KR100192004B1 - 광활성 아실 효소 및 그를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 화합물 또는 그의 염 - Google Patents

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Abstract

광활성화 아실 효소 및 그의 제조방법과 그를 제조하는데 유용한 중간체 화합물 본 발명은 다음의 식(Ⅲ)을 갖는 광활성화 아실 효소에 관하여 기술되어 있다.
상기 식(Ⅲ)의 화합물에서, ENZ는 효소이고, X는 0 또는 S이고, Y는 -NR3R4, -OR5, 또는 -SR5,이고 Z는 구핵원자이고, m은 0 내지 3이고, n은 1 또는 2이고, Y는 상기 고리의 위치 4, 위치 6, 또는 위치 4 및 6에서 치환된다. R1및 R2는 각각 H, C1내지 C4알킬, C3내지 C4비공명 알케닐, 또는 C3내지 C4비공명 알키닐이다. R3및 R4는 각각 H, C1z내지 C4알킬, C3내지 C4비공명 알케닐, 또는 C3내지 C4비공명 알키닐이고, R3및 R4가 동시에 둘다 H는 아니다.
R5는 C1내지 C4알킬, C3내지 C4비공명 알케닐, 또는 C3내지 C4비공명 알키닐이다.
또한 본 발명은 광활성화 아실 효소를 제조하는 방법 및 그에 사용되는 아실 효소 및 중간체 화합물에 대해서도 기술되어 있다. 바람직한 중간체 화합물로서는 2-프로펜산, 3-(2-히드록시-4-디에틸아미노페닐)-2-메틸, 4-(아미노이미노메틸)페닐 에스테르, (E)-, 모노하이드로 클로라이드 염이 있는데, 그러한 화합물은 바람직하게는 아실-트롬빈을 형성하기 위해 트롬빈과 반응한다.

Description

[발명의 명칭]
광활성 아실 효소 및 그를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 화합물 또는 그의 염
[승인문]
본 발명은 미국 정부의 재정 지원으로 이루어졌고, 미국 정부가 본 발명의 특정 권한을 소유할 수 있다.
[본 발명의 배경]
광활성 효소(Light-activatable enzymes)는 화학적 광증폭기 및 광활성 치료제로서 흥미롭다. 하나의 광활성 효소를 분당 수천의 분자로 전환시키는 광증폭기로서의 능력[D. Hug의 6 Photochem. Photobiol. Rev. 87(1981) 개괄 참조]은 그것이 시험관내 진단 검정과 같은 시스템 내에서 스위치와 같은 매력을 갖도록 한다. 그 표면이 혈액에 의해 고도로 살포되고 광처리에 영향을 받기 쉽기 때문에 치료학적으로 이용가능하다(J. Parrish, 77 J. Invest. Dermatology 45(1981) 개괄 참조).
S. Varfolomeyev 등의 15FEBS Lett. 118(1971)에는 α-키모트립신과 p-니트로-트랜스-신남산의 p-니트로페닐 에스테르 사이의 아실 효소 형성에 대해 기술되어 있다(식 Ⅰ을 참조하고, 여기에서 ENZ는 키모트립신이다).
상기 효소와 아실기 사이의 결합은 효소의 촉매 중심에서 세린의 히드록시기에 의해 형성된다(I. Berezin 등의 8FEBS Letters 173(1970); K. Martinek 등의 29 Photochem. and Photobiol. 637(1979); I. Berezin 등의 2 Enzyme Microb. Technol. 150(1980); 및 N. Kazanskaya 등의 5Enzyme Microb. Technol. 209(1983) 참조). 이들 연구는 단지 광이성질체를 분화시키는 입체 효과에만 의존한다. 대개 시스-신나모일 부가물은 트랜스 복합체보다 더 안정하지만 몇몇 경우에 이 차이는 다섯배 정도로 낮다.
A. Turner 등의 109 J. Am. Chem. Soc. 1274(1987)에는 α트롬빈과 0-히드록실-α-메틸신남산의 트랜스 이성질체 사이의 아실 효소의 형성에 대해 기술되어 있다(식 Ⅱ를 참조하고, 여기에서 ENZ는 트롬빈이다).
상기 효소와 아실기 사이의 결합의 효소의 촉매 중심에서 세린의 히드록시기에 의해 형성된다[A. Turner 등의 110 J. Am. Chem. Soc. 244(1988) 참조]. 이화합물은 광이성질화가 이루어질 때, 세린 히드록시기의 산소에 근접한 카르보닐 산소에 대한 내부 친핵체의 공격으로 인해 탈아실화되게 하는 내부 친핵체로서의 히드록시기를 아실기상에 포함한다.
식 Ⅱ의 아실 효소에 있어서 효소 활성 저해는 일시적이며, 효소 활성은 어둠속에서 몇시간 경과한 후에 회복된다. 더구나 이들 효소의 광활성은 서서히 일어나고, 감지할 수 있는 효소 분해가 광활성 동안에 일어나게 하는 빛의 세기 및 파장을 필요로 한다. 그러므로 광활성 아실 효소의 개발에 있어 새로운 연구를 해야 할 필요가 있다. 본 발명은 이 분야에서의 지속적인 연구에 근거를 두고 있다.
[본 발명의 요약]
본 발명은 다음의 식을 갖는 광활성 아실 효소에 대해 기술하고 있다:
ENZ는 세린 단백질 가수분해 효소와 시스테인 단백질 가수분해 효소로 구성된 군에서 선택한 효소이다. ENZ가 세린 단백질 가수분해 효소일 때 X는 ENZ의 촉매 중심 내의 히드록시기의 산소이고, ENZ가 시스테인 단백질 가수분해 효소일 때 X는 ENZ의 촉매 중심 내의 설프히드릴기의 황이다.
Y는 -NR3R4, -OR5및 -SR5로 구성된 군에서 선택한다. 바람직하게, Y는 -NR3R4이다.
Z는 -OH, -SH, -NH2및 -NHR6(여기에서 R6은 C1내지 C4알킬이다)로 구성된 군에서 선택한 친핵체이다. 바람직하게, Z는 -OH 및 -SH로 구성된 군에서 선택한다.
m은 0 내지 3이다. 바람직하게, m은 0 내지 1이고 가장 바람직하게는 0이다.
n은 Y가 고리상의 위치 4, 위치 6, 또는 위치 4와 6에서 치환된다는 조건하에 1 또는 2이다. 바람직하게, n은 1이다. 더욱 바람직하게, n은 1이고 Y는 고리상의 위치 4에서 치환된다. 통틀어, m 및 n은 5 이하이다.
R1은 H, C1내지 C4알킬, C3내지 C4짝안지은 알케닐 및 C3내지 C4짝안지은 알키닐로 구성된 군에서 선택한다. 바람직하게, R1은 C1내지 C4알킬이고, 이중 메틸이 가장 바람직하다.
R2는 H, C1내지 C4알킬, C3내지 C4짝안지은 알케닐 및 C3내지 C4짝안지은 알키닐로 구성된 군에서 선택한다. 바람직하게, R2는 H 또는 C1내지 C4알킬이고, 이중 H가 가장 바람직하다.
