DE69211567T2

DE69211567T2 - Hochwasserlösliche bis-naphthalimide-derivate nützlich als krebsmittel

Info

Publication number: DE69211567T2
Application number: DE69211567T
Authority: DE
Inventors: Jung-Hui Sun
Original assignee: DuPont Merck Pharmaceutical Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Pharma Co
Priority date: 1991-12-11
Filing date: 1992-12-11
Publication date: 1996-10-10
Anticipated expiration: 2012-12-12
Also published as: EP0618901A1; EP0618901B1; CA2125142A1; WO1993012092A1; AU3241593A; US5488110A; DE69211567D1; ES2088661T3; JPH07501822A

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf besondere Bisnaphthalimide, nämlich 2,2'-[1,2-Ethandiylbis(methylimino-2,1-ethandiyl)]bis[5- nitro-1H-ben[de]isochinolin-1,3(2H)-dion], 2-[2-isochinolin-2(3H)-yl)ethyl]- amino]ethyl]amino]ethyl]-5-nitro-1H-benz[de]isochinolin-1,3(2H)- dion, 2,2'- [1,2-Ethandiylbis(imino-2,1-ethandiyl)]bis[5-nitro-1Hbenz [de] isochinolin-1,3(2H)-dion], pharmazeutische Zusammensetzungen, die sie enthalten, und ihre Verwendung zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung fester Tumorkarzinome bei Säugern.

Hintergrund der Erfindung

Harnisch et al., US-Patent 4,919,848, offenbaren Naphthalsäureimide, die sich als ladungsregulierende Substanzen eignen, die für elektrophotographische Toner geeignet sind.
Brana et al., US 4,874,863, offenbaren Antikrebsverbindungen der Formel:
wobei X¹, X², X³ und X&sup4; gleich oder verschieden sind und jeweils H, NO&sub2;, NH&sub2;, C&sub1;-C&sub6;-Alkylamino, Di-C&sub1;-C&sub6;-Alkylamino, OH, C&sub1;-C&sub6;- Alkoxy, Halogen, Trihalogenmethyl, C&sub1;-C&sub6;-Alkyl, Formyl, C&sub1;-C&sub6;- Alkylcarbonyl, C&sub1;-C&sub6;-Acylamino, Ureyl, C&sub1;-C&sub6;-Alkylureyl oder C&sub1;-C&sub6;-Alkylcarbonylamino sind und R ein geradkettiges oder verzweigtes C&sub4;-C&sub1;&sub0;-Alkylen ist, das an einem oder zwei Punkten in der Kette durch eine sekundäre oder tertiäre Aminogruppe unterbrochen ist, wobei 2 Stickstoffatome zusätzlich über eine Alkylengruppe aneinander gebunden sein können, oder ein Salz mit einer physiologisch annehmbaren Säure.
Brana et al., US-Patent 4,874,863, offenbaren nicht speziell die Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Die in US 4,874,863 speziell offenbarten Verbindungen sind wesentlich weniger löslich als die Verbindungen der vorliegenden Erfindung und werfen daher Probleme bei der Zubereitung auf, wenn man versucht, solche Verbindungen zu einer Darreichungsform zuzubereiten, die sich für die menschliche Verwendung eignet.
Es wurde gefunden, daß die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine drastisch erhöhte Wasserlöslichkeit besitzen, was ein unerwarteter Vorteil gegenüber den Verbindungen des oben genannten Patents ist.
Außerdem zeigen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine unerwartet stärkere Antitumorwirkung als die von Brana et al. speziell offenbarten Verbindungen.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Es wird eine Verbindung der Formel:
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon beschrieben, wobei R¹ und R² unabhängig H oder CH&sub3; sind.
Besonders bevorzugte Verbindungen der Erfindung sind:
2,2'-[1,2-Ethandiylbis(methylimino-2,1-ethandiyl)]bis[5-nitro-1H- benz[de]isochinolin-1,3(2H)-dion];
2-[2-[N-Methyl-N-[2-[[2-(5-nitro-1,3-dioxo-1H-benz[de]isochinolin-2(3H)-yl)ethyl]amino]ethyl]amino]ethyl]-5-nitro-1H-benz[de]- isochinolin-1,3(2H)-dion;
2,2'-[1,2-Ethandiylbis(imino-2,1-ethandiyl)]bis[5-nitro-1H- benz[de]isochinolin-1,3(2H)-dion] und
pharmazeutisch annehmbare Salze davon.
Diese Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die die Verbindungen der oben beschriebenen Formel (i) enthalten, und gibt die Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung fester Tumorkarzinome bei Säugern an.
Obwohl die Verbindungen der vorliegenden Erfindung innerhalb des breiten Umfangs von US-Patent 4,874,863 enthalten sind, werden sie dort nicht speziell beansprucht oder als Beispiele genannt. Es wurde entdeckt, daß die Verbindungen der vorliegenden Erfindung gegenüber den in Brana et al., US-Patent 4,874,863, speziell offenbarten Verbindungen eine beträchtlich erhöhte Antitumorwirkung haben. Während die Verbindungen der vorliegenden Erfindung in vivo eine sehr starke Wirkung gegen feste Tumoren zeigen, erwiesen sich die von Brana et al. speziell offenbarten strukturell ähnlichen Verbindungen als inaktiv.
Außerdem wurde gefunden, daß die N-methylsubstituierten Verbindungen der vorliegenden Erfindung, wie in Beispiel 1, eine unerwartet erhöhte Wasserlöslichkeit haben. Dies war nicht zu erwarten, da man erwarten würde, daß das Hinzufügen hydrophober Methylgruppen zu dem Molekül eine Abnahme der Wasserlöslichkeit des Moleküls bewirkt.
Verbindungen dieser Erfindung können synthetisiert werden, indem man zwei Äquivalente eines Anhydrids der Formel (ii) in einem inerten Lösungsmittel, wie Ethanol oder Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, bei einer Temperatur in einem Bereich von Raumtemperatur bis zum Siedepunkt des Lösungsmittels mit einem Äquivalent eines Polyamins der Formel (iii) umsetzt (Schema A, unten). Die resultierende Suspension kann dann filtriert werden, um die freie Base von (i) zu erhalten, oder sie kann mit einer geeigneten Mineral- oder organischen Säure angesäuert werden, um ein pharmazeutisch annehmbares Salz zu bilden, das durch Filtration erhalten werden kann. Salze der freien Base können auch hergestellt werden, indem man eine Suspension der freien Base in Ethylalkohol oder Dichlormethan mit einer geeigneten Mineraloder organischen Säure ansäuert und den gebildeten Feststoff durch Filtration gewinnt. In einigen Fällen erfordert die freie Base von (i) eine Reinigung durch Säulenchromatographie, bevor ihr Salz wie oben beschrieben hergestellt werden kann. Schema A
Das Stammanhydrid (ii) ist im Handel erhältlich oder kann nach den von Hodgson et al., J. Chem. Soc., 5. 90 (1945), beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Verbindungen der Formel (iii) können nach den unten beschriebenen Verfahren hergestellt werden.

