DE68905557T2

DE68905557T2 - Kontinuierliches beschallungsverfahren zur herstellung proteinverkapselter mikroblaeschen.

Info

Publication number: DE68905557T2
Application number: DE8989116982T
Authority: DE
Inventors: David Cerny; Gary J Mills; Peter J Westkaemper
Original assignee: Molecular Biosystems Inc
Current assignee: Molecular Biosystems Inc
Priority date: 1988-09-14
Filing date: 1989-09-13
Publication date: 1993-07-01
Anticipated expiration: 2009-09-14
Also published as: KR900004395A; ES2054964T3; IE62602B1; JPH0720545B2; NO176871B; DE68905557D1; FI95872B; FI894335A; AU4131289A; DK175484B1; US4957656A; EP0359246B1; IE892837L; KR0135754B1; DK451189D0; EP0359246A2; IL91593A0; CA1337286C; NO176871C; EP0359246A3

Description

Die Erfindung betrifft das Aufnehmen von Ultraschallabbildungen des menschlichen Körpers für Diagnosezwecke und insbesondere die Herstellung von Ultraschallabbildungsmitteln durch Beschallen von Proteinlösungen.
Seit 1968-70 ist bekannt, daß Kontrastechocardiografie verwendet werden kann, um den Innenherzaufbau aufzuzeigen, den Herzklappenzustand zu bewerten, intracardiale Nebenschlüsse aufzuzeigen und pericardiale Effusion nachzuweisen (Gramiak und Shah, 1968; und Feigenbaum et al., 1970). Die Ultraschallabbildung des Herzens besitzt potentielle Vorteile hinsichtlich Zweckmäßigkeit, Sicherheit und reduzierten Kosten gegenüber derzeitigen Diagnoseverfahren wie der Angiografie, die die Verwendung von strahlungsundurchlässigen Farbstoffen für Röntgenaufnahmen erfordert oder die Verwendung von Radionuklidaufnahmemitteln für Strahlungsaufnahmen. Jedoch wurde der Fortschritt der praktischen Anwendungen von Ultraschallabbildungen durch Mangel an wirksamen klinisch verwendbaren Abbildungsmitteln verzögert.
Zur Ultraschallaufnahme wird ein Ultraschallscanner zur Erzeugung und zum Empfang der Schallwellen verwendet. Der Scanner wird auf einer Körperoberfläche plaziert, so daß die abzubildende Fläche bedeckt wird und die Schallwellen werden in diese Fläche hineingerichtet. Der Scanner zeichnet die reflektierten Schallwellen auf und überträgt die Daten in Bilder. Wenn Ultraschallenergie durch eine Substanz hindurchgesendet wird, so hängen die akustischen Eigenschaften der Substanz von der Übertragungsgeschwindigkeit und der Substanzdichte ab. Änderung in den akustischen Eigenschaften der Substanzen (z.B. die Änderung in der akustischen Impedanz) sind besonders auffällig an den Grenzflächen unterschiedlicher Stoffe wie einer Grenzfläche zwischen den Zuständen flüssig-fest oder flüssig-gasförmig. Wenn Ultraschallenergie durch ein Medium gerichtet wird, so führen Änderungen in den akustischen Eigenschaften zu intensiveren Schallreflektionssignalen bei der Detektion durch den Ultraschallscanner.
Ultraschallabbildungsmittel können aus kleinen festen oder gasförmigen Teilchen bestehen, die in das Kreislaufsystem injiziert, die Schallreflektion und die Bildauflösung verbessern. Abbildungsmittel vom Mikrobläschentyp bestehen aus kleinen Gasbläschen (gewöhnlich Luft), die in einer Trägerflüssigkeit zur parenteralen Injektion dispergiert sind. Die "Mikrobläschen" werden durch das Kreislauf system zu dem abzubildenden Organ befördert.
Es wurde vorgeschlagen, eine Dispersion aus Luftmikrobläschen in einer warmen wässerigen Gelatinelösung zu bilden und die Lösung auf eine Verfestigungstemperatur abzukühlen, um die Mikrobläschen einzuschließen. Zur Verabreichung wird die gelierte Dispersion zur Verflüssigung erwärmt und parenteral mit den Mikrobläschen dispergiert in der verflüssigten Gelatine verabreicht. (Tickner et al. U.S. Patentschrift 4 276 885 und Tickner et al. National Technical Information Service Report HR-69217-1A, April 1977). In Gelatine eingeschlossene Mikrobläschen zur Einführung in den Blutstrom haben eine geringe Lebensdauer. Sie verschwinden rasch. Ein anderer Nachteil ist, daß die Mikrobläschen zu groß sind, um Kapillargefäße zu passieren und daher nicht zur Abbildung des Herzens durch periphere intravenöse Verabreichung geeignet sind.
Die Entdeckung, der durch Beschallung hergestellten Mikrobläschen-Abbildungsmittel durch Dr. Steven B. Feinstein stellt einen bedeutenden Fortschritt auf diesem Gebiet dar. Unter Verwendung viskoser wässeriger Lösungen, wie 70 %-iges Sorbitol oder Glucose, stellte Dr. Feinstein eine Mikrobläschendispersion durch hochenergetische Beschallung der Lösungen her.
Die erhaltenen Mikrobläschen besaßen eine Größe von weniger als 10 um und waren in der Lage, durch Kapillargefäße hindurchzugelangen. Die Beständigkeit der Mikrobläschen, obwohl nur in der Größenordnung von einigen Minuten, erlaubte die Herstellung des Abbildungsmittels und die intravenöse Verabreichung zur Abbildung des Herzens. (Feinstein et al. 1984 und Feinstein U.S. Patent 4 572 203)