R3는 H, C1내지 C4알킬, C3내지 C4짝안지은 알케닐 및 C3내지 C4짝안지은 알키닐로 구성된 군에서 선택한다.
R4는 C1내지 C4알킬, C3내지 C4짝안지은 알케닐 및 C3내지 C4짝안지은 알키닐로 구성된 군에서 선택한다. 바람직하게, R3및 R4는 C1내지 C4알킬이다.
R5는 C1내지 C4알킬, C3내지 C4짝안지은 알케닐 및 C3내지 C4짝안지은 알키닐로 구성된 군에서 선택한다. 바람직하게, R5는 C1내지 C4알킬이고, 이중 메틸이 가장 바람직하다.
아실 효소는, 그 아실 효소의 광이성질화를 트랜스에서 시스로 유도하기에 충분한 주파수 및 세기에서 식(Ⅲ)의 아실 효소를 빛에 노출시킴으로써 세린 단백질 가수분해 효소 및 시스테인 단백질 가수분해 효소로 구성된 군에서 선택한 활성 효소를 제조하는데에 사용한다. 그런 다음 X에 근접한 카르보닐 산소에 대한 Z의 친핵적 공격으로 인해 아실 효소를 절단하여 이 효소를 활성 형태로 제조한다.
또한 본 발명은 다음 식을 갖는, 본 발명의 아실 효소를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 화합물[또는 억제제(inhibitors)]에 대해 기술하고 있다:
여기에서, A는및로 구성된 군에서 선택한다. 여기에서, B는 원자가 결합 또는 -N-이고; Y, Z, R1및 R2는 상기 식(Ⅲ)의 아실 효소와 관련하여 주어진 바와 같다. 또한, 식(Ⅳ)의 화합물의 염에 대해서도 기술하고 있다.
[발명의 상세한 설명]
본 발명의 아실 효소는 세린 단백질 가수분해 효소 또는 시스테인 단백질 가수분해 효소를 적당한 억제제와 반응시킴으로써 제조한다. 억제제는 적당한 이탈기에 공유결합된 식(Ⅲ)의 아실 효소의 아실기를 포함한다. 이탈기는 효소의 활성 부위에 결합하여 미하엘리스-멘텐(Michaelis-Menten) 중간체를 형성하도록 하기 위해 선택한다. 반응은 이탈기만을 효소와 결합시키는데에 사용하는 방법에 따라 수용액에서 실시할 수 있다. 일단 미하엘리스-멘텐 중간체가 생성되면, 효소의 촉매 중심에 존재하는 히드록시기 또는 설프히드릴기가 아실기의 카르보닐 산소를 친핵 공격하여 아실 효소가 생성된다. 그로 인해 이탈이가 억제제로부터 절단되면서 효소와 아실기 사이에 에스테르가 생성된다.
전형적인 세린 단백질 가수분해 효소는 다음을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다: 키모트립신, 키모트립신 C, 메트리듐(Metridium) 단백질 가수분해 효소 A, 트립신, 트롬빈, 응고 인자 Xa, 플라스민, 인테로펩티다아제, 아크로신, 믹소박터(Myxobacter) α-용균성 단백질 가수분해 효소, 섭티리신, E. coli 페리플라스믹 단백질 가수분해 효소, 아스페르질러스(Aspergillus) 알킬리 단백질 가수분해 효소, 트리티라치움(Tritirachium) 알칼리 단백질 가수분해 효소, 아르트로박터(Arthrobacter) 세린 단백질 가수분해 효소, 슈도모나스(Pseudomonas) 세린 단백질 가수분해 효소, 터모마이콜린(Thermomycolin), 호열성 스트렙토마이세스(Streptomyces) 세린 단백질 가수분해 효소, 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica) 세린 단백질 가수분해 효소, 앨터너리아(Alternaria) 세린 단백질 가수분해 효소, 테네브리오(Tenebrio) α-단백질 가수분해 효소, 포도상구균성(Staphylococcal) 세린 단백질 가수분해 효소, 카텝신 G, 응고 인자 VIIa(소), 응고 인자 IXa, 비페라 루셀리(Vipera russelli) 단백질 가수분해 효소, 적혈구 중성 엔도펩티다아제, 큐커미신, 프로릴 엔도펩티다아제, 응고 인자 XIa, 아그키스트로돈(Agkistrodon) 세린 단백질 가수분해 효소, 보드롭스 아트록스(Bothrops atrox) 세린 단백질 가수분해 효소, 크로탈루스 아다만테우스(Crotalus adamanteus) 세린 단백질 가수분해 효소, 플라스미노젠 활성화인자(예를들어, 조직 플라스미노젠 활성화인자, 유로키나아제, 스트렙토키나아제), 우카 푸질레이터(uca pugilator) 콜라겐 용균 단백질 가수분해 효소, 엔토모프토라(Entomophthora) 콜라겐 용균 단백질 가수분해 효소, 혈장 칼리크레인, 조직 칼리크레인, 췌장 엘라스타아제, 백혈구 엘라스타아제, 응고 인자 XIIa, 키마아제, 하악골하의 단백질 가수분해 효소 A, 보체 부성분, 전형적-보체-경로 C3/C5전환효소, 보체 인자 I, 보체 인자 D, 교대적-보체-경로 C3/C5전환효소, 효모 단백질 가수분해 효소 B, 하이포더마(Hypoderma) 콜라게나아제, 아크로모박터(Achromobacter) 단백질 가수분해 효소 I, 백혈구-막 중성 엔토펩티다아제 및 카텝신 R. 효소 명명법 1984: 효소 촉매화 반응의 명명법 및 분류에 대한 노멘클레이쳐 코미티 오브 디 인터내쇼날 유니온 오브 바이오케미스트리(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry)의 권고(아카데믹 프레스, 인코포레이티드 1984)(이하 효소 명명법 1984라 약칭한다)를 개괄 참조하라.
전형적인 시스테인 단백질 가수분해 효소는 다음을 포함하지만 이에 국한되지는 않는다:카텝신 B, 파파인, 피신, 브로멜라인, 보체 구성단백 C3/C5전환효소, 베이커의 효모 단백질 가수분해 효소, 리실(Lysyl) 결합 특이 단백질 가수분해 효소, 리보솜 카텝신, 카텝신 B1, 파파야 펩티다아 제1, 키모파파인, 아스클레파인(Asclepain), 클로스트리파인(Clostripain), 연쇄상구균성(Streptococcal) 시스테인 단백질 가수분해 효소, 감마-글루타민 가수분해 효소, 포도상구구균성 시스테인 단백질 가수분해 효소, 엑티니딘, 카텝신 L, 카텝신 H, 칼파인, 프로릴 엔도펩티다아제(티올-의존성), 클로스트리디오펩티다아제 B, 연쇄상구균성 단백질 가수분해 효소, 콘쥬가아제(conjugase), 포도상구균성 단백질 가수분해 효소, Ⅱ, 억티니디아(Actinidia) 음이온성 프로테아제, 카텝신 B3및 프로릴-(D,L)-알라닌-펩티딜 가수분해 효소. 효소 명명법 1984를 개괄 참조하라.