Beispiel 1

2,2'-[1,2-Ethandiylbis(methylimino-2,1-ethandiyl)]bis[5-nitro-1H- benz[de]isochinolin-1,3(2H)-dion]-Methansulfonat (1:2) (Ia)
Die Verbindung von Beispiel 1 kann nach dem folgenden Verfahren synthetisiert werden (siehe auch Schema 1 unten).
Teil A: Bis(1,1'-dimethylethyl) [1,2-ethandiylbis (methylimino- 2-oxy-2,1-ethandiyl)]bis(carbamat) (IIa)
Eine Lösung von N-t-BOC-glycin (17.52 g, 100 mmol) und 1,1'- Carbonyldiimidazol (17.02 g, 105 mmol) in Methylenchlorid (300 ml) wurde zwei Stunden unter Kühlung mit einem Eisbad gerührt. Dazu wurde bei 0-5ºC eine Lösung von N,N'-Dimethylethylendiamin in Methylenchlorid (40 ml) gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde mit gesättigtem Na&sub2;CO&sub3; (2 x 100 ml) und Kochsalzlösung (1 x 100 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und eingedampft, was 18,83 g (46,8% Ausbeute) ha als weißen Feststoff ergab: Smp. 112-118ºC. NMR (CDCl&sub3;) δ 5,43 (breit, 2H, 2 NH), 3,85-3,98 (m, 4H, 2 CH&sub2;), 3,55 (5, 4H, 2 CH&sub2;), 2,95 (m, 6H, 2 CH&sub3;) und 1,44 (5, 18H, 6 CH&sub3;) . MS (DCI) m/e 403 (M+1).
Teil B: N,N'-1,2-Ethandiylbis[2-amino-N-methylacetamid]- Dihydrochlond (IIIa)
Ein Gemisch von IIa (12,48 g, 31,02 mmol) und 15,5 ml 4,4 N HCl in Dioxan in 50 ml Dioxan wurde 3 Tage bei 0ºC und dann 48 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde weitere 24 Stunden auf 50-55ºC erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde Ether zu dem Gemisch gegeben, und der Feststoff wurde unter Stickstoff auf einem Filter aufgefangen, was 5,57 g (79,6%) IIIa als weißen Feststoff ergab, Smp. 223ºC (Zers.). NMR (D&sub2;O) δ 3,88, 3,80 (2 s, 4H, 2 CH&sub2;), 3,45 (5, 4H, 2 CH&sub2;) und 2,85 (t, 6H, 2 CH&sub3;). MS (CI) m/e 203 (M+1) . IR (KBR) 3435 (NH2) , 1665, 1649 (C=O) cm&supmin;¹.
Teil C: N,N'-Bis(2-aminoethyl)-N,N'-dimethyl-1,2-ethandiamin- Tetrahydrochlond (IVA)
Zu einer Suspension von IIIa (5,30 g, 18,32 mmol) in THF (125 ml) wurden langsam 150 ml 1 M BH&sub3; THF-Komplex gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht zum Rückfluß erhitzt. Weitere 50 ml 1 M BH&sub3;-THF- Komplex wurden hinzugefügt, und das Gemisch wurde 24 Stunden am Rückfluß erhitzt. Weitere 40 ml 1 M BH&sub3; THF-Komplex wurden hinzugefügt, und das Gemisch wurde weitere 72 Stunden am Rückfluß erhitzt. Die DC-Analyse (NH&sub4;OH/Isopropanol = 1:3) zeigte an, daß die Reaktion beendet war. Die Reaktionslösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und langsam mit 115 ml Methanol abgelöscht. Die Lösung wurde über Nacht am Rückfluß erhitzt. Die Lösungsmittel in der Lösung wurden verdampft, und zu der verbleibenden Flüssigkeit wurde viermal reichlich Methanol (100 ml) gegeben und verdampft, um Trimethylborat zu entfernen. Zu dern resultierenden viskosen Öl in 30 ml Methanol wurden 8 ml konz. HCl gegeben. Der weiße Feststoff wurde auf einem Filter aufgefangen, was 3,56 g (58,2%) IVa ergab. NMR (D&sub2;O) δ 3,53 (s, 4H, 2 CH&sub2;) , 3,48-3,30 (m, 8H, 4 CH&sub2;) und 2,83 (5, 6H, 2 CH&sub3;). MS (DCI) m/e 175 (M+1).
Teil D: N,N'-Bis(2-aminoethyl)-N,N'-dimethyl-1,2-ethandiamin (Va)
Zu einer frisch hergestellten Natriumethoxidlösung (1,15 g Natrium in 60 ml Ethanol) wurden 3,56 g (11,12 mmol) IVa gegeben. Das Gemisch wurde 2 1/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Natriumchlorid in dem Gemisch wurde auf einem Filter entfernt und das Lösungsmittel in dem Filtrat verdampft. Das Produkt in dem zurückbleibenden Rückstand wurde durch Kugelrohr-Destillation gereinigt (84-104ºC bei 0,7 mm), was 1,39 g (72%) Va als klare Flüssigkeit ergab. NMR (CDCl&sub3;) δ 2,78 (t, 4H, 2 CH&sub2;)&sub1; 2,50 (s, 4H, 2 CH&sub2;), 2,45 (t, 4H, 2 CH&sub2;) und 2,25 (5, 6H, 2 CH&sub3;). MS (CDI) m/e 175 (M+1). IR (Nujol) 3360, 3281 (NH, NH&sub2;) cm&supmin;¹.
Teil E: 2,2'-[1,2-Ethandiylbis(methylimino-2,1-ethandiyl)]bis[5-nitro-1H-benz[de]isochinolin-1,3(2H)-dion]-Methansulfonat (1:2) (Ia)
Ein Gemisch von 3-Nitro-1,8-naphthalsäureanhydrid (1,95 g, 8,03 mmol) und Va (0,7 g, 4,02 mmol) in 30 ml Ethanol wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Feststoff wurde auf einem Filter aufgefangen, was rohe freie Base von I (2,30 g, 92% Ausbeute) ergab. Diese wurde durch Säulenchromatographie gereinigt, was 1,27 g reine freie Base als helibraunen Feststoff ergab. Zu der freien Base (1,26 g, 2,0 mmol) in 40 ml Methylenchlorid wurden 0,39 g (4,0 mmol) Methansulfonsäure gegeben, und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierenden Niederschläge wurden auf einem Filter aufgefangen, was eine Menge von 1,76 g ergab, die durch Erhitzen in Methanol über Nacht gereinigt wurde, was 1,18 g Ia als hellgelben Feststoff ergab; Smp. 244-245ºC (Zers.). NMR (DMSO-d&sub6;) δ 9,50 (d, 2H, J = 1,9 Hz, aromatische Protonen), 9,00 (d, 2H, J = 1,9 Hz, aromatische Protonen), 8,85 (d, 2H, J = 8,0 Hz, aromatische Protonen), 8,74 (d, 2H, J = 7,3 Hz, aromatische Protonen), 8,11 (t, 2H, J = 7,9 Hz, aromatische Protonen), 4,49 (breites s, 4H, 2 CH&sub2;), 3,37 (breites s, 8H, 4 CH&sub2;), 2,92 (5, 6H, 2 CH&sub3;) und 2,25 (s, 6H, 2 CH&sub3;). MS (CI) m/e 625 (M+1). Analyse berechnet für C&sub3;&sub2;H&sub2;&sub6;N&sub6;O&sub8; 2CH&sub3;SO&sub3;H (MW 816,81): C, 50,00; H, 4,44; N, 10,29; S, 7,85. Gefunden: C, 49,69; H, 4,33; N, 10,24; S, 7,77. Schema 1