Anschließend versuchte Dr. Feinstein, die Beständigkeit der Mikrobläschen zu verbessern. Er fand, daß durch Beschallung von einem hitzeempfindlichen Protein wie Albumin Mikrobläschen mit verbesserter Stabilität erhalten wurden (Feinstein U.S. Patentschriften 4 572 203 und 4 718 433). Konzentrationen von Mikrobläschen von 10 bis 14 x 10&sup6; Mikrobläschen je Milliliter wurden erhalten mit Bläschengrößen von 2 bis 9 um (Keller, Feinstein und Watson, 1987). Die Mikrobläschen bestanden für 24 bis 48 Stunden. Die durch Beschallung hergestellten Albumin-Mikrobläschen-Abbildungen von Feinstein waren für die kommerzielle Fertigung jedoch nicht ausreichend stabil.
Stabilitäten in der Größenordnung von Wochen oder Monaten (anstatt von Stunden oder Tagen) sind erforderlich, für ein Abbildungsmittel, das für eine zentrale Einrichtung hergestellt werden soll und verteilt werden soll in Krankenhäusern der Vereinigten Staaten und anderer Staaten. Für die kommerziell machbare Herstellung, den Versand und die Aufbewahrung im Krankenhaus vor der Verwendung, wird eine Stabilitätszeit von mindestens 4 Wochen benötigt und vorzugsweise von mindestens 8 Wochen oder mehr. Auch ist es für wirksamste Abbildungen erforderlich, die höchst erreichbare Konzentration an Mikrobläschen im Abbildungsmittel vorzufinden. Ein Abbildungsmittel sehr hoher Mikrobläschenkonzentration ist für sich besser und bietet einen Sicherheitsfaktor. Diese Vorteile bei der Entwicklung von albumineingekapselten Mikrobläschen durch Beschallung wurden teilweise durch Molecular Biosystem, Inc. San Diego, CA. erreicht. Das experimentelle "ALBUNEX" -Produkt dieser Firma umfaßt Mikrokügelchen mit Mikrobläschenzentren und unlöslichen Albuminwänden.
Vor der vorliegenden Erfindung wurden die "ALBUNEX" - Mikrokügelchen jedoch nur im geringen Ausmaß auf einer Batch- by-batch-Grundlage hergestellt. Es war nicht bekannt, ob eine kommerzielle Produktion im großen Maßstab realisierbar war. Niemand wußte, ob mit Albumin eingekapselte Mikrokügelchen auf kontinuierlicher Basis hergestellt werden könnten, wobei die Größe kontrolliert wird, eine hohe Mikrobläschenkonzentration und eine Langzeitstabilität erhältlich ist.
Die Erfindung stellt ein Beschallungsverfahren zur kontinuierlichen Herstellung von Mikrokügelchen bereit, umfassend proteineingekapselte Mikrobläschen in kontrolliert kleinen Größen, wirksamen Konzentrationsbereichen und kommerziell und klinisch brauchbaren Stabilitäten. Wie in herkömmlicher Praxis wird eine verdünnte wässerige Lösung eines hitzedenaturierbaren wasserlöslichen biokompatiblen Proteins hergestellt. Zum Beispiel kann wie in der herkömmlichen Praxis eine sterile 5 %-ige wässerige Lösung von Humanserumalbumin verwendet werden. Ein kritischer Punkt für die kontinuierliche Herstellung ist dabei die rasche Erwärmung von Inkrementen der Proteinlösung auf eine Temperatur der beginnenden Denaturierung des Proteins. Zu diesem Zweck kann ein indirekter Durchflußwärmetauscher verwendet werden, jedoch ist es wichtig, dar die Temperatur der Wärmetauscherflüssigkeit sorgfältig geregelt wird. Im wesentlichen sollte das Wärmetauschermedium sich auf der gewünschten Temperatur der beginnenden Denaturierung befinden. Im Ergebnis des raschen Erhitzungsschritts sollte sich die Proteinlösung am Rande der Denaturierung befinden, jedoch kein denaturiertes Protein enthalten. Das Erhitzen auf eine Temperatur der beginnenden Denaturierung wird ohne Erhöhung der Proteinunlöslichkeit ausgeführt.
Ein anderes kritisches Merkmal des Verfahrens ist die Einführung eines biokompatiblen Gases in die Proteinlösung. Sterile Luft wird vorzugsweise für diesen Zweck verwendet. Die Einführung von Luft liefert einen Luftüberschuß zur Bildung von Mikrokügelchen. Die Luftzufuhr kann vor, während oder nach dem Erhitzen durchgeführt werden. In einem bevorzugten Verfahren wird das Gas jedoch unmittelbar anschließend an das Erwärmen gleichzeitig mit der Einführung der erhitzten Lösung in die Beschallungskammer eingegeben.
Die gashaltigen erhitzten Imkremente der Proteinlösung werden kontinuierlich durch eine Kammer geführt, die einen sich im Betrieb befindlichen mit einem Schalltrichter ausgestatteten Beschaller einschließt, der mit der Lösung in Kontakt steht. Das Beschallen erzeugt Gasmikrobläschen in der Lösung, während das Protein darin rasch erhitzt wird, wobei die Mikrobläschen herum unlöslich werden. Da die Lösung bereits auf eine Temperatur nahe der beginnenden Denaturierung erhitzt wurde, sind nur wenige Grad zusätzlicher Erwärmung erforderlich, um das unlösliche Protein zu erzeugen, das die Mikrokügelchenwände bildet.
