DE69015361T2 - Lichtaktivierte acylenzyme. - Google Patents

Lichtaktivierte acylenzyme.

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Description

    Anerkennung
  • Diese Erfindung wurde mit Unterstützung von Geldern der Regierung der Vereinigten Staaten gemacht. Die Regierung hat unter Umständen gewisse Rechte an dieser Erfindung.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Lichtaktivierbare Enzyme sind von Interesse als chemische Lichtverstärker und als photoaktivierbare therapeutische Mittel. Als Lichtverstärker macht die Fähigkeit eines einzigen lichtaktivierten Enzyms, tausende von Molekülen pro Minute umzuwandeln, siehe insgesamt D. Hug, 6 Photochem. Photobiol. Rev. 87 (1981) sie als Schalter in Systemen, wie diagnostischen Untersuchungen in vitro attraktiv. Therapeutische Verwendungen sind deshalb möglich, weil die Haut nicht nur von Blut stark durchströmt ist, sondern auch für Lichtbehandlung zugänglich, siehe insgesamt J. Parrish, 77 J. Invest. Dermatology 45 (1981).
  • S. Varfolomeyev et. al., 15 FEBS Lett. 118 (1971) beschreiben die Bildung von Acylenzym zwischen α-Chymotrypsin und dem p-Nitrophenylester von p-Nitro-Trans-Zimtsäure (siehe Formel I, in der 'ENZ" Chymotrypsin ist).
  • Die Bindung zwischen dem Enzym und der Acylgruppe geschieht mit der Hydroxylgruppe des Serins im katalytischen Zentrum des Enzyms, siehe auch I. Berezin et al., 8 FEBS Letters 173 (1970); K. Martinek et al., 29 Photochem. und Photobiol. 637 (1979); I. Berezin et al., 2 Enzyme Microb. Technol. 150 (1980); und N. Kazanskaya et al., 5 Enzyme Microb. Technol. 209 (1983). Diese Ansätze verlassen sich allein auf Sterineffekte zum Unterscheiden von Photoisomeren. Insgesamt ist das cis-Cinnamoyladdukt stabiler als der trans- Komplex, aber in manchen Fällen ist dieser Unterschied nur fünffach.
  • A. Turner et al., 109 J. Am. Chem. Soc. 1274 (1987) beschreiben die Bildung eines Acylenzyms zwischen α-Thrombin und dem trans-Isomer von O-Hydroxyl-α-Methylzimtsäure (siehe Formel II, in der ENZ Thrombin ist).
  • Die Bindung zwischen dem Enzym und der Acylgruppe entsteht so, daß die Hydroxylgruppe des Serins sich im katalytischen Zentrum des Enzyms befindet, siehe auch A. Turner et al., 110 J. Am. Chem. Soc. 244 (1988). Diese Verbindung enthielt an der Acylgruppe eine Hydroxylgruppe als internes Nukleophiles, welches bei der Photoisomerisierung zu einer Deacylierung durch den Angriff des internen Nukleophilen auf den dem Sauerstoff der Serinhydroxylgruppe benachbarten Karbonylsauerstoff führt.
  • Die Hemmung der Enzymaktivität im Acylenzym der Formel II ist vorübergehend, und nach einigen Stunden im Dunkeln kehrt die Enzymaktivität zurück. Ferner ist die Photoaktivierung dieser Enzyme langsam und erfordert solche Lichtstärken und Wellenlängen, daß ein nennenswerter Enzymabbau während der Photoaktivierung entsteht. Folglich besteht Bedarf an neuen Ansätzen in der Entwicklung lichtaktivierter Acylenzyme. Die vorliegende Erfindung beruht auf unserer fortgesetzten Forschung auf diesem Gebiet.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Hier werden lichtaktivierte Acylenzyme der folgenden Formel offenbart:
  • ENZ ist ein Enzym, welches aus der aus Serinproteinasen und Cysteinproteinasen bestehenden Gruppe ausgewählt ist. X ist der Sauerstoff der Hydroxylgruppe im katalytischen Zentrum von ENZ, wenn ENZ eine Serinproteinase ist, und X ist der Schwefel der Sulfhydrylgruppe im katalytischen Zentrum von ENZ, wenn ENZ eine Cysteinproteinase ist.
  • Y ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus -NR&sub3;R&sub4;, -OR&sub5; und -SR&sub5; besteht. Y ist vorzugsweise -NR&sub3;R&sub4;.
  • Z ist ein Nukleophiles, welches aus der aus -OH, -SH, -NH&sub2; und -NHR&sub6; bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin R&sub6; C1- bis C4-Alkyl ist. Vorzugsweise ist Z aus der aus -OH und -SH bestehenden Gruppe ausgewählt.
  • m ist 0 bis 3. m ist vorzugsweise 0 bis 1 und am meisten bevorzugt ist m 0.
  • n ist 1 oder 2 unter dem Vorbehalt, daß Y in dem Ring an der 4er Stelle, der 6er Stelle oder sowohl der 4er und der 6er Stelle substituiert ist. n ist vorzugsweise 1. Noch mehr bevorzugt wird, wenn n 1 und Y im Ring an der 4er Stelle substituiert ist. Zusammengenommen sind m und n nicht größer als 5.
  • R&sub1; ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus H, C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Alkenyl und C3- bis C4- unkonjugiertem Alkynyl besteht. Vorzugsweise ist R&sub1; 01 bis C4- Alkyl, und am meisten bevorzugt ist R&sub1; Methyl.
  • R&sub2; ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus H, C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Alkenyl und C3- bis C4- unkonjugiertem Alkynyl besteht. Vorzugsweise ist R&sub2; H oder C1- bis C2-Alkyl und am meisten bevorzugt ist R&sub2; H.
  • R&sub3; ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus H, C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Alkenyl und C3- bis C4- unkonjugiertem Alkynyl besteht.
  • R&sub4; ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus C1- bis C4- Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Alkenyl und C3- bis C4- unkonjugiertem Alkynyl besteht. Vorzugsweise sind R&sub3; und R&sub4; jeweils unabhängig C1- bis C2- Alkyl.
  • R&sub5; ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus C1- bis C4- Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Alkenyl und C3- bis C4- unkonjugiertem Alkynyl besteht. Vorzugsweise ist R&sup5; C1- bis C4- Alkyl. Am meisten bevorzugt ist R&sub5; Methyl.
  • Die Acylenzyme werden verwendet, um ein aktives Enzym, ausgewählt aus der aus Serinproteinasen und Cysteinproteinasen bestehenden Gruppe zu erzeugen, indem ein Acylenzym der Formel (III) Licht einer Frequenz und Intensität ausgesetzt wird, die ausreichen, um eine trans-cis-Photoisomerisierung des Acylenzymes zu induzieren. Danach wird das Acylenzym durch nukleophilen Angriff von Z auf den X benachbarten Karbonylsauerstoff gespalten, um das Enzym in aktiver Form zu erzeugen.
  • Gleichfalls offenbart werden hier Verbindungen (oder "Inhibitoren"), die als Intermediärprodukte zum Herstellen von Acylenzymen gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind und deren Formel folgende ist:
  • worin A aus der Klasse ausgewählt ist, die aus
  • besteht, worin B eine Valenzbindung oder -N- ist, und worin Y, Z, R&sub1; und R&sub2; das gleiche sind wie im Zusammenhang mit den Acylenzymen der Formel (III) oben angegeben. Salze der Verbindungen der Formel (IV) werden gleichfalls offenbart.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Acylenzyme der vorliegenden Erfindung werden durch Umsetzung einer Serinproteinase oder Cysteinproteinase mit einem geeigneten Hemmstoff gemacht. Der Hemmstoff weist die Acylgruppe der Acylenzyme der Formel (III) in kovalenter Vereinigung mit einer geeigneten, verlassenden Gruppe auf. Die verlassende Gruppe ist so gewählt, daß sie sich an die aktive Stelle des Enzyms bindet und damit ein Michaelis-Menten Zwischenprodukt erzeugt. Die Reaktion kann in wässriger Lösung entsprechend den zum Verbinden der verlassenden Gruppe allein mit dem Enzym angewandten Verfahren durchgeführt werden. Sobald das Michaelis-Menten Intermediärprodukt entstanden ist, wird das Acylenzym durch nukleophilen Angriff der Hydroxyl- oder Sulfhydrylgruppe im katalytischen Zentrum des Enzyms auf den Karbonylsauerstoff der Acylgruppe gebildet. Dadurch entsteht ein Ester zwischen dem Enzym und der Acylgruppe, während die verlassende Gruppe vom Hemmstoff abgespalten wird.
  • Zu exemplarischen Serinproteinasen gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: Chymotrypsin, Chymotrypsin C, Metridium Proteinase A, Trypsin, Thrombin, Koagulationsfaktor Xa, Plasmin, Enteropeptidase, Acrosin, Myxobacter α-lytische Proteinase, Subtilisin, E. coli periplasmische Proteinase, Aspergillus alkalische Proteinase, Tritirachium alkalische Proteinase, Arthrobacter Serinproteinase, Pseudomonas Serinproteinase, Thermomycolin, thermophilische Streptomyces Serinproteinase, Candida lipolytica Serinproteinase, Alternaria Serinproteinase, Tenebrio α-Proteinase, Staphylokokkenserinproteinase, Cathepsin G, Koagulationsfaktor VIIa (Rind), Koagulationsfaktor IXa, Vipera russelli Proteinase, erythrozytenneutrale Endopeptidase, Cucumisin, Prolylendopeptidase, Koagulationsfaktor XIa, Agkistrodon Serinproteinase, Bothrops atrox Serinproteinase, Crotalus adamanteus Serinproteinase, Plasminogenaktivator (zum Beispiel Gewebsplasminogenaktivator, Urokinase, Streptokinase), Uca pugilator kollagenolytische Proteinase, Entomophthora kollagenolytische Proteinase, Plasmakallikrein, Gewebskallikrein, pankreatische Elastase, Leukozytenelastase, Koagulationsfaktor XIIa, Chymase, submandibulare Proteinase A, Komplementunterkomponente, Komplementunterkomponente, klassische Komplementleitungspfad-C3/C5-Convertase, Komplementfaktor I, Komplementfaktor D, alternative Komplementleitungspfad-C3/C5-Convertase, Hefeproteinase B, Hypoderma Collagenase, Achromobacter Proteinase I, leukozytenmembranneutrale Endopeptidase und Cathepsin R, siehe allgemein Enzyme Nomenclature 1984: Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry on the Nomenclature and Classification of Enzyme- Catalysed Reactions (Academic Press, Inc. 1984) (nachfolgend "Enzyme Nomenclature 1984").
