DE69107226T2

DE69107226T2 - Verwendung von Tumornekrosefaktor.

Info

Publication number: DE69107226T2
Application number: DE69107226T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Hayashi; Kazuyoshi Hori; Yoshiki Otsuka
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-03-09
Filing date: 1991-03-08
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2011-03-09
Also published as: EP0445894A2; GR3015840T3; GB9104927D0; EP0445894A3; AU7281091A; CA2037831C; DE69107226D1; ES2067842T3; GB2241891B; FR2659235A1; ATE118221T1; DE4107554A1; GB2241891A; DK0445894T3; CA2037831A1; AU633196B2; US5190750A; EP0445894B1

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung eines Tumornekrosefaktors zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gegen Entmarkungserkrankung.
Ernste chronische Entzündungserkrankung ist ein Oberbegriff für eine Kategorie von Krankheiten, für die es keine grundsätzlichen Heilmittel gibt, da der Mechanismus für das Auftreten bis jetzt nicht verstanden worden ist und anhand seiner regionalen und allgemeinen chronischen Entzündungssymptome charakterisiert wird. Eine Art ernster chronischer Entzündungserkrankung ist die Entmarkungserkrankung.
Die krankheitserregende Hauptursache der Entmarkungserkrankung ist eine Zerstörung der Myelinhülle eines Nervs oder von Nerven. Allgemein wird sie in Multiple Sklerose und aktute diseminierte Encephalomyelitis unterteilt. Entmarkungserkrankung umfaßt auch diseminierte Sklerose, Leukodystrophie usw. Es wird angenommen, daß allergische Reaktionen der Myelinhülle mit dem Auftreten der Entmarkungserkrankung verbunden sind. Jedoch konnte die Ursache dieser Reaktionen bis jetzt nicht aufgeklärt werden. Multiple Sklerose unterscheidet sich von akuter diseminierter Encephalomyelitis und anderen Entmarkungserkrankungen, da Multiple Sklerose durch vorübergehende Besserungen und ständig wiederkehrende Verschlechterungen gekennzeichnet ist. Akute diseminierte Encephalomyelitis kann zur Multiplen Sklerose werden.
Die Symptome, die Entmarkungserkrankung anzeigen, sind neurologische Fehlordnungen, die hauptsächlich aus Ataxie und Paresthesie bestehen. Entmarkungserkrankung ist manchmal tödlich im akuten Stadium. Trotz dieser Ernsthaftigkeit gibt es kein wirksames therapeutisches Verfahren. Als therapeutische Verfahren für Multiple Sklerose werden hormonähnliche adrenokortikale Mittel für die akuten Perioden verwendet. Während der vorübergehenden Besserungsperioden wird medizinische Rehabilitation und medizinische Vorbeugebehandlung gegen Infektion angewendet. Jedoch kann Entmarkungserkrankung durch diese Behandlungen nicht geheilt werden. In manchen Fällen ist die Verwendung von hormonähnlichem adrenokortikalen Mittel als therapeutisches Verfahren für akute diseminierte Encephalomyelitis wirkungsvoll. Jedoch verbleiben nach der Behandlung manche Probleme wie neurologische Fehlordnungen und die Umwandlung in Multiple Sklerose.
Tumornekrosefaktor oder "TNF" wurde ursprünglich in Mäuseserum nach intravenöser Injektion von bakteriellen Endotoxin in Mäuse entdeckt, die mit lebensfähigem Mycobacterium bovis, Stamm Bacillus Calmette-Guerin (BCG) behandelt worden sind, vergleiche Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 72 (9), 3666-70 (1975).
TNF-haltiges Serum aus Mäusen ist cytotoxisch oder cytostatisch für eine Anzahl von Mäusen oder transformierten menschlichen Zellinien, jedoch nicht so stark bei normalen Zellen in vitro. Es verursacht in Mäusen Nekrose von transplantierbaren Tumoren. TNF tritt auch in den Seren von Ratten, Kaninchen und Meerschweinchen auf. Weiter ist bekannt, daß TNF von mononuklearen Phagocyten, Fibroplasten, B-Zellen usw. erzeugt werden kann, die von Säugetieren unter bestimmten Bedingungen herstammen. Dazu gibt es viele Berichte in der Literatur, die von Lloyd J. Old in Scientific American, 258(5), 59-75 (Mai 1988) zusammengefaßt worden sind.