Beispiel 2

2-[2-[N-Methyl-N-[2-[[2-(5-nitro-1,3-dioxo-1H-benz[de]isochinolin-2(3H)-yl)ethyl]amino]ethyl]amino]ethyl]-5-nitro-1H-benz[de]- isochinolin-1,3(2H)-dion-Methansulfonat (1:2) (Ib)
Durch Ersetzen von N,N'-Dimethylethylendiamin durch N-Methylethylendiamin wird Verbindung Ib unter Verwendung der oben für Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen hergestellt.
Gelber Feststoff, Smp. 232-234ºC (Zers.). NMR (CDCl&sub3;) für die freie Base δ 9,28 (s, 1H, aromatisches Proton), 9,25 (s, 1H, aromatisches Proton), 9,10 (s, 2H, aromatische Protonen), 8,75 (t, 2H, J = 7,9 Hz, aromatische Protonen), 8,40 (m, 2H, aromatische Protonen), 7,92 (m, 2H, aromatische Protonen), 4,52 (t, 2H, J = 6,6 Hz, CH&sub2;), 4,20 (t, 2H, J = 6,4 Hz, CH&sub2;), 2,89 (t, 2H, J = 6,4 Hz, CH&sub2;), 2,74 (s, 4H, 2 CH&sub2;), 2,59 (t, 2H, J = 5,5 Hz, CH&sub2;) und 2,35 (s, 3H, CH&sub3;). NMR (DMSO-d&sub6;) für das Methansulfonat- Salz δ 9,55 (d, 2H, J = 2,2 Hz, aromatische Protonen), 8,99 (d, 2H, J = 1,1 Hz, aromatische Protonen), 8,84 (d, 2H, J = 8,4 Hz, aromatische Protonen), 8,72 (d, 2H, J = 7,4 Hz, aromatische Protonen), 8,10 (t, 2H, J = 7,0 Hz, aromatische Protonen), 4,42 (m, 4H, 2 CH&sub2;), 3,40 (breit, 9H, 3 CH&sub2; und CH&sub3;), 2,98 (breit, 2H, CH&sub2;) und 2,22 (s, 6H, 2 CH&sub3;) . IR (KBR) 1709, 1668 (C=O) cm&supmin;¹. Analyse berechnet für C&sub3;&sub1;H&sub2;&sub6;N&sub6;O&sub8; 2CH&sub3;SO&sub3;H H&sub2;O (MW 820,80): C, 48,29; H, 4,42; N, 10,24; S, 7,81. Gefunden: C, 48,73, 48,73; H, 4,40, 4,39; N, 10,30, 10,27; S, 7,45, 7,40.
Verbindung IV kann durch Reaktion von 3-Nitro-1,8-naphthalsäureanhydrid (2,0 Äqu.) und Triethylentetramin (1,0 Äqu.) in Ethanol bei Rückflußtemperatur hergestellt werden. Die Verbindung wurde dann isoliert und als ihr Methansulfonat-Salz charakterisiert (siehe Schema 2).

