DE60319114T2

DE60319114T2 - Glycosylierte humane interferon alpha isoform

Info

Publication number: DE60319114T2
Application number: DE60319114T
Authority: DE
Inventors: Eun-Jung Lee; Hyung-Ki Seocho-gu PARK; Hyun-Seok Kangnam-gu KIM; Ji-Sook Park; Yeon-Hyang Kim; Hyune-Soo Lee; Hyung-Kon Koh; Myung-Suk Suwon-si OH
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2002-08-31
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2008-12-04
Anticipated expiration: 2023-08-30
Also published as: ATE386054T1; US7311903B2; AU2003256125A1; KR100536628B1; EP1549675B1; KR20040020830A; JP2006512058A; KR20040020817A; CN1684979A; DE60319114D1; WO2004019856A3; JP4181543B2; AU2003256125A8; EP1549675A2; WO2004019856A2; EP1549675A4; US20050019871A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine glykosylierte humane Interferon-alpha-Isoform. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine humane Interferon-alpha-Isoform mit mindestens einer Aminosäure, die mit einer anderen Aminosäure modifiziert ist, um die Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T) Sequenz in einer spezifischen Region zu erweitern und somit die in-vivo-Stabilität zu erhöhen und die glykosylierte humane Interferon-alpha-Isoform hiervon.
STAND DER TECHNIK
Interferon wurde von Isaacs und Lindenmann (Proc. R Soc. Lond[Biol.], 1957, 147, 258–267) 1957 entdeckt und ist dafür bekannt, starke antivirale Wirkungen zu besitzen.
Interferon wird unterteilt in ein Typ-I-Interferon, einschließlich Interferon-alpha/beta und in ein Typ-II-Interferon, einschließlich Interferon-gamma. Interferon-alpha wird aus B-Lymphozyten oder Makrophagen gewonnen, Interferon-beta wird aus Fibroblasten gewonnen, und Interferon-gamma wird aus T-Lymphozyten gewonnen.
Beim Menschen wurden mindestens 20 Arten von Interferon-alpha-Genen und -Pseudogenen identifiziert. Proteine dieser Interferon-alphas weisen zwei Disulfidbrücken (Cys1-Cys98; Cys29-Cys138) als Gemeinsamkeit auf. Humanes Interferon-alpha enthält keine N-glykosylierte Bindungsstelle, aber das reife Wildtyp-Protein enthält eine O-glykosylierte Bindung an Thr an der 106. Stelle (Adolf et al., Biochem. J., 276 (Pt 2), 511–518, 1991).
Interferon-alpha kann in Zellen von vielen Geweben produziert werden, die Ergiebigkeit ist jedoch sehr gering. Allgemein wird es größtenteils in Leukozyten wie, z. B. Monozyten/Makrophagen und B-Lymphozyten produziert. Hier schwankt der Anteil an Subtypen bei produzierten Interferonen in Abhängigkeit von produzierten Zelltypen und Produktionsbedingungen. Es ist bekannt, dass die Produktion von Interferonen durch eine Virusinfektion angeregt wird. Desweiteren können Bakterien, Mykoplasmen, Protozoen und dergleichen die Produktion von Interferon anregen, und insbesondere Lipopolysaccharid (LPS) von gramnegativen Bakterien ist ein Mittel, welches das Interferon stark anregt. Interferon-alpha-mRNA wird fortwährend sogar in normalen humanen Geweben produziert (Tovey et al, Proc Natl Acad Sci USA, 1987, Vol. 84, 5038–5042). Man geht davon aus, dass dieses Interferon ein autokrines Interferon ist, welches eine bedeutende Rolle beim Wachstum und bei der Differenzierung von Zellen spielt.
Der Wirkmechanismus in vivo von Interferon ist noch nicht bekannt. Dem Bericht von Branca und Baglioni zufolge (Nature, 294, 768–770,. 1981) wurde nachgewiesen, dass Interferon-alpha und -beta an denselben Rezeptor in humanen lymphoblastoiden Zellen binden.
Wenn eine Virusinfektion in vivo stattfindet, wird Interferon produziert, und das produzierte Interferon regt Proteine an, welche die Funktionen des Interferons ausführen.
Repräsentative Beispiele für solche Proteine umfassen 2'-5-Oligoadenylatsynthetase und Proteinkinase-Phosphorylierung des eIF2 (Elongationsfaktor2), wobei es sich um einen Faktor handelt, der an der Einleitung der Peptidkettensynthese beteiligt ist.
Die beiden Enzyme sind aktivierte doppelsträngige RNA (Lengyel P., Annu. Rev. Biochem., 51, 251–282, 1982; PestKa et. al., Annu. Rev. Biochem., 56, 727–777, 1982; De Maeyer and De Maeyer-Guignard J., Interferons and other regulatory cytokines, Wiley, New York).
Interferon findet seine klinische Anwendung bei der Behandlung von chronischer aktiver Hepatitis B, akuten viralen Encephalitiden, nasopharyngealem Karzinom und dergleichen.
Da die meisten bioaktiven Proteine, die als Medikamente verwendet werden, eine geringe Stabilität in lebenden Körpern aufweisen, sollten Patienten, die die bioaktiven Proteine benötigen, häufig sehr hohe Mengen erhalten, um einen gewissen Spiegel des Proteins aufrechtzuerhalten, damit diese wirken können. Daher leiden Patienten an Schmerzen und Unwohlsein, und es ist erwünscht, ein bioaktives Protein mit verbesserter in-vivo-Stabilität herzustellen, um das Leiden dieser Patienten zu lindern.
Die internationale Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. WO 98/48840 offenbart eine Zubereitung von Interferon-alpha, konjugiert mit Polyethylenglykol als ein Polymer zur Erhöhung der in-vivo-Stabilität von bioaktiven Proteinen, oder das US-Patent Nr. 6,399,103 offenbart eine Zubereitung eines Medikaments durch Mikroverkapselung von humanem Wachstumshormon. Diese Verfahren gehen jedoch mit komplizierten Prozessen einher, zu denen die primäre Herstellung eines Proteins aus einem Mikroorganismus, gefolgt von Reinigung und anschließenden Additionsreaktionen gehört. Auch kann es an einer unerwünschten Stelle zu Vernetzungen kommen, und die Homogenität des Endprodukts kann ein Problem darstellen. Ein anderer Ansatz ist ein Verfahren, das Glykosylierung einsetzt. Zelloberflächenproteine und von eukaryotischen Zellen produzierte Sekretionsproteine können durch Glykosylierung modifiziert werden. Es ist bekannt, dass die Glykosylierung nicht nur die physikalischen Eigenschaften eines Proteins beeinflussen kann, sondern auch Stabilität und Funktionen eines Proteins in lebenden Körpern.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Daher ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Zielprotein unter Einsatz rekombinanter Gentechnologie auf einfache Weise aus einer Zelllinie durch Glykosylierung an menschliches Interferon-alpha herzustellen, und ein Protein mit erhöhter in-vivo-Stabilität herzustellen.
In einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine aminosäuremodifizierte humane Interferon-alpha-Isoform vor, bei der mindestens eine der Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenzen an den folgenden Aminosäurerestpositionen gebildet ist, so dass Glykosylierung an diesen Stellen stattfindet:

