphthylene, acenaphthene, phenanthrene, fluorene, anthracene, chrysene, pyrene, fluoranthene, benzo [a] anthracene, benzo [k] fluoranthene, benzo [ b] fluoranthene, benzo [a] pyrene, dibenzo [a: h] anthracene, benzo [g: hi] perylene and indeno [l, 2,3-c: d] pyrene or the SRM 869-cPAC from NIST tetrabenzonapthalene or phenanthro [3,4-c] phenanthrene.
  • Examples of compounds PAOC are in particular dibenzodioxin or dibenzofuran.
  • Examples of compounds PASC are benzo [b] thiophene, dibenzodithiine (thianthrene), dibenzothiophene or naphtho [2,3-b] thiophene, in particular dibenzodithiine or dibenzothiophene.
  • Examples of compounds PANC are quinoline, isoquinoline, benzo (] isoquinoline, acridine, carbazole, naphthyridine, phenanthroline, phenanthridine or pyrazino [2, 3-a] acridine.
  • Examples of compounds PAOSC are phenoxathiin or thieno [2,3-b] furan, in particular phenoxathiin.
  • PAONC phenoxazine
  • Examples of compounds PANSC are phenothiazine or imidazo [2, l-bjthiazol.
  • PANOSC thieno [2,3-b] oxazole.
  • the compounds PA described above can be substituted with at least one chlorine, bromine and / or iodine atom.
  • the polychlorinated, polybrominated as well as polychlorinated and polybrominated compounds PA are particularly important from an environmental analysis and medical point of view.
  • PAOC polychlorinated, polybrominated and polychlorinated and polybrominated dibenzodioxins and dibenzofurans
  • PAOC also known as super poisons or Seveso poisons be of special importance.
  • they can arise from the above-mentioned transformer oils or flame retardants through pyrolytic processes.
  • parent compounds of the monofluorinated polycyclic aromatic compounds MF-PA to be used according to the invention in principle all naturally occurring or synthetic compounds PA can be used. All of the compounds PA described above are preferably used as parent compounds.
  • MF-PAC are free of heteroatoms
  • MF-PAOC at least one oxygen atom
  • MF-PASC at least one sulfur atom
  • MF-PANC at least one nitrogen atom
  • MF-PAC free of heteroatoms
  • MF-PAOC oxygen atom
  • MF-PASC at least one sulfur atom
  • MF-PANC nitrogen atom
  • MF-PANC at least one oxygen atom and at least one sulfur atom
  • PAOSC PAOSC
  • MF-PAOSC at least one oxygen atom and at least one nitrogen atom
  • PAONC at least one sulfur atom and at least one nitrogen atom
  • MF-PANSC at least one sulfur atom and at least one nitrogen atom
  • MF-PANOSC at least one oxygen atom, at least one sulfur atom and at least one nitrogen atom
  • MF-PAC monofluorinated biphenyls, triphenylenes, polyphenylenes and monofluorinated condensed polycyclic aromatic compounds (MF-cPAC).
  • MF-cPAC monofluorinated condensed polycyclic aromatic compounds
  • Examples of highly suitable triphenylenes MF-PAC to be used according to the invention are the positionally isomeric monofluorinated 1,2-, 1,3- or 1,4-diphenylbenzenes (terphenyls).
  • Examples of highly suitable polyphenylenes MF-PAC to be used according to the invention are the positionally isomeric monofluorinated quaterphenyls or 1,3,5-triphenylbenzenes.
  • Examples of highly suitable compounds MF-cPAC to be used according to the invention are the positionally isomeric monofluorinated naphthalenes, acenaphthylenes, acenaphthenes, phenanthrenes, fluorenes, anthracenes, chrysenes, pyrenes, fluoranthenes, benzo [a] anthracenes, benzo [k] fluoranthenes, benzo [b] fluoranthenes, Benzo [a] pyrene, Dibenzo [a: h] anthracene, Benzo [g: hi] perylene and Indeno [1,2,3-c: d] pyrene, tetrabenzonapthalenes or phenanthro [3, 4-c] phenanthrene.
  • Examples of very suitable compounds MF-PAOC to be used according to the invention are the positionally isomeric monofluorinated dibenzodioxins or dibenzofurans.
  • Examples of highly suitable compounds MF-PASC to be used according to the invention are the positionally isomeric monofluorinated benzo [b] thiophenes, dibenzoothiines (thianthrenes), dibenzothiophenes or naphtho [2,3-b] thiophenes, in particular the dibenzodithiines or dibenzothiophenes.
  • Examples of very suitable compounds MF-PANC to be used according to the invention are the positionally isomeric monofluorinated quinolines, isoquinolines, benzo [h] isoquinolines, acridines, carbazoles, naphthyridines, phenanthrolines, phenanthridines or pyrazino [2,3-a] acridines.
  • Examples of very suitable compounds MF-PAOSC to be used according to the invention are the positionally isomeric monofluorinated phenoxathiines or thieno [2,3-b] furans, in particular the phenoxathiines.
  • Examples of very suitable compounds MF-PAONC to be used according to the invention are the positionally isomeric monofluorinated phenoxazines.
  • PANSC to be used according to the invention are the positionally isomeric monofluorinated phenothiazines or imidazo [2, l-b] thiazoles.
  • Examples of very suitable compounds MF-PANOSC to be used according to the invention are the positionally isomeric monofluorinated thieno [2,3-b] oxazoles.
  • suitable compounds MF-PA are the compounds MF-PA described above which are substituted with at least one chlorine, bromine and / or iodine atom.
  • Examples of highly suitable compounds MF-PA of this type are the positionally isomeric polychlorinated, polybrominated and polychlorinated and polybrominated compounds MF-PA.
  • the polychlorinated, polybrominated and polychlorinated and polybrominated positionally isomeric monofluorinated biphenyls, terphenyls or quaterphenyls MF-PAC or the polychlorinated, polybrominated and polychlorinated and polybrominated positionally isomeric monofluorinated dibenzodioxins and dibenzofurans MF-PAOC are particularly suitable.
  • Examples of very particularly suitable compounds MF-PA to be used according to the invention are 1-fluoronaphthalene, 1-fluorophenanthrene, 1-fluorchrysene, 1-fluoropyrene, 2-fluorofluorene, 1-fluorofluoranthene, 1-fluoroacenaphthylene or 9-fluorobenzo [k] fluoranthene.
  • the preparation of the compounds MF-PA to be used according to the invention has no special features in terms of method, but instead takes place according to the customary and known methods of organic fluorine chemistry by directly halogenating the parent compound PA with a suitable fluorinating agent such as elemental fluorine or xenon difluoride or by reacting suitable fluorine-containing starting compounds.
  • 1-fluorophenanthrene or 1-fluorochrysene by oxidative photocyclization of suitable starting compounds, 1-fluoronaphthalene, 1-fluorofluoranthene, 1-fluoropyrene or 2-fluorofluorene by the Scliiemann reaction from the corresponding diazonium tetrafluoroborates, 9-fluorobenzo [k] fluoranthene by [4 + 2] -cycloaddition of suitable starting compounds and 1-fluoroacenaphthylene can be prepared by FVT (flash vacuum thermolysis).
  • the compounds are MF-PA
  • model compounds which, instead of the compounds PA, undergo chemical and / or biological processes for the purpose of elucidating reaction mechanisms and whose reaction products are detected and / or analyzed, used.
  • Examples of physical processes in which the compounds MF-PA are advantageously used according to the invention are evaporation, condensation, freezing, melting, sublimation, dissolving, dispersing, emulsifying, (re) crystallizing, precipitation, comminution, agglomeration, mixing, and distribution between at least two different material phases and / or the interaction with sound waves, electromagnetic radiation - such as gamma radiation, X-rays, UV radiation, visible light, near infrared (NIR), infrared or microwaves -, corpuscular radiation - such as proton, neutron or electron beams - And / or electric and / or magnetic fields of at least one compound PA and at least one compound MF-PA or a mixture of substances, for example an environmental sample containing these compounds.
  • electromagnetic radiation - such as gamma radiation, X-rays, UV radiation, visible light, near infrared (NIR), infrared or microwaves -, corpuscular radiation - such as proton, neutr
  • Examples of biological processes in which the compounds MF-PA are advantageously used according to the invention are biochemical or molecular biological processes which take place in vivo or in vitro.
  • the accompanying substance or the internal standard, the external standard and / or the model compound MF-PA or at least one accompanying substance or at least one internal standard and / or at least one external standard and / or at least one model compound MF PA has the same basic structure as the compound PA or at least one of the compounds PA (analytes).
  • process 1 the compounds MF-PA are used in process 1 according to the invention.
  • process step (I) process 1 according to the invention is based on the preparation of at least one analyte PA and / or the sample in which it is contained. The physical processes described above are used here.
  • the mixture of substances resulting from the treatment (I) is then separated into its constituents.
  • suitable separation methods (H) are soxlet extraction, ASE (accelerated solvent extraction), SFE (supercritial fluid extraction; supercritical liquid extraction), extraction under irradiation with microwaves, LLE (liquid-liquid extraction; liquid-liquid extraction) , SPE (solid phase extraction) or Empore Disk.
  • the analyte PA is detected and / or analyzed in method step (HI).
  • the usual and known detection methods such as detection with UV light, diode detectors (DAD UV; diode array detector), fluorescence, mass spectrometry or combinations of these methods can be used.
  • the accompanying substance or the internal standard MF-PA is added in known step in process step (I), (II) and / or (III), preferably in process step (I).
  • MF-PA are used as a solid or solution before or at the Process steps of the analytical process added. Or they are contained in the matrices, for example in the sorbents or solid phases.
  • the compounds MF-PA are used in process 2 according to the invention.
  • Method 2 is used to calibrate analysis methods for compounds PA by the quantitative analysis of at least one external standard using the analysis method to be calibrated, at least one compound MF-PA being analyzed in different concentrations and at least one calibration curve being formed from the resulting measured values.
