SE439647B - Kontinuerligt forfarande for framstellning av dextran - Google Patents

Description

l0 20 25 30 35 8201021-6 och mikroorganismer eller enzymer och kontinuerlig avtappning den dextranhaltiga reaktionsblandningen ett dextran erhålles, vilket har en för klinisk användning lämplig molekylvikt.

Det visar sig nämligen att vid kontinuerlig drift det erhållna dextranet till övervägande delen har en molekylvikt som under- stiger ca 300 000 och oftast understiger ca 100 000.

Det är att föredra att fermentativt framställa dextranet, varvid den avtappade reaktionsblandningen underkastas cellav- skiljning. Denna cellavskiljning i anslutning till förfarandet enligt föreliggande uppfinning är praktiskt enklare att utföra än vad fallet är vid konventionell dextranframställning på grund av att den erhållna reaktionsblandningen har lägre vis- kositet, varigenom cellerna sålunda lättare kan avskiljas.

Efter cellavskiljningen utvinnes dextranet ur reaktionsbland- ningen genom utfällning, exempelvis genom tillsats av etanol.

Eftersom dextranets löslighet i etanol är starkt beroende av molekylvikten kan medelst etanol även fraktíonering av dex- tranet efter molekylvikt utföras, vilket i och för sig utgör konventionell teknik.

Förfarandet enligt uppfinningen utföres i övrigt på tradi- tionellt sätt, och vilken som helst dextranproducerande organísm kan utnyttjas vid förfarandet. Det är emellertid att föredra att använda en organism av släktet Leuconostoc, speciellt arten Leuconostoc mecenteroides. Vid den nedan redovisade praktiska utföringsformen har använts stammen Leuconostoc mecenteroídes NRRL B5l2, men uppfinningen är naturligtvis ingalunda inskränkt till utnyttjning av just denna stam.

I anslutning till förfarandet enligt föreliggande uppfin- ning kan enzymproduktionen eller cellodlingen genomföras sats- vis eller kontinuerligt i enlighet med konventionell teknik.

Substratet för enzymproduktíonen innehåller sackaros, lämpligen i en mängd inom intervallet 10 till 50 g/liter, jämte jästextakt och andra kvävesubstanser och tillväxtfaktorer i enlighet med konventionell teknik. Oorganiska salter täcker behovet av mag- nesium, fosfor, svavel, spårelement etci och kan varieras med avseende på komponenter och koncentrationer.

Sterilisering kan ske på känt sätt, exempelvis genom sterilfiltrering, eller på annat sätt. Enzymproduktionen utföres lämpligen inom temperaturintervallet 10 till 50°C, före- 10 15 25 30 8201021-6 trädesvis 23 till SOOC. Odlingen utföres lämpligen utan eller med endast måttlig luftníng.

Cellodlingen utföres lämpligen inom pH-intervallet 5,5 till 8,0, speciellt 6,2 till 7,0. Vid satsvis odling utan pH-regle- ring ígångsättes odlingen vid pH ca 6,8, varvid pH spontant fal- ler till ca 5,0 vid odlingens slut. Om kultur- eller enzymlös- ning skall lagras bör pH sänkas till ca 5,0 och temperaturen hållas vid ca 4°C för att aktivítetsförluster skall undvikas.

Vid tillämpning av kontinuerlig cellodling kan utspädnings- hastigheten, dvs. förhållandet mellan ingående flöde och vätske- volym i reaktionskärlet, varieras mellan 0,05 och 0,7 tim_1, fö- Tßträdeåvíß 210,1 tim_1, varigenom höga enzymaktiviteter kan uppnås.

Dextransyntesen utförd i enlighet med uppfinningen sker kontinuerligt med kontinuerlig tillförsel av substrat och enzym- lösning (med eller utan celler) till en vätskevolym i reaktions- kärlet som hålles konstant medelst avtappning av dextranhaltig reaktionsblandning. Syntesen utföres lämpligen i ett reaktions- kärl utrustat med omrörare och med organ för temperatur- och pH- reglering.

Substratets sackaroskoncentration kan variera fritt upp till ca 70 viktprocent. Sackaroskoncentratíonen för i reaktionskär~ let ingående blandning, dvs. kvoten av ingående substratflöde och totalt ingående flöde gånger substratets sackaroskoncentra- tion, bör dock företrädesvis inställas på ca 10 till 25%, så att den motsvarande dextrankoncentrationen blir lämplig för den senare utvinníngen. âßrilisering av substratet sker enligt känd teknik och kan eventuellt kompletteras med eller ersättas av sterilskydd i reaktionskärlet, exempelvis tillsats av toluen, vilket ej ska- dar enzymet.

