JPH03261725A

JPH03261725A - 移植片対宿主の疾患治療用医薬組成物

Info

Publication number: JPH03261725A
Application number: JP2056736A
Authority: JP
Inventors: Yoshiki Otsuka; 大塚　善樹; Kazuyoshi Hori; 一良堀; Hiroshi Hayashi; 林　紘
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1990-03-09
Filing date: 1990-03-09
Publication date: 1991-11-21

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、腫瘍壊死因子（以下ＴＮＦと略す）を有効成
分とする移植片対宿主疾患に対する治療用医薬組成物に
関する。

（従来の技術）移植片対宿主疾患（ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓ
ｔ　ｄｉｓｅａｓｅ。

以下ＧＶＨＤと略す、）は、非自己の骨髄細胞を移植さ
れた患者において、頻繁にみられる発熱、皮疹、下痢、
肝障害などを主病変とし、ときには致命的にもなる疾患
である。骨髄移植は再生不良性貧血や重症免疫不全、あ
るいは白血病のような、患者自身の造血肝細胞や免疫担
当細胞が欠損または不足している疾患や、全身への放射
線照射や化学的療法によって造血機能が破壊されている
様な疾患の治療において用いられている。しかしながら
、骨髄移植には、ＧＶＨＤをはじめ間質性肝炎、再発、
感染など現在なお解決されなければならない問題もある
。特にＧＶＨＤは、間質性肺炎の誘因となることも多く
、その発生率の高さからも、骨髄性移植における主要な
障害となっている。

ＧＶＨＤは移植片中に含まれるＴリンパ球やナチュラル
キラー細胞などの免疫担当細胞が宿主との組織適合抗原
の違いを認識し、宿主細胞に障害をもたらすことによっ
て起こると考えられているが、その際、主要組織適合複
合体（ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉ
ｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘｉ：ＭＨＣ）のみならず銅組織適
合複合体（ｍｉｎｏｒ　　ｈｉｓｔｏｃｏｇｅｐａｔｉ
ｂｉｌｉｔｙ　　ｃｏｍｐｌｅｘ：　　ＭＨＣ）の差に
よっても、この反応は出現する。ヒトの場合の骨髄移植
においては、ヒトのＭＨＣであるヒト白血球抗原（ｈｕ
ｍａｎ　１ｅｕｋｏｃｙｔｅ　ａｎｔｉｇｅｎ：ＨＬ＾
）を−敗させて行うことが多いが、その場合でさえ、Ｇ
Ｖ−）ＩＤは頻繁に発生する。これは、Ｍｌ（Ｃの不一
致および胸腺の機能障害による自己と非自己の認識異常
の関与が示唆されている（ｋｏｒｎｇｏｌｄ、　Ｒ，ａ
ｎｄ　５ｐｅ−ｎｔ＋　Ｊ、＋　Ｉｍａｔｕｎｏｌ、　
Ｒｅｘ、＋　７１：５（１９８３）　；　５ａｎｔｏｓ
ＧＪ、、　Ｈｅ５ｓ、　Ａ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｖｏｇｅｌ
ｓａｎｇ、　Ｇ、Ｂ、ｒ　Ｉｍ＋＋＋ｕｎｏｌＲｅｖ、
、　８８：１７１　（１９８５）　）　。

ＧＶＨＤには、その発症時期から、急性型と慢性型とに
分けられるが、臨床所見からも両者には差が認められる
。急性ＧＶＨＤは、移植後１００日以内に発症し、皮膚
、肝臓、消化管を主たる標的組織とし、これらの組織傷
害により、皮膚の紅斑、水瓶、庚爛の形成、黄度および
下痢など臨床症状となって現れる。一方、慢性ＧＶＨＤ
は、移植後１００日以降に発症し、急性ＧＶＨＤに比べ
て標的組織がより多彩であり、従って、多様な病態をと
る。臨床的には、限局型と拡大型の２型に大別され、限
局型では皮疹（乾燥、扁平苔廚様変化、色素沈着または
脱失、剥離を伴う紅斑など）が主体で時に肝臓傷害を伴
い、拡大型では、これに加え、唾液腺、口腔、食道の粘
膜、涙腺、肺、気管支、筋肉、関節などが広範に侵され
各種自己抗体が陽性になるなど、自己免疫疾患に類似し
た症状を呈する。