  • the compound MF-PA has the same structure as the compound PA to be determined quantitatively.
  • the methods mentioned above can be used for detection, for example.
  • Examples of analytical methods which can be advantageously calibrated according to method 2 according to the invention are LC (liquid chromatography; liquid chromatography), GC (gas chromatography), SFC (supercritical fluid chromatography; supercritical liquid phase chromatography), CE (capillary electrophoresis; capillary electrophoresis) or techniques direct detection such as Shpol'skii spectroscopy, synchronous fluorescence spectroscopy, DAD or mass spectrometry.
  • the compounds MF-PA are used in process 3 according to the invention.
  • Method 3 serves to elucidate the mechanisms of biochemical reactions of compounds PA which take place in vitro or in vivo, preferably in vivo.
  • the model compounds MF-PA replace deuterated or radioactively labeled compounds.
  • Method 3 comprises introducing at least one model compound MF-PA into the metabolism of the organism, for example by means of direct injection, food intake, skin absorption and / or respiratory absorption.
  • the model compounds MF-PA are then metabolized in the organism instead of the corresponding parent compounds PA.
  • the metabolites are then isolated, separated and identified.
  • the metabolites and the model compounds MF-PA are used in their isomer distribution to elucidate the metabolism.
  • a particular advantage here is that the fluorine-containing metabolites can be identified in a simple manner by AED (atomic emission detection) or mass spectrometry.
  • connections MF-PA are used for a particular purpose, for example, method 1, 2 or 3 according to the invention, adapted composition, amount and dosage form, for example as a solution, as a powdery solid or adsorbed on carrier material.
  • the packaging itself can be of any shape adapted to the respective application, for example bags, ampoules, hollow spheres or microcapsules, and can consist of any materials, in particular glass or plastics.
  • openings can be provided, for example predetermined breaking or predetermined breaking points.
  • the possibility of using the MF-PA in standardized packaged form as so-called “kits” represents a further particular advantage of the use according to the invention.
  • Table 2 gives an overview of the eluted compounds and the order of their elution in the chromatograms.
  • Table 3 gives an overview of the eluted compounds and the order of their elution in the chromatograms.
  • Example 1 The statements made in Example 1 apply to the elution behavior of the 1,6 and 1,8 isomers.
  • the 1,3-isomers were somewhat more polar than the 1,8-isomers. T. were coeluted with the latter.
  • the length / width ratios of the isomers of a conjugate were comparable, so that this ratio had no influence on the retention behavior.
  • the further comparison of the chromatograms showed that both pyrene and 1-fluoropyrene and their first and second order metabolites could be detected quantitatively and qualitatively side by side.
  • Example 1 The statements made in Example 1 apply to the formation of the 1,6 and 1,8 isomers. A comparison of the enzymes involved from Platichthys flesus on the one hand and Porcellio scaber on the other hand made it clear that the enzymes of the semipode were not as site-specific as those of the flounder. This is shown by the picture of 1,3-isomers. The distribution of the isomers roughly corresponded to that of mononitration of 1-fluoropyrene.
  • GC-MS was performed on a Hewlett-Packard HP 6890 gas chromatograph and an HP 7972A mass spectrometric detector.
  • the gas chromatograph was equipped with an HP 7673 (G1523A) auto sampler.
  • the injections of 1 ⁇ l each into the separation capillary were carried out with a 10 ⁇ l autosampler microinjection syringe with a needle for injections in 0.32 mm separation capillaries.
  • a 30 mx 250 ⁇ m x 0.25 ⁇ m thick film of 5% diphenyl-95% dimethylpolysiloxane was used.
  • Carrier gas was helium 5.0 (purity: 99.999%) at a pressure of 92 kPa.
  • the HP 7972A mass spectrometric detector was operated at a scan rate of 9 scans / s in the m / z range from 50 to 350.
  • the oven temperature was from 60 ° C (3.5 min) to 290 ° C (4.5 min) varied in steps of 6.57 ° C / min over 35 min.
  • the connection line was kept at a temperature of 290 ° C.
  • Breakthrough volume 100 ml
  • Flow rate 0.5 ml / min
  • Breakthrough volume 100 ml flow rate: 0.5 ml min

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Abstract

Die Verwendung monofluorierter polycyclischer aromatischer Verbindungen (MF-PA) als Begleitsubstanzen, als externe Standards oder als Modellverbindungen polycyclischer aromatischer Verbindungen (PA) in physikalischen, chemischen und biologischen Prozessen sowie Verfahren zur qualitativen quantitativen Analyse von Verbindungen PA, zur Kalibrierung von Analyseverfahren für Verbindungen PA und zur Analyse biochemischer Reaktionen von Verbindungen PA, die unter Verwendung mindestens einer Verbindung MF-PA durchgeführt werden.

Description

Monofluorierte polycyclische aromatische Verbindungen und ihre Verwendung als Begleitsubstanzen polycyclischer aromatischer Verbindungen in physikalischen, chemischen und biologischen Prozessen
Die vorliegende Erfindung betrifft die neue Verwendung monofluorierter polycyclischer aromatischer Verbindungen (MF-PA) als Begleitsubstanzen, als externe Standards oder als Modellverbindungen polycyclischer aromatischer Verbindungen (PA) in physikalischen, chemischen und biologischen Prozessen. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung neue Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Verbindungen PA, zur Kalibrierung von Analyseverfahren für Verbindungen PA und zur Analyse biochemischer Reaktionen mit von Verbindungen PA, die unter Verwendung mindestens einer Verbindung MF-PA durchgeführt werden.
Verbindungen PA umfassen nicht nur reine polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe, sondern auch heterocyclische Analoga wie Sauerstoff-, schwefεl- und/oder stickstoffhaltige Derivate. Sie entstehen beispielsweise bei unvollständig verlaufenden pyrolytischen Prozessen.
Ihr Ursprung kann natürlicher Art wie Waldbrand oder Eruptionen oder Exhalationen von Vulkanen oder anthropogen wie industrielle Verbrennungsprozesse, Motorverkehr oder Hausbrand sein. Biogen entstehen Verbindungen PA aus Huminsäuren durch Kondensationsreaktionen und aus Aminosäuren über den Isoprenstoffwechsel durch Ringschluß in Mikroorganismen, Pilzen, Pflanzen und Tieren. Die vielfältigen
Emissionsquellen f hren zum ubiquitären Auftreten in den unterschiedlichsten Matrices, wie dies auch die SRMs (Standard Reference Materials, Standardreferenzmaterialien) des NIST (National Institute of Standards and Technology) belegen. Um dies zu veranschaulichen seien einige SRMs genannt: SRM 1648: Ölproben mit petrogenen Verbindungen PA; SRM 1649: Luftschwebstoffe; SRM 1950: Dieselpartikel; SRM 1941: maritimes Sediment aus einem Hafenbecken; SRM 1974: Muschelgewebe von Mytilus edulis; oder SRM 869: Tetrabenzonaphthalin, Phenanthro[3,4-c]phenanthren und Benzo[a]pyren. Wegen Teerzusätzen können Kosmetika und Shampoos ebenfalls Verbindungen PA enthalten. Des weiteren kommen die Verbindungen PA nicht nur auf der Erde, sondern auch im interstellaren Raum, in galaktischen Nebeln und in aktiven Galaxien vor.
Verbindungen PA zeichnen sich durch eine geringe Polarität und Wasserlöslichkeit aus. Bedingt durch die geringe Wasserlöslichkeit und starke Adsorption an organisches und anorganisches Material resultiert eine geringe Mobilität im Boden. Der Transport und die Anreicherung in spezifischen Bodenschichten erfolgt parallel zur Anreicherung organischer Substanzen wie Mineralöle, Detergentien und Lösemittel. Der Abbau von Verbindungen PA in der Chemosphäre und Biosphäre erfolgt sowohl abiotisch durch Photolyse und Ozonolyse als auch biotisch durch anaerobe und aerobe mikrobielle Tätigkeit.
Verbindungen PA sind sehr unterschiedlich in ihrer toxischen und karzinogenen Wirkung, weswegen die Qualifizierung aller Verbindungen PA in einer Umweltprobe von großer Bedeutung ist. Die Resorption der Verbindungen PA erfolgt zum einen auf inhalativem Wege durch Kleinstpartikel, an deren Oberfläche die Verbindungen PA adsorptiv gebunden sind, zum anderen werden sie über die Nahrungskette aufgenommen und konzentriert, da sie im Fettgewebe akkumuliert werden.
Gleiches gilt mutatis mutandis für die polyhalogenierten Verbindungen PA, insbesondere die polyhalogenierten sauerstoffhaltigen Verbindungen wie Dioxine und Furane, von denen einige zu den Supergiften zählen.
Die Bedeutimg der Verbindungen PA für die Umweltanalytik gründet in der vielfältigen Exposition des Menschen durch diese Stoffklasse. Keine andere
Stoffklasse besitzt einen höheren Anteil an Krebs erzeugenden Substanzen. Schon im achtzehnten Jahrhundert berichtete ein englischer Arzt über das signifikant erhöhte Auftreten von Hautkrebs bei Schornsteinfegern, das heute auf die ständige Exposition von Ruß zurückgeführt werden kann.