세린 단백질 가수분해 효소는 본 발명을 실시하는데에 바람직하다. 더욱 바람직한 것은 트립신, 키모트립신, 트롬빈, 플라스민, 아크로신, 응고 인자 IXa, 응고 인자 Xa, 응고 인자 XIa, 응고 인자 XIIa, 플라스미노젠 활성화인자, 혈장 칼리크레인, 조직 칼리크레인, 췌장 엘라스타아제 및 백혈구 엘라스타아제로 구성된 군의 세린 단백질 가수분해 효소이다.
본 발명의 실시를 위해 사용되는 단백질 가수분해 효소는 자연 단백질 가수분해 효소 또는 그의 유도체일 수 있다. 자연 단백질 가수분해 효소의 유도체는 그 자연 단백질 가수분해 효소 내에서 발견되는 아미노산에 첨가되는 아미노산, 그로부터 제거되는 아미노산 또는 그로부터 변화되는 아미노산을 수반하는 단백질 가수분해 효소들이다. 유도 단백질 가수분해 효소의 촉매 활성도는 그에 상응하는 자연 단백질 가수분해 효소의 촉매 활성도와 동일하거나 상이할 것이다. 단지 요구되는 것은 유도 단백질 가수분해 효소가 단백질 가수분해 효소로서의 활성도를 보유하고 그 효소의 촉매 중심내에 세린 또는 히드록시기를 보유하는 것이다.
아실 효소를 생성하는 데에 사용되는 효소를 수반하는 미하엘리스-멘텐 복합체를 생성할 수 있고 그 효소에 결합된 아실기와 함께 에스테르를 생성할 수 있는 모든 기는 이탈기로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 이미다졸 유도체는 α-키모트립신에 대한 우수한 기질로 공지되어 있다. Markwardt의 지휘하에 라이프치히에 있는 팀은 수십개의 억제제를 제조하였고 그것들을 트립신, 플라스민 및 트롬빈으로 검정하였다[F. Markwardt 등의 29 Pharmazie 333(1974); G. Wagner 등의 28 Pharmaszie 293(1973); J. Sturzebecher 등의 35 Acta Biol. Med. Germ. 1665(1976); P Walsmann 의 109 Folia Haematol., Leipzig 75(1982); V. Valenty 등의 88 Biochem. Biophys. Res. Comm. 1375(1979); F. Markwardt 등의 28 Acta Biol. Med. Germ 19(1972) 개괄 참조]. 이들은 효소 활성 세린 또는 시스테인의 안정한 카르복실레이트 에스테르로 유도하는 화합물이다. 연구되어 왔던 다른 억제제는 안정한 술포네이트 에스테르 또는 포스페이트 에스테를 생성하기 위해 효소와 반응하는 화합물을 포함한다[R. Laura 등의 19 Biochemistry 4859(1980); S. wong 및 E. Shaw의 161 Ann. Biochem. and Biophys. 536(1974) 참조]. 그러므로 페닐메탄술포닐 플루오라이드는 키모트립신과 반응하여 공유결합 복합체를 형성하고, 벤젠술포닐 플루오라이드는 일반적으로 트립신, 트롬빈, 인자 Xa, 칼리크레인 및 플라스민과 반응하여 세린 아실 유도체를 형성한다[A. Gold 및 D. Fahrney, 3 Biochemistry 783(1964) 참조]. 디이소프로필 플로오로포스페이트는 세린 단백질 가수분해 효소 및 에스테라아제와 반응하고 이 시약은 비가역 억제제로서 광범위하게 사용되어 왔다[P. Bracha 및 R. O'Brien, 9 Biochemistry 741(1970) 참조]. 실제로, 구조식 R-0-P(=0) (-X)-R'을 수반하는 많은 화합물은 R이 아릴기 또는 알킬기이고, R'가 아릴록시, 알콕시, 아릴, 알킬 또는 치환 아미노기이고 X가 이탈기(괄호안의 기는 상기 괄호 표기하지 않은 마지막 원자에 나타난 바와 같이 결합되어 있다)인 억제제이다.
바람직한 억제제는 식(Ⅳ)에 나타나 있다. 바람직한 억제제 중에서, 트립신 및 키모트립신과 같은 소화 효소에 의해 아실 효소를 제조하는데 사용하기에는 p-니트로페닐이 이탈기인 억제제가 바람직하다. 4-아미디노페닐 또는 4-구아니디노페닐이 이탈기인 억제제는 트롬빈, 플라스민, 응고 인자 IXa, 응고 인자 Xa, 응고 인자 XIa, 응고 인자 XIIa 및 프라스미노젠 활성화인자와 같은 응고 효소에 의해 아실 효소를 제조하는데 사용하기에 바람직하다.
다음의 화합물은 본 발명의 아실 효소를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 전형적인 억제제를 나열한 것이다. 이들 화합물은 공지된 방법과 함께 하기 실시예의 지침에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 화합물은 염의 형태로 제공될 수 있다. 적당한 염으로서는 (a) 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산과 같은 무기산, (b) 이소티온산(2-히드록시에틸술폰산), 말레산, 말론산, 숙신산, 살리실산, 타르타르산, 락트산, 시트르산, 포름산, 락토비온산, 판토텐산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌-2-술폰산 및 아스코르브산과 같은 유기산 및 (c) 글리신과 같은 아미노산으로부터 유도한 것을 포함하지만 이에 국한되어 있지 않다. 그 화합물을 피검자에게 투여하고자 하는 경우에 한하여 상기 산은 제약학적으로 용인가능한 산일 필요가 있다.
본 발명의 아실 효소는 수용액내에 아실 효소를 제공하고, 용액내에 그 효소에 대한 기질을 제공하여 용액을 빛에 노출시킴으로써 사용할 수 있다. 아실 효소가 빛에 노출된 후 유리 효소에 의해 기질이 촉매 반응된다. 아실 효소는 생체내 또는 시험관내에서 빛에 노출시킬 수 있다. 시험관내에서 사용할 때 그 아실 효소는 특히 광증폭기 또는 광스위치로 사용할 수 있다. 예를들어, 진단 검정은 아실 효소 및 그 효소에 대한 기질을 포함하는 시약을 혼합한 다음 빛에 의해 효소를 활성화시킴으로써 광스위치할 수 있었다. 이것은 다중의 반응을 빛으로 동시에 시작하게 함으로써 공통의 시간 경로를 따라 그 반응을 진행시키는 동안에 반응을 위한 수많은 시료를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 아실 효소는 그것을 광역-스펙트럼광, 여과광 또는 단색광에 노출시킴으로써 활성화시킬 수 있다. 여과되거나 여과되지 않은 500와트의 고안 수은등이 적당한 광원 중의 하나이다. 효소에 의한 흡수 및 효소 자체의 광불활성을 최소화하기 위해 아실 효소를 노출시키는 빛으로부터 약 300nm 또는 그 미만의 파장은 여과하는 것이 바람직하다. 낮은 세기의 자연광이 좋다. 가장 바람직하게, 아실 효소는 아실기의 흡수 최대치와 거의 동일한 파장에서 단색광에 그 효소를 노출시킴으로써 활성화시킨다.