  • Zu exemplarischen Cysteinproteinasen gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Cathepsin B, Papain, Ficin, Bromelain, Komplementkomponente -C3/C5-Convertase, Saccharomyces cerevisiae Proteinase, lysylbindungsspezifische Proteinase, ribosomales Cathepsin, Cathepsin B1, Papaya Peptidase 1, Chymopapain, Asclepain, Clostripain, Streptokokkencysteinproteinase, gamma-Glutamylhydrolase, Staphylokokkencysteinproteinase, Actinidin, Cathepsin L, Cathepsin H, Calpain, Proylendopeptidase (Thiol-abhängig) Clostridiopeptidase B, Streptokokkenproteinase, Conjugase, Staphylokokkenproteinase II, Actinidia anionische Proteinase, Cathepsin B&sub3; und Prolyl-(D,L)-Alanin-Peptidylhydrolase, siehe insgesamt Enzyme Nomenclature 1984.
  • Die Serinproteinasen werden zur Verwirklichung der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Mehr bevorzugt werden die Serinproteinasen der aus folgendem bestehenden Gruppe: Trypsin, Chymotrypsin, Thrombin, Plasmin, Acrosin, Koagulationsfaktor IX, Koagulationsfaktor X, Koagulationsfaktor XI, Koagulationsfaktor XII, Plasminogenaktivator, Plasmakallikrein, Gewebskallikrein, Pancreaselastase und Leukocytenelastase.
  • Bei der Verwirklichung der Erfindung verwendete Proteinasen können entweder natürliche Proteinasen oder Derivate von Nativproteinasen sein. Ableitungen natürlicher Proteinasen sind Proteinasen, bei denen den in den natürlichen Proteinasen vorkommenden Aminosäuren Aminosäuren hinzugefügt oder von diesen entfernt oder geändert werden. Die katalytische Aktivität der abgeleiteten Proteinasen kann entweder die gleiche sein wie die katalytische Aktivität der entsprechenden nativen Proteinase oder sich von dieser unterscheiden. Nötig ist nur, daß die abgeleitete Proteinase eine Aktivität als Proteinase beibehält und im katalytischen Zentrum des Enzyms entweder eine Serin- oder eine Hydroxylgruppe beibehält.
  • Jede Gruppe, die einen Michaelis-Menten-Komplex mit dem Enzym bilden kann, welches zur Erzeugung des Acylenzyms benutzt wird, und die mit der Acylgruppe, die dem Enzym hinzugefügt werden soll, einen Ester bilden kann, läßt sich als die verlassende Gruppe verwenden. So ist beispielsweise von Imidazolderivaten bekannt, daß sie gute Substrate für α-Chymotrypsin bilden. Die Gruppe in Leipzig unter der Leitung von Markwardt hat mehrere Dutzende von Hemmstoffen zubereitet und mit Trypsin, Plasmin und Thrombin untersucht, siehe insgesamt F. Markwardt et al., 29 Pharmazie 333 (1974); G. Wagner et al., 28 Pharmazie 293 (1973); J. Sturzebecher et al., 35 Acta Biol. Med. Germ. 1665 (1976); P. Walsmann, 109 Folia Haematol., Leipzig 75 (1982); V. Valenty et al., 88 Biochem. Biophys. Res. Comm. 1375 (1979); F. Markwardt et al., 28 Acta Biol. Med. Germ 19 (1972). Hierbei handelt es sich um Verbindungen, die zu stabilen Carboxylatestern des enzymaktiven Serins oder Cysteins führen. Weitere Hemmstoffe, die untersucht worden sind, schließen Verbindungen ein, die mit dem Enzym unter Erzeugung stabiler Sulfonat- oder Phosphatester reagieren, siehe R. Laura et al., 19 Biochemistry 4859 (1980); S. Wong und E. Shaw, 161 Ann. Biochem. and Biophys. 536 (1974). So reagiert Phenylmethansulfonylfluorid unter Erzeugung eines kovalenten Komplexes mit Chymotrypsin, und Benzolsulfonylfluorid reagiert insgesamt mit Trypsin, Thrombin, Faktor X&sub2;, Kallikrein sowie Plasmin unter Erzeugung von Serinacylderivaten, siehe A. Gold und D. Fahrney, 3 Biochemistry 783 (1964). Disopropylfluorphosphat reagiert mit Serinproteinasen und Esterasen, und dieser Stoff wird bereits weit verbreitet als irreversibler Inhibitor verwendet, siehe P. Bracha und R. O'Brien, 9 Biochemistry 741 (1970). Tatsächlich sind zahlreiche Verbindungen mit der Struktur R-O-P- (=0) (-X)-R' Hemmstoffe, wobei R eine Aryl- oder Alkyl- gruppe ist, R' eine Aryloxy-, Alkoxy-, Aryl-, Alkyl- oder substituierte Aminogruppe und X eine verlassende Gruppe ist (Gruppen in Klammern sind wie angegeben an das letzte vorhergehende, nicht in Klammern stehende Atom gebunden).
  • Bevorzugte Hemmstoffe sind in Formel (IV) angegeben. Unter den bevorzugten Hemmstoffen werden diejenigen, bei denen p- Nitrophenyl die verlassende Gruppe ist, für die Herstellung von Acylenzymen mit Verdauungsenzymen, beispielsweise Trypsin und Chymotrypsin bevorzugt. Diejenigen Hemmstoffe, in denen entweder 4-Amidinophenyl oder 4-Guanidinophenyl die verlassenden Gruppen sind, werden für die Herstellung von Acylenzymen mit Koagulationsenzymen, wie Thrombin, Plasmin, Koagulationsfaktor IX&sub2;, Koagulationsfaktor X&sub2;, Koagulationsfaktor XI&sub2;, Koagulationsfaktor XII&sub2; und Plasminogenaktivator bevorzugt.
  • Die folgenden Verbindungen sind exemplarische Hemmstoffe, die als Intermediärprodukte zur Schaffung von Acylenzymen gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Diese Verbindungen können durch Befolgung der Lehre der unten angegebenen Beispiele im Zusammenhang mit bekannten Verfahren geschaffen werden.
  • (1) 2-Propensäure, 3-(2-Mercapto-4-Diethylaminophenyl)-2- Methyl-,4-(Aminoiminomethyl)-Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (2) 2-Propensäure, 3-(2-Amino-4-Diethylaminophenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl)-Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (3) 2-Propensäure, 3-(2-Methylamin-4-Diethylaminophenyl)- 2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl)-Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (4) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-6-Diethylaminophenyl)-2- Methyl-,4-(Aminoiminomethyl)-Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (5) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4,6- bis (Diethylaminophenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (6) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylamino-5-Methylphenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (7) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylamino-5, 6-Dimethylphenyl)-2-Methyl-, 4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (8) 2-Propensaure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylamino-3,5,6- Trimethylphenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (9) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (10) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- Ethyl-, 4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (11) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- Propyl-,4- (Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (12) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- Butyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (13) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- (-2-Propenyl)-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (14) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- (3-Butenyl)-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (15) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- (2-Butenyl)-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (16) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- (2-Propenyl)-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (17) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- (3-Butynyl)-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (18) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- (2-Butynyl)-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (19) 2-Butensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2-(2- Methyl)-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (20) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (21) 2-Hexensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (22) 2-Heptensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (23) 2,5- Hexadiensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (24) 2,6-Heptadiensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (25) 2,5-Heptadiensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (26) 2-Penten-5-ynsäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (27) 2-Hepten-6-ynsäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (28) 2,6-Hepten-5-ynsäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (29) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Ethylaminophenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (30) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Ethylpropylaminophenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (31) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Butylethylaminophenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (32) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Dimethylaminophenyl)-2- Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (33) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Ethyl) (2-Propenyl) (Aminophenhyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (34) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Ethyl) (3-Butenyl) (Aminophenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoimino-methyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (35) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Ethyl) (2-Butenyl) (Aminophenyl)-2-Methyl-,4- (Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (36) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Ethyl) (2-Propynyl) (Aminophenyl)-2-Methyl-,4- (Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (37) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Ethyl) (3-Butynyl) (Aminophenyl)-2-Methyl-,4- (Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (38) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Ethyl) (2-Butynyl) (Aminophenyl)-2-Methyl-,4- (Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (39) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- Methyl-,4- (Aminoimimetyhlamino)-Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz.
  • (40) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2- Methyl-,4- (Aminoimimetyhlamino)-Phenylester, (E)-, Monoessigsäuresalz.
  • Die Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung können in Form von Salzen vorgelegt werden. Zu geeigneten Salzen gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Salze der (a) anorganischen Säuren, wie Hydrochlor-, Hydrobrom-, Schwefel- und Phosphorsäure, (b) organischer Säuren, wie Isethion- (2-Hydroxyethylsulfon-) Malein-, Malon-, Bernstein-, Salizyl-, Weinstein-, Milch-, Zitronen-, Ameisen-, Milchzucker-, Pantothen-, Methansulfon-, Ethansulfon-, Benzolsulfon, p-Toluolsulfon-, Napathalen-2-Sulfon- und Ascorbinsäure, sowie (c) Aminosäuren, wie Glycin. Die Säure muß nur dann eine pharmazeutisch akzeptable Säure sein, wenn die Verbindung zur Verabreichung an einen Menschen gedacht ist.
  • Acylenzyme der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, indem das Acylenzym in einer wässrigen Lösung vorgelegt wird, wobei ein Substrat für das Enzym in der Lösung vorgesehen und die Lösung Licht ausgesetzt wird. Das Substrat erfährt eine Umsetzung, die von dem freien Enzym katalysiert wird, nachdem das Acylenzym Licht ausgesetzt wurde. Die Acylenzyme können entweder in vivo oder in vitro Licht ausgesetzt werden. Bei Verwendung in vitro können sie unter anderem als Lichtverstärker oder Lichtschalter verwendet werden. So könnte zum Beispiel eine diagnostische Untersuchung durch Licht geschaltet werden, indem Reagentien, einschließlich des Acylenzyms und eines Substrats für das Enzym gemischt werden und dann das Enzym mittels Licht aktiviert wird. Das bietet eine Möglichkeit, zahlreiche Proben für die Umsetzung vorzubereiten, wobei mehrfache Reaktionen längs eines gemeinsamen Zeitverlaufs ablaufen können, indem die Reaktionen gleichzeitig mit Licht ausgelöst werden.
  • Acylenzyme der vorliegenden Erfindung können dadurch aktiviert werden, daß sie Licht eines breiten Spektrums, gefiltertem Licht oder monochromatischem Licht ausgesetzt werden. Eine solche geeignete Lichtquelle ist eine Hochdruckquecksilberlampe, gefiltert oder ungefiltert, von 500 Watt. Vorzugsweise werden Wellenlängen von ca. 300 Nanometer oder weniger aus dem Licht ausgefiltert, dem die Acylenzyme ausgesetzt werden, um die Absorption durch das Enzym und die Lichtinaktivierung des Enzyms selbst auf ein Minimum einzuschränken. Hintergrund licht von geringer Intensität kann hingenommen werden. Es wird am meisten bevorzugt, die Acylenzyme dadurch zu aktivieren, daß sie monochromatischem Licht einer Wellenlänge ausgesetzt werden, die etwa dem Absorptionsmaximum der Acylgruppe entspricht.