Für einige Verbindungen PA, insbesondere die kondensierten polycyclischen aromatischen Verbindungen (cPAC) Naphthalin, Acenaphthylen, Acenaphthen, Phenanthren, Fluoren, Anthracen, Chrysen, Pyren, Fluoranthen, Benzo[a]anthracen, Benzo[k]fluoranthen, Benzo[b]fluoranthen, Benzo[a]pyren, Dibenzo[a:h]anthracen, Benzo[g:h.i]perylen und Indeno[l,2,3-c:d]pyren, die zusammenfassend auch als EPA-cPAC der Enviromnental Protection Agency bezeichnet werden, wurde in Subkutantests das karzinogene Potential an Mäusen verifizert und quantifiziert. So verursacht Benzo[a]pyren in Milligrammdosen bei über 33 Prozent der Population der exponierten Mäuse Krebs. In dieser Hinsicht ist die Verwendung von juckreizstillenden und bakteriziden, Verbindungen PA enthaltenden Teerzusätzen in Kosmetika und Shampoos besonders problematisch. So sind noch immer Shampoos mit einem Gehalt an Benzo[a]pyren von 50 mg/kg am Markt erhältlich.
Die Verbindungen PA induzieren die Synthese der sie abbauenden Enzyme wie Dioxigenase, die beim Säuger durch Cytochrom P-450 eingeleitet wird. Die
Ausscheidung der Abbauprodukte erfolgt über den Harn. Der karzinogene
Wirkungsmechanismus der Entstehimg bösartiger Tumore durch Verbindungen
PA erfolgt durch direkte Reaktion mit der DNA (Desoxyribonucleinsäure).
Ursachen hierfür ist ein Molekülbereich, in dem sich zwei elektrophile Zentren in Abstand von 280 pm voneinander befinden (Bay-Region). Dies entspricht dem
Abstand der Basenpaare in der DNA, wodurch es zur Adduktbildung über metabolische Epoxidbildung kommt.
Aus all diesen Gründen ist die qualitative und quantitative Analytik von Verbindungen PA von allergrößter Bedeutung, und es existieren zahlreiche entsprechende physikalische, physikalisch chemische und chemische Verfahren, die indes weiterentwickelt werden müssen, um gerade im Spurenbereich zu verläßlichen Aussagen zu gelangen.
Zu diesem Zweck wurden und werden Analoge, Homologe, Isomere, Enantiomere oder mit Isotopen markierte Analoge der Analyten verwendet. Insbesondere finden deuterierte Verbindungen PA als interne Standards Verwendung (vgl. den Artikel von W. E. May und S. A. Wise in Analytical Chemistry, Band 56, Seiten 225 und folgende, 1984). Des weiteren werden methylierte Verbindungen PA angewandt, wobei zu beachten ist, daß zahlreiche Umweltproben bereits methylierte Verbindungen PA enthalten. Außerdem ist es von Nachteil, daß sich diese methylierten Verbindungen PA in ihren Eigenschaften häufig stark von den Stammverbindungen unterscheiden, so daß sie im Grunde nicht als interne Standards in Betracht kommen.
Ein gewisser Fortschritt bietet hier die Zugabe fluorierter Verbindungen PA als interne Standards zu den Analyten, wie sie beispielsweise in dem Artikel von J. T. Anderson und U. Weis, »Gas Chromatographie determination of polycyclic aromatic compounds with fluorinated analogues as internal Standards«, in Journal of Chromatography A, Band 659 (1994), Seiten 151 bis 161, beschrieben wird.
Es wird indes hierin nicht gelehrt, wie die internen Standards im Sinne eines pseudoidentischen Verhaltens den im Analyten enthaltenen Verbindungen PA angepaßt werden sollen. Des weiteren wird keine Lehre erteilt, nach welchen Kriterien fluorierte Verbindungen PA als externe Standards zur Kalibrierung physikalischer, chemischer und/oder biologischer Prozesse ausgewählt werden können. Nicht zuletzt fehlen auch Hinweise darauf, welche fluorierte Verbindungen PA als Modellverbindungen für Verbindungen PA in chemischen und/oder biologischen Prozessen verwendet werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, neue Begleitsubstanzen oder interne Standards, neue externe Standards und neue Modellverbindungen für polycyclische aromatische Verbindungen PA, die die Nachteile des Standes der Technik nicht mehr länger aufweisen, im Rahmen physikalischer, chemischer und biologischer Prozesse bereitzustellen. Insbesondere sollen die neuen Begleitsubstanzen oder internen Standards im Sinne eines pseudoidentischen Verhaltens gemeinsam mit den Verbindungen PA physikalische, chemische und/oder biologische Prozesse durchlaufen und anschließend gemeinsam mit diesen oder getrennt von diesen detektiert und/oder analysiert werden. Des weiteren sollen die neuen externen Standards im Sinne eines pseudoidentischen Verhaltens physikalische, chemische und/oder biologische Prozesse zu Zwecken ihrer Kalibrierung durchlaufen und getrennt von den Verbindungen PA analysiert und/oder detektiert werden. Nicht zuletzt sollen die neuen Modellverbindungen ebenfalls im Sinne eines pseudoidentischen Verhaltens anstelle der Verbindungen PA chemische und/oder biologische Prozesse zu Zwecken der Aufklärung von Reaktionsmechanismen durchlaufen, wonach deren Reaktionsprodukte mit detektiert und/oder analysiert werden.
Demgemäß wurde die neue Verwendung monofluorierter polycyclischer aromatischer Verbindungen (MF-PA) als Begleitsubstanzen oder interne Standards, als externe Standards oder als Modellverbindungen polycyclischer aromatischer Verbindungen (PA) in physikalischen, chemischen und biologischen Prozessen gefunden.
Im folgenden wird die neue Verwendung monofluorierter polycyclischer aromatischer Verbindungen (MF-PA) als „erfindungsgemäße Verwendung" bezeichnet.
Außerdem wurde das neue Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Verbindungen PA (Analyten) durch
I) Aufbereitung mindestens eines Analyten PA und/oder der Probe, worin er enthalten ist, sowie II) Trennung und
HI) Detektion und/oder Analyse des oder der Analyten PA
gefunden, bei dem mindestens eine Verbindung MF-PA im Verfahrensschritt I, II und/oder HI als Begleitsubstanz in bekannter Konzentration als interner Standard zugesetzt wird und das im folgenden als „erfindungsgemäßes Verfahren 1 bezeichnet wird.
Des weiteren wurde das neue Verfahren zur Kalibrierung von Analyseverfahren für Verbindungen PA durch die quantitative Analyse mindestens eines externen Standards mit dem zu kalibrierenden Analyserfahren, wobei der externe Standard in unterschiedlichen Konzentrationen analysiert und aus den resultierenden Meßwerten mindestens eine Eichkurve gebildet wird, gefunden, bei dem man als externer Standard mindestens eine Verbindung MF-PA verwendet und das im folgenden als „erfindungsgemäßes Verfahren 2" bezeichnet wird.
Nicht zuletzt wurde das neue Verfahren zur Analyse biochemischer Reaktionen von Verbindungen PA in einem Organismus durch Einführen mindestens einer Modellverbindung in den Metabolismus des Organismus, Metabolisieren der Modellverbindungen sowie Isolieren, Trennen und Identifizieren der Metaboliten gefunden, bei dem man als Modellverbindung eine Verbindung MF-PA verwendet, die dieselbe Grundstruktur wie die Verbindung PA aufweist und das im folgenden als „erfindungsgemäßes Verfahren 3" bezeichnet wird.
Im Hinblick auf den Stand der Technik war es überraschend und für den Fachmann nicht vorhersehbar, daß die außerordentlich komplexe Aufgabe, die der vorliegenden Erfindung zugrunde lag, mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verwendung gelöst werden konnte. Insbesondere überraschte, daß die erfindungsgemäß zu verwendenden Verbindungen MF-PA im Rahmen so zahlreicher komplexer chemischer, physikalischer und sogar biologischer Systeme und Verfahren anwendbar sind und dabei bezüglich der jeweiligen Stammverbindung ein pseudoidentisches Verhalten zeigen. Dabei bieten die erfindungsgemäß zu verwendenden Verbindungen MF-PA noch den ganz besonderen Vorteil, daß sie neben der jeweiligen Stammverbindung PA in einfacher Weise analysiert und/oder detektiert werden können. Darüber hinaus können die Verbindungen MF-PA einfach und in hohen Ausbeuten hergestellt werden.
Im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung und erfindungsgemäßen Verfahren 1 bis 3 resultieren als zusätzliche überraschende besondere Vorteile die leichte Identifizierbarkeit der erfindungsgemäß zu verwendenden Verbindungen MF-PA und ihrer Folgeprodukte, insbesondere ihrer Metabolite.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung spricht man von pseudoidentischem Verhalten einer Verbindung MF-PA, wenn sie sich in physikalischen, chemischen und/oder biochemischen (in vitro und in vivo) Prozessen hinsichtlich der zu untersuchenden Merkmale ähnlich, fast genauso oder genauso verhält wie die betreffende Stammverbindung PA. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung als Begleitsubstanz oder interner Standard ist es erfindungsgernäß von Vorteil, wenn sich die Verbindung MF-PA fast genauso verhält wie die betreffende Stammverbindung PA, weil hierbei zwischen diesen beiden Verbindungen gut differenziert werden kann. Bei der erfindungsgemäßen Verwendung als externer Standard ist es erfindungsgemäß von Vorteil, wenn sich die Verbindung MF-PA fast genauso oder genauso verhält wie die betreffende Stammverbindung PA, weil hierdurch die besonders genaue Kalibrierung eines Prozesses möglich ist.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei den Verbindungen PA um polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe, die in ihrem Ringsystem
frei von Heteroatomen sind (PAC) oder mindestens ein Sauerstoffatom (PAOC), mindestens ein Schwefelatom (PASC), mindestens ein Stickstoffatom (PANC), mindestens ein Sauerstoffatom und mindestens ein Schwefelatom (PAOSC), mindestens ein Sauerstoffatom und mindestens ein Stickstoffatom
(PAONC), mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom
(PANSC) oder - mindestens ein Sauerstoffatom, mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom (PANOSC) enthalten.
Diese Verbindungen PA können synthetischen oder natürliche Ursprungs sein.