ＧＶＨＤの治療としては、メトトレキセート、ステロイ
ド、アザチオプリン、シクロスポリンＡなどの免疫抑制
剤の全身投与が普通おこなわれる。しかし、これらの免
疫抑制剤の全身投与は、副作用の点で問題がある。

（問題点を解決するための手段）腫瘍壊死因子、すなわちＴＮＦは多様な生物活性を有す
る公知のサイトカインである。本発明者らはＴＮＦに対
し、その薬理作用について鋭意研究を続けていたところ
、意外にも、ＴＮＦがＧ■ＨＤ抑制作用を有することを
発見し、該知見に基づきさらに研究を続け、本発明を完
成した。

本発明によれば、ＧＶＨＤの治療に有効な量のＴＮＦと
少なくとも一種の医薬投与可能な担体、希釈剤あるいは
賦形剤を含有するＧＶＨＤの治療用の新規医薬Ｍｔｃ物
が提供される。ＧＶＨＤが起こると予想されるあるいは
ＧＶＨＤが起きた患者の治療に用いられる本発明の医薬
組成物においては、腫瘍壊死因子は、ヒト由来の細胞か
ら、あるいは組替えＤＮＡ技術によって製造されるもの
であることが好ましい。このような組成物には、例えば
、静脈内注射用、筋肉的注射、皮下注射用、皮肉注射用
、経口投与用、直腸内投与用、外部施用用、局所施用用
、点眼用などに適合する投与形態を与えることができる
。さらに、本発明の医薬組成物はポリペプチド組成物に
適合する投与形態を与えることができる。

腫瘍壊死因子、すなわちＴＮＦは、生存能力のあるマイ
クロバクテリウム　ボーヴアイス（Ｍｉｃｒｏ−ｂａｃ
ｔｅｒｔｕｍ　ｂｏｖｉｃｅ）のバチルスカルメツドー
グニリン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｃａ１ｓ＋ｅｔｔｅ−Ｇ
ｕｅｒｉｎ）株（ＢＧＧ）を前投与後、細菌のエンドト
キシンを静脈内投与したマウスの血清中から初めて発見
された［プロシーデインゲス・オブ・ナショナル・アカ
デも−・オプ・サイエンス・ニー・ニス・ニー（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａ１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｆ、Ｕ、Ｓ、Ａ、）７２巻第９号、３６６６−７０
頁（１９７５年）コ。

ＴＮＦを含有するマウス血清は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験
で多数のマウス及びヒト形質転換細胞系に対して細胞傷
害活性作用あるいは静細胞活性を示すが、これらの作用
は正常細胞に対しては非常に弱い。

ＴＮＦを含有するマウス血清は、マウスに移植可能な腫
瘍の壊死を生しせしめる。ＴＮＦはラット、ウサギ及び
モルモットの血清中にも産生ずる。さらに、ＴＮＦは哺
乳類由来の単核食細胞、繊維芽細胞、Ｂ細胞などによっ
てもある条件下において産生され得るものである。これ
に関しては、ロイド　ジェイ・オールド（Ｌｌｏｙｄ　
Ｊ、０Ｉｄ）によってサイエンティフィック　アメリカ
ン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ａｌＩｌｅｒｉｃａｎ）　
２５８巻第５号５９−７５頁（１９８８年５月）の総説
に引用された文献中に多くの報告がある。本発明におい
ては、哺乳類由来の血清あるいは哺乳類由来の細胞から
得られる上記ＴＮＦを活性成分として用いることができ
るが、ヒトの患者に使用するためには、免疫適合性の点
からヒ）ＴＮＦを含有する医薬組成物を用いることが好
ましい。