Die Bildung einer großen Menge kleiner Mikrokügelchen < weniger als 10 um im Durchmesser) findet aufgrund des Luftüberschusses, der in der Lösung vorliegt, mit äußerster Geschwindigkeit statt. Das unlösliche Albumin wird, aufgrund der vorgeheizten Bedingung der Lösung in gleicher Geschwindigkeit gebildet. Diese Faktoren führen zu einer sehr raschen Bildung von proteineingekapselten Mikrobläschen, forthin als "Mikrokügelchen" bezeichnet. Die Aufenthaltszeit des Lösungsinkrements in der Beschallungskammer kann sehr kurz sein.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren ist es möglich, das Mikrokügelchen-Abbildungsmittel auf kontinuierlicher hochproduktiver Basis herzustellen. Die aus der Beschallungskammer entnommene Lösung enthält bereits stabile kleine proteineingekapselte Mikrobläschen. Nur eine geringe Menge über- oder unterdimensionierter Mikrokügelchen liegt vor. Dies beseitigt das Erfordernis für zeitaufwendige Fraktionierungen. Während des Beschallens findet intensives Aufschäumen der Lösung statt und die aus der Beschallungskammer entnommene Lösung hat einen schaumigen Charakter. Der Schaum kann jedoch leicht verschwinden.
Das erfindungsgemäße Beschallungsverfahren zur kontinuierlichen Herstellung von albumineingekapselten Mikrobläschen kann in einer Folge von Arbeitsgängen ausgeführt werden. Diese Arbeitsgänge sind schematisch in den beigefügten Zeichnungen erläutert, in denen --
Figur 1 ein Fließbild zur Herstellung der Albuminlösung erläutert;
Figur 2 ein schematisches Fließbild der Beschallung darstellt, einschließlich des Vorheizens, der Lufteinführung und der kontinuierlichen Beschallung;
Figur 3 eine vergrößerte Querschnittansicht eines Beschallers darstellt, der anstatt des Beschallungsgefäßes von Figur 2 verwendet werden kann;
Figur 4 ist ein Fließbild, das die Weiterverarbeitung der Suspension von Mikrokügelchen in einem Separator/Konzentrierer erläutert; und
Figur 5 ist ein alternativer Separator/Konzentrierer, der anstatt der in Figur 4 erläuterten Vorrichtung verwendet werden kann.
Das Ausgangsmaterial zur Durchführung der Erfindung ist eine wässerige Lösung eines hitzedenaturierbaren, wasserlöslichen, biokompatiblen Proteins. Das einkapselnde Protein sollte hitzeempfindlich sein, so daß es durch Erhitzen während des Beschallens teilweise unlöslich wird. Insbesondere wird ein geringer Teil gelösten Proteinmaterials gleichzeitig mit der Beschallung unlöslich. Dieses führt zu einem geringen Volumen von Festphasenmaterialien, die einkapselnde Schichten um die Mikrokügelchen herum bilden. Hitzeempfindliche Proteine können verwendet werden, wie Albumin, Hämoglobin, Collagen. Zur Verabreichung beim Menschen ist Humanprotein bevorzugt. Humanserumalbumin (HSA) ist besonders geeignet. HSA ist im Handel als sterile 5 %-ige wässerige Lösung erhältlich, die direkt als Ausgangsmaterial zur Herstellung der Mikrokügelchen verwendet werden kann. Es können jedoch auch andere Konzentrationen von Albumin oder anderen hitzedenaturierbaren Proteinen verwendet werden. Die HSA-Konzentration kann variiert werden zum Beispiel im Bereich von 1 bis 25 Gew.-%. Im kontinuierlichen Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, das Protein in Form einer wässerigen verdünnten Lösung zu verwenden. Für das Albumin ist es bevorzugt, daß die Lösung 0,5 bis 7,5 Gew.-% des Albumins enthält. Aufgrund der extrem günstigen Bedingungen für die Erzeugung von Mikrobläschen und des Unlöslichmachens des Proteins und der erhaltenen Einkapselung, können Konzentrationen innerhalb von 5 % Albumin verwendet werden, wie 0,5 bis 3 %.
In der Praxis dieser Erfindung kann eine kommerziell erhältliche Ausrüstung verwendet werden. Das Herstellungsverfahren für die Beschickung kann in rostfreien Stahltanks und mit Prozeßfiltern ausgeführt werden, die von Walker Stainless Eguipment Co., New Lisbon, WI bzw. Milliporr, Bedford, MA erhalten werden können, als auch von anderen Herstellern. Dieser Arbeitsgang sichert, daß alle zu beschallenden Beschickungsmedien im Einklang stehen mit FDA- Erfordernissen und Anordnungen.
Der Beschallungsvorgang verwendet sowohl einen Wärmetauscher als auch ein Durchflußbeschallungsgefäß in Reihe. Wärmetauscherausrüstungen dieses Typs können von ITT Standard, Buffalo, New York und anderen Herstellern erhalten werden. Der Wärmetauscher hält die Betriebstemperatur für das Beschallungsverfahren aufrecht. Dessen Temperatur regelt das Beschallungsmedium im Bereich von 65ºC bis 80ºC in Abhängigkeit von der Auffüllung des Mediums.