Beispiele für Verbindungen PAC sind Biphenyl, Triphenylene, Polyphenylene und kondensierte polycyclische aromatische Verbindungen (cPAC).
Beispiele für Triphenylene PAC sind 1,2 -, 1,3- oder 1,4-Diphenylbenzol (Terphenyl).
Beispiele für Polyphenylene PAC sind Quaterphenyl oder 1,3,5-Triphenylbenzol.
Beispiele für Verbindungen cPAC sind die umweltanalytisch und medizinisch besonders bedeutsamen EPA-cPAC der Enviromnental Protection Agency Naphthalin, Acenaphthylen, Acenaphthen, Phenanthren, Fluoren, Anthracen, Chrysen, Pyren, Fluoranthen, Benzo[a]anthracen, Benzo[k]fluoranthen, Benzo[b]fluoranthen, Benzo[a]pyren, Dibenzo[a:h]anthracen, Benzo[g:h.i]perylen und Indeno[l,2,3-c:d]pyren oder die SRM 869-cPAC des NIST Tetrabenzonapthalin oder Phenanthro[3,4-c]phenanthren. Beispiele für Verbindungen PAOC sind insbesondere Dibenzodioxin oder Dibenzofuran.
Beispiele für Verbindungen PASC sind Benzo[b]thiophen, Dibenzodithiin (Thianthren), Dibenzothiophen oder Naphtho[2,3-b]thiophen, insbesondere Dibenzodithiin oder Dibenzothiophen.
Beispiele für Verbindungen PANC sind Chinolin, Isochinolin, Benzo( ]isochinolin, Acridin, Carbazol, Naphthyridin, Phenanthrolin, Phenanthridin oder Pyrazino [2 ,3 -a] acridin.
Beispiele für Verbindungen PAOSC sind Phenoxathiin oder Thieno[2,3-b]furan, insbesondere Phenoxathiin.
Ein Beispiel für Verbindungen PAONC ist Phenoxazin.
Beispiele für Verbindungen PANSC sind Phenothiazin oder Imidazo[2,l- bjthiazol.
Ein Beispiel für Verbindungen PANOSC ist Thieno[2,3-b]oxazol.
Die vorstehend beschriebenen Verbindungen PA können mit mindestens einem Chlor-, Brom- und/oder Iodatom substituiert sein. Umweltanalytisch und medizinisch bedeutsam sind insbesondere die polychlorierten, polybromierten sowie polychlorierten und polybromierten Verbindungen PA. Von diesen sind wiederum die polychlorierten, polybromierten sowie polychlorierten und polybromierten Biphenyle, Terphenyle oder Quaterphenyle PAC, wie sie beispielsweise als Transformatorenöle oder Flammschutzmittel für Kunststoffe verwendet werden, besonders bedeutsam. Des weiteren sind die polychlorierten, polybromierten sowie polychlorierten und polybromierten Dibenzodioxine und Dibenzofurane PAOC, die auch als Supergifte oder Seveso-Gifte bezeichnet werden, von ganz besonderer Bedeutung. Insbesondere können sie aus den vorstehend genannten Transformatorenölen oder Flammschutzmitteln durch pyrolytische Prozesse entstehen.
Als Stammverbindungen der erfindungsgemäß zu verwendenden monofluorierten polycyclischen aromatischen Verbindungen MF-PA kommen grundsätzlich alle in der Natur vorkommenden oder synthetischen Verbindungen PA in Betracht. Vorzugsweise werden alle vorstehend beschriebenen Verbindungen PA als Stammverbindimgen angewandt.
Bei den vorteilhaften erfindungsgemäß zu verwendenden monofluorierter polycyclischen aromatischen Verbindungen MF-PA handelt es sich demnach um monofluorierte polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe, die in ihrem Ringsystem
frei von Heteroatomen sind (MF-PAC) oder mindestens ein Sauerstoffatom (MF-PAOC), mindestens ein Schwefelatom (MF-PASC), mindestens ein Stickstoffatom (MF-PANC), - mindestens ein Sauerstoffatom und mindestens ein Schwefelatom (MF-
PAOSC), mindestens ein Sauerstoffatom und mindestens ein Stickstoffatom (MF-
PAONC), mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom (MF- PANSC) oder mindestens ein Sauerstoffatom, mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom (MF-PANOSC) enthalten.
Beispiele geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender Verbindungen MF-PAC sind monofluorierte Biphenyle, Triphenylene, Polyphenylene und monofluorierte kondensierte polycyclische aromatische Verbindungen (MF-cPAC). Beispiele gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender Triphenylene MF- PAC sind die stellungsisomeren monofluorierten 1,2 -, 1,3- oder 1,4- Diphenylbenzole (Terphenyle).
Beispiele gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender Polyphenylene MF- PAC sind die stellungsisomeren monofluorierten Quaterphenyle oder 1,3,5- Triphenylbenzole.
Beispiele gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender Verbindungen MF- cPAC sind die stellungsisomeren monofluorierten Naphthaline, Acenaphthylene, Acenaphthene, Phenanthrene, Fluorene, Anthracene, Chrysene, Pyrene, Fluoranthene, Benzo[a]anthracene, Benzo[k]fluoranthene, Benzo[b]fluoranthene, Benzo[a]pyrene, Dibenzo[a:h]anthracene, Benzo[g:h.i]perylene und Indeno[ 1,2,3- c :d]pyrene, Tetrabenzonapthaline oder Phenanthro[3 ,4-c]phenanthrene.
Beispiele gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender Verbindungen MF- PAOC sind die stellungsisomeren monofluorierten Dibenzodioxine oder Dibenzofurane.
Beispiele gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender Verbindungen MF- PASC sind die stellungsisomeren monofluorierten Benzo[b]thiophene, Dibenzoώthiine (Thianthrene), Dibenzothiophene oder Naphtho[2,3-b]thiophene, insbesondere die Dibenzodithiine oder Dibenzothiophene.
Beispiele gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender Verbindungen MF- PANC sind die stellungsisomeren monofluorierten Chinoline, Isochinoline, Benzo[h]isochinoline, Acridine, Carbazole, Naphthyridine, Phenanthroline, Phenanthridine oder Pyrazino[2,3-a]acridine. Beispiele gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender Verbindungen MF- PAOSC sind die stellungsisomeren monofluorierten Phenoxathiine oder Thieno[2,3-b]furane, insbesondere die Phenoxathiine.
Beispiele gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender Verbindungen MF- PAONC sind die stellungsisomeren monofluorierten Phenoxazine.
Beispiele gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender Verbindungen PANSC sind die stellungsisomeren monofluorierten Phenothiazine oder Imidazo[2,l-b]thiazole .
Beispiele gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender Verbindungen MF- PANOSC sind die stellungsisomeren monofluorierten Thieno[2,3-b]oxazole.
Weitere Beispiele geeigneter Verbindungen MF-PA sind die vorstehend beschriebenen Verbindungen MF-PA, die mit mindestens einem Chlor-, Brom- und/oder Iodatom substituiert sind.
Beispiele gut geeigneter Verbindungen MF-PA dieser Art sind die stellungsisomeren polychlorierten, polybromierten sowie polychlorierten und polybromierten Verbindungen MF-PA. Von diesen sind wiederum die polychlorierten, polybromierten sowie polychlorierten und polybromierten stellungsisomeren monofluorierten Biphenyle, Terphenyle oder Quaterphenyle MF-PAC oder die polychlorierten, polybromierten sowie polychlorierten und polybromierten stellungsisomeren monofluorierten Dibenzodioxine und Dibenzofurane MF-PAOC besonders gut geeignet.
Beispiele ganz besonders gut geeigneter erfindungsgemäß zu verwendender Verbindungen MF-PA sind 1 -Fluornaphthalin, 1-Fluorphenanthren, 1- Fluorchrysen, 1-Fluorpyren, 2-Fluorfluoren, 1-Fluorfluoranthen, 1- Fluoracenaphthylen oder 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen. Die Herstellung der erfindungsgemäß zu verwendenden Verbindungen MF-PA weist keine methodischen Besonderheiten auf, sondern erfolgt nach den üblichen und bekannten Methoden der organischen Fluorchemie durch direkte Halogenierung der Stammverbindung PA mit einem geeigneten Fluorierungsmittel wie elementarem Fluor oder Xenondifluorid oder durch die Umsetzung geeigneter fluorhaltiger Ausgangsverbindungen.
So ist beispielsweise 1-Fluorphenanthren oder 1-Fluorchrysen durch oxidative Photocychsierung geeigneter Ausgangsverbindungen, 1 -Fluornaphthalin, 1- Fluofluoranthen, 1-Fluorpyren oder 2-Fluorfluoren durch die Scliiemannreaktion aus den entsprechenden Diazoniumtetrafluorboraten, 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen durch [4 + 2]-Cycloaddition geeigneter Ausgangsverbindungen sowie 1- Fluoracenaphthylen durch FVT (flash vacuum thermolysis) herstellbar.
Erfindungsgemäß werden die Verbindungen MF-PA
als interne Standards, die gemeinsam mit den Verbindungen PA physikalische, chemische und/oder biologische Prozesse durchlaufen und anschließend gemeinsam mit diesen oder getrennt von diesen detektiert und/oder analysiert werden,
als externe Standards, die anstelle der Verbindungen PA physikalische, chemische und/oder biologische Prozesse zu Zwecken der Kalibrierung dieser Prozesse durchlaufen und getrennt von den Verbindungen PA analysiert und/oder detektiert werden, und/oder
als Modellverbindungen, die anstelle der Verbindungen PA chemische und/oder biologische Prozesse zu Zwecken der Aufklärung von Reaktionsmechanismen durchlaufen und deren Reaktionsprodukte detektiert und/oder analysiert werden, verwendet.