  • Um bestimmte Aspekte und Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung besser zu veranschaulichen, werden die folgenden Beispiele gegeben. Diese Beispiele dienen lediglich der Illustration und sind nicht als die Erfindung einschränkend aufzufassen.
    • Beispiele
  • Die Synthese der folgenden Verbindungen wird in den Beispielen 1 bis 8 offenbart:
  • (A) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-5-Methoxyphenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz (oder 4-Amidinophenyl-(E)-2-Hydroxy-5-Methoxy- α-Methylcinnamathydrochlorid);
  • (B) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-5-Methoxyphenyl)-2-Methyl- ,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz (oder 4-Amidinophenyl-(E)-2-Hydroxy-4-Methoxy- α-Methylcinnamathydrochlorid);
  • (C) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-5-Nitrophenyl)-2-Methyl-, 4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz (oder 4-Amidinophenyl-(E)-2-Hydroxy-5-Nitro-α-Methylcinnamat p-Toluolsulfonsäuresalz)
  • (D) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-3,5-Dimethoxyphenyl)-2-Methyl-, 4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz (oder 4-Amidinophenyl-(E)-2-Hydroxy-3,5-Dimethoxy-α-Methylcinnamathydrochlorid);
  • (E) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4,6-Dimethoxyphenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, Monohydrochloridsalz (oder 4-Amidinophenyl-(E)-2-Hydroxy-4,6-Dimethoxy-α-Methylcinnamathydrochlorid);
  • (F) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Dlmethoxyphenyl)-2-Methyl-,4-(Aminoiminomethyl) Phenylester, (E)-, MonohydrochlorIdsalz (oder 4-Amidinophenyl-(E)-2-Hydroxy-4-Diethylamino-α-Methylcinnamathydrochlorid);
  • (G) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxyphenyl)-2-Methyl, -4- Nitrophenylester, (E)- (oder 4-Nitrophenyl-(E)-2-Hydroxy-α-Methylcinnamat); und
  • (H) 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylamino-phenyl)-2- Methyl-,4-Nitrophenylester, (E)-, (oder 4-Nitrophenyl-(E)- 2-Hydroxy-4-Diethylamino-α-Methylcinnamat).
  • Die Verbindungen B, E, F und H sind Hemmstoffe, die als Intermediärprodukte zur Erzeugung von Acylenzymen der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
    • Beispiel 1 Synthese von 4-Amindinphenyl-(E)-2-Hydroxy-5-Methoxy-α-Methylcinnamathydrochlorid (Verbindung A) (a) Synthese von 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-5-Methoxyphenyl)-2-Methyl-, Ethylester, (E)- (oder Ethyl-(E)-2-Hydroxy- 5-Methoxy-α-Methylzimtsaures Salz).
  • 770,3 mg (5,06 mmol) 5- Methoxysalicylaldeyhyd in 20 mL Benzol bei Zimmertemperatur unter Argon wurden 2,20 g (6,08 mmol, 1,2 eq.) (Carbethoxyethyliden)-Triphenylphosphoran hinzugefügt. Nach einer Stunde wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und der Rest einer Schnellsäulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von 75/25 Hexan/Ethylacetat als Elutionsmittel unterzogen, was 1,06 gm (88 %) Produkt ergab; Schmelzpunkt 103-104º C. 300 MHz¹H-NMR (CDCL&sub3;) δ 7,71 (s, 1H, β-H) , 6,81 (m, 3H, aromatisch-H), 5,31 (s. 1H, phenolisch-H), 4,29 (q, 2H, OCH&sub2;CH&sub3; , J=7,1 Hz), 3,78 (s, 3H, OCH&sub3;), 2,04 (s, 3H, C=CCH&sub3;, 1,38 (t, 3H, OCH&sub2;CH&sub3;, J=7,1 Hz). ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ 168,42, 153,07, 147,63, 133,77, 130,79, 123,28, 116,52, 115,42, 114,73, 61,08, 55,79, 14,27, 14,23. UV- lambdamax=334 nm (EtOH). TLC; 70/30 Hexan/Ethylacetat, Rf=0,28. Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub6;O&sub4;; C, 66,09; H, 6,83. Gefunden: C, 65,96; H, 6,88.
    • (b) Synthese von 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-5-Methoxyphenyl-2-Methyl-, (E)- (oder (E)-2-Hydroxy-5-Methoxy-α-Methylzimtsäure).
  • Einer Rührlösung aus 318 mg (1,35 mmol) Ethyl-(E)-2-Hydroxy-5-Methoxy-α-methylzimtsaurem Salz in 16 mL 1:1 EtOH:H&sub2;O bei Zimmertemperatur wurden 318 mg (7,95 mmol, 6 eq.) frisch gemahlenes NaOH hinzugefügt. Die Reaktion wurde dann bei 60º C erwärmt. Nach 45 Minuten wurde die Wärme entfernt und die Lösung in einem Eisbad abgekühlt. Dann wurde die Reaktion mit 10 % HCl angesäuert und mit Ether extrahiert. Die organische Phase wurde mit 10 % HCl gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und in vacuo konzentriert und ergab 257,7 mg (92 %) Produkt; Schmelzpunkt 145-146º C. 300 MHz¹-H- NMR (CD&sub3;OD) δ 7,81 (s, 1H, β-H) 6,82 (m, 1H, aromatisch), 6,77 (m, 2H, aromatisch), 4,91 (s, 2H, OH), 3,72 (s, 3H, OCH&sub3;), 2,02 (s, 3H, C=CCH&sub3;). ¹³C- NMR (CD&sub3;OD) δ 172,19, 153,84, 150,95, 136,54, 129,06, 124,80, 117,13, 116,55, 116,07, 56,21, 14,42. TLC; 70/30 Hexan/Ethylacetat, Rf=0,07. Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub2;O&sub4;; C, 63,45, H, 5,81. Gefunden: C, 63,35, H, 5,84.
    • (c) Synthese von 4-Amidinphenyl-(E)-2-Hydroxy-5-Methoxy-α-Methylcinnamathydrochlorid.
  • Einer Rührlösung von 257,7 mg (1,24 mmol) (E)-2-Hydroxy-5-Methoxy-α-Methylzimtsäure in 8 mL trockenen Pyridins bei Zimmertemperatur unter Argon wurden 307 mg (1,49 mmol, 1,2 eq.) DCC gefolgt vom 235 mg (1,36 mmol, 1,1 eq.) p-Hydroxybenzamidinhydrochlorid hinzugefügt, siehe G. Wagner und H. Horn, 28 Pharmazie 427 (1973); M. Partridge und W. Short, J. Chem. Soc. 390 (1947). Nach 48 Stunden wurde die Lösung gefiltert, in vacuo konzentriert und einer Schnellsäulenchromathographie auf 12 % (w/w H&sub2;O) deaktiviertem Kieselgel unterzogen, wobei 90/10 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH als Elutionsmittel benutzt wurde, und ergab 294 mg (65 %) Produkt; Schmelzpunkt 225-226º C. 300 MHz¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ 8,09 (s, 1H, β-H), 7,89 (d, 2H, Amidinphenyl-H, J=8,6 Hz), 7,46 (d, 2H Amidinphenyl-H, J=8,6 Hz), 6,92 (d, 1H, aromatisch 3-Position, J=2,69 Hz), 6,83 (d, 1H, aromatisch 4-Position, J=2,69 Hz), 6,82 (s. 1H, aromatisch 6-Position), 4,88 (s, austauschbare-H's), 3,77, (s, 3H, OCH&sub3;), 2,19 (s, 3H, C=CCH&sub3;). ¹³C-NMR (CD&sub3;OD) δ 167,99, 157,31, 153,92, 151,35, 139,04, 130,65, 127,49, 126,85, 124,14, 124,10, 117,41, 117,27, 116,08, 56,29, 14,55. TLC; 77/23 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH, Rf=0,25. Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub9;N&sub2;O&sub4;Cl; C, 59,59; H, 5,28; N, 7,72. Gefunden: C, 59,62, 59,57; H, 5,36, 5,38; N, 7,67, 7,65.
    • Beispiel 2 Synthese von 4-Amindinphenyl-(E)-2-Hydroxy-4-Methoxy-α-Methylcinnamathydrochlorid (Verbindung B) (a) Synthese von 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Methoxyphenyl)-2-Methyl-, Ethylester, (E)- (oder Ethyl-(E)-2-Hydroxy- 4-Methoxy-α-Methylcinnamat).
  • Einer Rührlösung von 760,8 mg (5 mmol) 4-Methoxy-Salicylaldeyhyd in 20 mL Benzol bei Zimmertemperatur unter Argon wurden 2,718 g (7,5 mmol, 1,2 eq.) (Carbethoxyethyliden)-Triphenylphosphoran hinzugefügt. Nach zehn Minuten wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und der Rest einer Schnellsäulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von 80/20 Hexan/Ethylacetat als Elutionsmittel unterworfen, was 1,013 g (86 %) Produkt ergab; Schmelzpunkt 104-105º C. 300 MHz¹H- NMR (CDCl&sub3;) δ 7,71 (s, 1H, β-H), 7,16 (d, 1H, aromatisch 6- Position, J=8,5 Hz), 6,50 (dd, 1H, aroinatisch 5-Position, J=2,45, 8,5 Hz), 6,45 (d, 1H, aromatisch 3-Position, J=2,45 Hz), 5,74 (s, 1H, phenolisch-H), 4,26 (q, 2H, OCH&sub2;CH&sub3;, J=7,1 Hz), 3,78 (s, 3H, CH&sub3;0), 2,02 (s, 3H, C=CCH&sub3;, 1,32 (t, 3H, OCH&sub2;CH&sub3;). ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ 169,19, 161,14, 155,44, 133,85, 130,83, 128,03, 115,53, 106,24, 101,45, 61,05, 55,31, 14,27, 14,24. TLC; 70/30 Hexan/Ethylacetat, Rf=0,25. Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub3;H&sub1;&sub6;O&sub4;; C, 66,09; H, 6,83. Gefunden: C, 66,12; H, 6,86.
    • (b) Synthese von 2-Propensäure 3-(2-Hydroxy-4-Methoxyphenyl-2-Methyl-, (E)- (oder (E)-2-Hydroxy-4-Methoxy-α-Methylzimtsäure).