本発明において使用するのに通したヒ）ＴＮＦは、組換
えＤＮＡ技術によって製造することができる。あるいは
また、ヒトＴＮＦはヒト由来の細胞を培養することによ
っても製造することができる。

組換えＤＮＡ技術によりヒトＴＮＦを製造する方法の適
例としては、たとえば、シライ　ティー（Ｓｈｉｒａｉ
　Ｔ、）　ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、３１３
壱８０３８０６真（１９８５年）や特開昭６０−２５２
４９６号（欧州特許出願公開第０．１５８，２８６号に
対応）に記載されている。

例えば、大腸菌の培養によって均質なヒ）ＴＮＦを得る
ことができる。精製中のヒトＴＮＦ活性は、Ｌ−Ｍ細胞
［アメリカン　タイプ　カルチャーコレクション、シー
シーエル１．２（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ　ｃｏｒｅｃｔｉｏｎ、ＣＣＬ　１．２）］　
を用いたウィリアムソン等（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、＋）の方法の変法によるマウスＬ−細胞に対
する殺細胞活性によって知ることができる。従って、必
要に応じてより高純度ヒトＴＮＦは、ダイアン　ペニカ
（Ｄｉａｎｅ　Ｐｅｎｎ１−ｃａ）　　らがネーチ＋　
−（Ｎａｔｕｒｅ）、３１２巻、２０−２７頁（１９８
４年１２月）に記載した方法や、欧州特許出願公開第１
６８２１４号及び第１５５５４９号等に記載されている
他の公知の方法によっても製造することができる。

ヒトＴＮＦを構成するアミノ酸の数は、ＴＮＦを得るた
めに用いる製造方法によって異なる。たとえば、欧州特
許出願公開第０１５８２８６号に記載されている組換え
ＤＮＡ技術によって製造されるヒ）ＴＮＦは１５５個の
アミノ酸から戒る。一方、上記のべ二カ（Ｐｅｎｎ　１
ｃａ）等の方法によって製造されるヒトＴＮＦは１５７
個のアミノ酸と、そのＮ末端に結合した２個のアミノ酸
からなる配列を有する。

組換えＤＮＡ技術によって製造されるＴＮＦは、上記の
アミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が結合している
ポリペプチドと、上記のアミノ酸配列のＮ末端にヒトＴ
ＮＦのシグナルペプチドの一部分あるいは全部が結合し
ている中間体も包含する。自然の変異、あるいは人為的
変異によって、そのボリペチドの活性に有為な変化を生
じることなくポリペプチドをコードするＤＮＡの構造の
一部を変えることは可能である。

本発明で用いることのできるヒトＴＮＦは、上記のアミ
ノ酸配列を有するポリペプチドの相同変異体（ｈｏｍｏ
ｌｏｇｏｕｓ　ｖａｒｉａｎｔ）に相当する構造を有す
るポリペプチドを包含する。相同変異体の例として、米
国特許第４．６７７．０６３号と第４，６７７．０６４
号に記載されているペプチドが挙げられ、この開示内容
は、参照によって本明細書に記載する。これらすべての
生理活性ペプチドも、以下「ヒトＴＮＦ。

と称する。

天然のヒトＴＮＦは、生化学的修飾あるいは化学的修飾
を受は易く、また、２量体や３量体のような会合体の形
になり易い。天然に産生されるこれらのＴＮＦポリペプ
チドもまた、以下「ヒトＴＮＦ、と称し、本発明の医薬
ｍ酸物の活性成分として使用できる。