Beispiel 3

2,2'-[1,2-Ethandiylbis(imino-2,1-ethandiyl)]bis[5-nitro-1H- benz[de]isochinolin-1,3(2H)-dion]-Methansulfonat (1:2)(VI)
Ein Gemisch von 3-Nitro-1,8-naphthalsäureanhydrid (20,0 g, 82,2 mmol) und Triethylentetramin (6,2 g, 42,4 mmol) in 900 ml Ethanol wurde 72 Stunden unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt und dann 2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Der Feststoff wurde auf einem Filter aufgefangen, was 23,60 g der freien Base ergab (96,3% Ausbeute); Smp. 198-201ºC (Zers.). Die freie Base wurde dann wie folgt zum Methansulfonat-Salz umgesetzt. Zu einer Aufschlämmung der freien Base (3,0 g, 5,0 mmol) in 50 ml Methylenchlorid wurden 0,96 g (10 mmol) Methansulfonsäure in 10 ml Methylenchlorid gegeben. Das Gemisch wurde dann über Nacht am Rückfluß erhitzt. Der Feststoff wurde auf einem Filter aufgefangen, was einen gelben Feststoff ergab. Dieser wurde durch 4 Stunden Erhitzen in 98% Ethanol (200 ml) gereinigt, filtriert und getrocknet, was VI ergab (siehe Schema 2 unten) (3,36 g, 85,2% Ausbeute), Smp. 271-273ºC (Zers.).
NMR (DMSO-d&sub6;) δ 9,55 (d, 2H, J 8,1 Hz, aromatische Protonen), 8,99 (d, 2H, J = 2,5 Hz, aromatische Protonen), 8,84 (d, 2H, J = 8,1 Hz, aromatische Protonen), 8,72 (m, 2H, aromatische Protonen), 8,10 (t, 2H, J = 7,9 Hz, aromatische Protonen), 4,40 (t, 4H, J = 5,3 Hz, 2 CH&sub2;), 3,40 (m, 4H, 2 CH&sub2;), 3,31 (s, 4H, 2 CH&sub2;) und 2,23 (s, 6H, 2 CH&sub3;). Analyse berechnet für C&sub3;&sub0;H&sub2;&sub4;N&sub6;O&sub8; 2CH&sub3;50&sub3;H (MW 788,76): C, 48,73; H, 4,09; N, 10,66; 5, 8,13. Gefunden: C, 48,78; H, 3,97; N, 10,50; S, 7,92. Schema 2

Löslichkeit der Verbindungen der Erfindung

UV-Verfahren zur Bestimmung der Wasserlöslichkeit

Das UV-Spektrum einer gesättigten Lösung der Probe wird bei Raumtemperatur aufgenommen (wobei eine gesättigte Lösung als Lösung in Wasser definiert ist, die 15 bis 20 Stunden über überschüssiger Probe steht, ohne daß Hitze angewendet wird). Wenn möglich, wird eine Standardlösung der Probe in Wasser erhalten. Wenn die Löslichkeit in Wasser dafür zu gering ist (< 1 mg/100 ml), wird ein mg der Probe in DMSO gelöst und mit Wasser auf 100 ml verdünnt. Molare oder massenbezogene Extinktionskoeffizienten werden für die Standardlösungen berechnet, und diese Werte werden verwendet, um die Konzentration der gesättigten Lösung zu bestimmen. Tabelle 1 Verbindung Wasserlöslichkeit (g/1) log P* Beisp. * berechneter Verteilungskoeffizient (log P-Wert) zwischen Octanol und Wasser für die neutrale Form der Verbindungen.
Wie aus den Daten in Tabelle 1 hervorgeht, zeigt die Verbindung von Beispiel 1 eine drastische unerwartete Erhöhung der Wasserlöslichkeit. Dies ist wegen der Erhöhung des berechneten Verteilungskoeffizienten (log P-Wert) zwischen Octanol und Wasser für das Molekül nicht zu erwarten.

Verwendbarkeit

Wachstumshemmende Wirkung in vitro

L1210-Zellen wurden in RPMI-1640-a-Medium gehalten, dem 10% hitzeinaktiviertes Rinderfetusserum und 50 ml Mercaptoethanol/ Liter Medium zugesetzt waren (RPMI-L). B16-Zellen wurden in RPMI- 1640-Medium gehalten, dem 15% hitzeinaktiviertes Rinderfetusserum und Antibiotika zugesetzt waren (RPMI-C).
Exponentiell wachsende Mäuse-Leukämie-L1210-Zellen (1 x 10³ Zellen) in 0,1 ml Medium wurden am Tage 0 in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen eingeimpft. Am Tage 1 wurde ein 0,1-ml-Aliquot Medium, das abgestufte Konzentrationen von Testanaloga enthielt, zu dem Anfangsvolumen gegeben. Nach 3 Tagen Inkubation bei 37ºC in einem Feuchtkammerinkubator wurden die Platten kurz zentrifugiert, und 0,1 ml des Wachstumsmediums wurden entnommen. Die Zellkulturen wurden 4 Stunden bei 37ºC mit 50µl 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT; 1 mg/ml in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung) inkubiert. Der resultierende rotviolette Formazan-Niederschlag wurde mit 0,2 ml 0,04 N HCl in Isopropylalkohol in Lösung gebracht. Die Extinktion wurde mit einem Titertek-Multiskan-MCC-Scanning- Well-Spektrophotometer (Flow Laboratories) bei einer Testwellenlänge von 570 nm und einer Bezugswellenlänge von 630 nm abgelesen.
Die ID&sub5;&sub0;-Werte wurden mit einem Computerprogramm bestimmt, das für alle Daten (8 Bestimmungen pro Konzentration und 12 Konzentrationen pro Testanalogon) die folgende Gleichung anpaßte:
Y = ((Am - A&sub0;)/(1+(X/ID&sub5;&sub0;)n))+A&sub0;
wobei Am = Extinktion der Kontrollzellen; A&sub0; = Extinktion der Zellen in Gegenwart der höchsten Wirkstoffkonzentration; Y = beobachtete Extinktion; X = Wirkstoffkonzentration; ID&sub5;&sub0; = Wirkstoffdosis, die das Wachstum der Zellen auf die Hälfte von dem der Kontrollzellen hemmt.
Die Ergebnisse der in-vitro-Tests sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Beisp. Nr. ID&sub5;&sub0; (µg/ml)