Die Vibrationsfrequenzen der Beschallungsgeräte können im beträchtlichen Bereich variieren, wie von 5 bis 40 Kilohertz (kHz), jedoch die meisten kommerziell erhältlichen Beschaller arbeiten bei 20 oder 10 kHz. Die 20 kHz-Beschaller arbeiten recht gut für den erfindungsgemäßen Zweck. Solche Beschallungsausrüstung kann von Sonics & Materials, Inc., Danbury, CT und anderen Herstellern erhalten werden. Sonics & Materials Vibra-Cell oder ein ähnliches Modell kann mit einem flachen Spitzschalltrichter verwendet werden. Die auf dem Beschallungstrichter einwirkende Leistung kann variieren über eingestellte Leistungen von 1 bis 10, wie vom Hersteller ausgewiesen, zum Beispiel mit dem Sonics & Materials Vibra-Cell-Modell VL1500. Eine mittlere Leistungseinstellung kann verwendet werden (nämlich von 5 bis 9). Die Vibrationsfrequenz und die zugeführte Leistung müssen ausreichen, um Kavitation in der zu beschallenden Lösung zu erzeugen. Die Beschickungsfließgeschwindigkeit bewegt sich von 50 ml/min bis 1000 ml/min. Aufenthaltszeiten in dem Beschallungsgefäß können im Bereich von 1 s bis 4 min liegen. Gasförmige Flüssigkeitszugabegeschwindigkeiten bewegen sich von 10 cm³/min bis 100 cm³/min oder 5 % bis 25 % der Beschickungsfließgeschwindigkeit.
Die Beschallung wird, im Gegensatz zu üblichen Beschallungen, bei denen es erwünscht ist, Schäumen zu vermeiden, bewußt in einer derartigen Weise ausgeführt, daß intensives Schäumen der Lösung auftritt. Für den erfindungsgemäßen Zweck sind Schäumen und Aerosolbildung wichtig, um das Abbildungsmittel in erhöhter Konzentration und Stabilität zu erhalten. Um Schäumen zu fördern, kann die Inputleistung des Schalltrichters erhöht werden und es kann auch das Verfahren unter leichtem Druck (d.h. 1 bis 5 psi (= 6,9-34,5 kPa)) ausgeführt werden. Der von der Beschallung erzeugte Schäumungsvorgang kann sofort durch das trübe Aussehen der Lösung und durch den erzeugten Schaum festgestellt werden.
Mit Hilfe des kontinuierlichen Beschallungsverfahrens, umfassend die Kavitationsphase, gefolgt von einer Schäumungsphase kann die Konzentration an eingekapselten Mikrobläschen, forthin als "Mikrokügelchen" bezeichnet, stark erhöht werden. Konzentrationen über 40 x 10&sup6; Mikrokügelchen pro ml sind leicht erhältlich, wie Konzentrationen von 40 bis 200 x 10&sup6;. Darüberhinaus sind die erhaltenen Mikrokügelchen vorwiegend von einem Durchmesser von weniger als 10 um. Zum Beispiel haben 80 % oder mehr der Mikrokügelchen Durchmesser im Bereich von 1 bis 9 um mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 4 bis 6 um.
Wenn die Beschallung in Luftkontakt als Gasfluid ausgeführt wird, so werden die Mikrokügelchen Luftzentren haben. Luft wird als zweckmäßigstes Gasfluid angenommen, aber falls erwünscht, könnte die Beschallung auch unter anderen Gasfluids ausgeführt werden (nämlich Stickstoff, Sauerstoff, Kohlendioxid).
Das kontinuierliche Beschallungsverfahren erlaubt eine kontinuierliche oder zumindest halbkontinuierliche Trennungs-/Konzentrierungsarbeitsweise. Es kann wiederum ein rostfreier/s Stahltank/Gefäß von Walker Stainless Equipment Co., New Lisbon, WI oder anderen Herstellern verwendet werden. Die Trennung-/Konzentrierungsbetriebsweise erlaubt die Gesamtsteuerung des Produktausstoßes hinsichlich Mikrokügelchenkonzentrationen und einer gesamtdurchschnittlichen Kügelchengröße.
Da die Mikrokügelchen im schwebenden Zustand sind, neigen sie dazu, zur Oberfläche der Dispersion zu steigen. Durch Halten der Dispersion ohne Rühren für eine Zeit von einigen Stunden (nämlich 1 bis 8 Stunden) werden die meisten Mikrokügelchen an die Oberfläche steigen und in einer oberen Schicht oberhalb der sich klärenden Lösung aufkonzentriert. Durch diesen Trennungs-/Konzentrierungsvorgang oder "Float/Trennung" von Mikrokügelchen in einer oberen Schicht, können Teile der geklärten Lösung vom Unteren der Mikrokügelchen entfernt werden, wodurch die Dispersion eine größere Mikrokügelchenkonzentration erhält. Zum Beispiel können 50 bis 75 % des Lösungsvolumens bei diesem Konzentrierungsverfahren entfernt werden. Diese geklärte Lösung kann in das Herstellungsverfahren für die Beschickung zurückgeführt werden.
Falls erforderlich, kann vor oder nach vorstehend genannter Konzentrierung, Floattrennung von übergroßen Mikrokügelchen erhalten werden. Große Mikrokügelchen wie solche mit Durchmessern größer 10 um haben eine relativ hohe Schwimmfähigkeit. Sie werden daher rascher zur Oberfläche der Lösung wandern. Durch Anwendung einer kurzen Haltezeit von etwa 15 bis 45 min können die größten Mikrokügelchen in einer kleinen oberen Schicht oberhalb der Dispersion gesammelt werden, die noch im wesentlichen alle Mikrokügelchen kleiner Größe enthält. Durch Entfernen dieser Mikrokügelchendispersion vom Unteren der Schicht der übergroßen Mikrokügelchen kann eine Fraktionierung erreicht werden, bei der die großen Mikrokügelchen in dem Gefäß verbleiben, in dem die Fraktionierung ausgeführt wird. Jedoch macht die inhärente Steuerung der durch die kontinuierliche erfindungsgemäße Beschallung erhältlichen Größe, es unnötig, langwierige Trennschritte zum Entfernen über- oder unterdimensionierter Mikrokügelchen auszuführen.
