DE69021599T2

DE69021599T2 - Biologisch aktive RON-Substanz Synthetase und ihre Verwendung für die Herstellung biologisch aktiver RON-Substanz.

Info

Publication number: DE69021599T2
Application number: DE69021599T
Authority: DE
Inventors: Hisao Kado; Yutaka Mitani; Suguru Takeo; Nobuhiro Watanabe; Yasuo Yoneta
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1989-02-08
Filing date: 1990-02-03
Publication date: 1996-02-15
Anticipated expiration: 2010-02-04
Also published as: DE69021599D1; EP0382121B1; KR900013073A; EP0382121A1; ES2078253T3; US5565342A; JPH03224494A; JPH0740953B2; CA2009193A1

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Enzym RON- Substanz-Synthetase, die bewirkt die Synthese der biologisch aktiven Polysaccharid-RON-Substanz (nachstehend als "RON-Substanz" bezeichnet) aus Saccharose, die eine ausgezeichnete Antitumor-Aktivität, immun-modulierende Aktivität und Wirtsabwehr-Aktivität gegenüber Infektionserkrankungen hat, sowie auf die Verwendung des genannten Enzyms in einem Verfahren zur Herstellung dieser RON-Substanz.

2. Beschreibung des verwandten Standes der Technik

Die den Gegenstand der Erfindung bildende RON-Subsanz und ein Verfahren zum Extrahieren dieser RON-Substanz aus Reiskleie sind bereits in JP-B-62-7173 beschrieben.
Bei diesem konventionellen Verfahren wird die RON-Substanz aus Reiskleie extrahiert und der Extrakt wird gereinigt. Die Qualität des Ausgangsmaterials ist daher instabil und es gibt beträchtliche Schwankungen in bezug auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften und biologischen Aktivitäten der erhaltenen Substanz. Darüber hinaus ist die Ausbeute niedrig und es sind viele Stufen erforderlich und bei dem konventionellen Verfahren tritt das Problem einer langen Betriebsdauer auf und es ist wirtschaftlich nachteilig.
Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen Dextranen, die für die klinische Verwendung geeignet sind und ein Molekulargewicht zwischen 5000 und 50 x 10&sup6; haben, aus einem Saccharose enthaltenden Substrat sind aus EP-A-0 087 404 und aus US-A-2 823 128 bereits bekannt.
Diese Dextrane, die überwiegend als synthetisches Blutplasma verwendet werden, können erhalten werden durch Impfen eines Saccharose und andere Bestandteile enthaltenden Nährmediums mit einem geeigneten Mikroorganismus, beispielsweise mit Leuconostoc mesenteroides NRRL B512. Die biologisch aktive Polysaccharid RON-Substanz mit den oben angegebenen nützlichen Aktivitäten kann jedoch bei Anwendung dieser fermentativen oder enzymatischen Verfahren des Standes der Technik nicht erhalten werden.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen Weg zur Herstellung der RON-Substanz unter Anwendung eines fermentativen oder enzymatischen Verfahrens zu finden, das die RON-Substanz mit einer stabilen und hohen Qualität liefert.

Zusammenfassung der Erfindung

Auf diesem Hintergrund wurden umfangreiche Untersuchungen durchgeführt mit dem Ziel, die obengenannten Mängel der konventionellen Verfahren zu beseitigen und als Ergebnis wurde gefunden, daß ein spezifischer Mikroorganismus, der zum Genus Leuconostoc gehört, extrazellulär ein Enzym bildet, das in der Lage ist, die RON-Substanz aus Saccharose zu synthetisieren, d.h. die RON-Substanz-Synthetase, und die RON-Substanz, die stabile physikalisch-chemische Eigenschaften und biologische Aktivitäten aufweist, kann in hoher Ausbeute erhalten werden durch Behandeln von Saccharose mit diesem Enzym. Darauf beruht die vorliegende Erfindung.
Erfindungsgemäß wird insbesondere eine biologisch aktive Polysaccharid-RON-Substanz-Synthetase zur Verfügung gestellt, die in der Lage ist, durch Reaktion mit Saccharose die biologisch aktive Polysaccharid-RON-Substanz zu bilden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist gemäß einem ersten Aspekt eine biologisch aktive Polysaccharid-RON-Substanz-Synthetase mit den folgenden Eigenschaften:
(a) Wirkung: Das Enzym zersetzt 1 mol Saccharose unter Bildung von 1 mol Fructose und gleichzeitig überträgt das Enzym den Glucose-Anteil auf die Polysaccharid-RON-Substanz, die als Rezeptor wirkt;
(b) Optimaler pH-Wert: der optimale pH-Wert beträgt etwa 5,5;
(c) Stabiler pH-Wert-Bereich: das Enzym ist in dem pH-Wert- Bereich von 4,5 bis 7,0 stabil;
(d) Substrat-Spezifität: die Bildung der biologisch aktiven Polysaccharid-RON-Substanz aus Glucose, Fructose, Maltose und Isomaltose ist nicht zu beobachten, das Enzym reagiert jedoch nur mit Saccharose unter Bildung der biologisch aktiven Polysaccharid-RON-Substanz;
(e) Optimale Temperatur: die optimale Temperatur beträgt etwa 40ºC; und
(f) Stabiler Temperaturbereich: das Enzym ist bei einer Temperatur unterhalb 40ºC stabil,
wobei die biologisch aktive Polysaccharid-RON-Substanz die folgenden Eigenschaften hat:
(1) Form: die Substanz ist ein weißes amorphes Pulver, das keinen Geschmack und keinen Geruch hat;
(2) Löslichkeit: die Substanz ist in Wasser löslich, die Lösung wird jedoch milchig-weiß und viskos, wenn die Konzentration erhöht wird, die Substanz ist in Formamid und Dimethylsulfoxid löslich, sie ist jedoch in Alkoholen, Aceton, Benzol, Ethylacetat, Hexan, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich;
(3) pH-Wert der wäßrigen Lösung: die wäßrige Lösung ist neutral oder schwach sauer;
(4) Saccharid-Bestandteil: die Substanz besteht nur aus Glucose;
(5) Werte der Elementar-Analyse: die Substanz enthält 44,0 bis 45,0 % c und 6,1 bis 6,4 % H;
(6) Struktur: die Substanz ist ein α-1,6-Glucan und enthält eine geringe Menge an 3,6-verzweigten Seitenketten;
(7) Proteine: die Substanz enthält nahezu keine Proteine;
(8) Molekulargewicht: die Substanz durchdringt nicht eine Dialyse-Membran und das Molekulargewicht ist, wie angenommen wird, höher als 10 000 Dalton;
(9) spezifische Drehung: [α]D25 = +190º bis +220º (C=0,5, Formamid);
(10) Farbreaktion: die Substanz ist positiv bei der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion und der Phenol-Schwefelsäure- Reaktion, jedoch negativ bei der Biuret-Reaktion, der Lowry-Folin-Reaktion, der Elson-Morgan-Reaktion und der Jod-Reaktion;
(11) Schmelzpunkt: die Substanz hat keinen definierten Schmelzpunkt;
(12) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: die Substanz weist keine charakteristische Absorption auf;
(13) Infrarot-Absorptionsspektrum: Die Substanz zeigt die charakteristische Absorption von α-Glucan;
(14) ¹³C-NMR Spektrum: die Substanz weist in den Hauptsignalen die Absorptions-charakteristischen chemischen Verschiebungs-Werte von α-1,6-Glucan auf; und
(15) Biologische Aktivität: die Substanz weist eine Antitumor-Aktivität auf.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung ist die biologisch aktive Polysaccharid-RON-Substanz-Synthetase, wie sie oben definiert ist, erhältlich durch Kultivieren eines die biologisch aktive Polysaccharid-RON-Substanz bildenden Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Stamm BL-75 (FERM BP-2242), Stamm NCFB 517 (FERM BP-2711), Stamm NCFB 531 (FERM BP-2712), Stamm NCFB 861 (FERM BP-2713), Stamm NCFB 864 (FERM BP-2714), Stamm NCFB 880 (FERM BP-2715), Stamm 46-1 (FERM BP-2670), Stamm ATCC 1956 und Stamm IFO 3349 und Mutanten davon,
in einem Saccharose als Kohlenstoffquelle enthaltenden Medium, und Abtrennen des Enzyms aus den Zellen oder der überstehenden Flüssigkeit.
Ein weiterer Gegenstand ist gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung einer biologisch aktiven RON-Substanz-Synthetase,
die erhältlich ist durch Isolierung aus einem Stamm, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Stamm BL-75 (FERM BP- 2242), Stamm NCFB 517 (FERM BP-2711), Stamm NCFB 531 (FERM BP-2712), Stamm NCFB 861 (FERM BP-2713), Stamm NCFB 864 (FERM BP-2714), Stamm NCBF 880 (FERM BP-2715), Stamm 46-1 (FERM BP-2670), Stamm ATCC 1956 und Stamm IFO 3349 und Mutanten davon,
zur Herstellung der biologisch aktiven Polysaccharid-RON- Substanz aus Saccharose, wobei die RON-Substanz die folgenden Eigenschaften hat:
(1) Form: die Substanz ist ein weißes amorphes Pulver ohne Geschmack und ohne Geruch;
(2) Löslichkeit: die Substanz ist in Wasser löslich, die Lösung wird jedoch milchig-weiß und viskos, wenn die Konzentration erhöht wird, die Substanz ist in Formamid und Dimethylsulfoxide löslich, die Substanz ist jedoch in Alkoholen, Aceton, Benzol, Ethylacetat, Hexan, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich;
(3) pH-Wert der wäßrigen Lösung: die wäßrige Lösung ist neutral oder schwach sauer;
(4) Saccharid-Bestandteil: die Substanz besteht nur aus Glucose;
(5) Werte der Elementaranalyse: die Substanz enthält 44.0 bis 45,0 % C und 6,1 bis 6,4 % H;
(6) Struktur: die Substanz ist ein α-1,6-Glucan und enthält eine geringe Menge an 3,6-verzwelgten Seitenketten;
(7) Proteine: die Substanz enthält, nahezu keine Proteine;
(8) Molekulargewicht: die Substanz durchdringt nicht eine Dialysemembran und das Molekulargewicht ist, wie angenommen wird, höher als 10 000 Dalton;
(9) spezifische Drehung: [α]D25 = +190º bis +220º (C=0,5, Formamid);
(10) Farbreaktion: die Substanz ist positiv bei der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion und bei der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, jedoch negativ bei der Biuret-Reaktion, der Lowry-Folin-Reaktion, der Elson-Morgan Reaktion und der Jod-Reaktion;
(11) Schmelzpunkt: die Substanz hat keinen definierten Schmelzpunkt;
(12) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: die Substanz weist keine charakteristische Absorption auf;
(13) Infrarot-Absorptionspektrum: die Substanz weist die charakteristische Absorption von α-Glucan auf;
(14) ¹³C-NMR-Spektrum: die Substanz weist die Absorptions- charakteristischen chemischen Verschiebungswerte von α-1,6- Glucan in den Hauptsignalen auf; und
(15) biologische Aktivität: die Substanz weist eine Antitumor-Aktivität auf.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der RON-Substanz, das umfaßt die Behandlung von Saccharose mit dem obengenannten Enzym unter Bildung der obengenannten biologisch aktiven Polysaccharid-RON-Substanz und das Sammeln der genannten Substanz.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum der erfindungsgemäß hergestellten RON-Substanz;
Fig. 2 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum der RON-Substanz;
Fig. 3 zeigt das ¹³C-NMR-Spektrum der RON-Substanz.