in-vivo-Tumormodelle

Repräsentative Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurden in präklinischen Tests auf Antikrebswirkung getestet, die die klinische Anwendbarkeit anzeigen. Zum Beispiel zeigen die hier beanspruchten Verbindungen eine verblüffende in-vivo-Wirksamkeit gegen Human-DLD-2-Dickdarmkarzinome, die in nackte Mäuse fremdimplantiert wurden.
Die beim Testen von Verbindungen bei den in-vivo-Human-Tumor- Fremdimplantat-Modellen verwendeten Verfahren sind unten beschrieben.

in-vivo-Human-Tumor-Fremdimplantat-Modelle

Der DLD-2-Human-Dickdarmtumor, das MX-1-Human-Brustdrüsenkarzinom und der LX-1-Human-Lungentumor wurden ursprünglich aus einem chirurgisch entfernten Primärkolonkarzinom, Brusttumor bzw. nichtkleinzelligen Lungenkarzinom erhalten. Die Human-Tumorlinien wurden durch fortgesetztes überimpfen in athymische nackte Mäuse erhalten. Das MX-1-Human-Brustdrüsenkarzinom und der LX-1-Human- Lungentumor sind bewährte Tumoren, die von der NCI verwendet werden. Die Tumormodelle DLD-2, MX-1 und LX-1 sind gut charakterisiert.
Die in diesen Experimenten verwendeten Mäuse waren inzuchtfreie Schweizer Mäuse oder BALB/c-Mäuse, die das Nacktgen (nu/nu) trugen. Am Tage 0 werden männliche und weibliche Mäuse mit einem Gewicht von 22-30 g mit 0,2 ml einer 25%igen Tumorzellmasse geimpft. Diese Zellmasse wird durch Zerkleinern von frischem Tumorgewebe, das subkutan in Zwischenträgermäusen gezüchtet wurde, in steriler physiologischer Kochsalzlösung hergestellt. Tastbare Tumoren mit einem Gewicht von ungefähr 50 mg treten innerhalb von 7-10 Tagen nach der Impfung in den Mäusen auf. Die Mäuse werden paarweise gemäß dern Tumorgewicht und ihrem Geschlecht in Gruppen von jeweils zehn eingeordnet, und die Testverbindungen und die Trägerkontrolle werden an neun aufeinanderfolgenden Tagen einmal am Tag intravenös (i.v.) verabreicht. Eine Abnahme des Körpergewichts von > 20% am Tage 5 nach der Verabreichung der Verbindung wird als ein Anzeichen von Toxizität angesehen. Tumormessungen und Körpergewichte werden einmal pro Woche aufgezeichnet. 15 bis 18 Tage nach der ersten Injektion werden die Mäuse gewogen, getötet, und die Tumore werden herausgeschnitten und gewogen.
Die Wirksamkeit der Testverbindungen wird anhand des Ausmaßes der Hemmung des Tumorwachstums bei behandelten im Vergleich zu mit Träger behandelten Kontrollmäusen bestimmt. Die Anfangstumorgewichte (mg) werden aus den mit dem Tastzirkel gemessenen Tumorabmessungen (mm) berechnet, wobei die Formel für ein verlängertes Rotationsellipsoid verwendet wird (mg Tumorgewicht = (Länge x Breite²)/2). Die Tumornettogewichte werden für jede der behandelten Gruppen und die mit Träger behandelte Kontrollgruppe berechnet, indem man das Anfangstumorgewicht vom Endtumorgewicht am Tage 15 abzieht. Die Ergebnisse sind als prozentuale Abnahme im Vergleich zum mittleren Tumorgewicht bei der mit Träger behandelten Kontrollgruppe ausgedrückt.
% Hemmung des Tumor wachstums = [1 - mittleres Tumorgewicht (behandelt)/mittleres Tumorgewicht (Kontrolle)] x 100