Das durch diese Kombination von kontinuierlicher Beschallung und der Trennung-/Konzentrierungsvorgänge erzeugte Abbildungsmittel kann eine homogendisperse Konzentration von mehr als 22 x 10&sup6; wie 100 bis 1200 x 10&sup6; (1 bis 12 x 10&sup8;) Mikrokügelchen pro Milliliter aufweisen. Hohe Konzentrationen können für lange Zeiträume beim Aufbewahren bei Raumtemperatur (20-25ºC) aufrecht erhalten werden. Konzentrationen oberhalb 200 sind typischerweise oberhalb 44 x 10&sup6; Mikrokügelchen pro Milliliter und können für Zeiträume von mindestens 4 und gewöhnlich 8 Wochen oder länger aufrecht erhalten werden.
Figuren 1, 2 und 4 erläutern die drei Betriebsweisen einer Herstellungsanlage zur Erzeugung des Mikrokügelchenabbildungsmittels. Das die Albuminlösung umfassende Beschickungsmedium wird zuerst einer Zubereitung für die Beschickung unterzogen. Das Medium wird dann zum Beschallungsarbeitsgang befördert. Nachdem das Medium erhitzt worden ist und das gasförmige Fluid zugegeben worden ist, wird das Medium beschallt. Es wird dann zu einem Trenngang befördert, wobei die Mikrokügelchen konzentriert werden. Das geklärte Medium kann aus der Mikrokügelchensuspension entfernt werden und dem Zubereitungsvorgang für die Beschickung zurückgeführt werden.
Figur 1 zeigt die Zubereitung der Beschickung im Detail. Das Beschickungsmedium wird durch eine Reihe von Filtern gepumpt, um das Beschickungsmedium unter FDA- Spezifikation zu halten. Das gefilterte Medium wird dann in ein oder mehrere Beschickungstanks für die Beschallung gegeben.
Figur 2 erklärt den Beschallungsvorgang im Detail. Das Medium wird durch einen Flußregler und durch einen Wärmetauscher geführt, bevor es das Beschallungsgefäß erreicht. Ein Gasfluid, vorzugsweise Luft, wird in das Beschickungsmedium entweder bei oder vor dem Beschallungsgefäß in kontrollierter Geschwindigkeit eingespeist. Zum Beispiel kann Luft aus einer Druckquelle wie Flaschenpreßluft oder mit einer Luftpumpe zugeführt werden. Die Luft sollte sterilisiert sein, bevor sie zu der Lösung zugegeben wird.
Figur 4 erläutert den Trenn- und Konzentrierungsvorgang im Detail. Hier werden die Mikrokügelchen durch Floattrennung am oder nahe dem Gefäßoberen konzentriert, das, wie gezeigt, einen statischen Entschäumer enthalten kann. Dieser Entschäumer kann auch dazu dienen, große Mikrokügelchen zu zerstören, die zum Lösungsoberen flotiert sind. Das Mikrokügelchenkonzentrat wird selektiv entfernt. Das geklärte Medium am Boden des Separators kann dem Zubereitungsarbeitsgang für die Beschickung zugeführt und wieder aufbereitet werden. Bei diesem Aufbereitungsschritt werden alle festen Stoffe und Teilchen entfernt, so daß nur Protein in der Lösung zurückbleibt.
Figur 2 erläutert den Vorgang, der das Herz des Verfahrens ausmacht. Wie ausgewiesen, umfaßt ein Isolationsmantel den Wärmetauscher und das Beschallungsgefäß. Die hergestellte Albuminlösung wird über ein Fluß-Meß-und- Regelgerät in das Beschickungsende des Rohr-Hülse-Wärmetauschers gepumpt. Im Wärmetauscher passiert die Albuminlösung mehrere Röhren, die sich zum Auslaß des Wärmetauschers erstrecken. Diese Röhren können doppelt ummantelt sein, um Trennung vom Wärmeübertragungsmedium zu sichern, das in die Röhren nahe des Austrittsendes umfassenden Hohlräume eintritt und gegenläufig zu der Albuminlösung nahe dem Austrittsende des Wärmetauschers austritt. Geeignete Wärmeübertragungsmedien sind Wasser und Mineralöl.
Die Temperatur des Wärmeübertragungsmediums wird sorgfältig auf eine Temperatur eingeregelt, die der anzustrebenden Temperatur der beginnenden Denaturierung des Albumins entspricht. Für Humanserumalbumin bewegt sich die beginnende Denaturierung zwischen 70 und 75ºC. Temperaturen oberhalb 75ºC können das Albumin im wesentlichen Ausmaß unlöslich machen. Ein wünschenswerter Betriebsbereich für das Wärmeübertragungsmedium ist von 72 bis 74ºC. Die Albuminlösung wird rasch durch einfaches Durchleiten über den Wärmetauscher von der Einlaßtemperatur von 20 bis 30ºC bis zu einer Ausgangstemperatur von 72 bis 73ºC erhitzt. In der Praxis kann die Aufenthaltszeit im Wärmetauscher weniger als 1 Minute, wie 45 bis 55 Sekunden betragen.