Detaillierte Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Die erfindungsgemäße biologisch aktive Polysaccharid-RON- Substanz-Synthetase kann nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden.
Ein bestimmter Mikroorganismus, der die RON-Substanz-Synthetase bilden kann, welche die RON-Substanz mit den obengenannten Eigenschaften bildet, wird in einem Kulturmedium kultiviert, die RON-Substanz-Synthetase wird in der Kulturbrühe angereichert und dann wird die Synthetase gesammelt. Die Mikroorganismen, welche das erfindungsgemäße Enzym bilden können, sind vorstehend aufgezählt.
Als spezifische Beispiele für den Mikroorganismus, der die RON-Substanz-Synthetase bilden kann, können genannt werden Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Stamm BL-75 (FERM BP-2242) und Stamm 46-1 (FERM BP-2670), isoliert aus Reiskleie.
Die mikrobiologischen Eigenschaften dieser Stämme sind folgende:

Stamm BL-75 (FERM BP-2242)

Gram-Färbung: +
morphologische Eigenschaften: kugelförmig bis ellipsenförmig, 0,4 bis 0,7 um, Kette aus 3 bis 4 Kokken, Kluster-Bildung
Katalase-Reaktion: -
Oxidase-Reatkion: -
freier Sauerstoffbedarf: fakultativ anaerob
Zersetzung von Arginin: -
Milchsäure-Fermentation: Hetero-Typ D-Milchsäure
Säurebildung aus Kohlehydraten:
Arabinose: -
Fructose: +
Galactose: +
Glucose: +
Lactose: +
Mannose: +
Trehalose: +
Esculin-Hydrolyse: +
Dextran-Bildung: +
Wachstum in Gegenwart von NaCl:
3,0 % NaCl: +
6,5 % NaCl: -
Wachstum bei verschiedenen anfänglichen pH-Werten:
ph 4,8: -
pH 6,5: +
End-pH-Wert in dem Glucose-Medium: 4,3

Stamm 46-1 (FERM BP-2670)

Gram-Färbung: +
Morphologische Eigenschaften: kugelförmig bis ellipsenförmig, 0,4 bis 0,6 um, paarig und kurze Kette
Katalase-Reaktion: -
Oxidase-Reaktion: -
Freier Sauerstoffbedarf: fakultativ anaerob
Zersetzung von Arginin: -
Milchsäure-Fermentation: Hetero-Typ, D-Milchsäure
Säurebildung aus Kohlehydraten:
Arabinose: -
Fructose: +
Galactose: +
Glucose: +
Lactose: +
Mannose: +
Trehalose: +
Esculin-Hydrolyse: +
Dextran-Bildung: +
Wachstum in Gegenwart von NaCl:
3,0 % NaCl: +
6,5 % NaCl: -
Wachstum bei unterschiedlichen anfänglichen pH-Werten:
ph 4,8: ±
pH 6,5: +
End-pH-Wert in dem Glucose-Medium: 4,1
Im Hinblick auf die vorstehenden Angaben werden die mycologischen Eigenschaften beider Stämme wie folgt zusammengefaßt:
1. Beide Stämme sind positiv gegenüber der Gram-Färbung und fakultativ anaerob.
2. Die morphologische Charakteristik liegt in einer Kette von kugelförmigen bis ellipsenförmigen Kokken.
3. Beide Stämme sind positiv gegenüber der Bildung von Säure aus Kohlehydraten mit Ausnahme von Arabinose.
4. Die Milchsäure-Fermentation ist eine solche vom Hetero-Typ und nur die D-Form von Milchsäure wird gebildet.
5. Beide Stämme sind negativ gegenüber der Zersetzung von Arginin.
Unter Bezugnahme auf "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 8. Auflage, wurde festgestellt, daß der Stamm BL-75 zum Genus Leuconostoc gehörte, und da der Stamm gegenüber der Bildung von Dextran positiv war und gegenüber der Bildung einer Säure aus Arabinose negativ war und in Gegenwart von 6,5 % NaCl nicht wuchs, wurde der Stamm BL-75 identifiziert als Stamm von Leuconostoc dextranicum und hinterlegt unter der Nr. FERM BP-4242 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry.
Danach wurde durch Lesen des nachträglich geschriebenen neuen Handbuchs festgestellt, daß der Name der Species Leuconostoc dextranicum geändert wurde. Daher wurden der Stamm LB-75 und der Stamm 46-1, die danach gefunden wurden, erneut unter Bezugnahme auf "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology", Band 2, 9. Auflage (1986), und "Methods in Microbiology", Band 16, Seiten 147 und 148 (1984), untersucht. Als Ergebnis wurde gefunden, daß beide Stämme als Stämme von Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum identifiziert wurden. Daher wurde der Name des Stammes BL 75 geändert in Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum BL-75 und der Stamm 16-1 wurde als Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum 46-1 bezeichnet und letzterer wurde ebenfalls unter der Nr. FERM BP-2670 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, hinterlegt.
Es wurde weiter geforscht nach die RON-Substanz bildenden Mikroorganismen und es wurde gefunden, daß einige bekannte Stämme eine Aktivität in bezug auf die Bildung der RON-Substanz aufwiesen ebenso wie die Stämme BL-75 und 46-1. Es wurde nämlich gefunden, daß Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Stamm NCFB 517 (FERM BP-2711), Stamm NCFB 531 (FERM BP-2712), Stamm NCFB 861 (FERM BP-2713), Stamm NCFB 864 (FERM BP-2714), Stamm NCFB 880 (FERM BP- 2715), Stamm ATCC 1956 und Stamm IFO 3349 die RON-Substanz bilden.
Die Kultivierung des Mikroorganismus, der das Enzym bilden kann, das eine RON-Substanz-Bildungsaktivität aufweist, wird im Prinzip durchgeführt unter Anwendung eines üblichen Mikroorganismus-Kultivierungs-Verfahrens. Da der Mikroorganismus, der zu dem Genus Leuconostoc gehört, fakultativ anaerob ist und keinen Sauerstoff benötigt, wird im allgemeinen zweckmäßig eine stationäre Kultivierung unter Verwendung eines flüssigen Mediums oder eine Kultivierung unter leichtem Rühren, um die Temperaturverteilung zu vereinheitlichen, angewendet.
In dem Kulturmedium sollte Saccharose zwingend als Kohlenstoffquelle für die Bildung eines die RON-Substanz bildenden Enzyms enthalten sein. Es kann jedes beliebige synthetische Kulturmedium, halbsynthetische Kulturmedium und natürliche Medium verwendet werden, sofern zusätzlich zu Saccharose eine weitere Kohlenstoffquelle,eine Stickstoffquelle, eine anorganische Substanz und andere Nährstoff-Quellen, die durch den obengenannten Enzym-bildenden Mikroorganismus verwertet werden können, darin enthalten sind.
Gegebenenfalls können beliebige rohe und raffinierte Saccharose-Produkte verwendet werden. Beispielsweise können verwendet werden weißer raffinierter Zucker der ersten Handelsklasse, Molassen oder Saccharose von Reagens-Qualität. Eine höhere Saccharose-Konzentration führt zu einer höheren Produktivität des erfindungsgemäßen Enzyms, gleichzeitig wird jedoch, da sie eine höhere Konzentration an der gebildeten RON-Substanz ergibt, die Entfernung von Zellen schwierig. Daher ist im allgemeinen eine Saccharose-Konzentration von etwa 1 bis etwa 3 % bevorzugt. Als Stickstoffquelle können verwendet werden Hefeextrakt, Pepton, Glutenmehl, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, trockene Hefe, Fleischextrakt, Ammoniumsulfat und Harnstoff. Als anorganische Substanz können verwendet werden Phosphorsäuresalze und Salze von Metallen, wie Magnesium, Mangan, Eisen, Kobalt und Natrium, können zweckmäßig zugesetzt werden. Da der PH-Wert die Bildung des erfindungsgemäßen Systems beeinflußt, ist es bevorzugt, daß ein Phosphorsäuresalz in einer Menge von etwa 1 bis etwa 3 % zugegeben wird, um die Pufferkapazität des Kulturmediums zu erhöhen.
Die Inkubationstemperatur kann eine solche sein, wie sie fpr Mesophile angewendet wird, deshalb beträgt sie im allgemeinen 15 bis 45ºC, vorzugsweise 20 bis 30ºC. Die Inkubationszeit beträgt im allgemeinen 10 bis 30 h und nachdem die Bildung des erfindungsgemäßen Enzyms den Höhepunkt erreicht hat, wird die Inkubation beendet.
Da sich das erfindungsgemäße Enzym in den Zellen und in dem Kulturmedium anreichert, kann das erfindungsgemäße Enzym aus den durch Zentrifugenabscheidung abgetrennten Zellen gesammelt werden oder es kann aus der überstehenden Flüssigkeit gesammelt werden, die nach der Entfernung der Zellen zurückbleibt. Es können somit die Kulturbrühe selbst oder die obengenannten Zellen oder die überstehende Flüssigkeit als rohes Enzym für die Bildung der RON-Substanz verwendet werden. Wenn das erfindungsgemäße Enzym aus den Zellen gewonnen wird, kann ein Verfahren angewendet werden, bei dem das erfindungsgemäße Enzym auf geeignete Weise, beispielsweise durch Extraktion mit einem oberflächenaktiven Agens oder durch Ultraschallbehandlung der Zellen, solubilisiert (löslich gemacht) wird und die unlöslichen Substanzen werden beispielsweise durch Zentrifugenabscheidung abgetrennt. Da jedoch die Gewinnung aus der überstehenden Flüssigkeit leichter ist, wird das erfindungsgemäße Enzym im allgemeinen aus der überstehenden Flüssigkeit gewonnen.
Die Reinigung des erfindungsgemäßen Enzyms kann durchgeführt werden auf eine Weise, wie sie üblicherweise für die Reinigung von Enzymen angewendet wird, beispielsweise durch Präzipitation mit einem organischen Lösungsmittel, durch Aussalzen, durch verschiedene Chromatographie-Arten (Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitäts-Chromatographie und Hydroxyapatit-Chromatographie) und Ultrafiltration. Das erfindungsgemäße Enzym kann ausreichend gereinigt werden durch Entfernung der Komponenten mit niedrigem Molekulargewicht (die ein Molekulargewicht von weniger als 30 000 Dalton haben) durch Ultrafiltration.
Nachstehend werden die Eigenschaften des die RON-Substanz bildenden erfindungsgemäßen Enzyms näher beschrieben. Das in dem nachstehend beschriebenen Beispiel 1 erhaltene Enzym wurde als Standardsubstanz des erfindungsgemäßen Enzyms verwendet. Die Enzymaktivität wurde unter Anwendung der folgenden Methode gemessen.