Aktivitätskriterien

Die Kriterien des National Cancer Institute (NCI) für die Aktivität in den in-vivo-Krebsmodellen wurden verwendet. Eine Hemmung (des Tumorwachstums von 58-89% im DLD-2-Assay wird als eine mäßige Aktivität angesehen, und eine Hemmung von ≥ 90% wird als eine gute bis ausgezeichnete Aktivität angesehen. Ein tatsächlicher Rückgang des Tumors (IR = unvollständiger Rückgang; FR = vollständiger Rückgang) zeigt eine ausgezeichnete bis hervorragende Aktivität an. Verbindungen, die eine Wachstumshemmung von < 58% zeigen, werden als inaktiv angesehen.
Die Verbindungen der Beispiele 1, 2 und 3 zeigten eine ausgezeichnete bis hervorragende Aktivität gegen DLD-2-Human-Dickdarmtumore.
Die nachgewiesene Wirksamkeit der Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei den Human-Kolontumor-Fremdimplantat-Modellen zeigt an, daß die Verbindungen der vorliegenden Erfindung für die Behandlung fester Tumorkarzinome beim Menschen und insbesondere von Tumoren des Dickdarms geeignet sein könnten. Das hohe Ausmaß der in-vivo-Antitumorwirkung gegen Human-Dickdarmtumore, das die hier beanspruchten Verbindungen zeigen, liefert einen starken Beweis dafür, daß die in der vorliegenden Erfindung beanspruchten Verbindungen eine wichtige therapeutische Anwendbarkeit bei der Behandlung von Krebs beim Menschen haben können.