  • Einer Rührlösung aus 300 mg (1,27 mmol) Ethyl-(E)-2-Hydroxy-4-Methoxy-α-Methylzimtsaurem Salz in 8 mL 1/1 EtOH:H&sub2;O bei Zimmertemperatur wurden 300 mg (7,5 mmol, 6 eq.) frisch gemahlenes NaOH hinzugefügt. Die Reaktion wurde dann bei 60º C eine Stunde lang erhitzt. Nachdem sich die Reaktion abgekühlt hatte, wurde sie mit 10 % HCl angesäuert und zweimal mit Ether extrahiert. Die organische Phase wurde mit 10 % HCl gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und in vacuo konzentriert, was 248,9 mg (94 %) Produkt ergab; Schmelzpunkt 159-160º C. 300 MHz¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ 7,86 (s, 1H, β-H), 7,26 (d, 1H, aromatisch 6-Position, J=8,5 Hz), 6,45 (dd, 1H, aromatisch 5-Position, J=2,5, 8,5 Hz), 6,40 (d, 1H, aromatisch 3-Position; J=2,5 Hz), 4,90 (s. breit, 2H, austauschbare H's), 3,77 (s, 3H, OCH&sub3;), 2,03 (s, 3H, C=CCH&sub3;). ¹³C-NMR (CD&sub3;OD) δ 172,77, 162,83, 158,64, 136,33, 132,09, 126,15, 117,19, 106,00, 101,99, 55,68, 14,47. TLC; 70/30 Hexan/Ethylacetat, Rf= 0,06. Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub2;O&sub4;; C, 63,45; H, 5,81. Gefunden: C, 63,42, H, 5,82.
    • (c) Synthese von 4-Amidinphenyl-(E)-2-Hydroxy-4-Methoxy-α-Methylcinnamatchlorid.
  • Einer Rührlösung von 230 mg (1,1 mmol) (E)-2-Hydroxy-4-Methoxy-α-Methylzimtsäure in 7 mL trockenen Pyridins bei Zimmertemperatur unter Argon wurden 273,5 mg (1,33 mmol, 1,2 eq.) DCC, gefolgt von 209,7 mg (1,22 mmol, 1,1 eq.) p-Hydroxybenzamidinhydrochlorid hinzugefügt, siehe G. Wagner und H. Horn, 28 Pharmazie 427 (1973); M. Partridge und W. Short, J. Chem. Soc. 390 (1947). Nach 25 Stunden wurde die Reaktion gefiltert und in vacuo konzentriert. Der Rest wurde einer Schnellsäulenchromathographie auf 12 % (w/w H&sub2;O) deaktiviertem Kieselgel unterzogen, wobei 90/10 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH als Elutionsmittel benutzt wurde, was 222 mg (55,6 %) Produkt ergab; Schmelzpunkt 198-201º C. 300 MHZ¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ 8,15 (s, 1H, β-H), 7,88 (d, 2H, p-Amidinphenyl-H, J=8,9 Hz), 7,43 (d, 2H p-Amidinphenyl-H, J=8,9 Hz), 7,38 (d, 1H, aromatisch 6-Position, J=8,5 Hz), 6,50 (dd, 1H, aromatisch 5-Position, J=2,4, 8,5 Hz, 6,45 (d. 1H, aromatisch 3-Position, J=2,4 Hz), 4,91 (s, breit, 5H, austauschbare H's), 3,79 (s, 3H, OCH&sub3;), 2,17 (s, 3H, C=CCH&sub3;). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;) δ 166,54, 165,07, 161,49, 158,14, 155,18, 136,60, 131,08, 129,88, 125,35, 122,79, 122,42, 114,76, 105,20, 101,05, 55,14, 14,38. TLC; 77/23 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH, Rf=0,41. Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub8;H&sub1;&sub9;N&sub2;O&sub4;Cl; C, 59,59; H, 5,28; N, 7,72. Gefunden: C, 59,57, 59,48; H, 5,29, 5,33; N, 7,68, 7,65.
    • Beispiel 3
  • Synthese von 4-Amindinphenyl-(E)-2-Hydroxy-5-Nitro-α-Methylcinnamat p-Toluolsulfonsäuresalz (Verbindung C)
    • (a) Synthese von 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-5-Nitrophenyl)-2-Methyl-, Ethylester, (E)- (oder Ethyl-(E)-2-Hydroxy- 5-Nitro-α-Methylcinnamat).
  • Einer Suspension aus 1,337 g (8 mmol) 5-Nitro-Salicylaldeyhyd in 35 mL Benzol bei Zimmertemperatur wurden 3,479 g (9,6 mmol, 1,2 eq.) (Carbethoxyethyliden)-Triphenylphosphoran hinzugefügt. Nach 5,25 Stunden wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und der Rest einer Schnellsäulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von 80/20 bis 65/35 Hexan/Ethylacetat als Elutionsmittel unterzogen, was 1,629 g (81 %) Produkt ergab; Schmelzpunkt 121-122º C. 300 MHz¹H-NMR (CDCL&sub3;) δ 8,22 (d, 1H, aromatisch 6-Position, J=2,7 Hz), 8,18 (dd, 1H, aromatisch 4-Position, J=2,7, 8,8 Hz), 7,76 (s, 1H, β-H), 7,35-7,55 (breit s, 1 H, phenolisch-H), 7,05 (d, 1H aromatisch 3-Position, J=8,8 Hz), 4,35 (q, 2H, OCH&sub2;CH&sub3;, J=7,1 Hz), 2,11 (s, 3H, C=CCH&sub3;, 1,42 (t, 3H, OCH&sub2;CH&sub3;). ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ 168,63, 159,61, 141,02, 132,47, 131,85, 125,97, 125,82, 123,20, 116,05, 61,69, 14,27, 14,22. TLC; 70/30 Hexan/Ethylacetat, Rf=0,25. UV-lambdamax= 410 nm (H&sub2;O). Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub3;NO&sub5;; C, 57,34; H, 5,22; N, 5,57. Gefunden: C, 57,42; H, 5,23; N, 5,58.
    • (b) Synthese von 2-Propensäure. 3-(2-Hydroxy-5-Nitrophenyl)-2-Methyl-, (E)- (oder (E)-2-Hydroxy-5-Nitro-α-Methylzimtsäure).
  • Einer Rührlösung aus 242 mg (0,69 mmol) Ethyl-(E)-2-Hydroxy-5-Nitro-α-methylzimtsaurem Salz in 10 mL 1/1 EtOH:H&sub2;O bei Zimmertemperatur wurden 240 mg (4,28 mmo1, 4,5 eq.) frisch gemahlenes KOH hinzugefügt. Die Reaktion wurde 1,5 Stunden bei 60º C erwärmt. Danach wurde die Reaktion abgekühlt, mit 3 % HCl angesäuert und zweimal mit Ether extrahiert. Die organische Phase wurde mit 3 % HCl gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und in vacuo konzentriert, was 210,3 mg (98 %) Produkt ergab; Schmelzpunkt 235-237º C mit Zersetzung. 300 MHz¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ 8,20 (d, 1H, aromatisch 6-Position, J=7,2 Hz), 8,12 (dd, 1H, aromatisch 4- Position, J=2,7, 9,0 Hz), 7,76 (s, 1H, β-H), 6,96 (d, 1H, aromatisch 3-Position, J=9,0 Hz), 4,91 (s. br, 2H, austauschbare H's), 2,06 (s, 3H, C=CCH&sub3;). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub5;) δ 169,01, 162,07, 139,31, 131,56, 130,29, 125,95, 125,71, 123,12, 115,82, 14,05. TLC; 60/40 Hexan/Ethyacetat, Rf=0,13. Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub0;H&sub9;NO&sub5;; C, 53,82; H, 4,06; N, 6,28. Gefunden: C, 53,65; H, 4,13; N, 6,21.
    • (c) Synthese von 4-Amidinphenyl-(E)-2-Hydroxy-5-Nitro-α-Methylcinnamat p-Toluolsulphonsäuresalz.
  • Einer Rührlösung von 146,6 mg (0,657 mmol) (E)-2-Hydroxy-5-Nitro-α-Methylzimtsäure in 3,5 mL trockenen Pyridins bei Zimmertemperatur unter Argon wurden 165,1 mg (0,8 mmol, 1,2 eq.) DCC, gefolgt von 258 mg (2,1 mmol, 3,2 eq.) p-Hydroxybenzamidinhydrochlorid hinzugefügt, siehe G. Wagner und H. Horn, 28 Pharmazie 427 (1973); M. Partridge und W. Short, J. Chem. Soc. 390 (1947). Nach 19,75 Stunden wurde die Lösung gefiltert und auf die Hälfte ihres ursprünglichen Volumens konzentriert. Anschließend wurde die Lösung in eine gesättigte NaHCO&sub3;-Lösung gegossen. Die Lösung wurde filtriert und die Feststoffe dreimal mit H&sub2;O und viermal mit Aceton gewaschen. Dann wurden die Feststoffe in 1,5 mL CH&sub3;OH suspendiert und diesem 125 mg p-Toluolsulfonsäuremonohydrat hinzugefügt. Das Produkt 10 mg (3 %) wurde dann nach Zusatz von Ether aus der Lösung verdrängt. 300 MHZ¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ 9,32 (s, br, 1H NH) , 8,81 (s, br, 1H, NH) , 8,29 (s, 1H, aromatisch 6-Position,) 8,16 (d, 1H, aromatisch 4-Position, J=9,0 Hz), 8,03 (s. 1H, β-H), 7,89 (d, 2H, p-Amidinphenyl- H, J=8,7 Hz), 7,69 (d, 2H, Toluolsulphonat-H, J=8,1 Hz), 7,47 (d, 2H, p-Amidinphenyl-H, J=8,7 Hz), 7,23 (d, 2H, Toluolsulphonat-H, J=8,1 Hz), 7,02 (d, 1H, aromatisch 3-Position, J=9,0 Hz), 4,90 (s, 3H, austauschbare H's), 2,38 (s, 3H, CH&sub3;-Ph-), 2,21 (s, 3H, C=CCH&sub3;). ¹³C-NMR (CD&sub3;OD) δ 167,37, 163,23, 157,10, 141,72, 141,46, 136,44, 130,70, 130,05, 129,84, 129,77, 127,28, 127,12, 127,02, 126,96, 124,21, 124,11, 124,05, 116,61, 21,33, 14,50. Analytisch berechnet auf C&sub2;&sub4;H&sub2;&sub3;N&sub3;O&sub8;S; C, 56,13; H, 4,51; N, 8,13. Gefunden: C, 55,15, 55,12; H, 4,61, 4,62; N, 7,73, 7,69.
    • Beispiel 4 Synthese von 4-Amindinphenyl-(E)-2-Hydroxy-3,5-Dimethoxy-α-Methylcinnamathydrochlorid (Verbindung D) (a) Synthese von 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-3,5-Dimethoxyphenyl)-2-Methyl-, Ethylester, (E)- (oder Ethyl-(E)-2- Hydroxy-3,5-Dimethoxy-α-methylzimtsaurem Salz).