Messung der Enzymaktivität

Die Enzymaktivität wurde bestimmt durch Messung der Menge an Fructose, die gleichzeitig mit der Bildung der RON-Substanz freigesetzt wurde.
Eine Substratlösung, enthaltend Saccharose (60 Gew./Vol.-%) und einen Acetatpuffer (0,3 M, pH 5,5), die vorher auf 30ºC erwärmt worden war, wurde mit einer auf 30ºC erwärmten Enzymlösung (0,5 bis 1 U/ml) in der vierfachen Menge der Substratlösung gemischt und die Mischung wurde ausreichend gerührt und die Reaktion wurde 30 min lang bei 30ºC durchgeführt. Der Reaktionsmischung wurde eine 40 mM NaOH-Lösung in der fünffachen Menge der Reaktionsmischung zugesetzt, um die Reaktion abzustoppen.
Die Mischung mit der abgestoppten Reaktion wurde in geeigneter Weise verdünnt und der reduzierte Zucker wurde als Fructose nach der Somogyi-Methode bestimmt [M. Somogyi, "J. Biol. Chem.", 160, 61 (1945)]. Als Kontrolle wurde reduzierender Zucker in der Mischung mit der abgestoppten Enzymreaktion, die auf die gleiche Weise ohne Zugabe von Saccharose behandelt worden war, als Fructose bestimmt und es wurde eine Korrektur durchgeführt. Die Menge der an der Reaktion teilnehmenden Saccharose wurde aus der Fructosemenge ermittelt. Die Aktivität der RON-Substanz-Synthetase wird in der Weise ausgedrückt, daß eine Einheit die Menge des Enzyms ist, die 1 umol Saccharose innerhalb einer Minute unter den obengenannten Bedingungen in die RON-Substanz überführt.

Eigenschaften des Enzyms

a) Art der Wirkung

Das Enzym zersetzt 1 mol Saccharose unter Bildung von 1 mol Fructose und gleichzeitig überträgt das Enzym den Glucose- Anteil auf die ROM-Substanz, die als Rezeptor dient.

b) Optimaler pH-Wert

Die relativen Aktivitäten bei verschiedenen pH-Werten wurden bei 30ºC bestimmt unter Verwendung verschiedener Pufferlösungen. Es wurde gefunden, daß ein optimaler pH- Wert für das erfindungsgemäße Enzym etwa 5,5 beträgt.

c) Stabiler pH-Wert-Bereich

Die relativen Rest-Aktivitäten bei verschiedenen pH-Werten wurden bestimmt nach dem Stehenlassen der Enzymlösung bei 25ºC für 18 h bei jedem pH-Wert. Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Enzym in Pufferlösungen mit einem pH-Wert von 4,5 bis 7,0 stabil ist.
Wenn die erfindungsgemäße Enzymlösung bei einem pH-Wert von 5,5 mit Toluol gesättigt wurde und im kalten Zustand (4 bis 6ºC) aufbewahrt wurde, war das Enzym 2 Monate lang stabil.

d) Substrat-Spezifität

Die Bildung der ROM-Substanz aus Glucose, Fructose, Maltose und Isomaltose ist nicht festzustellen, das Enzym reagiert nur mit Saccharose unter Bildung der ROM-Substanz.

e) Optimale Temperatur

Nach der vorstehend beschriebenen Methode wurde die Aktivität des Enzyms bei verschiedenen Temperaturen bestimmt und es wurden auch die relativen Aktivitäten bei den jeweiligen Temperaturen ermittelt. Es wurde gefunden, daß die optimale Temperatur des erfindungsgemäßen Enzyms etwa 40ºC bei pH 5,5 ist.

f) Stabiler Temperaturbereich

Die relativen Restaktivitäten bei verschiedenen Temperaturen wurden nach 30-minütigem Stehenlassen der Enzymlösung bei pH 5,5 bestimmt. Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Enzym bei Temperaturen unterhalb 40ºC stabil ist.