ＴＮＦは現在、抗癌剤としての臨床研究が進められてい
るほか、抗炎症・鎮痛作用（日本公開特許公報間６２−
２９２７２７　）　、免疫複合体病として定義される抑
制作用（日本公開特許公報間６３−３０４２６）、等を
も有することが報告されている。しかし、ＴＮＦがＧＶ
ＨＤを抑制するという報告はいっさいなされていない。

その反対に、ＴＮＦは急性Ｇ■ＨＤにおける皮膚および
消化管障害に関与する物質の１つではないかという推測
（Ｐｉｇｕｅｔ、　ｐｐ、。

Ａ１１ｅｔ、　Ｂ、、　ｅｔａｌ、、　Ｊ、Ｅｘｐ、　
Ｍｅｄ、、　１６６：１２８０（１９Ｂ？）　）すらな
されていた。ところが、発明者らはマウスを用いたＧＶ
ＨＤの実験モデルにおいて、意外にもＴＮＦを投与する
とＧＶＨＤの発症を抑制することを見出した。すなわち
、本発明は既に知られている作用のいずれとも異なった
新しいＴＮＦの作用の発見に基づくものである。以下に
その具体的な実験例をしめす。

１」動差ＧＶＨＤのモデルとして、マウスの急性ＧＶＨＤについ
て、ピゲらの方法（Ｐｉｇｎｅｔ、　ｐｅ、、　Ｇｒａ
ｎ＋Ｇ、Ｅ、、　Ａ１１ｅｔ、　Ｂ、、　ｅｔａｌ、、
　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６６：１２８０　（
１９８７年））に従って検討した。３ヶ月齢の（ＢＩＯ
Ｘ　ＣＢＡ　）　Ｆｌ−ｒウスニ放射線照射（８００う
Ｆ）を行い、その２４時間後にＣ５７ＢＬ／１０マウス
由来の鼠径および腋下リンパ節から調製したリンパ球２
Ｘ１０’個と、Ｃ５７ＢＬ／１０マウス由来のあらかじ
め抗Ｔｈｙｌ抗体と補体とを用いてＴリンパ球を除去し
た骨髄細胞２×１０ｈ個とをともに尾静脈内移植注射し
た。マウスは放射線照射後、ネオマイシン（０，５ｍｇ
／ｍｌ）を飲料水に加えて飼育した。ヒトＴＮＦは、欧
州特許出願公開第０．１５８，２８６号に記載の方法に
従って組換えＤＮＡ技術によって製造したものを用い、
移植注射の翌日から１０，０００単位／匹を１日１回、
隔日毎に移植後４１日まで尾静脈内投与した。対照群に
は、ヒトＴＮＦを溶解するのに用いた溶液（０，１ｇゼ
ラチン含有リン酸緩衝液）をヒトＴＮＦ投与群と同じス
ケジュール、同じ投与法で投与した。ＧＶＨＤの発症は
移植後８４日までの生存マウス数の観察と移植２１日後
の皮膚および十二指腸の病理学的検索によって行った。

マウスの死亡率の観察によると、結果は別表に示すごと
く、対照群では、移植３週間後から死亡例が認められる
様になり、以後死亡率が増加してゆき、移植１２週間後
には金側が死亡してしまうのに対し、ヒ）ＴＮＦ投与群
では、投与期間中ば死亡例が全く認められず、移植１２
週間後においても、８匹中２匹が死亡したのみであった
。また、組織病理学的検索によると、対照群では皮膚表
皮の肥厚と浸潤細胞の出現および表皮細胞の壊死に加え
、腸管絨毛の扁平化と腸陰窩における細胞壊死および腸
管粘膜平組織へのリンパ球の細胞浸潤が観察されたのに
対し、ヒトＴＮＦ投与群では明らかにその様な変化は抑
制されていた。