하기 실시예는 본 발명의 특이적 양상 및 구체예를 더욱 충분히 입증하기 위해 제공한다. 이들 실시예는 단지 설명을 목적으로 하는 것으로 본 발명을 제한하고자 설정한 것은 아니다.
[실시예]
다음 화합물의 합성은 실시예 1 내지 8에 기술되어 있다:
화합물 B, E, F 및 H는 본 발명의 아실 효소를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 억제제이다.
[실시예 1]
4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-5-메톡시-α-메틸신나메이트 히드로클로라이드(화합물 A)의 합성
(a) 2-프로펜산, 3-(2-히드록시-5-메톡시페닐)-2-메틸-, 에틸 에스테르, (E)-[또는 에틸-(E)-2-히드록시-5-메톡시-α-메틸신나메이트]의 합성
아르곤 존재하의 실온에서 20ml 벤젠내의 770.3mg(5.06mmol)의 5-메톡시살리실알데히드에 2.20mg(6.08mmol, 1.2당량)의 (카르브에톡시에틸리덴)-트리페닐포스포란을 첨가하였다. 한시간 후 용매를 진공상태에서 제거하고, 용리액으로 75/25 헥산/에틸 아세테이트를 이용하여 실리카겔 상에서 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 1.06mg(88%)의 생성물을 수득하였다; 생성물의 녹는 점은 103-104℃.
(b) 2-프로펜산, 3-(2-히드록시-5-메톡시페닐)-2-메틸-, (E)-[또는 (E)-2-히드록시-5-메톡시-α-메틸신남산]의 합성
318mg(7.95mmol, 6당량)의 방금 분쇄한 NaOH를 실온에서 16ml의 1:1 EtOH:H2O내의 318mg(1.35mmol) 에틸-(E)-2-히드록시-5-메톡시-α-메틸신나메이트로 구성된 교반용액에 가하였다. 그런 다음 반응물을 60℃에서 가열하였다. 45분 후 가열을 중단하고 용액을 냉각조에서 식혔다. 그런 다음 반응물을 10% HCl로 산성화시키고 에테르로 추출하였다. 유기상을 10% HCl로 세척하고, MgSO4에서 건조시키고, 진공상태에서 농축하여 257.7mg(92%)의 생성물을 수득하였다; 생성물의 녹는점은 145-146℃.
(c) 4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-5-메톡시-α-메틸신나메이트 히드로클로라이드의 합성
아르곤 존재하의 실온에서 8ml 건조 피리딘 내의 257.7mg(1.24mmol) (E)-2-히드록시-5-메톡시-α-메틸신남산으로 구성된 교반용액에 307mg(1.49mmol, 1.2당량)의 DCC를 가한 후 235mg(1.36mmol, 1.1당량)의 p-히드록시벤자미딘 히드로클로라이드를 가하였다[G Wagner 및 H. Horn 28 Pharmazie 427(1973); M. Partridge 및 W. Short, J. Chem. Soc. 390(1947) 참조]. 48시간 후에 용액을 여과하여 진공상태에서 농축하고, 용리액으로 90/10 CHCl3/CH3OH를 이용하여 12%(w/w H2O)의 불활성 실리카겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 294mg(65%)의 생성물을 수득하였다; 생성물의 녹는점은 225-226℃.
[실시예 2]
4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-4-메톡시-α-메틸신나메이트 히드로클로라이드(화합물 B)의 합성
(a) 2-프로펜산, 3-(2-히드록시-4-메톡시-페닐)-2-메틸-, 에틸 에스테르, (E)-[또는 에틸-(E)-2-히드록시-4-메톡시-α-메틸신나메이트]의 합성
아르곤 존재하의 실온에서 20ml 벤젠내의 760.8mg(5mmol) 4-메톡시-살리실알데히드로 구성된 교반용액에 2.718g(7.5mmol, 1.2당량)의 (카르브에톡시에틸리덴)-트리페닐포스포란을 첨가하였다. 10분 후 용매를 진공상태에서 제거하고, 용리액으로 80/20 헥산/에틸 아세테이트를 사용하여 실리카겔 상에서 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 1.013g(86%)의 생성물을 수득하였다; 생성물의 녹는 점은 104-105℃.
(b) 2-프로펜산, 3-(2-히드록시-4-메톡시페닐)-2-메틸-, (E)-[또는 (E)-2-히드록시-4-메톡시-α-메틸신남산]의 합성
8ml의 1/1 EtOH:H2O내의 300mg(1.27mmol) 에틸-(E)-2-히드록시-4-메톡시-α-메틸신나메이트로 구성된 교반용액에 300mg(7.5mmol, 6당량)의 방금 분쇄한 NaOH를 실온에서 가하였다. 그런 다음 반응물을 60℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응물을 식힌 후, 10% HCl로 산성화시키고 에테르로 2회 추출하였다. 유기상을 10% HCl로 세척하여, MgSO4에서 건조시키고, 진공상태에서 농축하여 248.9mg의 생성물을 수득하였다; 생성물의 녹는점은 159-160℃.
(c) 4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-4-메톡시-α-메틸신나메이트 히드로클로라이드의 합성
아르곤 존재하의 실온에서 7ml 건조 피리딘 내의 230mg(1.1mmol) (E)-2-히드록시-4-메톡시-α-메틸신남산으로 구성된 교반용액에 273mg(1.33mmol, 1.2당량)의 DCC를 가한 후 209.7mg(1.22mmol, 1.1당량)의 p-히드록시벤자미딘 히드로클로라이드를 가하였다[G Wagner 및 H. Horn 28 Pharmazie 427(1973); M. Partridge 및 W. Short, J. Chem. Soc. 390(1947) 참조]. 25시간 후에 용액을 여과하여 진공상태에서 농축하였다. 용리액으로 90/10 CHCl3/CH3OH를 이용하여 12%(w/w H2O)의 불활성 실리카겔 상에서 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 222mg(55.6%)의 생성물을 수득하였다; 생성물의 녹는점은 198-201℃.
[실시예 3]
4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-5-니트로-α-메틸신나메이트 p-톨루엔술폰산염(화합물 C)의 합성
(a) 2-프로펜산, 3-(2-히드록시-5-니트로페닐)-2-메틸-, 에틸 에스테르, (E)-[또는 에틸-(E)-2-히드록시-5-니트로-α-메틸신나메이트]의 합성
35ml 벤젠내의 1.337g(8mmol)의 5-니트로살리실알데히드의 현탁액에 3.479g(9.6mmol, 1.2당량)의 (카르브에톡시에틸리덴)-트리페닐포스포란을 실온에서 가하였다. 5.25시간 후에 용매를 진공상태에서 제거하고, 용리액으로 80/20 내지 65/35 헥산/에틸 아세테이트를 사용하여 실리카겔 상에서 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 1.629g(81%)의 생성물을 수득하였다; 생성물의 녹는 점은 121-122℃.