g) Inhibierung und Aktivierung

Es wurden die relativen Aktivitäten bei Zugabe verschiedener Metallchloride in einer Endkonzentration von 1 mM nach einem Standardverfahren bestimmt. Der Relativwert wurde ausgedrückt in % im Vergleich zur Aktivität ohne Zugabe eines Metallchlorids. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle I angegeben. Tabelle I Metallsalz nicht zugegeben relative Aktivität (%)
Die Tabelle I zeigt, daß das Enzym durch ein Ca-Salz etwas aktiviert wird, daß es jedoch durch ein Cu-Salz inhibiert wird.
Wenn das erfindungsgemäße Enzym einer Gelfiltration unterworfen wird, wird das Enzym aus dem Zwischenkorn-Volumen der Säule (Toyopearl HW-75 ) eluiert, die eine Ausschlußgrenze bei einem Molekulargewicht von 10 000 000 Dalton hat. Die RON-Substanz wird jedoch gleichzeitig in der gleichen Position eluiert. Es wird daher angenommen, daß das erfindungsgemäße Enzym eine hohe Affinität gegenüber der RON-Substanz hat und daran gebunden ist. Es wurde bestätigt, daß dann, wenn das erfindungsgemäße Enzym von der Polysaccharid-RON-Substanz getrennt wird, die Aktivität des Enzyms instabil wird. In der Praxis kann das erfindungsgemäße Enzym ausreichend gereinigt werden unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens, in diesem Falle wird das erfindungsgemäße Enzym jedoch nicht bis zu einem Einzelprotein gereinigt, was anhand einer Elektrophorese festgestellt wird. Deshalb konnten das Molekulargewicht, die Werte der Elementaranalyse, die Kristallstruktur und dgl. des erfindungsgemäßen Katalysators nicht geklärt werden.
Das erfindungsgemäße Enzym hat die Wirkung, Saccharose zu zersetzen unter Bildung der biologisch aktiven Polysaccharid-RON-Substanz. Daher kann die RON-Substanz unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms hergestellt werden.
Das obengenannte (nicht vollständig gereinigte) erfindungsgemäße Enzym kann in befriedigender Weise als die RON-Substanz synthetisierendes Enzym verwendet werden. Die Verwendung von Saccharose mit einer höheren Reinheit ist für die Reinheit der ROM-Substanz vorteilhaft, in der Praxis ist jedoch im Handel erhältlicher weißer Zucker zufriedenstellend. Wenn die Saccharosekonzentration in der Reaktionsmischung höher ist, nimmt die Menge der gebildeten ROM-Substanz zu, die für die Reaktion erforderliche Zeit wird jedoch lang. Daher wird die Reaktion im allgemeinen bei einer Saccharosekonzentration von 5 bis 30 %, vorzugsweise von 10 bis 20 %, durchgeführt.
Wenn die Enzymkonzentration in der Reaktionsmischung höher ist, wird die für die Reaktion erforderliche Zeit kurz, wenn jedoch die Saccharosekonzentration die gleiche ist, ist die Menge der gebildeten ROM-Substanz die gleiche. Deshalb wird die Reaktion im allgemeinen bei einer Enzymkonzentration von 0,2 bis 2 U/ml, vorzugsweise von 0,5 bis 1 U/ml, durchgeführt.
Der pH-Wert der Reaktionsmischung kann innerhalb des stabilen pH-Wert-Bereiches des Enzyms liegen, da jedoch der höchste Wirkungsgrad erzielt wird, wenn die Reaktion bei dem optimalen pH-Wert des Enzyms durchgeführt wird, wird der pH-Wert vorzugsweise auf etwa 5,5 eingestellt. Der pH- Wert wird durch die Enzymreaktion nicht verändert und wenn eine Phosphat- oder Acetat-Pufferlösung verwendet wird, kann der pH-Wert der Reaktionsmischung leicht aufrechterhalten werden.
Die Reaktionstemperatur kann innerhalb des stabilen Temperaturbereiches liegen, da jedoch der Wirkungsgrad der Enzymreaktion höher ist, wenn die Temperatur höher ist, wird die Enzymreaktion vorzugsweise bei etwa 30ºC durchgeführt.
Die Reaktionszeit hängt von der Saccharosekonzentration, der Enzymkonzentration, der Reaktionstemperatur und dem pH- Wert der Reaktionsmischung ab. Es wird jedoch empfohlen, daß die praktische Reaktionszeit vorzugsweise 6 bis 7 h beträgt.
Nach der Reaktion kann die gebildete RON-Substanz durch organische Lösungsmittel-Präzipitation unter Verwendung eines wasserlöslichen polaren organischen Lösungsmittels gereinigt werden. Es können organische Lösungsmittel verwendet werden, wie sie üblicherweise für die Reinigung von Polysacchariden eingesetzt werden, z.B. Methanol, Ethanol und Aceton. Das organische Lösungsmittel wird der Reaktionsmischung zugesetzt, bis die RON-Substanz in ausreichendem Maße ausgefallen ist. Um jedoch eine Kontamination durch Verunreinigungen in der Reaktionsmischung, z.B. Saccharose, Fructose und ein Pufferagens, zu verhindern, ist es bevorzugt, daß das organische Lösungsmittel vorsichtig unter Rühren zugegeben wird, so daß die Endkonzentration 40 bis 60 %, vorzugsweise 43 bis 48 %, beträgt. Der gebildete Niederschlag kann durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt werden, die Abtrennung durch Dekantation ist jedoch einfach und vorteilhaft. Im allgemeinen ist es bevorzugt, daß dieser Arbeitsgang mehrmals wiederholt wird, um die Verunreinigungen zu entfernen. Nachdem die RON-Substanz als Niederschlag abgetrennt worden ist, wird sie in Wasser gelöst und die Lösung wird einer Gefriertrocknung oder Sprühtrocknung unterworfen. Es ist auch möglich, die Lösung allmählich einem polaren organischen Lösungsmittel zuzusetzen und den Niederschlag unter vermindertem Druck im dehydratisierten Zustand zu trocknen. Die RON-Substanz wird in Form eines weißen Pulvers gewonnen. Außerdem kann die RON-Substanz mit einem höheren Wirkungsgrad hergestellt werden durch einen Bioreaktor, in dem das die RON-Substanz synthetisierende Enzym verwendet wird.
Da das Enzym, das einen festgelegten Titer hat, in dem Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen RON-Substanz verwendet wird, ist es möglich, die Bildung der RON- Substanz unter optimalen Bedingungen durchzuführen. Daher kann innerhalb einer kurzen Zeit ein Produkt mit einer einheitlichen Qualität erhalten werden. Da der die RON-Substanz bildende Mikroorganismus nicht direkt für die Bildung der RON-Substanz verwendet wird, wird die Ausgangs-Saccharose für das Wachstum des Mikroorganismus nicht verbraucht. Daher ist der Wirkungsgrad der Ausnutzung des Ausgangsmaterials hoch. Da keine Gefahr der Zersetzung der durch das Enzym gebildeten RON-Substanz besteht, ist darüber hinaus die Ausbeute höher und die Reinigung ist leichter als bei der fermentativen Herstellung.
Die Eigenschaften der auf diese Weise erhaltenen biologisch aktiven Polysaccharid-RON-Substanz sind folgende:
(1) Form: die Substanz ist ein weißes amorphes Pulver, das keinen Geschmack und keinen Geruch hat;
(2) Löslichkeit: die Substanz ist in Wasser löslich, die Lösung wird jedoch milchig-weiß und viskos, wenn die Konzentration erhöht wird, die Substanz ist in Formamid und Dimethylsulfoxid löslich, sie ist jedoch in Alkoholen, Aceton, Benzol, Ethylacetat, Hexan, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich;
(3) pH-Wert der wäßrigen Lösung: die wäßrige Lösung ist neutral oder schwach sauer;
(4) Saccharid-Bestandteil: die Substanz besteht nur aus Glucose;
(5) Werte der Elementar-Analyse: die Substanz enthält 44,0 bis 45,0 % C und 6,1 bis 6,3 % H;
(6) Struktur: die Substanz ist ein α-1,6-Glucan und enthält eine geringe Menge an 3,6-verzweigten Seitenketten;
(7) Proteine: die Substanz enthält nahezu keine Proteine;
(8) Molekulargewicht: die Substanz durchdringt nicht eine Dialysemembran und das Molekulargewicht ist, wie angenommen wird, höher als 10 000 Dalton und beispielsweise bei Anwendung der Gelpermeationsmethode unter Verwendung von Sepharose 2B wird angenommen, daß das Molekulargewicht, das in dem weiter unten beschriebenen Beispiel 2 erhalten wurde, höher ist als 20 000 000 Dalton;
(9) spezifische Drehung: [α]D25 = +190º bis +220º (C=0,5, Formamid);
(10) Farbreaktion: die Substanz ist positiv gegenüber der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion und der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, jedoch negativ bei der Biuret-Reaktion, der Lowry-Folin-Reaktion, der Elson-Morgan-Reaktion und der Jod-Reaktion;
(11) Schmelzpunkt: die Substanz hat keinen definierten Schmelzpunkt;
(12) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: die Substanz weist keine charakteristische Absorption auf, wie in Fig. 1 gezeigt wird;
(13) Infrarot-Absorptionsspektrum:die Substanz weist die charakteristische Absorption von α-Glucan auf, wie aus der Fig. 2 ersichtlich ist;
(14) ¹³C-NMR Spektrum: die Substanz weist die charakteristischen chemischen Verschiebungs-Werte von α- 1,6-Glucan bei dem Hauptpeak auf, wie aus Fig. 3 ersichtlich ist; und
(15) Biologische Aktivität: die Substanz hat eine Antitumor-Aktivität.
Es wurde gefunden, daß die erf indungsgemäß hergestellte RON-Substanz verschiedene biologische Aktivitäten aufwies, beispielsweise eine Antitumor-Aktivität, eine immunmodulierende Aktivität und eine Wirts-Abwehraktivität gegenüber Infektionserkrankungen. Die Verfahren zur Bestimmung dieser biologischen Aktivitäten und die erhaltenen Ergebnisse, wenn die in dem weiter unten beschriebenen Beispiel 2 erhaltene RON-Substanz verabreicht wurde, werden nachstehend im Detail beschrieben.

1) Antitumor-Aktivitäten

a) Effekt der intraperitonelalen Verabreichung der RON- Substanz auf den syngenetischen Tumor Meth-A

In die Peritoneal-Hohlräume von 6 Wochen alten weiblichen BALB/C-CRJ-Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g wurden Meth-A-Tumorzellen, die in den peritonealen Hohlräumen von syngenetischen Mäusen subkultiviert worden waren, in einer Menge von 1 x 10&sup5; Zellen pro Maus transplantiert. Die Mäuse wurden unterteilt in eine Kontrollgruppe, bestehend aus 20 Mäusen, und drei Testgruppen, jeweils bestehend aus 10 Mäusen. Ab dem auf die Transplantation der Tumorzellen folgenden Tag wurden kontinuierlich 5 Tage lang 0,1 ml der jeweiligen physiologischen Salzlösungen, enthaltend 10 mg, 30 mg und 100 mg RON pro kg Körpergewicht einer Maus intraperitoneal in die Hohlräume der Mäuse der jeweiligen Testgruppen verabreicht und den Mäusen der Kontrollgruppe wurde nur eine physiologische Salzlösung in entsprechender Weise verabreicht. Dann wurden die Überlebenstage festgestellt und die Verlängerung des Lebens wurde nach der folgenden Formel errechnet:
Verlängerung des Lebens(%) = durchschnittliche Überlebenszeit (Tage) für die Testgruppe/durchschnittliche Überlebenszeit (Tage) für die Kontrollgruppe x 100

b) Effekt der oralen Verabreichung der RON-Substanz auf den syngenetischen Tumor Meth-A