Beispiele physikalischer Prozesse, in denen die Verbindungen MF-PA erfindungsgemäß mit Vorteil angewandt werden, sind das Verdampfen, Kondensieren, Gefrieren, Schmelzen, Sublimieren, Lösen, Dispergieren, Emulgieren, (Um)Kristallisieren, Ausfällen, Zerkleinern, Agglomerieren, Vermischen, die Verteilung zwischen mindestens zwei unterschiedlichen stofflichen Phasen und/oder die Wechselwirkung mit Schallwellen, elektromagnetischer Strahlung - wie Gammastrahlung, Röntgenstrahlung, UV- Strahlung, sichtbares Licht, nahes Infrarot (NIR), Infrarot oder Mikrowellen -, Korpuskularstrahlung -wie Protonen-, Neutronen- oder Elektronenstrahlen - und/oder elektrischen und/oder magnetischen Feldern mindestens einer Verbindung PA und mindestens einer Verbindung MF-PA oder eines Stoffgemischs, beispielsweise eine Umweltprobe, das diese Verbindungen enthält.
Beispiele biologischer Prozesse, in denen die Verbindungen MF-PA erfindungsgemäß mit Vorteil angewandt werden, sind biochemische oder molekularbiologische Prozesse, die in vivo oder in vitro ablaufen.
Besondere Vorteile resultieren für die erfindungsgemäße Verwendung, wenn die Begleitsubstanz oder der interne Standard, der externe Standard und/oder die Modellverbindung MF-PA oder mindestens eine Begleitsubstanz oder mindestens ein interner Standard und/oder mindestens ein externer Standard und/oder mindestens eine Modellverbindungen MF-PA dieselbe Grundstruktur wie die Verbindung PA oder mindestens eine der Verbindungen PA (Analyten) aufweist oder aufweisen.
Erfindungsgemäß werden dieVerbindungen MF-PA in dem erfindungsgemäßen Verfahren 1 angewandt. Das erfindungsgemäße Verfahren 1 geht im Verfahrensschritt (I) von der Aufbereitung mindestens eines Analyten PA und/oder der Probe, worin er enthalten ist, aus. Hierbei finden die vorstehend beschriebenen physikalischen Prozesse Anwendung.
Erfindungsgemäß folgt hiernach die Trennung des durch die Aufbereitung (I) resultierenden Stoffgemischs in seine Bestandteile. Auch hierbei finden die vorstehend beschriebenen physikalischen Prozesse Anwendung. Beispiele geeigneter Trennmethoden (H) sind die Soxlethextraktion, ASE (accelerated solvent extraction; beschleunigte Flüssigextraktion), SFE (supercritial fluid extraction; superkritische Flüssigextraktion), Extraktion unter Bestrahlung mit Mikrowellen, LLE (liquid-liquid-extraction; Flüssig-Flüssig-Extraktion), SPE (solid phase extraction; Festphasenextraktion) oder Empore Disk. Diese und weitere Beispiele geeigneter Trennmethoden (II) werden beispielsweise von R. E. Majors in dem Artikel »Sample Preparation and Handling for Enviromnental and Biological Analysis«, LC-GC, Band 13, Nr. 7, 1995 Seiten 542 bis 555, H. L. Lord und J. Pawliszynin dem Artikel »Recent Advances in Solid-Phase Microextraction«, LC-GC International, Dezember 1998, Seiten 776 bis 785, oder von S. a. Barker in dem Artikel »Matrix Solid-Phase Dispersion«, LC-GC International, November 1998, Seiten 719 bis 724, beschrieben.
Erfindungsgemäß erfolgt im Verfahrensschritt (HI) die Detektion und/oder Analyse des Analyten PA. Hierbei können die üblichen und bekannten Detektionsverfahren wie die Detektion mit UV-Licht, Diodendetektoren (DAD UV; diode array detector), Fluoreszenz, Massenspektrometrie oder Kombinationen dieser Verfahren angewandt werden.
Die Begleitsubstanz oder der interne Standard MF-PA wird dabei erfindungsgemäß im Verfahrensschritt (I), (II) und/oder (III), vorzugsweise in Verfahrensschritt (I), in bekannter Konzentration zugesetzt. Die Verbindungen
MF-PA werden dabei als Feststoff oder Lösung vor oder bei den Verfahrensschritten des analytischen Prozesses zugefügt. Oder aber sie sind in den Matrices, beispielsweise in den Sorbentien oder festen Phasen enthalten.
Durch die erfindungsgemäße Verwendung der Verbindungen MF-PA in dem erfindungsgemäßen Verfahren 1 ist es möglich, die Effektivität und Reproduzierbarkeit der einzelnen Verfahrensschritte eines analytischen Prozesses in einfacher Weise quantitativ genau zu erfassen, was ein ganz besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung und des erfindungsgemäßen Verfahrens 1 ist.
Erfindungsgemäß werden die Verbindungen MF-PA in dem erfindungsgemäßen Verfahren 2 angewandt.
Das erfindimgsgemäße Verfahren 2 dient der Kalibrierung von Analyseverfahren für Verbindungen PA durch die quantitative Analyse mindestens eines externen Standards mit dem zu kalibrierenden Analyserfahren, wobei mindestens eine Verbindung MF-PA in unterschiedlichen Konzentrationen analysiert und aus den resultierenden Meßwerten mindestens eine Eichkurve gebildet wird. Besondere Vorteil resultieren auch hier, wenn die Verbindung MF-PA dieselbe Gπmdstruktur wie die quantitativ zu bestimmende Verbindung PA aufweist. Zur Detektion können beispielsweise die vorstehend genannten Verfahren angewandt werden.
Beispiele für Analyseverfahren, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren 2 in vorteilhafter Weise kalibriert werden können, sind LC (liquid chromatography; Flüssigchromatographie), GC (Gaschromatographie), SFC (supercritical fluid chromatography; superkritische Flüssigphasenchromatograpbie), CE (capillary electrophoresis; Kapillarelektrophorese) oder Techniken der direkten Detektion wie die Shpol'skii Spektroskopie, die synchrone Fluoreszenzspektroskopie, DAD oder Massenspektrometrie. Hierbei erweist es sich als ein weiterer besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens 2, daß hiermit die Analyseverfahren nicht nur hinsichtlich der korrespondierenden Stammverbindung PA, sondern auch hinsichtlich der korrespondierenden Stoffgruppe, wie beispielsweise die entsprechenden Metaboliten, etwa die Hydroxyderivate, die Sulfate oder die Glycoside, kalibriert werden können.
Erfindungsgemäß werden die Verbindungen MF-PA bei dem erfindungsgemäßen Verfahren 3 angewandt.
Das erfindungsgemäße Verfahren 3 dient der Aufklärung der Mechanismen biochemischer Reaktionen von Verbindungen PA, die in vitro oder in vivo, vorzugsweise in vivo ablaufen. In der erfindungsgemäßen Verwendung ersetzen die Modellverbindungen MF-PA deuterierte oder radioaktiv markierte Verbindungen.
Das erfindungsgemäße Verfahren 3 umfaßt das Einführen mindestens einer Modellverbindung MF-PA in den Metabolismus des Organismus, beispielsweise mittels direkter Injektion, Nahrungsaufnahme, Hautresorption und/oder Atmungsresorption. Hiernach werden die Modellverbindungen MF-PA im Organismus anstelle der korrespondierenden Stammverbindungen PA metabolisiert. Hiernach erfolgt das Isolieren, Trennen und Identifizieren der Metaboliten. Hierbei werden die Metaboliten und die Modellverbindungen MF- PA in ihrer Isomerenverteilung zur Aufklärung des Metabolismusses herangezogen. Hierbei erweist sich als besonderer Vorteil, daß die fluorhaltigen Metaboliten in einfacher Weise durch AED (atomic emmission detection; Atomemissionsdetektion) oder Massenspektrometrie identifiziert werden können.
Nicht zuletzt können die vorstehend beschriebenen Verbindungen MF-PA in standardisierter abgepackter Form als sogenannte „kits" vorliegen. In diesen kits liegen Verbindungen MF-PA in einer dem jeweiligen Anwendungszweck, beispielsweise den erfindungsgemäßen Verfahren 1, 2 oder 3, angepaßten Zusammensetzung, Menge und Darrreichungsform, beispielsweise als Lösung, als pulverförmiger Feststoff oder an Trägermaterial adsorbiert, vor. Die Verpackungen selbst können von beliebiger, dem jeweiligen Anwendungszweck angepaßter Form, beispielsweise Beutel, Ampullen, Hohlkugeln oder Mikrokapseln, sein und aus beliebigen Materialien, insbesondere Glas oder Kunststoffen, bestehen. Des weiteren können Öffmmgsvo richtungen, beispielsweise Sollbruch- oder Sollrißstellen, vorhanden sein. Die Möglichkeit, die MF-PA in standardisierter abgepackter Form als sogenannte „kits" zu verwenden, stellt einen weiteren besonderen Vorteil der erfindungsgemäßen Verwendung dar.
Beispiele
Beispiel 1
Die Verwendung von 1-Fluorpyren zur Untersuchung der Metabolisierung von Pyren in Flundern (Platichtys flesus)
Ausgewachsenen Flundern eines Gewichts von 200 bis 400 Gramm wurden pro 1 kg Körpergewicht jeweils eine Lösung einer Mischung von 1-Fluorpyren und Pyren im Gewichtsverhältnis 1 : 1 in Dimethylsulfoxid mit einer Konzentration von 200 μg/ml in die Bauchdecke injiziert. Die Expositionszeit betrug sieben Tage. Hiernach wurde den Flundern die Galle enmommen, und die Gallenflüssigkeit wurde mit Methanol verdünnt und direkt in einen Hochdruckflüssigchromatographen (HPLC) injektiert. Als stationäre Phase der HPLC-Säule wurde C-18 Polymer Vydack® verwendet. Die Tabelle 1 gibt eine Übersicht über den Gradientenverlauf. Die eluierten Verbindungen wurden bei einer Wellenlänge von 339 nm mit DAD (diode array detector) detektiert. Tabelle 1 : Gradientenverlauf bei der Hochdruckflüssigchromatographie
Zeit Acetonitril Wasser
(min) (%) (%)
0 5 95
40 90 10
50 90 10
60 5 95
Die Tabelle 2 gibt eine Übersicht über die eluierten Verbindungen und die Reihenfolge ihrer Elution in den Chromatogrammen.