  • Einer Rührlösung von 728,7 mg (4 mmol) 3,5-Dimethoxy-Salicylaldehyd1,2,3 in 20 mL Benzol bei Zimmertemperatur unter Argon wurden 1,74 g (4,8 mmol, 1,2 eq.) (Carbethoxyethyliden)- Triphenylphosphoran hinzugefügt. Nach 2 Stunden wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und der Rest einer Schnellsäulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von 80/20 Hexan/Ethylacetat als Elutionsmittel unterzogen, was 1,03 g (96,5 %) Produkt ergab. 300 MHz¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 7,79 (s, 1H β-H), 6,48 (d, 1H, aromatisch 6-Position, J=2,8 Hz), 6,40 (d, 1H, aromatisch 4-Position, J=2,8 Hz), 5,51 (s, 1H, phenolisch-H), 4,26 (q, 2H OCH&sub2;CH&sub3;, J=7,1 Hz), 3,88 (s, 3H, 5-CH&sub3;O), 3,74 (s, 3H, 3-CH&sub3;O), 2,04 (s, 3H, C=CCH&sub3;), 1,32 (t, 3H, OCH&sub2;CH&sub3;), J=7,1 Hz). ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ 168,48, 152,45, 147,01, 138,24, 133,70, 129,51, 121,87, 104,70, 99,49, 60,79, 56,07, 55,77, 14,40, 14,32. TLC; 60/40 Hexan/Ethylacetat, Rf=0,37. Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub8;O&sub5;; C, 63,15; H, 6,81. Gefunden: C, 63,07; H, 6,87.
    • (b) Synthese von 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-3,5-Dimethoxyphenyl-2-Methyl-, (E)- (oder (E)-2-Hydroxy-3,5-Dimethoxy-α-methylzimtsaurem Salz).
  • Einer Rührlösung aus 1 g (3,76 mmol) Ethyl-(E)-2-Hydroxy-3,5-Dimethoxy-α-methylzimtsaurem Salz in 24 mL 1:1 EtOH:H&sub2;O bei Zimmertemperatur wurden 510 mg (12,8 mmol) frisch gemahlenes NaOH hinzugefügt. Die Reaktion wurde 1,5 Stunden bei 60º C erwärmt. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktion mit 10 % HCl angesäuert und zweimal mit Ether extrahiert. Die organische Phase wurde mit 10 % HCl gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und in vacuo konzentriert, was 839,2 mg (93,7 %) Produkt ergab; Schmelzpunkt 210º C mit Zersetzung. 300 MHz¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ 12,3 (s, 1H, carboxylisch-H), 8,51 (s, 1H, phenolisch-H), 7,71 (s, 1H, β-H), 6,59 (d, 1H, aromatisch 6- Position, J=2,8 Hz), 6,41 (d, 1H, aromatisch 4-Position, J=2,8 Hz), 3,79 (s, 3H, 5-CH&sub3;O), 3,70 (s, 3H, 3-CH&sub3;O), 1,97 (s, 3H, C=CCH&sub3;). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub5;) δ 169,51, 151,76, 148,38, 139,06, 134,12, 127,84, 122,69, 104,60, 100,42, 55,93, 55,46, 14,18. TLC; 50/50 Hexan/Etyhlacetat, Rf=0,24. Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub4;O&sub5;; C, 60,50; H, 5,92. Gefunden: C, 60,45; H, 5,94.
    • (c) Synthese von 4-Amidinphenyl-(E)-2-Hydroxy-3,5-Dimethoxy-α-Methylcinnamathydrochlorid.
  • Einer Rührlösung von 306 mg (1,28 mmol) (E)-2-Hydroxy-3,5-Dimethoxy-α-Methylzimtsäure in 8 mL trockenem Pyridin bei Zimmertemperatur unter Argon wurden 318,1 mg (1,54 mmol, 1,2 eq.) DCC, gefolgt von 243,9 mg (1,41 mmol, 1,1 eq.) p-Hydroxybenzamidinhydrochlorid hinzugefügt, siehe G. Wagner und H. Horn, 28 Pharmazie 427 (1973); M. Partridge und W. Short, J. Chem. Soc. 390 (1947). Nach 24 Stunden wurde die Reaktion gefiltert und in vacuo konzentriert. Der Rest wurde einer Schnellsäulenchromatographie auf 12 % (w/w H&sub2;O) deaktiviertem Kieselgel unter Verwendung von 90/10 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH als Elutionsmittel unterzogen, was 258,4 mg (51,4 %) Produkt ergab. Das Produkt wurde durch Zusatz von Ether zwangsweise aus CH&sub3;OH ausgefällt; Schmelzpunkt 220-221º C. 300 MHZ¹H- NMR (DMSO-d&sub6;) δ 9,7-8,5 (zwei breite Singletts, 5H, austauschbare H's), 8,01 (s, 1H, β-H), 7,93 (d, 2H, Amidinophenyl-H, J=8,8 Hz), 7,49 (d, 2H, Amidinophenyl-H, J=8,8 Hz), 6,66 (d, 1H, aromatisch 6-Position, J= 2,9 Hz), 6,50 (d, 1H, aromatisch 4-Position, J=2,9 Hz), 3,82 (s. 3H, 5- CH&sub3;O) , 3,72 (s, 3H, 3-CH&sub3;O) , 2,12 (s, 3H, C=CCH&sub3;). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;) δ 166,21, 165,07, 154,99, 151,82, 148,47, 139,50, 137,15, 129,91, 125,87, 125,50, 122,74, 121,83, 104,43, 101,17, 55,97, 55,51, 14,35. TLC; 77/23 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH, Rf=0,44. UV-lambda=208, 228, 278, 334 nm (H&sub2;O) Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub9;H&sub2;&sub1;N&sub2;O&sub5;Cl; C, 58,09; H, 5,39; N, 7,13. Gefunden: C, 58,03, 57,97; H, 5,42, 5,45; N, 7,11, 7.08.
    • Beispiel 5 Synthese von 4-Amindinphenyl-(E)-2-Hydroxy-4,6-Dimethoxy-α- Methylcinnamathydrochlorid (Verbindung E) (a) Synthese von 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4,6-Dimethoxyphenyl)-2-Methyl-, Ethylester, (E)- (oder Ethyl-(E)-2- Hydroxy-4,6-Dimethoxy-α-methylzimtsaurem Salz).
  • Einer Rührlösung von 728,7 mg (4 mmol) 4,6-Dimethoxy-Salicylaldehyd in 20 mL Benzol bei Zimmertemperatur unter Argon wurden 1,735 g (4,79 mmol, 1,2 eq.) (Carbethoxyethyliden)-Triphenylphosphoran hinzugefügt. Nach 2,5 Stunden wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und der Rest einer Schnellsäulenchromatographie auf Kieselgel unterzogen, wobei 85/15 bis 75/25 Hexan/Ethylacetat als Elutionsmittel benutzt wurde, was 1,011 g (94,9 %) Produkt ergab. 300 MHz¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 7,49 (s, 1H, β-H), 6,14 (d, 1H, aromatisch 3-Position, J=2,3 Hz), 6,08 (d, 1H, aromatisch 5-Position, J=2,3 Hz), 5,44 (s, 1H, phenolisch-H), 4,26 (q, 2H OCH&sub2;CH&sub3;, J=7,1 Hz), 3,75-3,79 (zwei s, 6H, 4,6-CH&sub3;O), 1,84 (s, 3H, C-CCH&sub3;), 1,32 (t, 3H, OCH&sub2;CH&sub3;). ¹³C-NMR δ 167,96, 161,72, 158,71, 154,23, 131,40, 131,26, 104,39, 92,99, 91,20, 60,89, 55,59, 55,33, 14,89, 14,25. TLC; 60/40 Hexan/Ethylacetat, Rf=0,34. Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub8;O&sub5;; C, 63,15; H, 6,81. Gefunden: C, 62,94; H, 6,86.
    • (b) Synthese von 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4,6-Dimethoxyphenyl)-2 Methyl-, (E)- (oder (E)-2-Hydroxy-4,6 Dimethoxy-α-Methylzimtsäure).
  • Einer Rührlösung von 965 mg (3,62 mmol) Ethyl-(E)-2-Hydroxy-4,6-Dimethoxy-α-methylzimtsaurem Salz in 24 mL 1:1 EtOH:H&sub2;O bei Zimmertemperatur wurden 510 mg (12,8 mmol, 3,5 eq.) frisch gemahlenes NaOH hinzugefügt. Dann wurde die Reaktion 1,5 Stunden bei 60º C erwärmt. Danach wurde sie abgekühlt, mit 10 % HCl angesäuert und zweimal mit Ether extrahiert. Die organische Phase wurde mit 10 % HCl gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und in vacuo konzentriert, was 754 mg (87 %) Produkt ergab; Schmelzpunkt 141-142º C. 300 MHz¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ 7,48 (s, 1H, β-H), 6,08 (d, 1H, aromatisch 3-Position, J=2,2 Hz), 6,06 (d, 1H, aromatisch 5 Position, J=2,2 Hz), 4,91 (s (br), 2 H, austauschbare H's), 3,76 (zwei s, 6H, 4,6 CH&sub3;O), 1,73 (s, 3H, C=CCH&sub3;). ¹³C-NMR (CD&sub3;-OD) δ 172,34, 163,16, 160,33, 157,50, 134,39, 130,11, 106,34, 94,43, 90,97, 55,90, 55,65, 15,51. TLC; 50/50 Hexan/Etkylacetat, Rf=0,16. Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub4;O&sub5;; C, 60,50; H, 5,92. Gefunden: C, 60,58; H, 5,96.
    • (c) Synthese von 4-Amidinphenyl-(E)-2-Hydroxy-4,6-Dimethoxy-α-Methylcinnamathydrochlorid.
  • Einer Rührlösung von 300 mg (1,26 mmol) (E)-2-Hydroxy-4,6-Dimetoxy-α-Methylzimtsäure in 8 mL trockenen Pyridins bei Zimmertemperatur unter Argon wurden 311,8 mg (1,51 mmol, 1,2 eq.) DCC, gefolgt von 239,1 mg (1,39 mmol, 1,1 eq.) p-Hydroxybenzamidinhydrochlorid hinzugefügt, siehe G. Wagner und H. Horn, 28 Pharmazie 427 (1973); N. Partridge und W. Short, J. Chem. Soc. 390 (1947). Nach 26 Stunden wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und der Rest einer Schnellsäulenchromatographie auf 12 % (w/w H&sub2;O) deaktiviertem Kieselgel unter Verwendung von 90/10 CHCl&sub3;/CH³OH als Elutionsmittel unterzogen, was 356,5 mg (72 %) Produkt ergab. Schmelzpunkt 187º C. 300 MHZ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ 8,5-9,8 (breit s, 5H, austauschbare H's), 7,90 (d, 2H, p-Amidinophenyl-H, J=8,7 Hz), 7,65 (s, 1H, β-H), 7,48 (d, 2H, p-Amidinophenyl-H, J=8,7 Hz), 6,18 (d, 1H, aromatisch 3-Position, J= 2,2 Hz), 6,13 (d, 1H, aromatisch 5-Position, J=2,2 Hz), 3,77 (s. 3H, 6-CH&sub3;O), 3,72 (s, 3H, 4-CH&sub3;O), 1,81 (s, 3H, C=CCH&sub3;). ¹³C-NMR (DMSO- d&sub6;) δ 166,00, 165,05, 161,71, 158,75, 156,81, 155,03, 135,52, 129,86, 126,39, 125,40, 122,76, 103,87, 93,63, 89,82, 55,47, 55,11, 15,63. TLC; 77/23 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH, Rf=0,39. UV-lambda=214, 304 nm (H&sub2;O). Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub9;H&sub2;&sub1;N&sub2;O&sub5;Cl; C, 58,09; H, 5,39; N, 7,13. Gefunden: C, 57,91, 57,88; H, 5,43, 5,44; N, 7,10, 7,06.