(b) 2-프로펜산, 3-(2-히드록시-5-니트로페닐)-2-메틸-, (E)-[또는 (E)-2-히드록시-5-니트로-α-메틸신남산]의 합성
10ml의 1/1 EtOH:H2O내의 242mg(0.96mmol) 에틸-(E)-2-히드록시-5-니트로-α-메틸신나메이트의 교반용액에 방금 분쇄한 KOH 240mg(4.28mmol, 4.5당량)을 실온에서 가하였다. 반응물을 1.5시간 동안 60℃에서 가열하였다. 그 다음 반응물을 냉각하고, 3%의 HCl로 산성화하여 에테르로 2회 추출하였다. 유기상을 3%의 HCl로 세척하고, MgSO4에서 건조시켜 진공상태에서 농축하여 210.3mg(98%)의 생성물을 수득하였다; 분해되면서 녹는점은 235-237℃.
(c) 4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-5-니트로-α-메틸신나메이트 p-톨루엔술폰산염의 합성
아르곤 존재하의 실온에서 3.5ml 건조 피리딘 내의 146.6mg(0.657mmol) (E)-2-히드록시-5-니트로-α-메틸신남산으로 교반용액에 165.1mg(0.8mmol, 1.2당량)의 DCC를 가한 후 258mg(2.1mmol, 3.2당량)의 p-하드록시벤자미딘 히드로클로라이드를 차례로 가하였다[G Wagner 및 H. Horn 28 Pharmazie 427(1973); M. Partridge 및 W. Short, J. Chem. Soc. 390(1947) 참조]. 19.75시간 후에 용액을 여과하고 원래 부피의 반이 되도록 농축하였다. 그 다음에 이 용액을 NaHCO3포화 용액 내로 붓는다. 이 용액을 여과하고 고형물을 H2O로 3회, 아세톤으로 4회 세척하였다. 그 다음에 이 고형물을 1.5ml CH3OH 내에서 현탁시키고 여기에 125mg의 p-톨루엔술폰산 일수화물을 가하였다. 그런 다음 에테르를 가하여 10mg(3%)의 생성물을 용액으로부터 침전시켰다.
[실시예 4]
4-아미노페닐-(E)-2-히드록시-5-디메톡시-α-메틸신나메이트 히드로클로라이드(화합물 D)의 합성
(a) 2-프로펜산, 3-(2-히드록시-3, 5-디메톡시페닐)-2-메틸-, 에틸 에스테르, (E)-[또는 에틸-(E)-2-히드록시-3, 5-디메톡시-α-메틸신나메이트]의 합성
아르곤 존재하의 실온에서 20ml 벤젠내의 728.7mg(4mmol) 3, 5-디메톡시살리실알데히드1,2,3의 교반용액에 1.74g(4.8mmol, 1.2당량)의 (카르브에톡시에틸리덴)-트리페닐포스포란을 가하였다. 2시간 후 용매를 진공상태에서 제거하고, 용리액으로 80/20 헥산/에틸 아세테이트를 사용하여 실리카겔 상에서 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 1.03g(96.5%)의 생성물을 수득하였다.
(b) 2-프로펜산, 3-(2-히드록시-3, 5-디메톡시페닐)-2-메틸-, (E)-[또는 (E)-2-히드록시-3, 5-디메톡시-α-메틸신남산]의 합성
1:1 EtOH:H2O 24ml 내의 1g(3.76mmol) 에틸-(E)-2-히드록시-3, 5-디메톡시-α-메틸신나메이트의 교반용액에 150mg(12.8mmol)의 방금 분쇄한 NaOH를 실온에서 가하였다. 반응물을 1.5시간 동안 60℃에서 가열하였다. 냉각 후에, 반응물을 10% HCl로 산성화시키고 에테르로 2회 추출하였다. 유기상을 10% HCl로 세척하고, MgSO4에서 건조시켜, 진공상태에서 농축하여 839.2mg(93.7%)의 생성물을 수득하였다; 분해되면서 녹는점은 210℃.
(c) 4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-3, 5-디메톡시-α-메틸신나메이트 히드로클로라이드의 합성
아르곤 존재하의 실온에서 8ml 건조 피리딘 내의 306mg(1.28mmol) (E)-2-히드록시-3, 5-디메톡시-α-메틸신남산의 교반용액에 318.1mg(1.54mmol, 1.2당량)의 DCC와 243.9mg(1.41mmol, 1.1당량)의 p-히드록시벤자미딘 히드로클로라이드를 차례로 가하였다[G Wagner 및 H. Horn 28 Pharmazie 427(1973); M. Partridge 및 W. Short, J. Chem. Soc. 390(1947) 참조]. 24시간 후에 용액을 여과하여 진공상태에서 농축하였다. 용리액으로 90/10 CHCl3/CH3OH를 사용하여 12%(w/w H2O)의 불활성 실리카겔 상에서 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 258.4mg(51.4%)의 생성물을 수득하였다. 생성물은 에테르를 가하여 CH3OH로부터 침전시켰다; 생성물의 녹는점은 220-221℃.
[실시예 5]
4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-4, 6-디메톡시-α-메틸신나메이트 히드로클로라이드(화합물 E)의 합성
(a) 2-프로펜산, 3-(2-히드록시-4, 6-디메톡시페닐)-2-메틸, 에틸 에스테르, (E)-[또는 에틸-(E)-2-히드록시-4, 6-디메톡시-α-메틸신나메이트]의 합성
아르곤 존재하의 실온에서 20ml 벤젠내의 728.7mg(4mmol) 3, 6-디메톡시살리실알데히드의 교반용액에 1.735g(4.79mmol, 1.2당량)의 (카르브에톡시에틸리덴)-트리페닐포스포란을 가하였다. 2.5시간 후 이 용매를 진공상태에서 제거하고, 용리액으로 85/15 내지 75/25 헥산/에틸 아세테이트를 사용하여 실리카겔 상에서 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 1.011g(94.9%)의 생성물을 수득하였다.
(b) 2-프로펜산, 3-(2-히드록시-4, 6-디메톡시페닐)-2-메틸-, (E)-[또는 (E)-2-히드록시-4, 6-디메톡시-α-메틸신남산]의 합성
실온에서 EtOH:H2O(1:1) 24ml 내의 965mg(3.62mmol) 에틸-(E)-2-히드록시-4, 6-디메톡시-α-메틸신나메이트의 교반용액에 510mg(12.8mmol, 13.5당량)의 방금 분쇄한 NaOH를 가하였다. 반응물을 1.5시간 동안 60℃에서 가열하였다. 그런 다음 이 용액을 냉각하고 10% HCl로 산성화시키고 에테르로 2회 추출하였다. 유기상을 10% HCl로 세척하고, MgSO4에서 건조시켜 진공상태에서 농축하여 754mg(87%)의 생성물을 수득하였다; 생성물의 녹는점은 141-142℃.