In klinischen Versuchen wurde nun TNF zur Verwendung als Antitumormittel entwickelt. Es wurde auch berichtet, daß TNF Antientzündungswirkung und analgische (anodzne) Wirkung hat [offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 62-292727]. Es wurde auch berichtet, daß TNF einen hemmenden Effekt auf Autoimmunkrankheit, die als Immunkomplexkrankheit bezeichnet wird [Europäisches Patent 254647] und eine therapeutische Wirkung bei Hautentzündungen wie atopischer Dermatitis hat [WO 90/05532]. Jedoch gibt es keine Beschreibung darüber, daß TNF gegen ernste chronische Entzündungserkrankung wie Entmarkungserkrankung wirksam ist. Im Gegenteil, es wurde berichtet, daß TNF eine der Substanzen sein kann, die mit der Zerstörung der Myelinhülle bei Entmarkungserkrankung in Beziehung steht [Hofman et al., J. Exp. Med. 170, 607-612 (1989)].
Bei Berücksichtigung der zuvorgenannten Berichte konnte nicht erwartet werden, daß TNF Wirkung bei der Behandlung von Entmarkungserkrankung haben würde.
Unerwarteterweise zeigten jedoch unsere experimentellen Daten, d.h. in vivo-Daten und Daten, die unter unterschiedlichen Dosierungsbedingungen wie denjenigen in den zuvorgenannten Berichten erhalten worden sind, daß TNF bei der Behandlung von Entmarkungserkrankung wirksam ist. Basierend auf dieser neuartigen Erkenntnis wurde die vorliegende Erfindung vollendet.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neuartiges therapeutisches Verfahren zur Verfügung zu stellen, das für die Behandlung von Entmarkungserkrankung wirkungsvoll ist.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung sowie deren Vorteile werden anhand der folgenden Beschreibung und Ansprüche ersichtlich.
Erfindungsgemäß werden die vorstehenden Aufgaben durch die Erkenntnis der Erfinder hinsichtlich einer neuen Verwendung von TNF, d.h. für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gegen Entmarkungserkrankung, gelöst. Durch die Erfindung werden die zuvorgenannten Nachteile, die die herkömmlichen therapeutischen Zusammensetzungen und Verfahren unvermeidlich begleiten, vermieden. Insbesondere hat sich herausgestellt, daß, wenn Tumornekrosefaktor oder "TNF" tierischen Versuchsobjekten mit Entmarkungserkrankung verabreicht wird, die Symptome der Krankheit unterdrückt werden können. Diese Ergebnisse basieren auf einer neuen Art der Wirksamkeit von TNF, die von den bekannten Wirksamkeiten, die zuvor genannt worden sind, verschieden ist.
Erfindungsgemäß kann TNF, der aus Serum oder Zellen erhalten worden ist, die von Säugetieren stammen, als Wirkstoff verwendet werden. Soll jedoch die vorliegende Erfindung für menschliche Patienten verwendet werden, werden vorzugsweise unter dem Gesichtspunkt immunologischer Verträglichkeit pharmazeutische Zusammensetzungen eingesetzt, die menschlichen TNF enthalten.
Menschlicher TNF, der für die erfindungsgemäße Verwendung geeignet ist, kann mittels rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden. Alternativ kann menschlicher TNF mit Hilfe der Kultivierung von Zellen erzeugt werden, die von Menschen stammen.
Geeignete Verfahren für die Herstellung von menschlichem TNF mit Hilfe rekombinanter DNA-Techniken sind z.B. bei Shirai T. et al., Nature, 313, 803-6 (1985) und in der offengelegten Japanischen Patentanmeldung Nr. 60-252496 beschrieben (die der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 158 286 entspricht). Beispielsweise kann menschliches TNF durch Kultivieren von E. coli bis zur Homogenität erhalten werden.
Die Wirksamkeit von menschlichem TNF wird während der Reinigung über die abtötende Wirkung auf Mäuse-L-Zellen beobachtet, indem eine Modifikation des Verfahrens von Williamson et al. verwendet wird, wobei L-M-Zellen eingesetzt werden (American Type Culture Collection, CCL 1.2) (vergleiche Moss B., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 80, 5397-401 (1983)). Die Anzahl der überlebenden Zellen wird mittels dem photometischen Verfahren von Ruff und Gifford bestimmt, veröffentlicht in J. Immun., 125, 1671-7 (1980).