Tabelle 2: Die eluierten Verbindungen und die Reihenfolge ihrer Elution in den Chromatogrammen
Peak Nr. Verbindung
1 Injektionspeak
2 1-Glycronicacid-pyren (Metabolit zweiter Ordnung)
2 ' 1 -Fluor-8-glycronicacid-pyren (Metabolit zweiter Ordnung)
2" 1 -Fluor-6-glycronicacid-pyren (Metabolit zweiter Ordnung)
3 1-Sulfat-pyren (Metabolit zweiter Ordnung) 3 ' 1 -Fluor-8-sulfat-pyren (Metabolit zweiter Ordnung)
3 " 1 -Fluor-6-sulfat-pyren (Metabo ht zweiter Ordnung) unbekannter Stoff, der nicht dem Metabolismus, sondern der Matrix entstammte
Pyren, 1-Fluorpyren, 1-Hydroxypyren (Metabolit erster Ordnung) sowie 1-Fluor- 6-hydroxid-pyren und l-Fluor-8-hydroxy-pyren (Metaboliten erster Ordnung) waren in der Probe enthalten. Sie konnten jedoch wegen ihrer zu niedrigen Konzentration nicht direkt durch ihre Spektren, sondern nur anhand der Retensionszeiten nachgewiesen werden.
Was das Retensionsverhalten betraf, eluierten die nicht substituierten Verbindungen und die fluorierten Verbindungen auf der C-18-Phase später, weil sie lipophiler waren als die substituierten Verbindungen. Die Verbindungen mit dem 1,6-Substitutionsmuster waren unpolarer als die Verbindungen mit dem 1,8- Substitutionsmuster, weswegen letztere eine kürzere Retensionszeit aufwiesen. Der weitere Vergleich der HPLC-Chπnatogramme ergab, daß sowohl Pyren als auch 1-Fluorpyren und deren Metaboliten erster und zweiter Ordnung nebeneinander qualitativ und quantitativ nachgewiesen werden konnten.
Die Bildung der 1,6-Isomeren ist gegenüber der Bildung der 1,8-Isomeren energetisch begünstigt. Dies spiegelte sich auch bei der hier untersuchten Metabolisierung wider. Die hieran beteiligten Enzyme waren in ihrem Substratverhalten nicht ausgeprägt ortsspezifisch, sondern eher energiespezifisch. Der Substrat-Enzym-Mechanismus war indes so ortsspezifisch, daß keine Substitution am fluorierten Ring stattfand. Beispiel 2
Die Verwendung von 2-Fluorpyren zur Untersuchung der Metabolisierung von Pyren in Semipoden (Porcellio scaber)
Erwachsene Semipoden eines Alters von einem Jahr, nahmen 1-Fluorpyren und Pyren über die Nahrung auf. Hierzu wurde die Nahrung Folsomia candida mit den Verbindungen kontaminiert. Hierzu wurde eine Lösung von 1-Fluorpyren und Pyren im Verhältnis 1 : 1 in Aceton (Konzentration: 50 mg/ml) verwendet, womit die Nahrung getränkt wurde. Die Expositionszeit betrug ein Tag.
Hiernach wurden den Semipoden der Hepatopancreas vom Kopf abgetrennt und in Ethanol/Wasser (Volumenverhältnis 1 : 1) mit Protease K zusammengegeben. Die Proben wurden in Eppendorfhütchen während 30 min bei 30°C gerührt und nachfolgend mit Ultraschall behandelt. Die resultierenden Lösungen wurden direkt in einen Hochdruckflüssigchromatographen (HPLC) injektiert. Für die Messungen wurden die in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen angewandt.
Die Tabelle 3 gibt eine Übersicht über die eluierten Verbindungen und die Reihenfolge ihrer Elution in den Chromatogrammen.
Tabelle 3: Die eluierten Verbindungen und die Reihenfolge ihrer Elution in den Chromatogrammen
Peak Nr. Verbindung
4 polare Komponenten aus der Matrix von unbekannter Struktur
6' unbekanntes Konjugat von l-Flur-6-hydroxy-pyren mit der Masse 266
6" unbekanntes Konjugat von l-Flur-8-hydroxy-pyren mit der Masse
266
6'" unbekanntes Konjugat von l-Flur-3-hydroxy-pyren mit der Masse 266
7 ' 1 -Fluor-6-sulfat-pyren (Metabolit zweiter Ordnung)
7 " 1 -Fluor-8-sulfat-pyren (Metabolit zweiter Ordnung) 7 ' " 1 -Fluor-3 -sulfat-pyren (Metabolit zweiter Ordnung)
8 ' 1 -Fluor-6-glycronicacid-pyren (Metabolit zweiter Ordnung)
8 " 1 -Fluor-8-glycronicacid-pyren (Metabolit zweiter Ordnung)
8 " ' 1 -Fluor-3-glycronicacid-pyren (Metabolit zweiter Ordnung)
9' l-Fluor-6-hydroxy-pyren (Metabolit erster Ordnung)
9 " 1 -Fluor-8-hydroxy-pyren (Metabolit erster Ordnung) 9'" l-Fluor-3-hydroxy-pyren (Metabolit erster Ordnung)
10 unbekannte Komponente Hinsichtlich des Elutionsverhaltens der 1,6- und 1,8-Isomeren gilt das bei Beispiel 1 Gesagte. Die 1,3-Isomeren waren etwas polarer als die 1,8-Isomeren, weswegen sie z. T. mit den letzteren coeluiert wurden. Die Länge/Breite- Verhältnisse der Isomeren eines Konjugats waren vergleichbar, so daß dieses Verhältnis keinen Einfluß auf das Retentionsverhalten hatte. Der weitere Vergleich der Chromatogramme ergab, daß sowohl Pyren als auch 1-Fluorpyren und deren Metaboliten erster und zweiter Ordnung nebeneinander quantitativ und qualitativ nachgewiesen werden konnten.
Hinsichtlich der Bildung der 1,6- und 1,8-Isomeren gilt das bei Beispiel 1 Gesagte. Der Vergleich der beteiligten Enzyme von Platichthys flesus einerseits und Porcellio scaber andererseits wurde indes deutlich, daß die Enzyme des Semipoden nicht so ortsspezifisch waren wie die der Flunder. Dies zeigt sich an der Bildimg von 1,3-Isomeren. Die Verteilung der Isomeren entsprach in etwa der einer Mononitrierung von 1-Flurpyren.
Beispiel 3
Die Verwendung von Verbindungen MF-PA zur Kalibrierung einer GC-MS- Kopplung
GC-MS wurde auf einem Hewlett-Packard-Gaschromatograph HP 6890 und einem massenspektrometrischen Detektor HP 7972A durchgeführt. Der Gaschromatograph war mit einem HP 7673 (G1523A) Autosampier ausgerüstet. Die Injektionen von jeweils 1 μl in die Trennkapillare wurden mit einer 10 μl Autosampler-Mikroinjektionsspritze mit einer Nadel für Injektionen in 0,32 mm Trennkapillaren durchgeführt. Ein 30 m x 250 μm x 0,25 μm starker Film aus 5 % Diphenyl- 95% Dimethylpolysiloxan wurde verwendet. Trägergas war Helium 5.0 (Reinheit: 99,999 %) bei einem Druck von 92 kPa. Der massenspektrometrische Detektor HP 7972A wurde bei einer Scan-Rate von 9 Scans/s im m/z-Bereich von 50 bis 350 betrieben. Die Ofentemperatur wurde von 60°C (3,5 min) bis 290 °C (4,5 min) während 35 min in Schritten von 6,57 °C/min variiert. Die Verbindimgsleitung wurde bei einer Tempeartur von 290 °C gehalten.
Die Konzentration der angewandten Verbindungen MF-PA 1 -Fluornaphthalin, 1- Fluorphenanthren, 1-Fluorchrysen, 1-Fluorpyren, 2-Fluorfluoren, 1- Fluorfluoranthen und 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen sowie der 16 EPA-PA Naphthalin, Acenaphthylen, Acenaphthen, Phenanthren, Fluoren, Anthracen, Chrysen, Pyren, Fluoranthen, Benzo[a]anthracen, Benzo[k]fluoranthen, Benzo[b]fluoranthen, Benzo[a]pyren, Dibenzo[a:h]anthracen, Benzo[g:h.i]perylen und Indeno[ 1 ,2,3-c :d]pyren lag bei 4 ng/μl. Jede Probe wurde zwölfmal injektiert. Als Lösemittel wurde Methylacetat verwendet.
Charakteristisch für die Fragmetierung der Verbindungen MF-PA sind die m/z = [M]+ * , [M+l]+ ' , [M-HF] + • , [M] ++ • und [HF] + * . Die Tabelle 4 gibt einen Überblick über die entsprechenden m z- Werte.
Tabelle 4. m/z-Werte der verwendeten Verbindungen MF-PA
MF-PA m/z [M]+ * [M+l]+ # [M-HF] + * [M] ** -
1 -Fluornaphthalin 146 147 126 73
1 -Fluorphenanthren 196 197 176 98
1-Fluorchrysen 246 247 226 123
1-Fluorpyren 220 221 200 110 -Fluorfluoren 184 185 164 92
1 -Fluorfluoranthen 220 221 200 110
9-Fluorber_zo[k]fluoranthen 270 271 250 135
Die Standardabweichungen der GC-MS-Messungen an den EPA-PA wurden ermittelt. Sie lagen bei 18 bis 20%.