(c) 4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-4, 6-디메톡시-α-메틸신나메이트 히드로클로라이드의 합성
아르곤 존재하의 실온에서 8ml 건조 피리딘 내의 300mg(1.26mmol) (E)-2-히드록시-4, 6-디메톡시-α-메틸신남산의 교반용액에 311.8mg(1.51mmol, 1.2당량)의 DCC와 239.1mg(1.39mmol, 1.1당량)의 p-히드록시벤자미딘 히드로클로라이드를 차례로 가하였다[G Wagner 및 H. Horn 28 Pharmazie 427(1973); M. Partridge 및 W. Short, J. Chem. Soc. 390(1947) 참조]. 26시간 후에 용액를 진공상태에서 제거하고, 용리액으로 90/10 CHCl3/CH3OH를 사용하여 12%(w/w H2O)의 불활성 실리카겔 상에서 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 356.5mg(72%)의 생성물을 수득하였다; 생성물의 녹는점은 187℃.
[실시예 6]
4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-4-디메톡시-α-메틸신나메이트 히드로클로라이드(화합물 F)의 합성
(a) 2-프로펜산, 3-(2-히드록시-4-디에닐아미노페닐)-2-메틸-, 에틸 에스테르, (E)-[또는 에틸-(E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트]의 합성
아르곤 존재하의 실온에서 75ml 벤젠내의 2.9mg(15mmol) 4-디에틸아미노살리실알데히드의 교반용액에 7.07mg(19.5mmol, 1.3당량)의 (카르브에톡시에틸리덴)-트리페닐포스포란을 가하였다. 실온에서 4시간 후에 용매를 진공상태에서 제거하고, 용리액으로 90/10 헥산/에틸 아세테이트를 사용하여 실리카겔 상에서 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 3.52mg(85%)의 생성물을 수득하였다. 생성물의 녹는점은 102℃.
(b) 2-프로펜산, 3-(2-히드록시-4-디에틸아미노페닐)-2-메틸-, (E)-[또는 (E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신남산]의 합성
실온에서 4ml의 에탄올 내의 416mg(1.5mmol) 에틸-(E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트 교반용액에 4ml의 10% NaOH 용액을 가하였다. 반응물을 65℃에서 30분간 가열한 후에 냉각조에서 냉각하였다. 1N의 HCl을 조심스럽게 가하여 pH5로 반응물을 산성화하고 에테르로 2회 추출하여 NH4Cl 포화용액으로 세척하고, Na2SO4로 건조시켜 농축함으로써 365mg(98%)의 산을 수득하였다. 이 화합물의 분해가 장기간 지속되므로 즉시 사용하였다. IR(KBr) 3100-3700(OH), 2850-3050(C-H), 1675(C=O), 1610(C=C).
(c) 4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트 히드로클로라이드의 합성
아르곤 존재하의 실온에서 8ml 건조 피리딘 내의 303mg(1.36mmol) (E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신남산의 교반용액에 336.1mg(1.63mmol, 1.2당량)의 DCC와 257.7mg(1.49mmol, 1.1당량)의 p-히드록시벤자미딘 히드로클로라이드를 차례로 가하였다[G Wagner 및 H. Horn 28 Pharmazie 427(1973); M. Partridge 및 W. Short, J. Chem. Soc. 390(1947) 참조]. 40시간 후에 용액를 진공상태에서 제거하고, 용리액으로 90/10 CHCl3/CH3OH를 사용하여 12%(w/w H2O)의 불활성 실리카겔 상에서 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 258.4mg(47%)의 생성물을 수득하였다; 생성물은 125℃에서 분해.
[실시예 7]
4-니트로페닐-(E)-2-히드록시-α-메틸신나메이트(화합물 G)의 합성
아르곤 존재하의 실온에서 15ml의 건조 피리딘 내의 113.6mg(0.637mmol)의 트랜스-0-히드록시-α-메틸신남산[Shihababu, A.K. 및 Borchardt, R. T., J. org. chem. 48, 2356(1983) 참조]에 160.6mg(0.778mmol, 1.2당량)의 DCC와 98.5mg(0.708mmol, 1.1당량)의 p-니트로페놀을 차례로 가하였다. 반응물을 대략 26시간 동안 아르곤 존재하에서 교반하였다. 그런 다음 이 용액을 여과하고 피리딘은 진공상태에서 제거하였다. 용리액으로 9:1 벤젠:에틸아세테이트를 사용하여 실리카겔 상에서 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 80%의 흰 분말을 수득하였다; 생성물의 녹는점은 166-170℃.
[실시예 8]
4-니트로페닐-(E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트(화합물 H)의 합성
아르곤 존재하의 실온에서 7ml의 건조 피리딘 내의 860mg(3.45mmol)의 (E)-2-히드록시-5-메톡시-α-메틸신남산 교반용액에 854.1mg(4.14mmol, 1.2 당량)의 DCC를 가하고 575.8mg(4.14mmol, 1.2당량)의 p-니트로페놀과 촉매량의 디메틸아미노피리딘을 가하였다. 대략 26시간 후에 실온에서 반응물을 여과하고, 용액는 진공상태에서 제거하였다. 용리액으로 9:1의 벤젠:에틸아세테이트를 사용하여 실리카겔 상에서 잔여물을 플래시 컬럼 크로마토그래피하여 1.26mg(99%)의 생성물을 수득하였다; 생성물의 녹는점은 124-129℃.
[실시예 9]
[비교예 A]
트롬빈을 4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트(화합물 F)로 아실화
아실-트롬빈(이하 DEA 아실-트롬빈)을 형성하는, 4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트 히드로클로라이드(화합물 F)와 트롬빈과의 반응을 발색 검정으로 모니터하였다[A. Turner 등의 110 J. Am. Chem. Soc. 224(1988); B. Blomback, Theoretical Considerations of Substrate Structures Governing Enzyme Specificity, 3(M. Scully 및 V, kakkar eds 1979)(New York:Churchill Livingston) 참조]. pH 7.4의 트리스 완충액 내에서 크롬빈(1.5NM)과 1 내지 5배 과량의 4-아미디노페닐-(E)-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트의 반응은 1시간도 안되어 트롬빈 활성도의 완전한 손실을 초래하였다. 그 결과 생성된 불활성 트롬빈 용액을 세파덱스 G-25상에서 pH 7.4의 트리스 완충액으로 겔 여과시, 활성도가 2% 미만인 것을 제외하고 활성 트롬빈과 동일하게 용리시킨 아실 효소를 제공하였다. 빛이 없는 상태에서, 이 용액의 트롬빈 활성도는 일차 반응에서 1.4×10-6s-1(활성화 반감기=138시간)의 속도로 증가하였다.
그에 비해, 4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-α-메틸신나메이트와 트롬빈으로부터 동일한 방법으로 형성된 아실 트롬빈(이하 아실-트롬빈)의 재활성화에 대한 반감기는 3.8시간이었다.