    • Beispiel 6 Synthese von 4-Amindinphenyl-(E)-2-Hydroxy-4-Diethylamino- α-Methylcinnamathydrochlorid (Verbindung F) (a) Synthese von 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2-Methyl-, Ethylester, (E)- (oder Ethyl-(E)-2-Hydroxy-4-Diethylamino-α-methylzimtsaurem Salz).
  • Einer Rührlösung von 2,9 g (15 mmol) 4-Diethylamino-Salicylaldehyd in 75 mL Benzol bei Zimmertemperatur unter Argon wurden 7,07 g (19,5 mmol, 1,3 eq.) (Carbethoxyethyliden)-Triphenylphosphoran hinzugefügt. Nach 4 Stunden bei Zimmertemperatur wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und der Rest einer Schnellsäulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von 90/10 Hexan/Ethylacetat als E1utionsmittel unterzogen, was 3,52 g (85 %) Produkt ergab; Schmelzpunkt 102º C. 300 MHz¹H-NMR (CDCl&sub3;) δ 7,79 (s, 1H, β-H), 7,19 (d, 1H, aromatisch 6-Position, J=8,8 Hz), 6,23 (dd, 1H, aromatisch 5-Position, J=2,3, 8,8 Hz), 6,16 (d, 1H, aromatisch 3-Position, J=2,3 Hz), 5,8 (s, 1H, phenolisch-H), 4,22 (q, 2H O-CH&sub2;, J=7,1 Hz), 3,32 (q, 4H, N-CH&sub2;, J=7,0 Hz), 2,07 (s, 1H =C-CH&sub3;), 1,31 (t, 3H OCH&sub2;CH&sub3;), J=7,1 Hz), 1,14 (t, 6H, NCH&sub2;CH&sub3;, J=7,0 Hz. ¹³C-NMR (CDCl&sub3;) δ 169,51, 155,89, 149,57, 133,86, 131,12, 124,51, 110,18, 104,13, 98,01, 60,69, 44,34, 14,41, 14,35, 12,62. TLC; 70/30 Hexan/Ethylacetat, Rf=0,35. UV-lambdamax=360 nm (H&sub2;O). Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub6;H&sub2;&sub3;NO&sub3;; C, 69,29; H, 8,36; N, 5,05. Gefunden: 69,32; H, 8,36; N, 5,04.
    • (b) Synthese von 2-Propensäure, 3-(2-Hydroxy-4-Diethylaminophenyl)-2 Methyl-, (E)- (oder (E)-2-Hydroxy-4-Diethylamino-α-Methylzimtsäure).
  • Einer Rührlösung von 416 mg (1,5 mmol) Ethyl-(E)-2-Hydroxy-4-Diethylamino-α-methylzimtsaurem Salz in 4 mL Ethanol bei Zimmertemperatur wurden 4 mL 10 %ige NaOH-Lösung hinzugefügt. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei 65º C erhitzt und dann in einem Eisbad abgekühlt. Die Reaktion wurde sorgfältig bis zu einem pH-Wert 5 durch Zusatz von 1N HCl angesäuert, zweimal mit Ether extrahiert, mit gesättigter NH&sub4;CL-Lösung gewaschen, über NA&sub2;SO&sub4; getrocknet und konzentriert, um 356 mg (98 %) der Säure zu ergeben. Diese Verbindung zersetzte sich bei langem Stehen und wurde deshalb unmittelbar benutzt. IR (KBr) 3100-3700 (OH), 2850-3050 (C-H), 1675 (C=O), 1610 (C=C). 300 MHz¹H- NMR (DMSO-d&sub6;) δ 11,9 (s, 1H, carboxylisch-H), 9,5 (s, 1H, phenolisch-H), 7,64 (s. 1H, β-H), 7,22 (d, 1H, aromatisch 6-Position, J=9,0 Hz), 6,18 (m, 2H, aromatisch 3 und 5-Positionen), 3,35 (q, 4H, NCH&sub2;, J=7,1 Hz), 2,0, (s, 3H, C=CCH&sub3;), 1,1 (t, 6H, NCH&sub2;CH&sub3;). ¹³C-NMR (CD&sub3;-OD) δ 171,51, 158,60, 138,98, 134,28, 133,22, 131,24, 126,93, 113,33, 110,52, 54,73, 14,41, 10,77. TLC; 70/30 Hexan/Ethylacetat, Rf=0,04.
    • (c) Synthese von 4-Amidinphenyl-(E)-2-Hydroxy-4-Diethylamino-α-Methylcinnamathydrochlorid.
  • Einer Rührlösung von 303 mg (1,36 mmol) (E)-2-Hydroxy-4-Diethylamino-α-Methylzimtsäure in 8 mL trockenem Pyridin bei Zimmertemperatur unter Argon wurden 336,1 mg (1,63 mmol, 1,2 eq.) DCC, gefolgt von 257,7 mg (1,49 mmol, 1,1 eq.) p-Hydroxybenzamidinhydrochlorid hinzugefügt, siehe G. Wagner und H. Horn, 28 Pharmazie 427 (1973); M. Partridge und W. Short, J. Chem. Soc. 390 (1947). Nach 40 Stunden wurde das Lösungsmittel in vacuo entfernt und der Rest einer Schnellsäulenchromatographie auf 12 % (w/w H&sub2;O) deaktiviertem Kieselgel unter Verwendung von 90/10 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH als Elutionsmittel unterzogen, was 258,4 mg (47 %) Produkt ergab; Zersetzung bei 125º C. 300 MHZ¹H-NMR (CD&sub3;OD) δ 8,27 (s, 1H, β-H), 7,87 (d, 2H, p-Amidinphenyl-H, J=8,7 Hz), 7,43 (d, 2H, p- Amidinphenyl-H, J=8,7 Hz), 7,40 (d, 1H aromatisch 6-Position, J=8,8 Hz), 6,30 (dd, 1H, aromatisch 5-Position, J=2,5, 8,8 Hz), 6,20 (d, 1H, aromatisch 3-Position, J=2,5 Hz), 4,91 (s, br, 5H, austauschbare H's), 3,39 (g 4H, NCH&sub2;CH&sub3;, J=7,1 Hz) , 2,22 (s, 3H, C=CCH&sub3;, 1,21 (t, 6H NCH&sub2;CH&sub3;). ¹³C-NMR (CD&sub3;OD) δ 169,12, 167,89, 159,87, 157,78, 151,84, 139,19, 132,61, 130,57, 126,43, 124,20, 119,45, 111,58, 104,82, 98,47, 45,40, 14,83, 13,07. TLC; 77/23 CHCl&sub3;/CH&sub3;OH, Rf=0,28. UV-lambdamax= 378 nm (H&sub2;O). Analytisch berechnet auf C&sub2;&sub1;H&sub2;&sub6;N&sub3;O&sub3;Cl; C, 62,45; H, 6,49; N, 10,40. Gefunden: C, 62,29, 62,22; H, 6,52, 6,55; N, 10,34, 10,28.
    • Beispiel 7 Synthese von 4-Nitrophenyl-(E)-2-Hydroxy-α-methylzimtsaurem Salz (Verbindung G)
  • Zu 113,6 mg (0,637 mmol) trans-O-Hydroxy-α-Methylzimtsäure, siehe Sinhababu, A. K. und Borchardt, R. T., J. Org. Chem. 48, 2356 (1983) in 5 mL trockenen Pyridins bei Zimmertemperatur unter Argon wurden 160,6 mg (0,887 mmol, 1,2 eq.) DCC hinzugefügt, gefolgt durch Zusatz von 98,5 mg (0,708 mmol, 1,1 eq.) p-Nitrophenol. Die Reaktion wurde etwa 26 Stunden lang unter Argon rühren gelassen. Dann wurde die Lösung gefiltert und das Pyridin in vacuo entfernt. Der Rest wurde einer Schnellsäulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von 9:1 Benzol:Ethylacetat als Elutionsmittel unterzogen, was eine 80 % Ausbeute an weißem Pulver ergab; Schmelzpunkt 166-170º C. 300 MHz¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) δ 10,02 (s, 1H, phenolisch-H), 8,31 (d, 2H, p-Nitrophenyl 3-Position, J=9,23 Hz) , 8,04 (s, 1H, β-H) , 7,53 (d, 2H, p-Nitrophenyl 2-Position, J=9,23 Hz), 7,39 (d, 1H, aromatisch 6- Position, J=8,25 Hz), 7,25 (dt, 1H, aromatisch 4-Position, J=1,52, 8,25 Hz), 6,94 (d, 1H, aromatisch 3-Position, J=8,25 Hz), 6,88 (t, 1H, aromatisch 5-Position), J=8,25 Hz), 2,15 (s, 3H, C=CCH&sub3;). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;) δ 165,97, 156,27, 155,93, 144,,97, 137,28, 130,80, 130,05, 125,28, 125,21, 123,36, 121,73, 118,90, 115,65, 14,26. Analytisch berechnet auf C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub3;NO&sub5;; C, 64,21; H, 4,38; N, 4,68. Gefunden: C, 63,98; 64,32; H, 4,76, 4,41; N, 4,91, 4,62.