Wurde dagegen die korrespondierende Verbindung MF-PA (1 -Fluornaphthalin, 1- Fluorphenanthren, 1-Fluorchrysen, 1-Fluorpyren, 2-Fluorfluoren, 1- Fluorfluoranthen oder 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen) eines gegebenen EPA-PA als Standard verwendet, resultierte eine besonders geringe Standardabweichung.
Die Standardabweichung eines gegebenen EPA-PA, für den keine korrespondierende Verbindung MF-PA zur Verfügung stand, konnte bereits durch die Verwendung von 1 -Fluorphenanthren als Standard signifikant verbessert werden.
Eine weitere signifikante Verbesserung resultierte aus der Verwendung der drei Verbindungen MF-PA 1 -Fluornaphthalin, 1 -Fluorphenanthren und 9- Fluorbenzo[k]fluoranthen, die in der angegebenen Reihenfolge eluierten und deren Peaks am Anfang, in der Mitte und am Ende des Chromatogramms auftauchten.
Die Verwendung aller sieben Verbindungen MF-PA brachte dagegen keine weitere nennenswerte Verbesserung mehr mit sich. Mit anderen Worten: die Verwendung von drei Standards war völlig ausreichend. Die Tabelle 5 gibt einen Überblick über die ermittelten Standardabweichungen. Die EPA-PA eluierten in der angegebenen Reihenfolge. Korrespondierende Verbindungen MF-PA eluierten unmittelbar mit der jeweiligen Stammverbindung.
Tabelle 5: Die ermittelten Standardabweichungen (%) der 16 EPA-PA
Verbindung PA korrespondierende Anzahl der Standards:
Verbindung MF-PA 1 3 7
Naphthalin 0,38 1,62 1,44 1,63
Acenaphthylen 0,69 1,05 0,99
Acenaphthen 1,03 1,22 1,23
Fluoren 0,66 0,66 1,25 1,01
Anthracen 0,60 0,93 0,68
Phenanthren 0,60 0,58 0,98 0,86
Fluoranthen 0,92 0,83 0,79 0,65
Pyren 0, 73 0,75 0,89 0,71
Benzo[a]anthracen 1,67 1,21 1,18
Chrysen 1,03 1,82 1,32 1,31
Benzo [b]fluoranthen 2,14 1,59 1,63 Benzo[k]fluoranthen 1,12 2,4 1,91 1,93
Benzo [a]pyren 2,85 2,33 2,34
Indeno [ 1 ,2,3-c :d]pyren- 3,73 3,26 3,31
Dibenzo[a:h]anthracen - 4,22 3,75 3,81
Benzo[g:h:i]perylen 3,51 2,99 3,08
Die Untersuchung untermauerte, daß die Verbindungen MF-PA hervorragend zur Kalibrierung von Analyseverfahren für Verbindungen PA geeignet waren.
Beispiel 4
Die Verwendung von Verbindungen MF-PA als Begleitsubstanzen in der Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)
Als stationäre Phase der HPLC-Säule wurde C-18 Polymer Vydack® verwendet. Die Tabelle 6 gibt eine Übersicht über den Gradientenverlauf. Die eluierten Verbindungen wurden mit UV-DJAD (diode array detector) detektiert. Die Tabelle 7 gibt einen Überblick über das Wellenlängenprogramm.
Tabelle 6: Gradientenverlauf bei der Hochdruckflüssigchromatographie
Zeit Acetonitril Wasser
(min) (%) (%)
0 50 50
5 60 40
20 100 0
25 100 0
30 50 50
Tabelle 7: Wellenlän enp rogramm UV-D AD
Zeit (min) Wellenlänge (nm)
0,0 225
7,0 210
10,5 205
11,8 250
13,0 235
18,0 265
21,0 240
Es wurde eine Mischung aus 1-Fluomaphthalin, 1-Fluracenaphthylen 1- Fluorphenanthren, 1-Fluorchrysen, 1-Fluorpyren, 2-Fluorfluoren, 1- Fluorfluoranthen und 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen sowie der korrespondierenden Stammverbindungen PA analysiert. Die Verbindungen eluierten in der folgenden Reihenfolge:
1. Naphthalin 2. 1 -Fluornaphthalin
3. Acenaphthylen
4. 1-Fluoracenaphthylen
5. Fluoren
6. 1-Fluorfluoren
7. Pyren
8. 1-Fluorpyren
9. Fluoranthen
10. Phenanthren
11. 1 -Fluorfluoranthen
12. 1 -Fluorphenanthren
13. Chrysen
14. 1-Fluorchrysen
16. Benzo[k]fluoranthen 17. 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen.
Die Untersuchung untermauerte, daß die Verbindungen MF-PA hervorragend als Begleitsubstanzen bzw. interne Standards für ihre korrespondierenden Stammverbindungen PA waren. Beispiel 5
Die Verwendung der Verbindungen MF-PA als Begleitsubstanzen bzw. interne Standards in der Festphasenextraktion (SPE; solid phase extraction)
Mischungen von 1 -Fluornaphthalin und Naphthalin, 1-Fluracenaphthylen und Acenaphthylen, 1 -Fluorphenanthren und Phenanthren, 1-Fluorchrysen und Chrysen, 1 -Fluorpyren und Pyren, 2-Fluorfluoren und Fluoren, 1 -Fluorfluoranthen und Fluoranthen sowie 9-Fluorbenzo[k]fluoranthen und Benzo[k]fluoranthen wurden der SPE unterworfen und durch HPLC analysiert und detektiert.
Hierbei wurden die folgenden Bedingungen angewandt:
Bedingungen 1: Phase: C8-Polymer
Durchbruchvolumen: 100 ml Durchfluß: 0,5 ml/min
Bedingungen 2: Phase: Styrol-Divinylbenzol-Copolymerisat
Durchbruchvolumen: 100 ml Durchfluß: 0,5 ml min
Unter den Bedingungen 2 war die Verdünnung von Benzo[k]fluoranthen bei den nötigen Elutionsvolumina so hoch, daß die Verbindung nicht mehr detektiert werden konnte.
Ansonsten zeigte eine gegebene Verbindung MF-PA und ihre korrespondierende Stammverbindung PA in allen Fällen ein im wesentlichen identisches Elutionsverhalten. Untersuchungen der einzelnen Verbindungen MF-PA und PA durch SPE mit jeweils drei Phasen einer Charge unter den Bedingungen 1 zeigte, daß die Abweichungen der Phasen untereinander signifikant größer war, als die zwischen Analyt PA und internem Standard MF-PA. Dies unterstreicht weiter, daß die Verbindungen MF-PA hervorragend als interne Standards bzw. Begleitsubstanzen geeignet sind.

Claims

Monofluorierte polycyclische aromatische Verbindungen und ihre Verwendung als Begleitsubstanzen polycyclischer aromatischer Verbindungen in physikalischen, chemischen und biologischen Prozessen
Patentansprüche
1. Verwendung monofluorierter polycyclischer aromatischer Verbindungen (MF-PA) als Begleitsubstanzen oder interne Standards, als externe Standards oder als Modellverbindungen polycychscher aromatischer Verbindungen (PA) in physikalischen, chemischen und biologischen
Prozessen.
2. Die Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den polycyclischen aromatischen Verbindungen PA um polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe handelt, die in ihrem Ringsystem
frei von Heteroatomen sind (PAC) oder mindestens ein Sauerstoffatom (PAOC), mindestens ein Schwefelatom (PASC), - mindestens ein Stickstoffatom (PANC), mindestens ein Sauerstoffatom und mindestens ein Schwefelatom
(PAOSC), mindestens ein Sauerstoffatom und mindestens ein Stickstoffatom
(PAONC), - mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom
(PANSC) oder mindestens ein Sauerstoffatom, mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom (PANOSC)
enthalten.
3. Die Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen PAC um Biphenyl, Triphenylene, Polyphenylene und kondensierte polycyclische aromatische Verbindungen (cPAC) handelt.
4. Die Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen cPAC um Naphthalin, Acenaphthylen, Acenaphthen, Phenanthren, Fluoren, Anthracen, Chrysen, Pyren, Fluoranthen, Benzo[a]anthracen, Benzo[k]fluoranthen, Benzo [b]fluoranthen, Benzo[a]pyren, Dibenzo[a:h]anthracen,
Benzo[g:h.i]perylen und Indeno[ 1 ,2,3-c:d]pyren (zusammenfassend: EPA- cPAC) sowie Tetrabenzonapthalin oder Phenanthro[3,4-c]phenanthren (zusammenfassend: SRM 869-cPAC) handelt.
5. Die Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen
PAOC um Dibenzodioxin und Dibenzofuran, PASC um Dibenzom'thiin und Dibenzothiophen und - PAOSC um Phenoxathiin
handelt.
6. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen PA mit mindestens einem Chlor-,
Brom- und/oder Iodatom substituiert sind.
7. Die Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen PA polychlorierte, polybromierte oder polychlorierte und - bromierte Biphenyle, Terphenyle oder Quaterphenyle PAC oder
Dibenzodioxine oder Dibenzofurane PAOC sind.
. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen MF-PA um monofluorierte polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe handelt, die in ihrem Ringsystem
frei von Heteroatomen sind (MF-PAC) oder mindestens ein Sauerstoffatom (MF-PAOC), mindestens ein Schwefelatom (MF-PASC), - mindestens ein Stickstoffatom (MF-PANC), mindestens ein Sauerstoffatom und mindestens ein Schwefelatom
(MF-PAOSC), mindestens ein Sauerstoffatom und mindestens ein Stickstoffatom
(MF-PAONC), - mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom
(MF-PANSC) oder mindestens ein Sauerstoffatom, mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom (MF-PANOSC)
enthalten.