4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트의 p-디에틸아미노기는 360nm=λmax의 독특한 발색단을 제공한다. DEA 아실-트롬빈의 ε값이 그에 상응하는 에틸 에스테르인 에틸-(E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트의 값(ε=22400)과 일치한다고 가정할 때, 정제된 DEA 아실-트롬빈이 한개의 부착된 아실기를 갖는다는 결론을 얻을 수 있다. 이러한 자료는 4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-α-메틸신나메이트와 4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트(화합물 F)가 아실-트롬빈 및 DEA 아실-트롬빈을 형성하기 위해서 트롬빈의 세린 활성 부위인 히드록시기를 아실화한다는 견해를 지지한다. DEA 아실-트롬빈의 p-디에틸아미노기는 추측컨데 공명에 의해 전자밀도를 제공하며 아실 효소를 안정시킨다[R. kogan 및 T. Fife, 23 Biochemistry 2983(1984); F. Markwardt 등의 28 Acta. Biol. Med. Germ. 19(1972) 참조].
[실시예 10]
[비교예 B]
4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트(화합물 F)에 대한 속도 상수
최적 억제자인 4-아미디노페닐-(E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트 히드로클로라이드(화합물 F)에 대한 속도 상수를 본원에 기록하였다. 이러한 자료는 광활성 과정의 시간 경과에 따른 기록이다.
본 발명자는 효소 시스템 연구의 사전 준비 과정으로 모델 화합물인 에틸-(E)-2-메톡시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트와 에틸-(E)-2-히드록시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트(이하 DEA 아실이 화합물 모델은 트롬빈 대신 에틸을 갖는 DEA 아실-트롬빈임)의 광화학을 연구하였다. 366nm의 빛에 의한 에틸-(E)-2-메톡시-4-디에틸아미노-α-메틸신나메이트의 광분해는 시스 광이성질체를 형성임으로 인해 흡광도가 급격히 감소한다(레이저 플레시 연구를 제외한 본원에 기록된 모든 광분해에서 광원은 수은 500W 고압 램프이다. 366nm의 방출은 Bausch 및 Lomb의 회절 격자 단색화 장치로 분리하였다). 광정류 상태에서 시스 광이성질체는 혼합물의 60%이며 시스 화합물의 ε값은 360nm에서 트랜스 ε값의 40% 미만이다. 98% 에탄올/2% pH 7.4 트리스 완충액 내에서 DEA 아실의 5분 동안의 광분해로 360nm에서의 흡광도가 급속히 감소한 후, 3-메틸-7-N,N-디에틸아미노-쿠마린(이하 쿠마린)의 암 생성(drak formation)으로 인해 380nm에서의 흡광도가 완만히 증가한다. 쿠마린으로 인한 흡광도의 증가는 kc=7.17×10-4s-1으로 일차적이다. 시스 이성질체의 존재는 0℃ 미만에서의 광분해 후 NMR을 통해 확인하였다. 시스 DEA 아실의 고리화 속도는 용매 의존적이며 50/50 에탄올/트리스 완충액 내에서 2단계씩 증가한다(표 1). 트리스 완충액 내에서 트랜스 DEA 아실의 광분해로 인해, 370nm에서 관찰된 등흡광점을 갖는 쿠마린으로 확실히 전환된다. 따라서 트리스 및 통상적인 분광법을 이용하는데에 있어서 트랜스 이성질체의 쿠마린 전환시 시스 DEA 아실의 생성에 대한 증거는 없지만, 시스 중간체가 생성되나 이 용매내에서 반응성이 매우 크다는 것을 플래시 광분해 실험(이하 참조)으로 알 수 있다. DEA 아실로부터의 쿠마린 생성은 기술된 모든 조건하에서 본질적으로 양으로 나타낼 수 있다.
366nm의 단색광으로 25초 동안 DEA 아실-트롬빈(pH 7.4 트리스 내의 2.0μM)을 광분해하면 완전한 활성 효소(발색 검정에 의해 측정) 및 1당량의 쿠마린이 형성되는데, 이는 가스 크로마토그래피 및 480nm에서 4의 형광으로 측정한 바와 같다. 시스 아실 효소 광이성질체에 대한 증거는 통상적인 분광법으로 확인할 수 없다. 그러나 355nm의 Nd/Yad 레이저광으로 트리스 완충액내 DEA 아실 또는 DEA 아실-트롬빈을 플래시 광분해(10nsec)하면 시스 광이성질체에 대한 증거가 나타난다. DEA 아실과 DEA 아실-트롬빈에 대한 플래시 광분해는 380nm에서 흡광도의 즉각적인 감소 결과를 초래하며, 이후에 쿠마린이 시스 중간체로부터 생성되므로 흡광도의 1차적 증가를 초래한다. 본 연구에 의해 결정된 중요한 일차 속도 상수를 표 1에 제시한다.
시스 DEA 아실-트롬빈의 탈아실화는 트랜스 DEA 아실-트롬빈의 탈아실화보다 10 배 이상 빠르다. 이것은 관련된 탈아실화 메카니즘에서 기인하는데, 만약 알켄이 트랜스라면 신나메이트 방향족 고리상의 내부 친핵체가 효소 세린 에스테르의 카르보닐기를 공격할 수 없기 때문이다. 광이성질화는 탈아실화에 대한 반응 부위에 친핵체를 제시하며 시스 알켄의 락톤화는 효소 활성 부위내에서 신속히 진행된다[R. McClelland 등의 57 Can. J. Chem, 2260(1979); S. Milstein 및 L. Cohen. 67 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 1143(1970) 참조].
DEA 아실-트롬빈 및 DEA 아실의 탈아실화 반응 속도의 비교 또한 흥미롭다. 용매 및 온도의 동일 조건하에서 시스 DEA 아실-트롬빈은 시스 DEA 아실보다 1000배 이상 빠른 속도로 락톤화된다. 효소 활성 부위는 세린 히드록시 이탈기에 필요한 양성자를 제공하고 페놀 친핵체로부터 양성자를 수용하기 위해 히스티딘-아스파르트산 셔틀[Creighton, T. E., Proteins, Structures and Molecular Principles, New York: W. H. Freeman and Company 1984, 427]을 갖는다. 따라서 내부 친핵체가 광이성질화에 의해 활성 부위에 나타나면 효소의 정상적인 촉매 활성도는 명백히 탈아실화를 돕는다. 아실 세린 단백질 가수분해 효소의 할로겐화수소 이탈 및 락탐화와 같은 활성 부위 촉매 공정은 다른 중요한 연구의 주제가 되었다[C. Kam 등의 27 Biochemistry 2547(1988); A. Krantz 등의 30 J. Med. Chem. 589(1987); R. Westkaemper 및 R. Abeles, 19 Biochemistry 3256(1983); L. Hedstrom 등의 23 Biochemistry 1753(1984) 참조].
상기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하기 위함이지 본 발명을 한정하고자 함은 아니다. 본 발명은 본원에 포함된 특허청구 범위와 동일하며 다음의 특허청구 범위에 의해 한정된다.