Menschlicher TNF kann auch mittels anderer bekannter Verfahren erzeugt werden, einschließlich derjenigen, die bei Diane Pennica et al. , Nature, 312, 20-7 (Dezember 1984); in EP-A- 168214; EP-A-155549; usw. beschrieben worden sind.
Die Anzahl der Aminosäureeinheiten, aus denen menschliches TNF besteht, variiert in Abhängigkeit von dem Herstellungsverfahren, das zur Erzeugung von TNF verwendet worden ist. Beispielsweise besteht menschlicher TNF, der mit Hilfe der rekombinanten DNA-Techniken erzeugt worden ist, die in EP-A- 0158286 beschrieben worden sind, aus 155 Aminosäureeinheiten, hingegen menschlicher TNF, der mit Hilfe des Verfahrens gemäß Pennica et al., supra, hergestellt worden ist, aus 157 Aminosäureneinheiten mit derselben Reihenfolge besteht wie in dem TNF , der 155 Aminosäureeinheiten hat und hat zusätzlich an dessen N-Terminus zwei Aminosäuren.
Menschlicher TNF, der mit Hilfe von rekombinanter DNA-Technik erhalten worden ist, umfaßt auch ein Polypeptid, das einen Methioninbestandteil enthält, der mit dem N-Terminus der zuvorgenannten Aminosäuresequenz verknüpft ist, und ein Zwischenstück, das ein teilweises oder vollkommenes Signalpeptid für menschlichen TNF enthält, das mit dem N-Terminus der zuvorgenannten Aminosäuresequenz verbunden ist. Es ist möglich, mit Hilfe natürlicher oder künstlicher Mutation einen Bereich der Struktur einer DNA zu verändern, die für ein Polypeptid codiert, ohne die Wirksamkeit des Polypeptids signifikant zu ändern.
Der erfindungsgemäß verwendete menschliche TNF umfaßt ein Polypeptid, das eine Struktur hat, die einer homologen Variante bzw. homologen Varianten des Polypeptids entspricht, das die zuvorgenannte Aminosäuresequenz hat. Beispiele für homologe Varianten umfassen Polypeptide, die in den U.S.-Patenten 4,677,063 und 4,677,064 beschrieben sind, deren Inhalt zur vorliegenden Erfindung gehört. Alle diese physiologisch wirksamen Polypeptide werden im folgenden "menschlicher TNF" genannt.
Natürlicher menschlicher TNF unterliegt leicht biochemischen Modifikationen oder chemischen Modifikationen, und aggregiert ebenso leicht unter Ausbildung eines Multimers wie einem Dimer oder einem Trimer.
Diese TNF-Polypeptide, die in der Natur erzeugt werden, werden im folgenden auch als "menschlicher TNF" bezeichnet und können als Wirkstoff für erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können zu verschiedenen Präparationen formuliert werden, die z.B. für intravenöse, intramuskuläre, subkutane und intradermale Injektion, eine orale oder rektale Verabreichung, eine externe Verabreichung oder eine Instillation angepaßt worden sind. Vorteilhafterweise sind die Präparationen an die Verabreichung einer Polypeptidzusammensetzung angepaßt.
Bei der Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung können, falls erforderlich, verschiedene Zusätze hinzugefügt werden, wie ein oder mehrere Träger, Verdünnungsmittel, Arzneistoffträger, Verflüssigungsmittel, Bindemittel, Stabilisatoren, Dickungsmittel, pH- Justierungsmittel usw.
Geeignete Träger, Verdünnungsmittel und Arzneistoffträger umfassen Stärken und Derivate davon, wie Kartoffelstärke, Maisstärke, Dextrin und Weizenstärke und Hydroxypropylstärke, Zucker wie Lactose, Glucose, Saccharose, Mannit und Sorbitol, Cellulosen wie Methylcellulose, Carboxylmethylcellulose und Hydroxypropylcellulose; anorganische Verbindungen wie Natriumchlorid, Borsäure, Calciumsulfat, Calciumphosphat und gefälltes Calciumcarbonat usw.
Geeignete Verflüssigungsmittel umfassen Magnesiumoxid, synthetisches Aluminiumsilicat, Metakieselsäure, Magnesiumaluminiumoxid, wasserhaltige Kieselsäure, Kieselsäureanhydrid, Talk, Magnesiumstearat, Kaolin usw.