    • Beispiel 8 Synthese von 4-Nitrophenyl-(E)-2-Hydroxy-4-Dietylamino-α-methylzimtsaurem Salz (Verbindung H)
  • Einer Rührlösung von 860 mg (3,45 mmol) (E)-2-Hydroxy-5- Methoxy-α-Methylzimtsäure in 7 mL trockenem Pyridin bei Zimmertemperatur unter Argon wurden 854,1 mg (4,14 mmol, 1,2 eq.) DCC, gefolgt von 575,8 mg (4,14 mmol, 1,2 eq.) p- Nitrophenol sowie eine katalytische Menge Dimethylaminopyridin hinzugefügt. Nach etwa 26 Stunden bei Zimmertemperatur wurde die Reaktion gefiltert und das Lösungsmittel in vacuo entfernt. Der Rest wurde einer Schnellsäulenchromatographie auf Kieselgel unter Verwendung von 9:1 Benzol: Ethylacetat als Elutionsmittel unterzogen, was 1,26 g (99 %) Produkt ergab; Schmelzpunkt 124-129º C. 300 MHz¹H- NMR (DMSO-d&sub6;) δ 9,69 (s, 1H, phenolisch-H), 8,32, (d, 2H, p-Nitrophenyl 3-Position, J=9,0 Hz), 8,18 (s, 1H, β-H), 7,49 (d, 2H, p-Nitrophenyl 2-Position, J=9,0 Hz), 7,39 (d, 1H, aromatisch 6-Position, J=8,9 Hz), 6,22 (dd, 1H, aromatisch 5-Position, J=2,2, 8,9 Hz), 6,21 (d, 1H, aromatisch 3-Position, J=2,2 Hz), 3,38 (q, 4H, NCH&sub2;, J=7,1 Hz), 2,18 (s, 3H, C=CCH&sub3;), 1,17 (t, 6H, NCH&sub2;CH&sub3;, J=7,1 Hz). ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;) δ 166,64, 158,60, 156,46, 150,03, 144,67, 137,15, 131,28, 125,19, 123,36, 117,28, 109,51, 103,37, 97,13, 43,85, 14,52, 12,61. Analytisch berechnet auf C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub2;N&sub2;O&sub5;; C, 64,85; H, 5,99; N, 7,56, Gefunden: C, 64,95; H, 6,05; N, 7,53.
    • Beispiel 9 (Vergleichsbeispiel A) Acylierung von Thrombin mit 4-Amindinphenyl-(E)-2-Hydroxy- 4-Diethylamino-α-methylzimtsaurem Salz (Verbindung F)
  • Die Reaktion von 4-Amidinphenyl-(E)-2-Hydroxy-4-Diethylamino-α-Methylcinnamathydrochlorid (Verbindung F) mit Thrombin zur Erzeugung eines Acylthrombins (nachfolgende "DEA Acylthrombin") wurde durch chromogene Prüfung überwacht, siehe A. Turner, et al., 110 J. Am. Chem. Soc. 244 (1988); B. Blomback, Theoretical Considerations of Substrate Structures Governing Enzyme Specificity, 3 (M. Scully und V. Kakkar eds 1979) (New York: Churchill Livingston). Ein 1- -bis 5-facher Überschuß an 4-Aminidinphenyl-(E)-2-Hydroxy-4- Diethylamino-A-methylzimtsaurem Salz mit Thrombin (1,5 uM) in Tris-Puffer, pH-Wert 7,4, führte zu einem vollständigen Verlust an Thrombinaktivität in weniger als einer Stunde. Eine Gelfiltration der erhaltenen, inaktiven Thrombinlösung auf Sephadex G-25 mit Tris-Pufferlösung, pH-Wert 7,4, ergab eine mit dem aktiven Thrombin identische Acylenzymelution, allerdings mit weniger als 2 % Aktivität. Im Dunkeln nahm die Thrombinaktivität dieser Lösung in einem reinen Prozeß erster Ordnung mit einer Geschwindigkeit von 1,4 10&supmin;&sup6; s&supmin;¹ zu (Halbwertszeit für die Aktivierung = 138 Stunden).
  • Zum Vergleich betrug die Halbwertszeit für die Reaktivierung von Acylthrombin, welches auf die gleiche Weise aus 4- Amidinphenyl-(E)-2-Hydroxy-α-Methylcinnamat und Thrombin gebildet wurde (nachfolgend "Acylthrombin") 3,8 Stunden.
  • Die p-Diethylaminogruppe von 4-Amidinphenyl-(E)-2-Hydroxy- 4-Diethylamino-α-Methylcinnamat ergibt einen charakteristischen Farbstoffträger 360 nm=lambdamax. Wenn man ein ε von DEA Acylthrombin entsprechend dem des korrespondierenden Ethylesters annimmt, nämlich Ethyl-(E)-2-Hydroxy-4-Diethylamino-α-Methylcinnamat (ε=22400), ziehen wir die Schlußfolgerung, daß das gereinigte DEA Acylthrombin eine angehängte Acylgruppe hat. Diese Daten stützen die Ansicht, daß 4-Amidinphenyl-(E)-2-Hydroxy-α-Methylcinnamat und 4-Amidinphenyl-(E)-2-Hydroxy-4-Diethylamino-α-Methylcinnamat (Verbindung F) das Hydroxyl der serinaktiven Stelle von Thrombin acylieren, so daß Acylthrombin und DEA-Acylthrombin entstehen. Die p-Diethylaminogruppe von DEA-Acylthrombin spendet vermutlich Elektronendichte durch Resonanz und stabilisiert das Acylenzym, siehe R. Kogan und T. Fife, 23 Biochemistry 2983 (1984); F. Markwardt, et al., 28 Acta. Biol. Med. Germ. 19 (1972).
    • Beispiel 10 (Vergleichsbeispiel B) Geschwindigkeitskonstanten für 4-Amidinphenyl-(E)-2-Hydroxy-4-Diethylamino-α-Methylcinnamat (Verbindung F)
  • Wir teilen hier Geschwindigkeitskonstanten für unseren besten Hemmstoff, 4-Amidinphenyl-(E)-2-Hydroxy-4-Diethylamino-α-Methylcinnamathydrochlorid (Verbindung F) mit. Diese Daten ermöglichen es, den Zeitverlauf des Photoaktivierungsprozesses zu beschreiben.
  • Preliminär zu unseren Studien des Enzymsystems untersuchten wir die Photochemie der Modellverbindungen Ethyl-(E)-2- Methoxy-4-Diethylamino-&alpha;-Methylcinnamat und Ethyl-(E)-2-Hydroxy-4-Diethylamino-&alpha;-Methylcinnamat (nachfolgend "DEA Acyl", da diese Verbindung DEA Acylthrombin mit Ethyl anstelle von Thrombin modelliert). Die Photolyse von Ethyl- (E)-2-Methoxy-4-Diethylamino-&alpha;-Methylcinnamat mit 366 nm Licht führt zu einer raschen Abnahme des Absorptionsvermögens, wenn sich das cis-Photoisomere bildet (in allen hier mitgeteilten Photolysen, mit Ausnahme der Laserblitzstudien, war die Quellenlampe eine Quecksilberhochdrucklampe von 500 W. Die 366 nm Emission wurde mit einem Bausch und Lomb Gittermonochromator isoliert). Im photostationären Zustand ist das cis-Photoisomere 60 % des Gemisches, und der &epsi;-Wert der cis-Verbindung ist < 40 % desjenigen der Trans- Verbindung bei 360 nm. Eine 5 Minuten dauernde Photolyse von DEA Acyl in 98 % Ethanol/2 % Tris-Puffer, pH-Wert 7,4, ergibt eine scharfe Abnahme im Absorptionsvermögen bei 360 nm, gefolgt durch eine langsame Zunahme des Absorptionsvermögens bei 380 nm aufgrund der Dunkelbildung des 3- Methyl-7-N,N-Dietyhlaminokumarins (nachfolgend "das Kumarin"). Die Zunahme des Absorptionsvermögens aufgrund des Kumarins ist erster Ordnung mit kc = 7,17 10&supmin;&sup4; s&supmin;¹. Die Anwesenheit dieses cis-Isomeren ist durch Kernspinresonanz nach Photolyse als < 0º C bestätigt worden. Die Geschwindigkeit der Cyclisierung von cis-DEA Acyl ist lösungsmittelabhängig und nimmt um zwei Größenordnungen in 50/50 Ethanol/Tris-Puffer zu (Tabelle 1). Die Photolyse von trans-DEA Acyl in Tris-Puffer allein ergibt eine saubere Umwandlung in Kumarin, wobei bei 370 nm ein isosbestischer Punkt zu beobachten ist. In Tris und bei Anwendung herkömmlicher Spektroskopie gibt es also keinen Nachweis für die Bildung von cis-DEA Acyl bei der Umwandlung des trans-Isomeren in Kumarin, aber Blitzphotolyseversuche (siehe unten) deuten an, daß das cis-Intermediärprodukt gebildet wird, aber in diesem Lösungsmittel sehr reaktiv ist. Die Ausbeute an Kumarin aus DEA Acyl ist unter allen beschriebenen Bedingungen im wesentlichen quantitativ.
  • Die Photolyse von DEA Acylthrombin (2,0 um in Tris mit pH 7,4) mit monochromatischem 366 nm Licht während 25 Sekunden führt zur Ausbildung des voll aktiven Enzyms (durch chromogene Untersuchung) und von 1 Äquivalent von Kumarin, bestimmt durch Gaschromatographie und Fluoreszenz von 4 bei 480 nm. Mit herkömmlicher Spektroskopie ist kein Nachweis für ein cis-Acylenzym-Photoisomeres zu sehen. Nachweis für das cis-Photoisomere erbringt allerdings die Blitzphotolyse (10 ns) von DEA Acyl oder DEA Acylthrombin in Tris-Puffer mit 355 nm Licht eines Nd/Yad-Lasers. Sowohl im Fall von DEA Acyl als auch DEA Acylthrombin führt der Blitz zu einer sofortigen Abnahme des Absorptionsvermögens bei 380 nm, gefolgt durch eine Zunahme erster Ordnung des Absorptionsvermögens, während sich das Kumarin aus dem cis-Intermediärprodukt bildet. Die wichtigen Geschwindigkeitskonstanten erster Ordnung, die in dieser Studie bestimmt wurden, sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Geschwindigkeitskonstanten erster Ordnung für die Enzymdeacylierung und Cyclisierung von Cis-Photoisomeren bei 23º C Verbindung Lösungsmittel Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung s.1 Halbwertszeit trans-Acylthrombin trans-DEA Acylthrombin cis-DEA Acyl cis-DEA Acylthrombin Tris pH 7,4 98/2 Ethanol/Tris pH 7,4 a. Halbwertszeit der trans-Acylenzymdeacylierung b. Halbwertszeit der Cyclisierung zur Erzeugung des Kumarins c. Blitzphotolyse
  • Die Deacylierung von cis-DEA Acylthrombin ist > 10&sup9; schneller als die Deacylierung von trans-DEA Acylthrombin. Das resultiert aus dem betroffenen Deacylierungsmechanismus, da das interne Nukleophile am aromatischen Cinnamatring das Carbonyl des Enzymserinesters nicht angreifen kann, wenn das Alken "trans" ist. Durch die Photoisomerisierung wird das Nukleophile der reaktiven Stelle zur Deacylierung geboten, und die Lactonisierung des cis- Alkens ist ein rascher Prozeß im aktiven Zentrum des Enzyiris, siehe R. McClelland et al., 57 Can. J. Chem, 2260 (1979); S. Milstein und L. Cohen, 67 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1143 (1970).