Wie in Figur 2 gezeigt, wird die Lösung nach raschem Erhitzen auf die beginnende Denaturierungstemperatur für Albumin in den Einlaß eines ummantelten Beschallungsgefäßes geführt. Dieses Gefäß kann kleinvolumig sein, wie 25 bis 400 Liter. In dem Gefäß ist ein Schalltrichter für den direkten Kontakt mit der Lösung, die durch das Gefäß fließt, eingebaut. Vom Gefäßboden aus wird ein kontinuierlicher Fluß steriler filtrierter Luft eingelassen, wenn die Beschallung erfolgt. Die Luft wird in der Lösung dispergiert und rasch in Mikrokügelchen geformt. Die Temperatur der Lösung im Beschallungsgefäß steigt einige Grad oberhalb der Einlaßtemperatur, wobei diese Erhöhung ausreicht, um einen Teil des Albumins unlöslich zu machen. Zum Beispiel können 0,5 bis 3 % des Albumins, das in das Gefäß eingeführt wurde, denaturiert werden und sich aus der Lösung abscheiden unter Bereitstellung des einkapselnden Proteins. Unter stetigen Fließbedingungen können die Regeltemperaturen der Lösung im Beschallungsgefäß 74ºC ± 0,2 annehmen. Die Suspension der Mikrokügelchen, wie sie von dem Beschallungsgefäß entnommen wird, verfügt über diese Temperatur, was mit einem Temperaturregler unter Verwendung einer Rückkopplung zu einem Regler für die Fließgeschwindigkeit des Wärmeübertragungsmediums bestimmt werden kann.
Die entnommene schaumige Suspension der Mikrokügelchen kann durch einen statischen Mischer geführt werden. Dies ist jedoch wahlweise. Falls verwendet, kann der statische Mischer anfänglich den Schaum beseitigen und eine homogene Dispersion der Mikrokügelchen bereitstellen. Wie in Figur 4 gezeigt, wird die schaumige Suspension durch eine Separator- und Konzentrierereinheit geführt, die einen statischen Entschäumer einschließt. Die Mikrokügelchen werden mit dem Lösungsüberlauf am Oberteil des Überlaufwehrs entfernt. Die entschäumte Lösung wird entfernt und durch einen statischen Mischer geführt. Der Mischer sichert, daß die Mikrokügelchen homogen in der Lösung dispergiert sind.
Die Herstellung des Abbildungsmittels ist an diesem Punkt vollständig. Albuminmikrokügelchen gewünschter Größe bewegen sich im Bereich von 1 bis 10 um. Zum Beispiel können sie vorwiegend Größen von 3 bis 8 um aufweisen. Das Mikrokügelchenkonzentrat hat vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von 400 bis 800 10&sup6; Mikrokügelchen pro Milliliter. Die Mikrokügelchensuspension kann in geeignete Fläschchen unter sterilen Bedingungen für die anschließende Verabreichung als Ultraschallabbildungsmittel abgefüllt werden.
Figur 3 erläutert eine alternative Beschallungsvorrichtung. Ähnliche Beschallungseinheiten sind von Sonics & Materials, Danbury, CT erhältlich. Eine kleine Kammer mit einem inneren Volumen von etwa 50 bis 150 cm³ kann bereitgestellt werden. Die Beschallungsvorrichtung ist mit einem Trichter ausgerüstet, der sich in die Beschallungskammer erstreckt und die Kammer hat ein eine Vertiefung bereitstellendes Wandteil, das, wie gezeigt, die Form eines Bechers hat. Dieser Becher ist engräumig zu dem Beschallungstrichter angeordnet. Der Beschallungstrichter kann sich in die Vertiefung des Beschallungsbechers erstrecken. Durch einen Zulauf, der sich in den Boden des Beschallungsbechers erstreckt, wird eine vorgemischte Luft-Albumin-Lösung eingeführt. Die Albuminlösung wurde durch den Wärmetauscher geführt, wie vorstehend beschrieben, und die Luft wird aus einer Preßluftguelle unter sterilen Bedingungen eingeführt. Die Aufenthaltszeit der Lösung in dem Beschaller kann sehr kurz sein, wie 1 bis 20 Sekunden. Die schaumige Suspension von Albuminkügelchen wird aus der Beschallungskammer entnommen und wird, wie vorstehend beschrieben, mit Hinweis auf die Figuren 2 und 4 weiterverarbeitet.
In Figur 5 ist der alternative Separator/Konzentrierer in Form eines trichterförmigen Gefäßes dargestellt, an dessen Boden sich ein stellergeregelter Auslaß befindet. Eine Serie solcher Trenntrichter kann verwendet werden, die erlauben, Inkremente der schaumigen Mikrokügelchensuspension zum Entschäumen und zur Größentrennung aufrechtzuhalten. Der Schaum wird an der Spitze der Lösung zusammen mit den überdimensionierten Mikrokügelchen gesammelt. Unterdimensioniertes Mikrokügelchenkonzentrat fällt zum Boden des Trichters und kann zusammen mit der Albuminlösung, die wiederverarbeitet wird, als erste Ablauffraktion aus dem Trichter entfernt werden. Die nächste Fraktion wird die Albuminmikrokügelchen umfassen, die durch den statischen Mischer, wie vorstehend beschrieben, geführt und dann abgefüllt werden. Die Endfraktion, die aus dem Trenntrichter entfernt wird, enthält einen Restschaum und überdimensionierte Mikrokügelchen und wird als Abfall verworfen.