In die Achselbereiche von 6 Wochen alten weiblichen BALB/C- CRJ-Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g wurden Meth-A-Tumorzellen subkutan transplantiert in einer Menge von 6 x 10&sup4; Zellen pro Maus. Die Mäuse wurden unterteilt in eine Kontrollgruppe, bestehend aus 20 Mäusen, und drei Testgruppen, jeweils bestehend aus 10 Mäusen. Ab dem Tag nach der Transplantation der Tumorzellen wurden kontinuierlich 10 Tage lang 0,2 ml der jeweiligen physiologischen Salzlösungen, enthaltend 10 mg, 30 mg und 100 mg der RON-Substanz pro kg Körpergewicht einer Maus oral verabreicht unter Verwendung einer Oralsonde. Den Mäusen der Kontrollgruppe wurden nur eine physiologische Salzlösung in entsprechender Weise verabreicht. Nach 35 Tagen ab der Transplantation der Tumorzellen wurde jede Maus getötet und der gewachsene Tumor wurde herausgeschnitten und es wurde das Gewicht bestimmt. Das Inhibierungsverhältnis wurde aus der folgenden Formel errechnet:
Inhibierungsverhältnis(%) = 1-[durchschnittliches Tumorgewicht in der Testgruppe/durchschnittliches Tumorgewicht in der Kontrollgruppe] x 100
Die Antitumor-Aktivitäten der nach den obengenannten Verfahren (a) und (b) getesteten ROM-Substanz sind in der Tabelle II angegeben. Tabelle II Probe Dosis (mg/kg) Intraperitoneale Verabreichung (a) orale Verabreichung (b) durchschnittliche Überlebenszeit (Tage) Verlängerung des Lebens (%) durchschnittliches Tumorgewicht (g) Inhibierungsverhältnis (%) Kontrolle (Salzlösung) RON-Substanz
Aus den in der Tabelle I angegebenen Ergebnissen ist zu ersehen, daß die RON-Substanz eine starke Antitumor-Aktivität aufweist bei einer optimalen Dosis von etwa 30 mg/kg sowohl bei intraperitonealer als auch bei oraler Verabreichung.
Es wurde außerdem bestätigt, daß dann, wenn die RON-Substanz in einer Dosis von 10 bis 100 mg/kg intraperitoneal oder oral verabreicht wird, einem Tumorinhibierungsverhältnis von 30 bis 70 % entsprechende Aktivitäten erreicht werden bei den syngenetischen Maus-Tumoren Lewis-Lungencarcinom, Melanom B-16 und den allogenetischen Tumoren Sarcoma- 180 und dem Ehrlich-Ascites-Tumor.
Darüber hinaus wurde bestätigt, daß dann, wenn die RON-Substanz in Kombination mit einem geeigneten Primer (Auslöser) verabreicht wird, die Cytotoxizität gegenüber L-929-Zellen und die nektrotische Aktivität gegenüber dem festen Meth-A- Tumor in dem Serum induziert werden und ein Tumor-Nekrose- Faktor in dem lebenden Körper einer Tumor-tragenden Maus selbst-induziert wird. Im Hinblick auf die Tatsache, daß die RON-Substanz überhaupt keine Toxizität aufweist, wie nachstehend beschrieben, kann die RON-Substanz als sehr wirksames Antitumor-Mittel angesehen werden.

2) Immunmodulierende Aktivitäten

a) Kohlenstoff-Ausscheidungs-Test (CCT)

Dieser Test wird angewendet, um den Effekt der Erhöhung der phagozytischen Aktivität eines Makrophagen zu prüfen. Eine physiologische Salzlösung, welche die RON-Substanz darin gelöst enthielt, wurde 2 Tage lang einer Gruppe von 6 vier Wochen alten weiblichen ICR-CRJ-Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g intraperitoneal verabreicht (der Kontrollgruppe wurde nur eine physiologische Salzlösung verabreicht) und am dritten Tag wurden 0,25 ml einer Kohlenstofflösung (hergestellt durch Verdünnen von schwarzer Farbe (Tinte) (Fount India , geliefert von der Firma Pelikan Co., auf das 5-fache mit einer physiologischen Salzlösung) in die Schwanzvene der Maus injiziert. Unmittelbr nach der Injektion und 10 min später wurden 0,025 ml Blut aus dem Venenplexus der Retro-Orbita der Maus entnommen und suspendiert und gelöst in 3,5 ml einer 0,01 M Natriumcabonatlösung. Die Extinktion (0D&sub6;&sub5;&sub0;) bei 650 nm wurde bestimmt und der Grad der Abnahme der Kohlenstoffkonzentration in dem Blut wurde geprüft. Der Effekt wurde ausgedrückt durch den durch die folgende Formel dargestellten phagozytischen Index:
Phagozytischer Index (K) = log C&sub1; - log C&sub2;/T&sub2; - T&sub1;
worin bedeuten:
C&sub1; die OD&sub6;&sub5;&sub0; bei T&sub1; und
C&sub2; die OD&sub6;&sub5;&sub0; bei T&sub2;.
Im Falle der Tumor tragenden Mäuse wurden 7 Tage vor Beginn der Verabreichung der RON-Substanz 1 x 10&sup7; Sarcoma-180-Zellen in den Muskel der Hinterpfote jeder Maus transplantiert und der Test wurde in entsprechender Weise durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle III angegeben. Es wurde gefunden, daß im Falle sowohl der normalen Mäuse als auch der Tumor tragenden Mäuse die Funktion des Reticuloendothel-Systems der Mäuse durch die Verabreichung von 10 bis 100 mg/kg, insbesondere 30 mg/kg, der RON-Substanz verbessert wird. Tabelle III Probe Dosis (mg/kg) normale Mäuse Tumor-tragende Mäuse phagozytischer Index Relativwert(%) Kontrolle (Salzlösung) RON-Substanz

b) Plaque-Bildungs-Zell-Test (PFC)

Dieser Test wird angewendet, um den Effekt der Erhöhung des Antikörperbildungs-Vermögens durch Aktivierung von B-Zellen des Wirts unter den immunmodulierenden Aktivitäten zu prüfen.
Eine physiologische Salzlösung, welche die RON-Substanz enthielt, wurde 3 Tage lang kontinuierlich intraperitoneal in die Hohlräume einer Gruppe von 6 vier Wochen alten weiblichen ICR-CRJ-Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g verabreicht (der Kontrollgruppe wurde nur eine physiologische Salzlösung verabreicht). Am 4. Tag und am 11. Tag wurden 4 x 10&sup6; Schaf-Erythrozyten in die Schwanzvene injiziert und nach 4 Tagen wurden das Plaque- Bildungsvermögen der Maus-Milzzellen nach der Cunningham- Methode bestimmt.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle IV angegeben. Daraus ist zu ersehen, daß das Antikörperbildungsvermögen stark verbessert wird durch die Verabreichung von 10 bis 100 mg/kg der RON-Substanz. Tabelle IV Sensibilisierung am Tag Probe Dosis (mg/kg) Anzahl d. Plaques pro Milz Relativwert (%) Kontrolle (Salzlösung RON-Substanz

c) Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ (DHR)

Dieser Test wird angewendet, um den Effekt der Erhöhung der durch Zellen vermittelten Immunitäts-Wirkung durch Aktivierung von T-Zellen des Wirts unter den immunmodulierenden Aktivitäten zu prüfen.
Eine physiologische Salzlösung, welche die RON-Substanz enthielt, wurde an eine Gruppe von 6 acht Wochen alten weiblichen ICR-CRJ-Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 27 g oral verabreicht (der Kontrollgruppe wurde nur eine physiologische Salzlösung verabreicht). Am 4. Tag nach Beginn der Verabreichung wurde eine 5 %ige Ethanollösung von Picrylchlorid auf den Bauchbereich, der rasiert worden war, aufgetragen, um eine Primär-Sensibilisierung zu bewirken. Am 11. Tag wurde eine 1 %ige Olivenöl- Lösung von Picrylsäure auf die Vorderseite und die Rückseite beider Ohren jeder Maus aufgetragen, um eine Sekundär-Sensibilisierung zu bewirken. Nach 24 Stunden wurde die Ohrdicke mittels eines Meßgerätes gemessen und die Zunahme der Ohrdicke wurde aus der Differenz zwischen der Ohrdicke vor und nach dem Auftragen (Beschichten) ermittelt. Im Falle der Tumor-tragenden Mäuse wurden einen Tag vor der Verabreichung 1 x 10&sup5; Sarcoma 180-Ascites-Tumorzellen in den Peritoneal-Hohlraum der Maus transplantiert.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle V angegeben. Daraus ist zu ersehen, daß im Falle sowohl von normalen Mäusen als auch von Tumor tragenden Mäusen die durch Zellen vermittelte Immunitäts-Wirkung stark verbessert wird durch die orale Verabreichung von 30 bis 500 mg/kg der RON-Substanz. Tabelle V Probe Dosis (mg/kg) Normale Mäuse Tumor-tragende Mäuse Zunahme d. Ohrdicke (um) Relativwert (%) Kontrolle (Salzlösung) RON-Substanz
Aus den Ergebnissen der Immunitätswirkungs-Tests (a), (b) und (c) ist zu ersehen, daß verschiedene Immunitätswirkungen bei Mäusen mit unterschiedlichen Mechanismen durch die RON-Substanz beträchtlich verbessert werden können. Da ein immunmodulierendes Agens im allgemeinen verwendet wird, wenn die immunologische Kompetenz eines lebenden Körpers herabgesetzt ist oder die Fremdantigen-Erkennungsfunktion schlecht ist, kann erwartet werden, daß die RON-Substanz wirkungsvoll als therapeutisches Agens, als Adjuvans-therapeutisches Agens, als kombiniertes therapeutisches Agens, als Präventions-Agens oder als Erholungs-Beschleunigungs- Agens nach der Operation gegenüber Bakterien- und Virusinfektionserkrankungen und malignen Tumoren verwendet werden kann. Zusätzlich zu den obengenannten Immunitäts-aktivierenden und Erholungswirkungen hat das immunmodulierende Agens die Funktion, eine abnorm erhöhte Immunreaktion in einem lebenden Körper zu normalisieren und es ist anzunehmen, daß die RON-Substanz gegenüber Autoimmunerkrankungen, wie Rheumatismus, Kollagen-Erkrankungen und allergischen Erkrankungen eingesetzt werden kann.