Dosierung und Zubereitung

Die Antitumorverbindungen (Wirkstoffe) dieser Erfindung können mit jedem Mittel, das zu einem Kontakt des Wirkstoffes mit seinem Wirkungsort im Körper eines Säugers führt, verabreicht werden, um Tumore zu hemmen. Sie können mit jedem herkömmlichen Mittel verabreicht werden, das für die Verwendung in Verbindung mit Pharmaka, entweder als einzelne therapeutische Wirkstoffe oder in einer Kombination therapeutischer Wirkstoffe, zur Verfügung steht. Sie können allein verabreicht werden, werden jedoch im allgemeinen zusammen mit einem pharmazeutischen Träger verabreicht, der auf der Basis des gewählten Verabreichungsweges und der pharmazeutischen Standardpraxis ausgewählt wird.
Die verabreichte Dosis wird eine tumorhemmende Menge des Wirkstoffs sein und wird natürlich in Abhängigkeit von bekannten Faktoren, wie den pharmacodynamischen Merkmalen des besonderen Wirkstoffs und seinem Verabreichungsmodus und -weg, dem Alter, Gesundheitszustand und Gewicht des Empfängers, der Art und dern Ausmaß der Symptome, der Art der Begleitbehandlung, der Behandlungshäufigkeit und der gewünschten Wirkung variieren. Gewöhnlich kann eine tägliche Wirkstoffdosis 5 bis 400 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht betragen. Normalerweise sind 10 bis 200 und vorzugsweise 10 bis 50 Milligramm pro Kilogramm pro Tag, die 2- bis 4mal am Tag in geteilten Dosen oder in einer Form mit verzögerter Freisetzung gegeben werden, wirksam, um gewünschte Ergebnisse zu erhalten.
Darreichungsformen (Zusammensetzungen), die sich zur internen Verabreichung eignen, enthalten 1,0 Milligramm bis 500 Milligramm Wirkstoff pro Einheit. In diesen pharmazeutischen Zusammensetzungen ist der Wirkstoff normalerweise in einer Menge von 0,5-95 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, vorhanden.
Der Wirkstoff kann oral in festen Darreichungsformen, wie Kapseln, Tabletten und Pulvern, oder in flüssigen Darreichungsformen, wie Elixieren, Sirups und Suspensionen, verabreicht werden. Er kann auch parenteral in sterilen flüssigen Darreichungsformen verabreicht werden.
Gelatinekapseln enthalten den Wirkstoff und pulverisierte Träger, wie Lactose, Saccharose, Mannit, Stärke, Cellulosederivate, Magnesiumstearat und Stearinsäure Ähnliche Verdünnungsmittel können zur Herstellung komprimierter Tabletten verwendet werden. Sowohl Tabletten als auch Kapseln können als Produkte mit verzögerter Freisetzung hergestellt werden, um für eine kontinuierliche Freisetzung des Medikaments über Stunden hinweg zu sorgen. Komprimierte Tabletten können mit Zucker oder einem Film überzogen sein, um einen unangenehmen Geschmack zu verdecken und die Tablette vor der Atmosphäre zu schützen, oder magensaftresistent überzogen sein, damit sie selektiv im Magen-Darm-Trakt zerfallen.
Flüssige Darreichungsformen für die orale Verabreichung können Farb- und Aromastoffe enthalten, um die Akzeptanz beim Patienten zu erhöhen.
Im allgemeinen sind Wasser, ein geeignetes Öl, Salzlösung, wäßrige Dextrose (Glucose) und Lösungen verwandter Zucker sowie Glycole, wie Propylenglycol oder Polyethylenglycole, geeignete Träger für parenterale Lösungen. Lösungen für die parenterale Verabreichung enthalten vorzugsweise ein wasserlösliches Salz des Wirkstoffs, geeignete Stabilisatoren sowie, falls erforderlich, Puffersubstanzen. Antioxidantien, wie Natriumhydrogensulfit, Natriumsulfit oder Ascorbinsäure, sind entweder allein oder in Kombination geeignete Stabilisatoren. Verwendet werden auch Zitronensäure und ihre Salze sowie Natrium-EDTA. Außerdem können parenterale Lösungen Konservierungsstoffe enthalten, wie Benzalkoniumchlorid, Methyl- oder Propylparaben und Chlorbutanol.