Zufuhrherstellung:

Füllen der 100 oder 200 Liter-Zufuhrtanks mit wässerigem Albumin 5 %. Pumpen des Albumins durch die Filter mit einer Geschwindigkeit zwischen 50 ml/min bis 1 l/min. Das gefilterte Albumin wird in die Beschallungszufuhrtanks gegeben.

Beschallung:

Ein kontrollierter Albuminfluß zwischen 50 ml/min und 1 l/min wird während des Beschallungsvorganges durch einen mit einer rückgekoppelten Temperaturregelschleife ausgerüsteten Wärmetauscher, die zur Regelung der Albumintemperatur eingestellt wurde, befördert. Die Temperaturen des Wärmeübertragungsmediums und der erhitzten Lösung sind wie vorstehend beschrieben. Ein gefiltertes Gas (d.h. Luft mit 25 cm³/min bis 200 cm³/min) wird in das Beschallungsverfahren eingeführt. Diese Luft erhöht in großem Maße die Kavitation und die Bildung von Mikrobläschen während des Beschallungsvorgangs. Unter Verwendung eines Beschallungsgefäßes, wie in Figur 2 gezeigt, beträgt die gesamte Aufenthaltszeit in dem Beschallungsgefäß zwischen 1,0 und 4 Minuten. Die Beschallungsleistung (oder Energie) kann in einem Bereich von 6 bis 10 eingestellt werden (auf einer Scale von 1 bis 10). Der statische Mischer entschäumt nach der Beschallung den weniger dichten Schaum. Gegebenenfalls kann das Beschallungsprodukt in einen Aufbewahrungstank gegeben werden und vor Fortführung des Trennvorgangs gemischt werden.

Trennung/Konzentrierung:

Das Beschallungsprodukt wird zwischen 1 bis 8 Stunden ohne Rühren in einem Separator/Konzentrierungsgefäß belassen. Wenn im wesentlichen alle Mikrokügelchen eine Schicht im Oberen gebildet haben, werden etwa zwei Drittel des Volumens vom Boden abgezogen. Die obere Schicht ist das Mikrokügelchenprodukt. Die Bodenschicht wird für die Zubereitung der Beschickung wieder aufbereitet.