3) Wirts-Abwehraktivität

Ein lebender Körper weist im allgemeinen eine ausreichende Abwehraktivität gegenüber der Invasion von Fremdbakterien auf. Es ist bekannt, daß in dem Krebs-tragenden Zustand, insbesondere in der späteren Krebs-Stufe, die Abwehrwirkung drastisch vermindert ist und eine schwerwiegende Schädigung auch durch nicht-pathogene Bakterien auftritt, die üblicherweise mit dem Wirt in Symbiose leben.
Um zu prüfen, ob die RON-Substanz die Abwehr-Aktivität des Wirts gegenüber diesen bakteriellen Infektionserkrankungen erhöhen kann oder nicht, wurde der Effekt der RON-Substanz auf die Infektion mit Escherichia coli und Listeria monocytogenes untersucht.
Eine physiologische Salzlösung, die 10 bis 100 mg/kg der RON-Substanz enthielt, wurde subkutan in die Rücken einer Gruppe von 20 sieben Wochen alten weiblichen ICR-CRJ-Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 26 g einmal am Tage vor der Infektion mit den Bakterien und einmal am Tage nach der Infektion mit den Bakterien verabreicht (der Kontrollgruppe wurde nur die physiologische Salzlösung verabreicht). Im Falle von Escherichia coli wurden 2 x 10&sup7; Zellen subkutan in den Rücken transplantiert und im Falle von Listeria monocytogenes wurden 2 x 10&sup7; Zellen intraperitoneal transplantiert. Dann wurden die Mäuse eine Woche lang beobachtet und die Anzahl der überlebenden Mäuse wurde bestimmt und die Schutzwirkung wurde aus der folgenden Formel errechnet:
Schutzwirkung (%) = (Anzahl der über lebenden Mäuse in der Testgruppe) - (Anzahl der überlebenden Mäuse in der Kontrollgruppe) / Anzahl der Mäuse in einer Gruppe x 100
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle VI angegeben. Es ist daraus zu ersehen, daß dann, wenn 10 bis 100 mg/kg der RON-Substanz vor der Infektion mit Escherichia coli verabreicht werden, eine sehr starke Abwehraktivität gegenüber der Infektion mit Escherichia coli erzielt werden kann und daß ein signifikanter Effekt der Verbesserung der Abwehraktivität gegenüber der Infektion mit Listeria monocytogenes erzielt werden kann. Im Falle der Verabreichung nach der Infektion hat die RON-Substanz eine signifikante therapeutische Wirkung gegenüber beiden infektiösen Bakterien.
Im Hinblick auf die Tatsache, daß die RON-Substanz keine Toxizität aufweist, wie nachstehend erläutert, wird die RON-Substanz als sehr nützliches Wirts-Abwehragens gegenüber Infektionserkrankungen angesehen. Tabelle VI Einen Tag vor der Infektion Einen Tag nach der Infektion Infektions-Bakterium Probe Dosis (mg/kg) Anzahl der überlebenden Mäuse Schutzwirkung (%) Escherichia coli* Listeria monocytogenese ** Kontrolle (Salzlösung) RON-Substanz Fußnoten: *: Escherichia coli SB-001 **: Listeria monocytogenes SB-010
Die akute Toxizität der RON-Substanz wird nachstehend näher beschrieben. Die RON-Substanz wurde an eine Gruppe von 10 fünf Wochen alten männlichen SD-CRJ-Ratten mit einem Körpergewicht von 120 bis 150 g in einer Dosis von 15 g/kg, bei der es sich um eine physikalische Verabreichungsgrenzdosis handelt, oral verabreicht und die Ratten wurden beobachtet. Keine der Ratten starb und die Zunahme des Körpergewichts war nicht verschieden von derjenigen in der Kontrollgruppe und es wurde sowohl in bezug auf das Aussehen als auch in bezug auf die Nekropsie keine Abnormität festgestellt. Es wird daher angenommen, daß die LD&sub5;&sub0; größer ist als 15 g/kg und die RON-Substanz keine akute Toxizität aufweist.
Außerdem hat die RON-Substanz die Funktion, daß sie die Cytotoxizität von natürlichen Killerzellen, die aus Milzzellen von Ratten stammen, erhöht und die cytotoxische Aktivität gegenüber L-929-Zellen von residenten peritonealen Makrophagen einer Maus aktiviert. Darüber hinaus hat die RON-Substanz ein Immunitäts-Aktivierungsvermögen und die Funktion, die Bildung eines Cytokins wie Interferon zu erhöhen und es ist daher anzunehmen, daß die RON-Substanz präventive und therapeutische Effekte gegenüber Virus erkrankungen, wie Herpes, Influenza und Aids, ausübt. Die RON-Substanz wird außerdem als nützliches präventives und therapeutisches Agens gegenüber Hepatitis, z.B. chronischer Hepatitis und Lebererkrankungen, angesehen.
Da die RON-Substanz oral oder nicht-oral verabreicht werden kann, ist anzunehmen, daß die RON-Substanz wirksam eingesetzt werden kann als Antitumor-Agens, als immunmodulierendes Agens oder als präventives oder therapeutisches Agens gegen Infektionserkrankungen.
Bei der praktischen Herstellung von Arzneimitteln wird die RON-Substanz kombiniert mit einem Exzipienten (z.B. Wasser, physiologische Salzlösung, Polyethylenglycol, Glycerin, Stärke, Dextrin oder Lactose) und zu einem flüssigen Präparat, einer Pille, einer Tablette, einem Pulver oder einem Suppositorium geformt.
Die RON-Substanz weist keine Toxizität auf, sie weist bei oraler Verabreichung verschiedene biologische Aktivitäten auf, die wertvoll sind für die Aufrechterhaltung der Gesundheit, sie hat keinen Geschmack und keinen Geruch und kann leicht verarbeitet werden, weshalb die RON-Substanz als Lebensmittel oder Getränk zur Vorbeugung von Erkrankungen oder zur Aufrechterhaltung der Gesundheit oder als Zusatz zu Lebensmitteln oder Getränken zusätzlich zu den obengenannten Arzneimitteln verwendet werden kann.
Die erfindungsgemäße RON-Substanz umfaßt ein Makromolekül mit einem Molekulargewicht von höher als 20 000 000 Dalton, das in dem folgenden Beispiel 2 erhalten wurde, es wurde jedoch gefunden, daß ein Produkt mit einem niedrigen Molekulargewicht, das gebildet wird durch Herabsetzung des Molekulargewichtes der RON-Substanz bis zu einem gewissen Grade durch Säurehydrolyse oder dgl., biologische Aktivitäten aufweist, die vergleichbar sind mit denjenigen der ursprünglichen makromolekularen ROM-Substanz. Insbesondere dann, wenn die RON-Substanz in einer Schwefelsäure/Ameisensäure-Lösung mit einer Konzentration von 0,5 bis 5 %, vorzugsweise von 1 bis 3 %, bei 30 bis 70ºC, vorzugsweise 50 bis 60ºC, 2 bis 24 h lang, vorzugsweise 3 bis 6 h lang, hydrolysiert wurde, dann wurde die hydrolysierte Flüssigkeit mit Bariumcarbonat neutralisiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde durch Zentrifugen-Abscheidung abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit wurde eingeengt und einer Gelfitration in einer Säule aus Sepharose CL-2B oder Sephadex G-200 unterworfen und es wurden mehrere Fraktionen mit unterschiedlichem Molekulargewicht gesammelt und die biologischen Aktivitäten der jeweiligen Fraktionen wurden untersucht. Daraus ist zu ersehen, daß die Fraktionen mit einem Molekulargewicht von höher als etwa 10 000 Dalton Aktivitäten aufweisen, die vergleichbar sind mit denjenigen der ursprünglichen makromolekularen RON-Substanz.
Die RON-Substanz wurde bisher aus natürlichen Quellen durch Extraktion erhalten. Die erfindungsgemäße RON-Substanz- Synthetase hat die Funktion, die RON-Substanz aus Saccharose zu bilden. Das Verfahren zur Herstellung der RON-Substanz gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren, bei dem dieses Enzym verwendet wird. Da die Bildung der RON-Substanz stets unter bestimmten optimalen Bedingungen durchgeführt werden kann, kann die Qualität des Produkts vereinheitlicht werden. Da die Reinigung einfach ist, ist darüber hinaus auch die Ausbeute hoch. Deshalb können erfindungsgemäß beträchtliche quantitative und qualitative Verbesserungen erzielt werden und die vorliegende Erfindung ist vom industriellen Standpunkt aus betrachtet sehr vorteilhaft.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, auf welche die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist, im Detail beschrieben.

Beispiel 1

Eine Stab-Kulturflüssigkeit von Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, BL-75 (FERM BP-2242), wurde in 5 ml eines Vorkulturmediums (enthaltend 2 % Saccharose, 0,5 % Hefeextrakt, 0,25 % Trypton und 0,5 % K&sub2;HPO&sub4;, das einen pH- Wert von 7,4 hatte) inokuliert und die statische Kultivierung wurde 24 h lang bei 25ºC durchgeführt. Die Kulturbrühe wurde in 200 ml eines Hauptkulturmediums (enthaltend 2 % Saccharose, 0,5 % Hefeextrakt, 2 % K&sub2;HPO&sub4;, 0,02 % MgSO&sub4;, 0,001 % NHCl, 0,001 % Fe&sub2;(SO&sub4;)&sub3; und 0,001 % MnSO&sub4;, die einen pH-Wert von 7,4 hatte) inokuliert und die statische Kultivierung wurde 17 h lang bei 25º durchgeführt.
Die erhaltene Kulturbrühe wurde 15 min lang einer Zentrifugen-Abscheidung bei 10 000 G unterworfen, wobei eine überstehende Flüssigkeit erhalten wurde. Die Enzym-Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit betrug 0,74 U/ml und die Flüssigkeitsmenge betrug 180 ml. Die überstehende Flüssigkeit wurde mittels einer Ultrafiltrationsmembran (Amicon- Hohlfaser , Ausschluß-Molekulargewicht = 10 000) eingeengt. Das Konzentrat wurde mit einem 5 mM Acetat-Puffer mit einem pH-Wert von 5,5 versetzt. Die Lösung wurde mit Toluol gesättigt und schließlich wurden 80 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 2,0 U/ml erhalten.