  • Auch ein Vergleich der Deacylierungsgeschwindigkeiten von DEA Acylthrombin und DEA Acyl ist von Interesse. Unter den gleichen Bedingungen hinsichtlich Lösungsmittel und Temperatur lactonisiert cis-DEA Acylthrombin 1000-mal schneller als cis-DEA Acyl. Das aktive Zentrum des Enzyms hat ein Histidin-Asparagingsäurependel (Creighton, T.E., Proteins, Structures and Molecular Principles, New York: W.H. Freeman and Company 1984, 427), um der verlassenden Serinhydroxylgruppe das erforderliche Proton zu liefern und das Proton vom phenolischen Nukleophilen anzunehmen. Die normale katalytische Aktivität des Enzyms trägt also offensichtlich zur Deacylierung bei, sobald das interne Nukleophile dem aktiven Zentrum durch Photoisomerisierung dargeboten wird. Die Katalyse des aktiven Zentrums bei Verfahren wie der Dehydrohalogensierung und Lactamisierung von Acylserinproteasen ist Gegenstand weiterer wichtiger Studien gewesen, siehe C. kam et al., 27 Biochemistry 2547 (1988); A. Krantz et al., 30 J. Med. Chem. 589 (1987); R. Westkaemper und R. abeles, 19 Biochemistry 3256 (1983); L. Hedstrom et al., 23 Biochemistry 1753 (1984).
  • Die vorstehenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung und sind nicht als einschränkend zu verstehen. Die Erfindung wird durch die folgenden Ansprüche bestimmt.

Claims (30)

1. Acylenzym der Formel
in der
ENZ = ein Enzym, ausgewählt aus der aus Serinproteinasen und Cysteinproteinasen bestehenden Gruppe;
X = der Sauerstoff der Hydroxyl-Gruppe im katalytischen Zentrum von ENZ, wenn ENZ eine Serinproteinase ist, und
X = der Schwefel der Sulfhydryl-Gruppe im katalytischen Zentrum von ENZ, wenn ENZ eine Cysteinproteinase ist;
Y = ausgewählt aus der aus -NR&sub3;R&sub4;, -OR&sub5; und -SR&sub5; bestehenden Gruppe;
Z = ein Nukleophiles, ausgewählt aus der aus -OH, -SH, -NH&sub2; und -NHR&sub6; bestehenden Gruppe, worin R&sub6; C1- bis C4-Alkyl ist;
m = 0 bis 3;
n = 1 oder 2, unter dem Vorbehalt, daß Y in dem Ring an der 4er-Stelle, der 6er-Stelle oder sowohl an der 4er- als auch der 6er-Stelle substituiert ist;
R&sub1; = ausgewählt aus der aus H, C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugiertem Akynyl bestehenden Gruppe;
R&sub2; = ausgewählt aus der aus H, C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugiertem Alkynyl bestehenden Gruppe;
R&sub3; = ausgewählt aus der aus H, C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugiertem Alkynyl bestehenden Gruppe;
R&sub4; = ausgewählt aus der aus C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugiertem Alkynyl bestehenden Gruppe; und
R&sub5; = ausgewählt aus der aus C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugiertem Alkynyl bestehenden Gruppe.
2. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem ENZ = eine Serinproteinase und X = der Sauerstoff der Hydroxyl-Gruppe im katalytischen Zentrum von ENZ.
3. Acylenzym nach Anspruch 2, bei dem ENZ ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Trypsin, Chymotrypsin, Thrombin, Plasmin, Acrosin, Koagulationsfaktor IX, Koagulationsfaktor X, Koagulationsfaktor XI, Koagulationsfaktor XII, Plasminogenaktivator, Plasmakallikrein, Gewebekallikrein, Pankreatoelastase sowie Leukozytenelastase besteht.
4. Acylenzym nach Anspruch 3, bei dem ENZ ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Thrombin, Plasmin, Koagulationsfaktor IX, Koagulationsfaktor X, Koagulationsfaktor XI, Koagulationsfaktor XII sowie Plasminogenaktivator besteht.
5. Acylenzym nach Anspruch 3, bei dem ENZ aus der aus Trypsin und Chymotrypsin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
6. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem Y = -NR&sub3;R&sub4;
7. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem Z ein Nukleophiles, ausgewählt aus der aus -SH und -OH bestehenden Gruppe ist.
8. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem Z = -OH.
9. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem m = 0 bis 1.
10. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem m = 0.
11. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem n =1.
12. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem n = 1 und Y in dem Ring an der 4er-Stelle substituiert ist.
13. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem R&sub1; = C1- bis C4-Alkyl.
14. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem R&sub1; = Methyl.
15. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem R&sub2; = H oder C1- bis C2-Alkyl.
16. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem R&sub2; = H.
17. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem R&sub3; und R&sub4; jeweils unabhängig C1- bis C2-Alkyl sind.
18. Acylenzym nach Anspruch 1, bei dem
ENZ = eine Serinproteinase und X = der Sauerstoff der Hydroxyl-Gruppe im katalytischen Zentrum von ENZ;
Y = -NR&sub3;R&sub4;;
Z = ein Nukleophiles, ausgewählt aus der aus -SH und -OH bestehenden Klasse;
m = 0 bis 1;
n = 1;
R&sub1; = C1- bis C4-Alkyl;
R&sub2; = H oder C1- bis C2-Alkyl; und
R&sub3; und R&sub4; jeweils unabhängig C1- bis C2-Alkyl sind.
19. Verfahren zum Herstellen eines aktiven Enzyms, welches aus der aus Serinproteinase und Cysteinproteinase bestehenden Klassse ausgewählt ist, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
(a) es wird ein Acylenzym der Formel
bereitgestellt, in der
ENZ = ein Enzym, ausgewählt aus der aus Serinproteinasen und Cysteinproteinasen bestehenden Gruppe;
X = der Sauerstoff der Hydroxyl-Gruppe im katalytischen Zentrum von ENZ, wenn ENZ eine Serinproteinase ist, und
X = der Schwefel der Sulfhydryl-Gruppe im katalytischen Zentrum von ENZ, wenn ENZ eine Cysteinproteinase ist;
Y = ausgewählt aus der aus -NR&sub3;R&sub4;, -OR&sub5; und -SR&sub5; bestehenden Gruppe;
Z = ein Nukleophiles, ausgewählt aus der aus -OH, -SH, -NH&sub2; und -NHR&sub6; bestehenden Gruppe, worin R&sub6; C1- bis C4-Alkyl ist;
m = 0 bis 3;
n = 1 oder 2, unter dem Vorbehalt, daß Y in dem Ring an der 4er-Stelle, der 6er-Stelle oder sowohl an der 4er- als auch der 6er-Stelle substituiert ist;
R&sub1; = ausgewählt aus der aus H, C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugiertem Akynyl bestehenden Gruppe;
R&sub2; = ausgewählt aus der aus H, C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugiertem Alkynyl bestehenden Gruppe;
R&sub3; = ausgewählt aus der aus H, C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugiertem Alkynyl bestehenden Gruppe;
R&sub4; = ausgewählt aus der aus C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugiertem Alkynyl bestehenden Gruppe; und
R&sub5; = ausgewählt aus der aus C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugiertem Alkynyl bestehenden Gruppe;
und dann
(b) wird das Acylenzym Licht einer Frequenz und Intensität ausgesetzt, die ausreichen, uni eine trans-cis-Photoisomerisierung des Acylenzyms zu induzieren, wodurch das Acylenzym durch nukleophilen Angriff von Z auf den X benachbarten Karbonylsauerstoff gespalten wird, um das Enzym in aktiver Form zu erzeugen.
20. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem das Acylenzym in wässriger Lösung bereitgestellt wird, bei dem in der wässrigen Lösung ferner ein Substrat des Enzyms bereitgestellt wird, und bei dem das Substrat eine Umsetzung erfährt, die durch das Enzym nach dem Schritt katalysiert wird, bei dem das Acylenzym Licht ausgesetzt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 19, bei dem das Acylenzym dadurch aktiviert wird, daß es Licht einer Frequenz von mindestens etwa 300 Nanometer ausgesetzt wird.
22. Verbindung, die als Zwischenprodukt zur Herstellung mittels Licht aktivierbarer Acylenzyme verwendbar ist und folgende Formel hat:
in der A aus der aus
bestehenden Klasse ausgewählt ist;
in der B eine Valenzbindung oder -N- ist;
Y = ausgewählt aus der aus -NR&sub3;R&sub4;, -OR&sub5; und -SR&sub5; bestehenden Gruppe;
Z = ein Nukleophiles, ausgewählt aus der aus -OH, -SH, -NH&sub2; und -NHR&sub6; bestehenden Gruppe, worin R&sub6; C1- bis C4-Alkyl ist;
m = 0 bis 3;
n = 1 oder 2, unter dem Vorbehalt, daß Y in dem Ring an der 4er-Stelle, der 6er-Stelle oder sowohl an der 4er- als auch der 6er-Stelle substituiert ist;
R&sub1; = ausgewählt aus der aus H, C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugiertem Akynyl bestehenden Gruppe;
R&sub2; = ausgewählt aus der aus H, C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugierte Alkynyl bestehenden Gruppe;
R&sub3; = ausgewählt aus der aus H, C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugierte Alkynyl bestehenden Gruppe;
R&sub4; = ausgewählt aus der aus C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugierte Alkynyl bestehenden Gruppe; und
R&sub5; = ausgewählt aus der aus C1- bis C4-Alkyl, C3- bis C4- unkonjugiertem Akenyl sowie C3- bis C4-unkonjugierte Alkynyl bestehenden Gruppe;
oder ein Salz derselben.
23. Verbindung nach Anspruch 22, bei der Y = -NR&sub3;R&sub4;.
24. Verbindung nach Anspruch 22, bei der Z = ein Nukleophiles, ausgewählt aus der aus -SH und -OH bestehenden lasse.
25. Verbindung nach Anspruch 22, bei der m = 0 bis 1.
26. Verbindung nach Anspruch 22, bei der n = 1.
27. Verbindung nach Anspruch 22, bei der R&sub1; = C1- bis C4-Alkyl.
28. Verbindung nach Anspruch 22, bei der R&sub2; = H oder C1- bis C2-Alkyl.
29. Verbindung nach Anspruch 22, bei der R&sub3; und R&sub4; jeweils unabhängig C1- bis C2-Alkyl sind.
30. Verbindung nach Anspruch 22, bei der
Y = -NR&sub3;R&sub4;;
Z = ein Nukleophiles, ausgewählt aus der aus -SH und -OH bestehenden Klasse;
m = 0 bis 1;
n = 1;
R&sub1; = C1- bis C4-Alkyl;
R&sub2; = H oder C1- bis C2-Alkyl; und
R&sub3; und R&sub4; jeweils unabhängig C1- bis C2-Alkyl sind.
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