Dextransyntesen drives vid en temperatur lämpligen inom intervallet 10 till 50%, företrädesvis 15 till zs°c. pn i. reaktionszonen inställes lämpligen inom intervallet 4,0 till 8,0, företrädesvis 4,8 till 0,0.

Utspädningshastígheten, dvs. kvoten av totalt ingående Flöde och vätskevolym i reaktionskürlet, anpassas till enzym- aktíviteten och sackaroskoncentration i ingående blandning så att merparten av sackarosen, dvs. 80 till 95%, är omsatt till 10 8201021-6 4 dextran i den utgående reaktionsblandningen.

Genom att välja sådana parametrar som utspädningshas- tighet, temperatur, sackaroskoncentration i ingående blandning etc., på lämpligt sätt kan den högmolekylära fraktionen väsent- ligt reduceras och molekylviktsfördelningen hos det producerade dextranet i övrigt optimeras.

Såsom tidigare nämnts erhålles genom att viskositeten på reaktionsblandningen från reaktionskärlet är relativt måttlig den fördelen, att bakterieceller kan avskiljas genom filtrering eller centrifugering. Detta är såsom nämnts en ytterligare för- del jämfört med konventionell satsvis dextranjäsning, där den I höga viskositeten hos produkten omöjliggör sådan separation. 15 25 30 35 40 Efter cellavskiljningen kan dextranet utvinnas på konven- tionellt sätt, exempelvis medelst fraktionerad utfällning med etanol, metanol eller dylikt. Fraktioner i önskade molekyl- viktsintervaller omfälles ett antal gånger, lösningsmedlet av- skiljes och efter eventuell ytterligare rening kan om det är önskvärt dextranet spraytorkas. Ett eventuellt lågt innehåll av högmolekylär dextranfraktion kan hydrolyseras på konven- tionellt sätt om den erhållna mängden är tillräcklig för att detta skall vara ekonomiskt intressant. Emellertid möjliggör tekniken enligt föreliggande uppfinning framställning av dex- tran med en molekylvikt som till övervägande delen lämpar sig för klinisk användning.

I samband med uppstartningen av processer vid tillämpning av förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan fortvarighets- tillstånd snabbare uppnås om reaktionskärlet i förväg tillföres färdig dextranvolym, substrat och cellkultur resp. enzymlösning till den volym och i de proportioner som motsvarar tillståndet vid kontinuerlig drift. Uppfinningen kommer i det följande att beskrivas genom icke inskränkande exempel i anslutning till bilagda ritning, där: Pig. 1 visar ett diagram över mängden utfällt doxtran som funktion av etanolkoncentrationen; Pig. 2 visar ett diagram över eluering av dextran från Sepharos 4 B med mängd elucrat dextran som funktion av clue- ringsvolymen; och Fig. 3 visar molekylviktsfördelningen hos enligt uppfinning- CH fTflmSfiä1lt dflxträn och hos på marknaden förekommande kliniskt dextran. 10 15 20 25 35 8201021-6 I exemplen avser angivna procenttal vikten om ej annat anges.

EXEMPEL l Enzymproduktion Substrat: Sackaros 20 g/1 Jästextrakt 2 g/l KHZPO4 1 g/1 MgSO4.7H2O 0,2 g/1 NaC1 0,01 g/1 FeSO4.7HzO 0,01 g/1 MnSO4.H2O 0,01 g/1 pH justeras till 6,7-6,8.

Substratkomponenterna löstes i avjoniserat vatten i ovan- stående koncentrationer och autoklaverades vid l2l°C, 30 min.

Efter ínokuleríng med 100 ml ympkultur av Leuconostoc mesente- roides B5l2 uppodlad på substrat av samma sammansättning ínku- berades i en Z l fermentor (vätskevolym = 1 liter) med omrör- ning och pH-reglering. pH hölls vid 6,7 och temperaturen vid 25°c.

Efter satsvis uppodling under 24 timmar startades kontinu- erligt substrattíllflöde = 95 ml/tim och ett lika stort utgående flöde från fermentorn (konstant vätskevolym i fermentorn). Efter ca l dygn erhölls i centrifugerad, cellfrí lösning en dextran- sukrasaktívitet av ca 25 DSU-enheter (l DSU-enhet = den mängd dextransukras som producerar l mg fruktos (red.socker] ur sackaros på en timme vid 2300, pH = 5,2) som sedan kunde upprätt- hållas i mer än 10 dygn.

Dextransyntesen genomfördes i ett 8 l fermentationskärl med omrörare och pH-reglering (pH = 5,2) och kontinuerliga tíllflö- den av ovanstående enzymlösning (125 ml/tim) och steril 22% sackaroslösning (250 ml/tim). Temperaturen hölls vid Z3°C.