Beispiel 2

Zu 30 ml eines 50 mM Acetat-Puffers mit einem pH-Wert von 5,5, der 20 % Saccharose enthielt, wurden 10 ml (20 U) der in Beispiel 1 erhaltenen Enzymlösung zugegeben und die Mischung wurde gerührt und die Reaktion wurde bei 30ºC durchgeführt. Da die für die Vervollständigung der Reaktion erforderliche Zeit aus den Mengen an Enzym und Saccharose auf 3,5 h errechnet wurde, wurde die Reaktion 9 h lang durchgeführt. Das Abstoppen der Reaktion wurde bewirkt durch allmähliche Zugabe von 30 ml Methanol zu der Reaktionsmischung (Endkonzentration 45 %) unter Rühren, um die RON-Substanz auszufällen. Die Ausfällung mit Methanol wurde erneut durchgeführt, um die RON-Substanz zu reinigen. Der Niederschlag wurde in Wasser gelöst und die Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei man 1,20 g RON-Substanz in Form eines weißen Pulvers erhielt (die Ausbeute betrug 85 % der theoretischen Ausbeute).

Beispiel 3

Zu 15 ml eines 50 mM Acetat-Puffers mit einem pH-Wert von 5,5, der 20 % Saccharose enthielt, wurden 5 ml (10 U) der in Beispiel 1 erhaltenen Enzymlösung zugegeben und die Mischung wurde gerührt und die Reaktion wurde bei 30ºC durchgeführt. Die Reaktionszeit wurde auf 18 h eingestellt. Dann wurden 16 ml Methanol allmählich zu der Reaktionsmischung unter Rühren zugegeben (die Endkonzentration betrug 45 %), um die ROM-Substanz auszufällen. Die Ausfällung mit Methanol wurde wiederholt, um die ROM-Substanz zu reinigen. Die gereinigte ROM-Substanz wurde in Wasser gelöst und die Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei man 1,16 g der ROM-Substanz in Form eines weißen Pulvers erhielt (die Ausbeute betrug 82 % der theoretischen Ausbeute).

Beispiel 4

Zu 500 ml des in Beispiel 1 verwendeten Vorkulturmediums wurden 10 ml der Kulturbrühe zugegeben, die aus dem in Beispiel 1 verwendeten Vorkulturmedium erhalten wurde, und die statische Kultivierung wurde 24 h lang bei 25ºC durchgeführt. Die Kulturbrühe wurde in einen Kolben-Fermenter mit einem Volumen von 30 l gegeben, der mit 25 l des in Beispiel 1 verwendeten Kulturmediums beschickt wurde, und die Hauptkultivierung wurde 20 h lang bei 25ºC durchgeführt unter langsamem Rühren. Die erhaltene Kulturbrühe wurde einer Zentrifugen-Abscheidung bei 13 000 G bei einer Fließgeschwindigkeit von 60 l/h in einem kontinuierlichen Zentrifugen-Abscheider unterworfen, wobei man 20 l einer rohen Enzymlösung mit einer Aktivität von 0,7 U/ml erhielt.

Beispiel 5

In 5 l (3500 U) der rohen Enzymlösung wurden 500 g Saccharose unter Rühren gelöst und die Reaktion wurde 17 h lang bei 30ºC durchgeführt. Nach der Reaktion wurden allmählich 4 l Methanol zu der Reaktionsmischung unter Rühren zugegeben (die Endkonzentration betrug 45 %), um die ROM-Substanz auszufällen. Der gebildete Niederschlag wurde erneut mit Methanol ausgefällt und die gereinigte ROM-Substanz wurde in Wasser gelöst und die Lösung wurde sprühgetrocknet, wobei man 174 g der ROM-Substanz in Form eines weißen Pulvers erhielt (die Ausbeute betrug 74 % der theoretischen Ausbeute).

Beispiel 6

Die Verfahren des Beispiels 1 wurden auf die gleiche Weise wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum 46-1 (FERM BP-2670) anstelle von Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, BL-75 (FERM BP-2242) verwendet wurde, wobei man 70 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 2,0 U/ml erhielt.

Beispiel 7

Die Verfahren des Beispiels 1 wurden auf die gleiche Weise wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NCFB 517 (FERM BP-2711) anstelle von Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum BL-75 (FERM BP-2242) verwendet wurde, wobei man 30 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 2,0 U/ml erhielt.

Beispiel 8

Die Verfahren des Beispiels 1 wurden auf die gleiche Weise wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NCBF 531 (FERM BP-2712) anstelle von Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum BL-75 (FERM BP-2242) verwendet wurde, wobei man 45 ml einer Enzymflüssigkeit mit einer Aktivität von 2,0 U/ml erhielt.

Beispiel 9

Die Verfahren des Beispiels 1 wurden auf die gleiche Weise wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum ATCC 1956 anstelle von Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum BL-75 (FERM BP-2242) verwendet wurde, wobei man 50 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 2,0 U/ml erhielt.

Beispiel 10

Die Verfahren des Beispiels 1 wurden auf die gleiche Weise wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NCFB 861 (FERM BP-2713) anstelle von Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum BL-75 verwendet wurde, wobei man 30 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 2,0 U/ml erhielt.

Beispiel 11

Die Verfahren des Beispiels 1 wurden auf die gleiche Weise wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum NCFB 864 (FERM BP-2714) anstelle von Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum BL-75 (FERM BP-2242) verwendet wurde, wobei man 30 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 2,0 U/ml erhielt.

Beispiel 12

Die Verfahren des Beispiels 1 wurden auf die gleiche Weise wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum IFO 3349 anstelle von Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum BL-75 verwendet wurde, wobei man 45 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 2,0 U/ml erhielt.

Beispiel 13

Die Verfahren des Beispiels 2 wurden wiederholt unter Verwendung der in Beispiel 6 erhaltenen Enzymlösung, wobei man 1,18 g RON-Substanz erhielt.

Beispiel 14

Die in Beispiel 7 erhaltene Enzymlösung wurde auf das Zweifache verdünnt und die Verfahren des Beispiels 2 wurden wiederholt unter Verwendung der Verdünnung, wobei man 1,20 g RON-Substanz erhielt.

Beispiel 15

Die Verfahren des Beispiels 2 wurden wiederholt unter Verwendung der in Beispiel 8 erhaltenen Enzymlösung, wobei man 1,17 g RON-Substanz erhielt.

Beispiel 16

Die Verfahren des Beispiels 2 wurden wiederholt unter Verwendung der in Beispiel 9 erhaltenen Enzymlösung, wobei man 1,18 g RON-Substanz erhielt.

Beispiel 17

Die Verfahren des Beispiels 2 wurden wiederholt unter Verwendung der in Beispiel 10 erhaltenen Enzymlösung, wobei man 1,10 g RON-Substanz erhielt.

Beispiel 18

Die Verfahren des Beispiels 2 wurden wiederholt unter Verwendung der in Beispiel 11 erhaltenen Enzymlösung, wobei man 1,13 g RON-Substanz erhielt.

Beispiel 19

Die Verfahren des Beispiels 2 wurden wiederholt unter Verwendung der in Beispiel 12 erhaltenen Enzymlösung, wobei man 1,21 g RON-Substanz erhielt.

Beispiel 20

Zu 1 g des weißen Pulvers der RON-Substanz, die in Beispiel 2 erhalten worden war, wurden 100 ml einer Schwefelsäure/Ameisensäure-Mischungs-Lösung mit einer Konzentration von 2 % zugegeben und die Hydrolyse wurde 4 h lang bei 60ºC durchgeführt. Zu der Hydrolysat-Lösung wurde Bariumcarbonat zugegeben, um eine Neutralisation zu bewirken, und die Lösung wurde einer Zentrifugen-Trennung unterworfen, wobei man eine überstehende Flüssigkeit erhielt. Eine Hälfte der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde einer Gelfitration in einer Säule von Sepharose CL-2B unterworfen, wobei man eine Fraktion F&sub1; (mit einem Molekulargewicht von höher als 20 000 000 Dalton), die aus dem Zwischenkornvolumen eluiert wurde, und eine Fraktion F&sub2; mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 1 000 000 Dalton erhielt. Die restliche Hälfte der überstehenden Flüssigkeit wurde auf eine Sephadex G-200-Säule aufgegeben, wobei man Fraktionen F&sub3; und F&sub4; mit mittleren Molekulargewichten von etwa 100 000 Dalton bzw. etwa 10 000 Dalton erhielt. Diese Fraktionen wurden gefriergetrocknet, wobei man 200 mg, 160 mg, 150 mg bzw. 120 mg weiße Pulver von F&sub1;, F&sub2;, F&sub3; bzw. F&sub4; erhielt.
Die biologischen Aktivitäten dieser Fraktionen werden nachstehend beschrieben.