（以下余白）別表以上の結果より明らかなる如く、ヒトＴＮＦの投与はＧ
ＶＨＤの発症を抑制する作用を有していることを示して
いる。

本発明のＧＶＨＤの治療用医薬組成物は静脈内、筋肉内
、皮下及び皮肉注射剤として、または経口剤、外用剤、
坐剤、点訳剤として投与することが出来る。

製剤例としては、溶液または凍結乾燥品が挙げられる。

その製剤化にあったては、賦形剤として、バレイショデ
ンブン、トウモロコシデンプン、デキストリン、小麦、
デン粉等のデンプン類、ヒドロキシプロピルスターチ等
のデンプン誘導体、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マントニ
トール、ソルビトール等のａｍ、メチルセルロース、カ
ルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロ
ース等のセルロース類、塩化ナトリウム、ホウ酸、硫酸
カルシウム、リン酸カルシウム類、沈降炭酸カルシウム
等の無機物質、流動化剤としては一１重質酸化マグネシ
ウム、合成ケイ酸アルミン酸マグネシウム、含水ケイ酸
、タルク、ステアリン酸マグネシウム、無水ケイ酸、カ
オリン（Ｋａｏｌｉｎ）等、結合剤としては、ポリエチ
レングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルア
ルコール等の合成高分子及びこれらの誘導体、アラビア
ゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、
グルテン等の天然物、安定化剤としては、アルブミン、
ゼラチン、グロブリン、プロタミン、プロタ壽ン塩等の
蛋白質、及びア逅ノ酸類、ｐａｉｌ！節剤としては、塩
酸、水酸化ナトリウム１．リン酸塩類、クエン酸塩、炭
酸塩等を使用する事が出来る。

本発明の他の態様によれば、ＧＶＨＤの治療に有効な量
のヒトＴＮＦをＧＶＨＤが起こると予想されるあるいは
ＧＶＨＤが起きた患者に投与することからなるＧＶＨＤ
の治療方法が提供される。

本発明の医薬組成物は、底入に対するヒ）ＴＮＦの一日
投与量として、一般に約５０から１００．００ｏ、ｏｏ
ｏ単位の用量で、好ましくは、局所投与の場合には、約
５０から５００．０００単位の用量で、静脈内投与や筋
肉内投与のような一般的な投与のばあい、約１．０００
から１０．０００．０００単位の用量で、そして経口投
与の場合には、約１０，０００から１００．Ｏｏｏ、　
ｏｏｏ単位の用量でＧＶＨＤが起こると予想されるある
いはＧＶＨＤが起きた患者に投与することができる。−
日の投与量は患者の年齢や症状によって異なる。上記の
ように本発明の医薬組成物は、通常、数日から数週間に
わたり、−日５０から１００．０００．　Ｇｏｏ単位の
用量で投与することができる。

この−日投与量は、−度に、あるいは数回に分けて患者
に投与することができる。本発明の医薬組成物は、連日
、あるいは、間隔をおいて投与することができる。その
代表的な投与方法の例を次に示す。

ａ）１週間から４週間の連日投与ｂ）６日間毎日投与した後、７日間から数週間の体薬を
はさむ間歇的投与ｃ）１週間に１回投与ｄ）５日間毎日投与した後、１ケ月の体薬期間をはさむ
間歇投与。

以上のように本発明によれば、現在は確実な治療法が存
在しないＧＶＨＤの治療用医薬組成物の提供が可能とな
る。

以下に実施例にて本発明の一実施態様を具体的に説明す
る。

（実施例）ヒトＴＮＦを上記組換えＤＮＡ技術によって調製し、得
られるヒ）ＴＮＦを用いて下記の組成を持つ注射用凍結
乾燥製剤を調製する。

組成ヒトＴＮＦ５００．０００単位Ｄ−マンニトール正常血清アルブミン（ヒト）塩化ナトリウムリン酸二水素ナトリウム（水酸化ナトリウムでｐｕ　８．００　ｓａｇ０　ｍｇ２．０　　ｍｇ３．９−ｇに調製）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）腫瘍壊死因子を有効成分とする移植片対宿主疾患
の治療用医薬組成物。