Vätskevolymen i kärlet hölls konstant vid 4 1 medelst ett brädd- avlopp. _ Analys av utgående flöde visade vid fortvarighetstíllstånd stånd en dextranhalt motsvarande 80-90% utbyte av det teoretiskt beräknade (1 g sackaros kan teor. ge 0,47 g dexfran). Den ut- gående lösníngen var relativt lågviskös (jämfört med den som er- hölls vid satsvís jäsning enligt exemplet 2) och dextranet upp- 10 15 20 25 35 8201021-6 visar, efter rening från fruktos etc. genom upprepade omfäll- ningar med etanol, en gränsviskositet'2 = 0,40. Detta kan jäm- föras med'É = 1,1 som normalt erhålles för dextran framställt med konventionellt satsvis förfarande (se exempel 2, molvikt :>1o6) resp.^g = o;z1, 0,26, 0,31, 0,36, 0,42, 0,52 för dex- _tranpreparat erhållna efter syra-hydrolys och noggrann fraktio- nering (Pharmacia-produkter T40, T70, 110, Tl50, T250, T500) med medelmolekylvikter MW = 41 800, 67 600, 100 500, 147 000, 243 000 resp. 510 000.

Det kontinuerliga förfarandet enligt uppfinningen ger så- lunda en betydligt lägre medelmolekylvíkt än det satsvisa för- farandet och i stort sett överensstämmande med det för klinisk användning aktuella området.

Närmare undersökning medelst analytisk fraktionerad ut- fällning med etanol (fíg. 1) resp. gelfíltreríng (fig. 2) på Sepharos 4B-kolonn avslöjar en bimodal molekylviktsfördel- ning med en mindre fraktion i det högmolekylära området (MW 7*l06) och merparten i det för klinisk användning aktuella området.

Den lågmolekylära fraktionen (molvikt i själva verket en mol-viktsfördelníng som nära ansluter till de kliniska preparaten dextran 40 och dextran 70 (fig. 3).

EXEMPEL 2: SATSVIS DEXTRANJÄSNING (REFERENS) Substrat: Sackaros 120 g/l Jästextrakt 0,5 g/l KHZPO4 0,5 g/l pH justeras till 6,8-7,0. 1,5 liter substrat i en Z liters kolv autoklaverades vid l2l°C under 20 min. Det ínokuleras med 30 ml av en ympkultur (Leuconostoc mesenteroides B5l2) uppodlad vid ZSOC, 36 tim på samma substrat kompletterat med pepton l g/l, MgS04.7H2O 0,2 g/l.

Efter 48 timmars inkubering vid ZSOC stillastående utan luftning hade pH sjunkit till 4,8 och en högviskös lösning er- hållits. Analys visade en dextranhalt motsvarande 88% av det teoretiskt beräknade, Dextranet var av högmolekylär typ och mo lvikten var 7 106 .

Det bör observeras, att uppfinningen ingalunda är inskränkt 8201021-6 till ovan beskrivna exempel som endast är avsedda att i1lustre~ ra uppfinningens praktiska tillämpning. Sålunda kan andra dextranproducerande mikroorganismer användas, substratens sam- mansättníng kan varieras och försöksparametrarna i övrigt modifieras.

Claims (9)

18201021-6 PATENTKRAV

1. l. Förfarande för att medelst mikroorganismer eller enzymer framställa dextran med en för klinisk användning lämp- lig molekylvikt utgående från ett sackaroshaltígt substrat, k ä n n e t e c k n a t därav, att den utföres kontinuerligt Kunder kontinuerlig tillförsel av substrat och mikroorganismer eller enzymer och kontinuerlig avtappníng av dextranhaltig reaktionsblandning, ur vilken dextranet därefter tíllvaratages.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t därav, att det utföres på fermentativ väg under utnyttjning av en dextranproducerande art av Leuconostoc.

3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t ,därav, att man utnyttjar arten mesenteroídes.

4. Förfarande enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t därav, att man utnyttjar stammen Leuconostoc mesenteroidesNRRL B5l2.

5. Förfarande enligt något av föregående krav för att fermentativt framställa dextran, k ä n n e t e c k n a t därav, att den avtappade reaktionsblandningen underkastas cell- avskiljning och därefter dextranutfällning.

6. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n- n e t e c k n a t därav, att odling av mikroorganismer för enzymproduktionen utföres kontinuerligt jämsides med dextran- framställningen.

7. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n- n e t e c k n a t därav, att det utföres vid en temperatur inom intervallet ca 10-50°C.

8. Förfarande enligt något av föregående krav för fram- ställning av dextran som till övervägande delen har en molvíkt understigande ca 300 000.

9. Förfarande enligt något av föregående krav, k ä n- n e t e c k n a t därav, att man för snabbare uppnående av fortvarighetstillstånd i samband med uppstartandet av proces- sen tíll reaktionszonen sätter dextran av önskad molvíkt och övriga komponenter till önskad volym och i önskade propor- tioner.