Geeignete pharmazeutische Träger sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, einem Standardbezugstext in diesem Gebiet, beschrieben.
Geeignete pharmazeutische Darreichungsformen zur Verabreichung der Verbindungen dieser Erfindung können wie folgt erläutert werden.
Kadseln: Kapseln werden hergestellt, indem man zweiteilige Standard-Hartgelatinekapseln jeweils mit 100 mg pulverisiertem Wirkstoff, 175 mg Lactose, 24 mg Talk und 6 mg Magnesiumstearat füllt.
Weichgelatinekapseln: Ein Gemisch eines Wirkstoffs in Sojabohnenöl wird hergestellt und mittels einer Verdrängerpumpe unter Bildung von Weichgelatinekapseln, die 100 mg des Wirkstoffs enthalten, in Gelatine injiziert. Die Kapseln werden gewaschen und getrocknet.
Tabletten: Tabletten werden nach herkömmlichen Verfahren hergestellt, so daß die Dosierungseinheit aus 100 mg Wirkstoff, 0,2 mg kolbidalem Siliciumdioxid, 5 mg Magnesiumstearat, 275 mg mikrokristalliner Cellulose, 11 mg Maisstärke und 98,8 mg. Lactose besteht. Geeignete Überzüge können aufgetragen werden, um die Schmackhaftigkeit zu erhöhen oder die Resorption zu verzögern.
Injektionslösungen: Eine parenterale Zusammensetzung, die sich zur Verabreichung durch Injektion eignet, wird hergestellt, indem man 1,5 Gew.-% Wirkstoff in 10 Vol.-% Propylenglycol und Wasser rührt. Die Lösung wird mit Natriumchlorid isotonisch gemacht und sterilisiert.
Suspension: Eine wäßrige Suspension für orale Verabreichung wird hergestellt, so daß 5 ml jeweils 100 mg fein zerteilten Wirkstoff, 200 mg Natriumcarboxymethylcellulose, 5 mg Natriumbenzoat, 1,0 g Sorbitlösung, U.S.P., und 0,025 ml Vanillin enthalten.

Claims

1. Verbindung der Formel

oder pharmazeutisch annehmbares Salz davon, wobei R¹ und R² unabhängig H oder CH&sub3; sind.

2. Verbindung gemäß Anspruch 1, bei der es sich um 2,2'-[1,2- Ethandiylbis(methylimino-2,1-ethandiyl)]bis[5-nitro-1H- benz[de]isochinolin-1,3(2H)-dion] und pharmazeutisch annehmbare Salze davon handelt.

3. Verbindung gemäß Anspruch 1, bei der es sich um 2-[2-[N- Methyl-N-[2-[[2-(5-nitro-1H-benz[de]isochinolin-2(3H)- yl)ethyl]amino]ethyl]amino]ethyl]-5-nitro-1H-benz[de]isochinolin-1,3(2H)-dion und pharmazeutisch annehmbare Salze davon handelt.

4. Verbindung gemäß Anspruch 1, bei der es sich um 2,2'-[1,2- Ethandiylbis(imino-2,1-ethandiyl)]bis[5-nitro-1H-benz[de]- isochinolin-1,3(2H)-dion] und pharmazeutisch annehmbare Salze davon handelt.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung gemäß Anspruch 2 sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung gemäß Anspruch 3 sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung gemäß Anspruch 4 sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.

8. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Dickdarmtumors bei einem Säuger.

9. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 3 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Dickdarmtumors bei einem Säuger.

10. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Dickdarmtumors bei einem Säuger.