Geeignete Bindemittel umfassen Polyethylenglycol, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol, Gummi arabicum, Tragant, Natriumalginat, Gelatine, Gluten usw.
Geeignete Stabilisatoren umfassen Proteine wie Albumin, Protamin, Gelatine und Globulin, Aminosäuren und deren Salze usw.
Geeignete pH-Justierungsmittel umfassen Chlorwasserstoffsäure, Natriumhydroxid, Phosphate, Citrate, Carbonate usw.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung können Patienten in einer solchen Menge verabreicht werden, daß die tägliche Dosis an TNF für einen Erwachsenen im allgemeinen in einem Bereich von etwa 50 bis 100.000.000 Einheiten und vorzugsweise von 50 bis 500.000 Einheiten im Fall einer lokalen Verabreichung, von etwa 1.000 bis 10.000.000 Einheiten im Fall einer allgemeinen Injektion wie einer intravenösen Injektion und intramuskulären Injektion und von etwa 10.000 bis 100.000-000 Einheiten im Fall einer oralen Verabreichung liegt.
Der Ausdruck "Einheit", wie er vorstehend verwendet wurde, bedeutet eine Menge an TNF, mit der 50 % von 1 x 10&sup5; Zellen/ml von L-M-Zellen (American Type Culture Collection CCL 1.2) abgetötet werden. Diese Menge wird wie folgt gemessen: als Kulturgefäß werden Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen verwendet, die von Flow Laboratories, Inc. (U.S.A.) hergestellt werden. L-M-Zellen werden in Eagle's essentiellem Minimalmedium kultiviert, das 1 v/v % fötales Kälberserum enthält [die Zusammensetzung dieses Mediums ist z.B. in Tissue Culture, herausgegeben von Junnosuke Nakai et al., Asakura Shoten, Japan (1967) beschrieben worden]. Eine Probe (0,1 ml), die seriell mit dem Medium verdünnt worden ist, und L-M- Zellsuspension (0,1 ml, 1 x 10&sup5; Zellen/ml) werden jeweils in jeder Vertiefung der Platten vermischt und die Platten werden bei 37ºC 48 Stunden an Luft, die 5 % Kohlenstoffdioxid enthält, incubiert. Zum Ende der Kultivierungsdauer werden 20 ul Glutaraldehyd zugesetzt, um die Zellen zu fixieren. Nach der Fixierung werden die Platten mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet, und 0,05 % Methylenblau (0,1 ml) werden zugesetzt, um die lebensfähigen Zellen einzufärben. Die Platten werden sorgfältig mit destilliertem Wasser gewaschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen und getrocknet. Chlorwasserstoffsäure (0,36 N) wird zu jeder Vertiefung zugegeben, um den Farbstoff aus den gefärbten Zellen zu extrahieren. Die dekadische Extinktion jeder Vertiefung bei 665 nm wird mit Titertek Multiskan gemessen, das von Flow Laboratories, Inc. (U.S.A.) hergestellt worden ist. Die dekadische Extinktion ist proportional zur Anzahl der lebensfähigen Zellen. Die zuvorgenannte Menge an dem physiologisch aktiven Polypeptid gemäß der Erfindung, mit der 50 % von 1 x 10&sup5; Zellen/ml von L-M abgetötet werden, wird erhalten, indem die Verdünnung gegen die dekadische Extinktion aufgetragen wird.
Der Dosierungsbereich zur Behandlung eines Patienten mit der pharmazeutischen Zusammensetzung nach der vorliegenden Erfindung variiert in Abhängigkeit des Alters und der Symptome des Patienten. Wie zuvor erwähnt, kann die Zusammensetzung im allgemeinen über mehrere Tage bis mehrere Wochen mit einer täglichen Dosis von 50 bis 10&sup8; Einheiten verabreicht werden. Die tägliche Dosis kann einem Patienten auf einmal oder über mehrere Male verabreicht werden. Die Verabreichung der vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzung kann jeden Tag durchgeführt werden, oder andererseits kann die Verabreichung in Intervallen durchgeführt werden. Repräsentative Beispiele für die Dosierungsbereiche sind wie folgt
(a) tägliche Verabreichung über 1 bis 4 Wochen;
(b) tägliche Verabreichung über 1 bis 6 Tage, abwechselnd mit einer Pause von einem Tag bis mehreren Wochen;
(c) Verabreichung an einem Tag pro Woche; und
(d) tägliche Verabreichung an 5 Tagen, abwechselnd mit einer Pause von einem Monat.

BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

BEISPIEL 1

Experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE) wurde viele Jahre an Tiermodellen für Entmarkungserkrankung studiert [Tahira et al., Experimental Allergic Encephalomyelitis (EAE). [Multiple Sclerosis -basic and clinical-] Shiokoigakushuppansha 241 (1985)]. Eine Menge (0,1 ml) einer Emulsion von Rindermyelingrundeiweiß (bovine myelin basic protein) und Freund's vollständigem Adjuvant wird subkutan in die Fußsohle eines 5 Wochen alten weiblichen Hartley Meerschweinchens injiziert, um EAE zu induzieren. Nach der Injektion werden 300.000 Einheiten/Meerschweinchen an menschlichem TNF, der mittels rekombinanter Technik gemäß dem Verfahren, das in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 158 286 beschrieben ist, erhalten worden ist, intraperineal jedem der 8 Meerschweinchen jeden Tag 12 Tage lang injiziert. 0,1 % gelatinehaltige Phosphatpufferlösung, die zur Verdünnung von menschlichem TNF verwendet worden ist, wird jedem der 8 Meerschweinchen einer Kontrollgruppe nach dem gleichen Zeitplan und Verfahren wie in der Gruppe, der TNF injiziert worden ist, injiziert. Die neurologischen Signale werden beobachtet und jeden Tag aufgezeichnet, um den Beginn der Krankheit festzustellen. Die Ergebnisse werden durch histologische Untersuchung des Gehirns und des Rückenmarks 21 Tage nach der Injektion bestätigt.
Die Beobachtungsdauer wird auf 21 Tage nach der Injektion festgesetzt. Die Anzahl der Meerschweinchen, die ernsthafte klinische Zeichen während der Beobachtungsdauer zeigen, werden statistisch verglichen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, wird in der Gruppe, der TNF injiziert worden ist, signifikante Unterdrückung des Auftretens von EAE statistisch anhand des Wilcoxons'-Bewertungstests beobachtet. Zudem sterben 2 von 8 Meerschweinchen der Kontrollgruppe an akuter Encephalomyelitis. Im Gegensatz dazu stirbt kein Meerschweinchen der Gruppe, der TNF injiziert worden ist. TABELLE 1 Bewertete Anzahl Untersuchte Anzahl KONTROLL-GRUPPE
In dem Wilcoxon's-Bewertungstest ist der Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und der Gruppe, der TNF injiziert worden ist, signifikant (p < 0.05).
Die einzelnen Tiere werden wie folgt bewertet:
- : normal
+ : Gliederschwäche
++: Ataxie
+++: Paralyse, Tremor
++++: Tod
Diese Ergebnisse belegen die unterdrückende Wirkung von TNF gegen Entmarkungskrankheit.

BElSPIEL 2

Menschlicher TNF wird mittels der rekombinanten DNA-Technik nach dem Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben worden ist, hergestellt. Unter Verwendung der so hergestellten rekombinanten menschlichen TNF wird eine gefriergetrocknete Präparation für die Injektion mit der folgenden Zusammensetzung formuliert.

Formulierung

Menschlicher TNF 5 x 10&sup5; Einheiten
D-Mannit 30 mg
Normales Serum Albumin (menschlich) 10 mg
Natriumchlorid 2,0 mg
Natriumdihydrogenphosphatdihydrat (mit Natriumhydroxid auf pH 8,0 eingestellt) 3,9 mg

Claims

1. Verwendung von Tumornekrosefaktor zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gegen eine Entmarkungserkrankung.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Entmarkungserkrankung um Multiple Sklerose handelt.

3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei es sich bei der Entmarkungserkrankung um akute diseminierte Encephalomyelitis handelt.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Tumornekrosefaktor durch eine Zelle auf Humanbasis hergestellt worden ist.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Tumornekrosefaktor mit Hilfe einer rekombinanten DNA-Technik hergestellt worden ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung an eine Verabreichung durch intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intradermale lnjektion, eine orale oder rektale Verabreichung, eine externe Verabreichung oder eine Instillation angepaßt ist.