1) Antitumor-Aktivität

Die Aktivität gegenüber dem syngenetischen Meth-A-Tumor, die durch orale Verabreichung in einer Dosis von 30 mg/kg erzielt wurde, war wie in der folgenden Tabelle VII angegeben. Tabelle VII Fraktion durchschnittliches Tumorgewicht (G) Inhibierungs-Verhältnis (%) Kontrolle (Salzlösung)

2) Immunmodulierende Aktivität

a) Kohlenstoff-Ausscheidungstest (CCT)

Der durch die intraperitoneale Verabreichung in einer Dosis von 30 mg/kg auf Tumor-tragende Mäuse erzielte Effekt war wie in der folgenden Tabelle VIII angegeben. Tabelle VIII Fraktion phagozvtischer Index Relativwert (%) Kontrolle (Salzlösung)

b) Plaque-Bildungs-Zell-Test (PFC)

Die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn die Sensibilisierung bei normalen Mäusen mit Schaf-Erythrozyten am 4. Tag nach der intraperitonealen Verabreichung in einer Dosis von 30 mg/kg durchgeführt wurde, waren wie in der folgenden Tabelle IX angegeben. Tabelle IX Fraktion Anzahl der Plaques pro Milz Relativwert Kontrolle (Salzlösung)

c) Hypersensibilitätsreaktion vom verzögerten Typ (DHR)

Der durch die intraperitoneale Verabreichung in einer Dosis von 30 mg/kg an Tumor-tragende Mäuse erzielte Effekt war wie in der Tabelle X angegeben. Tabelle X Fraktion Zunahme der Ohrdicke (um) Relativwert (%) Kontrolle (Salzlösung)

3) Wirt-Abwehr-Aktivität gegenüber Infektionserkrankungen

Die durch die subkutane Verabreichung in einer Dosis von 30 mg/kg einen Tag vor der Infektion erzielte Abwehr-Aktivität war wie in der Tabelle XI angegeben. Tabelle XI Fraktion Anzahl d. überlebenden Mäuse Schutzwirkung (%) Kontrolle (Salzlösung)
Die durch die subkutane Verabreichung in einer Dosis von 30 mg/kg einen Tag nach der Infektion erzielte Abwehrwirkung war wie in der folgenden Tabelle XII angegeben. Tabelle XII Fraktion Anzahl d. überlebenden Mäuse Schutzwirkung (%) Kontrolle (Salzlösung)
Aus den obengenannten Ergebnissen ist zu ersehen, daß selbst dann, wenn die erfindungsgemäße makromolekulare RON- Substanz zu einer Fraktion mit einem Molekulargewicht von etwa 10 000 Dalton hydrolysiert wird, verschiedene biologische Aktivitäten der Fraktion bei Werten gehalten werden können, die vergleichbar sind mit denjenigen der ursprünglichen makromolekularen ROM-Substanz.
Wenn die Toxizitäten der Fraktionen der RON-Substanz mit verringertem Molekulargewicht untersucht wurden unter Verwendung von Mäusen, wurde im Falle der oralen Verabreichung keine Toxizität bei jeder der Fraktionen beobachtet wie im Falle der ursprünglichen makromolekularen RON-Substanz und im Falle der intravenösen Injektion nahm die Toxizität mit abnehmendem Molekulargewicht ab, obgleich die LD&sub5;&sub0; der ursprünglichen makromolekularen ROM-Substanz 300 mg/kg betrug, und die LD&sub5;&sub0; der Fraktion F&sub4;, die ein Molekulargewicht von etwa 10 000 Dalton aufwies, war größer als 1 g/kg und es wurde überhaupt keine Toxizität festgestellt.
Im Hinblick darauf, daß die Produkte der makromolekularen RON-Substanz mit vermindertem Molekulargewicht verschiedene biologische Aktivitäten aufweisen, ohne daß überhaupt eine Toxizität auftritt, werden diese Substanzen als vorteilhaft für die Verwendung als Injektions-Arzneimittel oder dgl. angesehen.

Claims

1. Verwendung einer biologisch aktiven RON-Substanz- Synthetase,

die erhältlich ist durch Isolierung aus einem Stamm, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Stamm BL-75 (FERM BP-2242), Stamm NCFB 517 (FERM BP-2711), Stamm NCFB 531 (FERM BP- 2712), Stamm NCFB 861 (FERM BP-2713), Stamm NCFB 864 (FERM BP-2714), Stamm NCFB 880 (FERM BP-2715), Stamm 46-1 (FERM BP-2670), Stamm ATCC 1956 und Stamm IFO 3349 und Mutanten davon,

zur Herstellung der biologisch aktiven Polysaccharid-RON- Substanz aus Saccharose, wobei die RON-Substanz die folgenden Eigenschaften hat:

(1) Form: die Substanz ist ein weißes amorphes Pulver ohne Geschmack und ohne Geruch;

(2) Löslichkeit: die Substanz ist in Wasser löslich, die Lösung wird jedoch milchig-weiß und viskos, wenn die Konzentration erhöht wird, die Substanz ist in Formamid und Dimethylsulfoxid löslich, die Substanz ist jedoch in Alkoholen, Aceton, Benzol, Ethylacetat, Hexan, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff unlöslich;

(3) pH-Wert der wäßrigen Lösung: die wäßrige Lösung ist neutral oder schwach sauer;

(4) Saccharid-Bestandteil: die Substanz besteht nur aus Glucose;

(5) Werte der Elementar-Analyse: die Substanz enthält 44,0 bis 45,0 % C und 6,1 bis 6,4 % H;

(6) Struktur: die Substanz ist ein α-1,6-Glucan und enthält eine geringe Menge 3,6-verzweigte Seitenketten;

(7) Proteine: die Substanz enthält nahezu keine Proteine;

(8) Molekulargewicht: die Substanz durchdringt nicht eine Dialysemembran und ihr Molekulargewicht ist, wie angenommen wird, höher als 10 000 Dalton;

(9) spezifische Drehung: [α]D25 = +190º bis +220º (C=0,5, Formamid);

(10) Farbreaktion: die Substanz ist positiv gegenüber der Anthron-Schwefelsäure-Reaktion und der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, jedoch negativ gegenüber der Biuret-Reaktion, der Lowry-Folin-Reaktion, der Elson-Morgan-Reaktion und der Jod-Reaktion;

(11) Schmelzpunkt: die Substanz hat keinen definierten Schmelzpunkt;

(12) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: die Substanz weist keine charakteristische Absorption auf;

(13) Infrarot-Absorptionsspektrum: die Substanz zeigt die charakteristische Absorption von α-Glucan;

(14) ¹³C-NMR Spektrum: die Substanz weist in den Hauptsignalen die Absorptions-charakteristischen chemischen Verschiebungs-Werte von α-1,6-Glucan auf; und

(15) biologische Aktivität: die Substanz weist eine Antitumor-Aktivität auf.

2. Biologisch aktive Polysaccharid-RON-Substanz-Synthetase, welche die folgenden Eigenschaften hat:

(a) Wirkung: das Enzym zersetzt 1 mol Saccharose unter Bildung von 1 mol Fructose und gleichzeitig überträgt das Enzym den Glucose-Anteil auf die Polysaccharid-RON-Substanz, die als Rezeptor wirkt;

(b) optimaler pH-Wert: der optimale pH-Wert beträgt etwa 5,5;

(c) stabiler pH-Wert-Bereich: das Enzym ist in dem pH-Wert- Bereich von 4,5 bis 7,0 stabil;

(d) Substrat-Spezifität: die Bildung der biologisch aktiven Polysaccharid-RON-Substanz aus Glucose, Fructose, Maltose und Isomaltose ist nicht zu beobachten, das Enzym reagiert jedoch nur mit Saccharose unter Bildung der biologisch aktiven Polysaccharid-RON-Substanz;

(e) optimale Temperatur: die optimale Temperatur beträgt etwa 40ºC; und

(f) stabiler Temperaturbereich: das Enzym ist bei einer Temperatur unterhalb 40ºC stabil,

wobei die biologisch aktive Polysaccharid-RON-Substanz die folgenden Eigenschaften hat:

(1) Form: die Substanz ist ein weißes amorphes Pulver, das keinen Geschmack und keinen Geruch hat;

(4) Saccharid-Bestandteil: die Substanz besteht nur aus Glucose;

(6) Struktur: die Substanz ist ein α-1,6-Glucan und enthält eine geringe Menge an 3,6-verzweigten Seitenketten;

(7) Proteine: die Substanz enthält nahezu keine Proteine;

(8) Molekulargewicht: die Substanz durchdringt nicht eine Dialysemembran und das Molekulargewicht ist, wie angenommen wird, höher als 10 000 Dalton;

(9) spezifische Drehung: [α]D25 = +190º bis +220º (C=0,5, Formamid);

(11) Schmelzpunkt: die Substanz hat keinen definierten Schmelzpunkt;

(15) biologische Aktivität: die Substanz weist eine Antitumor-Aktivität auf.

3. Biologisch aktive Polysaccharid-RON-Substanz-Synthetase nach Anspruch 2, erhältlich durch Kultivieren eines die biologisch aktive Polysaccharid-RON-Substanz bildenden Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum, Stamm BL-75 (FERM BP-2242), Stamm NCFB 517 (FERM BP-2711), Stamm NCFB 531 (FERM BP-2712), Stamm NCFB 861 (FERM BP-2713), Stamm NCFB 864 (FERM BP-2714), Stamm NCFB 880 (FERM BP-2715), Stamm 46-1 (FERM BP-2670), Stamm ATCC 1956 und Stamm IFO 3349 und Mutanten davon, in einem Medium, das Saccharose als Kohlenstoffquelle enthält, und Abtrennen (Gewinnen) des Enzyms aus den Zellen oder der überstehenden Flüssigkeit.