Wahlweise Fraktionierung:

Resuspendieren der Mikrokügelchen und Füllen einer 60 ml-Spritze damit. Absetzenlassen für 30 Minuten, dann alles abziehen in ein Sammelgefäß bis auf etwa die letzten 3 bis 4 ml. Die überdimensionierten Mikrokügelchen werden abgelassen. Zählen einer Probe und Berechnen der Konzentration, des durchschnittlichen Durchmessers und des prozentualen Anteils, der weniger als 10 um aufweist. Wenn weniger als 90 % weniger als 90 um aufweisen, Refraktionieren. Falls Redispergieren erforderlich wird, kann die Konzentration mit 5 % Humanserumalbumin eingestellt werden.

Literatur

Feigenbaum, et al. (1970), Circulation 41:515-521.
Feinstein, U.S. Patent 4 572 203.
Feinstein, U.S. Patent 4 718 433.
Feinstein, et al. (1984), J. Am. Coll. Cardiol. 3:14-20.
Gramiak und Shah (1968), Invest. Radiol. 3:356-358.
Keller, Feinstein und Watson (1987), Amer. Heart. J., 114:570-575.
Tickner, et al. U.S. Patent 4 176 885.
Tickner, et al., National Technical Information Service Report HR 62917-1A, April, 1977, Seiten 34-40.

Claims

1. Beschallungsverfahren zum kontinuierlichen Herstellen von proteinverkapselten Mikrokügelchen, welches die Schritte umfaßt:

(a) Herstellen einer verdünnten wäßrigen Lösung eines wärmedenaturierbaren, wasserlöslichen, biokompatiblen Proteins;

(b) rasches Erwärmen von Inkrementen dieser Lösung auf eine Temperatur der beginnenden Denaturierung des Proteins, aber ohne nennenswerte Unlöslichmachung des Proteins;

(c) Durchleiten eines biokompatiblen Gases in Inkremente der Lösung vor, während oder nach dem Erwärmen zum Einbringen in diese;

(d) kontinuierliches Durchleiten der Gas enthaltenden erwärmten Inkremente der Proteinlösung durch eine Kammer, die eine in Betrieb befindliche Beschallungsvorrichtung umschließt, welche einen Schalltrichter in Berührung mit der Lösung in der Kammer bereitstellt, wobei die resultierende Beschallung die Lösung aufschäumt und Gasmikrobläschen darin erzeugt, während das Protein darin erwärmt wird, um einen Teil davon unlöslich zu machen; und

(e) das kontinuierliche Bilden von stabilen proteinverkapselten Mikrokügelchen in den Inkrementen der Lösung, die durch die Kammer hindurchgeht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Protein menschliches Serumalbumin ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, in dem die verkapselten Mikrokügelchen hauptsächlich Durchmesser von weniger als 10 um haben.

4. Verfahren nach Anspruch 1, in dem die Kammer einen Hohlraum bereitstellenden Wandbereich hat, der im geringen Abstand gegenüber dem Schalltrichter angebracht ist, und die Gas enthaltenden erwärmten Inkremente der Lösung in diesen Hohlraum eingebracht werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das Protein menschliches Serumalbumin ist und das Erwärmen des Schritts (b) auf eine Temperatur zwischen 70 und 75º C erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, in welchem die Lösung 0,5 bis 7,5 Gew.-% des Albumins enthält.

7. Beschallungsverfahren zum kontinuierlichen Herstellen von proteinverkapselten Mikrokügelchen, welches die Schritte umfaßt:

(a) Herstellen einer verdünnten wäßrigen Lösung von menschlichem Serumalbumin;

(b) rasches Erwärmen von Inkrementen der Lösung auf eine Temperatur der beginnenden Denaturierung des Albumins ohne nennenswerte Unlöslichmachung des Albumins;

(c) Durchleiten von steriler Luft in die Inkremente der Lösung unmittelbar nach dem Erwärmen der Lösung, so daß die Luft in die Lösung eingebracht wird;

(d) kontinuierliches Durchleiten der Luft enthaltenden erwärmten Inkreemente der Albuminlösung durch eine Kammer, die eine in Betrieb befindliche Beschallungsvorrichtung umschließt, die in Berührung mit der Lösung in der Kammer zur Beschallung dieser ist, wobei die resultierende Beschallung die Lösung aufschäumt und Gasmikrobläschen erzeugt, während das Albumin darin erwärmt wird, um einen Teil davon unlöslich zu machen;

(e) kontinuierliches Bilden von stabilen proteinverkapselten Mikrokügelchen in den Inkrementen der Lösung, die durch diese Kammer durchgeleitet wird;

(f) Entschäumen der Mikrokügelchen enthaltenden Lösung und Abtrennen der Luft davon; und

(g) Gewinnen der verkapselten Mikrokügelchen.

8. Verfahren nach Anspruch 7, in dem das Erwärmen im Schritt (b) auf eine Temperatur zwischen 70 und 750º C erfolgt.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, in welchem die Lösung 0,5 bis 7,5 Gew.-% des Albumins enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, in welchem die Lösung 0,5 bis 3 Gew.-% des Albumins enthält.