9. Die Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen MF-PAC um stellungsisomere monofluorierte Biphenyle, Triphenylene, Polyphenylene und stellungsisomere monofluorierte kondensierte polycyclische aromatische Verbindungen
(MF-cPAC) handelt.
10. Die Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen MF-cPAC um die stellungsisomeren monofluorierten Naphthaline, Acenaphthylene, Acenaphthene,
Phenanthrene, Fluorene, Anthracene, Chrysene, Pyrene, Fluoranthene, Benzo[a]anthracene, Benzo[k]fluoranthene, Benzo[b]fluoranthene, Benzo [a]pyrene, Dibenzo[a:h]anthracene, Benzo[g:h.i]perylene und Indeno[l,2,3-c:d]pyrene sowie Tetrabenzonapthalin oder Phenanthro[3,4- c]phenanthren handelt.
11. Die Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen
MF-PAOC um die stellungsisomeren monofluorierten Dibenzodioxine und Dibenzofurane, MF-PASC um die stellungsisomeren monofluorierten Dibenzodithiine und Dibenzothiophene und MF-PAOSC um die stellungsisomeren monofluorierten Phenoxathiine
handelt.
12. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen MF-PA mit mindestens einem Chlor-, Brom- und/oder Iodatom substituiert sind.
13. Die Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen MF-PA polychlorierte, polybromierte oder polychlorierte und -bromierte stellungsisomeren monofluorierte Biphenyle, Terphenyle oder Quaterphenyle MF-PAC oder Dibenzodioxine oder Dibenzofurane
MF-PAOC sind.
14. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindungen MF-PA als interne Standards, die gemeinsam mit den Verbindungen PA physikalische, chemische und/oder biologische Prozesse durchlaufen und anschließend gemeinsam mit diesen oder getrennt von diesen detektiert und/oder analysiert werden,
als externe Standards, die anstelle der Verbindungen PA physikalische, chemische und/oder biologische Prozesse zu Zwecken der Kalibrierung dieser Prozesse durchlaufen und getrennt von den Verbindungen PA analysiert und/oder detektiert werden, und/oder
als Modellverbindungen, die anstelle der Verbindungen PA chemische und/oder biologische Prozesse zu Zwecken der Aufklärung von Reaktionsmechanismen durchlaufen und deren Reaktionsprodukte detektiert und/oder analysiert werden,
verwendet.
15. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den physikalischen Prozessen um das
Verdampfen, Kondensieren, Gefrieren, Schmelzen, Sublimieren, Lösen, Dispergieren, Emulgieren, (Um)Kristallisieren, Ausfällen, Zerkleinern, Agglomerieren, Vermischen, die Verteilung zwischen mindestens zwei unterschiedlichen stofflichen Phasen und/oder die Wechselwirkung mit Schallwellen, elektromagnetischer Strahlung, Korpuskularstrahlung und/oder elektrischen und/oder magnetischen Feldern mindestens einer Verbindungen PA und mindestens einer Verbindung MF-PA oder eines Stoffgemischs, das diese Verbindungen enthält, handelt.
16. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den biologischen Prozessen um biochemische oder molekularbiologische Prozesse handelt.
17. Die Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Begleitsubstanzen, die externen Standards und oder die Modellverbindungen MF-PA dieselbe Grundstruktur wie die Verbindungen PA aufweisen.
18. Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse von Verbindungen PA (Analyten) durch
I) Aufbereitung mindestens eines Analyten PA und/oder der Probe, worin er enthalten ist, sowie
II) Trennung und
III) Detektion und/oder Analyse des oder der Analyten PA,
dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Verbindung MF-PA im Verfahrensschritt (I), (II) und/oder (III) als Begleitsubstanz in bekannter Konzentration als interner Standard zugesetzt wird.
19. Das Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine Verbindung MF-PA im Verfahrensschritt I zugesetzt wird.
20. Verfahren zur Kalibrierung von Analyseverfahren für Verbindungen PA durch die quantitative Analyse mindestens eines externen Standards mit dem zu kalibrierenden Analyserfahren, wobei der externe Standard in unterschiedlichen Konzentrationen analysiert und aus den resultierenden Meßwerten mindestens eine Eichkurve gebildet wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als externer Standard mindestens eine Verbindung MF-PA verwendet.
21. Verfahren zur Analyse biochemischer Reaktionen von Verbindungen PA in einem Organismus durch Einführen mindestens einer Modellverbindung in den Metabolismus des Organismus, Metabohsieren der Modellverbindungen sowie Isolieren, Trennen und Identifizieren der Metaboliten, dadurch gekennzeichnet, daß man hierbei als Modellverbindung eine Verbindung MF-PA verwendet, die dieselbe
Grundstruktur wie die Verbindung PA aufweist.
22. Das Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, das Verfahren nach Anspruch 20 oder das Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen PA um polycyclische aromatische
Kohlenwasserstoffe handelt, die in ihrem Ringsystem
frei von Heteroatomen sind (PAC) oder mindestens ein Sauerstoffatom (PAOC), - mindestens ein Schwefelatom (PASC), mindestens ein Stickstoffatom (PANC), mindestens ein Sauerstoffatom und mindestens ein Schwefelatom
(PAOSC), mindestens ein Sauerstoffatom und mindestens ein Stickstoffatom (PAONC), mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom
(PANSC) oder mindestens ein Sauerstoffatom, mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom (PANOSC)
enthalten.
3. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 18, 19 oder 22, das Verfahren nach Anspruch 20 oder 22 oder das Verfahren nach Anspruch 21 oder 22 dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen PAC um Biphenyl, Triphenylene, Polyphenylene und kondensierte polycyclische aromatische Verbindungen cPAC handelt.
24. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 18, 19, 22 oder 23, das Verfahren nach einem der Ansprüche 20, 22 oder 23 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 23 dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen cPAC um Naphthalin, Acenaphthylen, Acenaphthen, Phenanthren, Fluoren, Anthracen, Chrysen, Pyren, Fluoranthen, Benzo[a]anthracen, Benzo [k]fluoranthen,
Benzo[b]fluoranthen, Benzo [ajpyren, Dibenzo[a:h]anthracen, Benzo[g:h.i]perylen und Indeno[l,2,3-c:d]pyren (zusammenfassend: EPA- cPAC) sowie Tetrabenzonapthalin oder Phenanthro[3,4-c]phenanthren (zusammenfassend: SRM 869-cPAC) handelt.
25. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 18,19 oder 22 bis 24, das Verfahren nach einem der Ansprüche 20 oder 22 bis 24 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 24 dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen
PAOC um Dibenzodioxin und Dibenzofuran, - PASC um Dibenzodithiin und Dibenzothiophen und
PAOSC um Phenoxathiin
handelt.
26. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 18, 19 oder 22 bis 25, das Verfahren nach einem der Ansprüche 20 oder 20 bis 25 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen PA mit mindestens einem Chlor-, Brom- und/oder lodatom substituiert sind.
27. Das Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen PA polychlorierte, polybromierte oder polychlorierte und - bromierte Biphenyle, Terphenyle oder Quaterphenyle PAC oder Dibenzodioxine oder Dibenzofurane PAOC sind.
28. Das Verfahren nach einem der Ansprüche mit 18, 19 oder 22 bis 27, daß Verfahren nach einem der Ansprüche 20 oder 22 bis 27 oder das Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen MF-PA um monofluorierte polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe handelt, die in ihrem Ringsystem
frei von Heteroatomen sind (MF-PAC) oder mindestens ein Sauerstoffatom (MF-PAOC), mindestens ein Schwefelatom (MF-PASC), mindestens ein Stickstoffatom (MF-PANC), - mindestens ein Sauerstoffatom und mindestens ein Schwefelatom
(MF-PAOSC), mindestens ein Sauerstoffatom und mindestens ein Stickstoffatom (MF-PAONC), mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom (MF-PANSC) oder mindestens ein Sauerstoffatom, mindestens ein Schwefelatom und mindestens ein Stickstoffatom (MF-PANOSC)
enthalten.
29. Das Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen MF-PAC um monofluorierte Biphenyle, Triphenylene, Polyphenylene und kondensierte polycyclische aromatische Verbindungen (MF-cPAC) handelt.
30. Das Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Verbindungen MF-cPAC um monofluorierte Naphthaline, Acenaphthylene, Acenaphthene, Phenanthrene, Fluorene, Anthracene, Chrysene, Pyrene, Fluoranthene, Benzo[a]anthracene, Benzo[k]fluoranthene, Benzo[b]fluoranthene, Benzo[a]pyrene,
Dibenzo[a:h]anthracene, Benzo [g:h.i]perylene und Indeno[ 1,2,3- c:d]pyrene sowie Tertabenzonapthaline oder Phenanthro[3,4- c]phenanthrene handelt.
31. Das Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei Verbindungen
MF-PAOC um monofluorierte Dibenzodioxine und Dibenzofurane, MF-PASC um monofluorierte Dibenzodithiine und Dibenzothiophene und
MF-PAOSC um monofluorierte Phenoxathiine
handelt.
32. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 18, 19 oder 22 bis 31, das Verfahren nach einem der Ansprüche 20 oder 22 bis 31 oder das Verfahren nach Anspruch 21 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen MF-PA mit mindestens einem Chlor-, Brom- und/oder lodatom substituiert sind.
3. Das Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungen MF-PA polychlorierte, polybromierte oder polychlorierte und -bromierte Biphenyle, Terphenyle oder Quaterphenyle MF-PAC oder Dibenzodioxine oder Dibenzofurane MF-PAOC sind.
34. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 18, 19 oder 22 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Begleitsubstanz oder der interne Standard dieselbe Grundstruktur wie mindestens einer der Analyten PA aufweisen.
35. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 20 oder 22 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß der externe Standard dieselbe Grundstruktur wie mindestens einer der Analyten PA aufweist.
36. Verpackungen („kits"), enthaltend monofluorierte polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe MF-PA zur Verwendung in den
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18 bis 35.
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