Claims (28)

  1. 다음의 식(Ⅲ)을 갖는 광활성 아실 효소:
    위 식에서: ENZ는 세린 단백질 가수분해 효소 및 시스테인 단백질 가수분해 효소 중에서 선택한 효소이고; X는 ENZ가 세린 단백질 가수분해 효소일 때 ENZ의 촉매 중심 내에 있는 히드록시기의 산소이고, ENZ가 시스테인 단백질 가수분해 효소일 때 ENZ의 촉매 중심 내에 있는 설프히드릴기의 황이며; Y는 -NR3R4, 및 -OR5중에서 선택하고; Z는 -OH이고; m은 0 내지 3이고; n은 Y가 고리의 위치 4, 위치 6 또는 위치 4 및 6에서 치환된다는 조건하에서 1 또는 2이고; R1은 H, C1내지 C4알킬, C3내지 C4짝안지은 알케닐 및 C3내지 C4짝안지은 알키닐 중에서 선택하고; R2는 H, C1내지 C4알킬, C3내지 C4짝안지은 알케닐 및 C3내지 C4짝안지은 알키닐 중에서 선택하고; R3는 C1내지 C4알킬이고; R4는 C1내지 C4알킬이며; R5는 C1내지 C4알킬이다.
  2. 제1항에 있어서, ENZ는 세린 단백질 가수분해 효소이고 X는 ENZ의 촉매 중심 내에 있는 히드록시기의 산소임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  3. 제2항에 있어서, ENZ는 트립신, 키모트립신, 트롬빈, 플라스민, 아크로신, 응고 인자 IXa, 응고 인자 Xa, 응고 인자 XIa, 응고 인자 XIIa, 플라스미노젠 활성화인자, 혈장 칼리크레인, 조직 칼리크레인, 췌장 엘라스타아제 및 백혈구 엘라스타아제 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  4. 제3항에 있어서, ENZ는 트롬빈, 플라스민, 응고 인자 IXa, 응고 인자 Xa, 응고 인자 XIa, 응고 인자 XIIa, 플라스미노젠 활성화인자 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  5. 제3항에 있어서, ENZ는 트립및 키모트립신 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  6. 제1항에 있어서, Y는 -NR3R4임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  7. 제1항에 있어서, m이 0 내지 1임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  8. 제1항에 있어서, m이 0임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  9. 제1항에 있어서, n이 1임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  10. 제1항에 있어서, n인 1이고 Y가 고리의 위치 4 에서 치환됨을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  11. 제1항에 있어서, R1이 C1내지 C4알킬임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  12. 제1항에 있어서, R1이 메틸임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  13. 제1항에 있어서, R2가 H 또는 C1내지 C2알킬임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  14. 제1항에 있어서, R2가 H임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  15. 제1항에 있어서, R3및 R4가 각각 C1내지 C2알킬임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  16. 제1항에 있어서, ENZ가 세린 단백질 가수분해 효소이고 X가 ENZ의 촉매 중심 내에 있는 히드록시기의 산소이며; Y가 -NR3R4이고; Z가 -OH이고; m이 0 내지 1이고; n이 1이고; R1이 C1내지 C4알킬이고; R2가 H 또는 C1내지 C2알킬이고; R3및 R4가 각각 C1내지 C2알킬임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소.
  17. (a) 다음의 식(Ⅲ)을 갖는 아실 효소를 제공하는 단계:
    여기에서: ENZ가 세린 단백질 가수분해 효소 및 시스테인 단백질 가수분해 효소 중에서 선택한 효소이고; X는 ENZ가 세린 단백질 가수분해 효소일 때 ENZ의 촉매 중심 내에 있는 히드록시기의 산소이고, ENZ가 시스테인 단백질 가수분해 효소일 때 ENZ의 촉매 중심 내에 있는 설프히드릴기의 황이며; Y는 -NR3R4, 및 -OR5중에서 선택하고; Z는 -OH이고; m은 0 내지 3이고; n은 Y가 고리의 위치 4, 위치 6 또는 위치 4 및 6에서 치환된다는 조건하에서 1 또는 2이고; R1은 H, C1내지 C4알킬, C3내지 C4짝안지은 알케닐 및 C3내지 C4짝안지은 알키닐 중에서 선택하고; R2는 H, C1내지 C4알킬, C3내지 C4짝안지은 알케닐 및 C3내지 C4짝안지은 알키닐 중에서 선택하고; R3는 C1내지 C4알킬이고; R4는 C1내지 C4알킬이며; R5는 C1내지 C4알킬이고; 및 (b) 이 효소를 활성 형태로 생성시키기 위해 X에 근접한 카르보닐 산소에 대한 Z의 친핵적 공격으로 아실 효소가 절단되도록, 아실 효소의 광이성질화를 트랜스에서 시스로 유도하기에 충분한 주파수 및 세기에서 그 아실 효소를 빛에 노출시키는 단계를 포함하는, 세린 단백질 가수분해 효소 및 시스테인 단백질 가수분해 효소 중에서 선택한 활성 효소의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 아실 효소를 수용액 내에 제공하고 이 효소의 기질을 상기 수용액 내에 제공하여, 아실 효소를 빛에 노출시키는 단계 이후에 상기 기질이 효소에 의해 촉매 반응됨을 특징으로 하는 활성 효소와 제조방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 아실 효소는 약 300nm 이상의 주파수에서 효소를 빛에 노출시킴으로써 활성화됨을 특징으로 하는 활성 효소와 제조방법.
  20. 다음의 식(Ⅳ)를 갖는, 광활성 아실 효소를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 화합물 또는 그의 염:
    여기에서 A는및중에서 선택하고; B는 원자가 결합 또는 -N-이고; Y는 -NR3R4및 -OR5중에서 선택하고; Z는 -OH이고; m은 0 내지 3이고; n은 Y가 고리의 위치 4, 위치 6 또는 위치 4 및 6에서 치환된다는 조건하에서 1 또는 2이고; R1은 H, C1내지 C4알킬, C3내지 C4짝안지은 알케닐 및 C3내지 C4짝안지은 알키닐 중에서 선택하고; R2는 H, C1내지 C4알킬, C3내지 C4짝안지은 알케닐 및 C3내지 C4짝안지은 알키닐 중에서 선택하고; R3는 C1내지 C4알킬이고; R4는 C1내지 C4알킬이며; R5는 C1내지 C4알킬이다.
  21. 제20항에 있어서, Y가 -NR3R4임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 화합물 또는 그의 염.
  22. 제20항에 있어서, Z가 -OH임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 화합물 또는 그의 염.
  23. 제20항에 있어서, m이 0 내지 1임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 화합물 또는 그의 염.
  24. 제20항에 있어서, n이 1임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 화합물 또는 그의 염.
  25. 제20항에 있어서, R1이 C2내지 C4알킬임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 화합물 또는 그의 염.
  26. 제20항에 있어서, R2가 H 또는 C1내지 C2알킬임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 화합물 또는 그의 염.
  27. 제20항에 있어서, R3및 R4가 각각 C1내지 C2알킬임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 화합물 또는 그의 염.
  28. 제20항에 있어서, Y는 -NR3R4이고; Z는 -OH이고; m은 0 내지 1이고; n은 1이고; R1이 C1내지 C4알킬이고; R2가 H 또는 C1내지 C2알킬이고; R3및 R4가 각각 C1내지 C2알킬임을 특징으로 하는 광활성 아실 효소를 제조하기 위한 중간체로서 유용한 화합물 또는 그의 염.
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