– Cys1-Ser8(Cys1-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser8);
– Arg22-Thr52(Arg22-Arg-Ile-Ser-Leu-Phe-Ser-Phe-Gly-Phe-Pro-Gln-Glu-Glu-Phe-Gly-Asn-Gln-Phe-Gln-Lys-Ala-Glu-Thr52);
– Ser68;
– Asp77;
– Lys134-Ser137(Lys134-Tyr-Ser137); und
– Gln158-Glu165(Gln158-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu165).

In einem anderen Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Gen vor, das für eine aminosäuremodifizierte humane Interferon-alpha-Isoform kodiert, bei der mindestens eine der Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenzen an einer spezifischen Stelle gebildet ist, so dass Glykosylierung an der Stelle stattfindet.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor vor, der ein Gen umfasst, das für eine aminosäuremodifizierte humane Interferon-alpha-Isoform kodiert, bei der mindestens eine der Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenzen an einer spezifischen Stelle gebildet ist, so dass Glykosylierung an der Stelle stattfindet.
In noch einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine transformierte oder transfizierte Wirtszelle mit einem Expressionsvektor vor, der ein Gen umfasst, das für eine aminosäuremodifizierte humane Interferon-alpha-Isoform kodiert, bei der mindestens eine der Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenzen an einer spezifischen Stelle gebildet ist, so dass Glykosylierung an der Stelle stattfindet.
In noch einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Zubereitung von glykosyliertem humanem Interferon-alpha vor, welches das Kultivieren einer transformierten oder transfizierten Wirtszelle mit einem Expressionsvektor umfasst, der ein Gen umfasst, das für eine aminosäuremodifizierte humane Interferon-alpha-Isoform kodiert, bei der mindestens eine der Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenzen an einer spezifischen Stelle gebildet ist, so dass Glykosylierung an der Stelle in einem geeigneten Medium unter geeigneten Bedingungen zur Isolierung der glykosylierten humanen Interferon-alpha-Isoform stattfindet.
In noch einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine glykosylierte humane Interferon-alpha-Isoform vor, die durch zusätzliche Glykosylierung einer aminosäuremodifizierten humanen Interferon-alpha-Isoform, bei der mindestens eine der Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenzen an einer spezifischen Stelle gebildet ist, erhalten werden kann, so dass Glykosylierung an der Stelle stattfindet.
In noch einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung vor, die eine glykosylierte humane Interferon-alpha-Isoform umfasst, die durch zusätzliche Glykosylierung einer aminosäuremodifizierten humanen Interferon-alpha-Isoform, bei der mindestens eine der Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenzen an einer spezifischen Stelle gebildet ist, erhalten werden kann, so dass Glykosylierung an der Stelle stattfindet, und einen pharmazeutisch zulässigen Träger.
In noch einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein synthetisches Oligodeoxynukleotid vor, welches als Primer zur Herstellung einer Glykosylierungsstelle in humanem Interferon-alpha-Protein verwendet wird.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung können vollständiger aus der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen verstanden werden, in denen:
1 die Sequenz eines humanen Interferon-alpha-Gens und -Proteins darstellt. Die Pfeile oder geraden Linien über der Sequenz repräsentieren Regionen einer helikalen Konfiguration in der dreidimensionalen Struktur eines humanen Interferon-alpha-Proteins; die Pfeilrichtung repräsentiert die Richtung der Helix gemäß der Abfolge der Aminosäuresequenz.
Arginin, die 23. Aminosäure von reifem Interferon-alpha, besitzt eine DNA-Sequenz, die sich von der auf dem Fachgebiet bekannten unterscheidet, aber für dieselbe Aminosäure kodiert. Vor der Modifizierung ist die 106. Aminosäure Threonin des reifen Interferon-alpha-Proteins eine Stelle, an welcher Glykosylierung (O-Glykosylierung) bei Produktion einer vom Menschen gewonnenen oder eukaryotischen Zelle stattfindet. 2 eine Stelle in der Proteinstruktur eines humanen Interferon-alphas darstellt, an der die Aminosäuremodifikation der Glykosylierung gemäß der vorliegenden Erfindung stattfindet, bei der die Stelle die Präsequenz enthält, 6 Histidine als Aminosäuren, die in der Lage sind, an ein Metall-Ion zur Reinigungsbereitschaft zu binden und eine durch Enterokinase aufgeschlossene Stelle (4 Asparaginsäuren und darauf folgende Lysinsequenz);
3 ein schematisches Diagramm ist, das das Verfahren zur Modifizierung von Leucin, der 26. Aminosäure, mit Asparagin darstellt.
4 ein schematisches Diagramm ist, das das Verfahren zur Modifizierung von Histidin, der 34. Aminosäure und Phenylalanin, der 36. Aminosäure mit jeweils Asparagin und Serin darstellt.
5 ein schematisches Diagramm ist, das das Verfahren zur Modifizierung von Lysin, der 134. Aminosäure des Wildtyps von Interferon-alpha, mit Asparagin darstellt.
6 ein schematisches Diagramm ist, das das Verfahren zur gleichzeitigen Modifizierung der 26. Aminosäure Leucin, der 34. Aminosäure Phenylalanin und der 36. Aminosäure Phenylalanin des Wildtyps von Interferon-alpha mit jeweils Asparagin und Asparagin und Serin darstellt.
7 ein schematisches Diagramm ist, das das Verfahren zur gleichzeitigen Modifizierung der 26. Aminosäure Leucin und der 134. Aminosäure Lysin, mit jeweils Asparagin darstellt.
8 das Ergebnis des Western Blot bei humanen Interferon-alpha-Derivaten darstellt.
Der primäre Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper gegen humanes Interferon-alpha und der sekundäre Antikörper ist ein Kaninchenantikörper gegen Maus-Immunglobulin, das an das HRP-Enzym gebunden ist. Hier repräsentiert 1 einen Marker, 2 repräsentiert O-glykosyliertes IFN-alpha, 3 repräsentiert L26N Mutation, 4 repräsentiert L26N/H34NF36S Mutation, 5 repräsentiert H34NF36S Mutation, 6 repräsentiert K134N Mutation und 7 repräsentiert L26N/K134N Mutation; und
9 ist ein Graph, der die Restkonzentration von humanen Interferon-alpha-Derivaten bei der Maus in Abhängigkeit von der verstrichenen Zeit darstellt.
BESTE AUSFÜHRUNGSARTEN DER ERFINDUNG
Der hierin verwendete Begriff "Isoform von humanem Interferon-alpha" bezieht sich auf ein Analogon oder eine Mutation mit einem oder mehr inhärenten Aminosäureresten des humanen Interferon-alpha-Wildtyps, der mit einer anderen Aminosäure modifiziert ist, während er seine inhärenten Wirkungen beibehält.
Die hierin verwendeten drei Buchstaben (Einzelbuchstabe) der Aminosäuren stehen für die folgenden Säuren in Übereinstimmung mit den Standardabkürzungsregeln auf dem Gebiet der Biochemie:
Ala(A): Alanin; Asx(B): Asparagin oder Asparaginsäure; Cys(C): Cystein;
Asp(D): Asparaginsäure; Glu(E): Glutaminsäure; Phe(F): Phenylalanin;
Gly(G): Glycin; His(H): Histidin; Ile(I): Isoleucin; Lys(K): Lysin; Leu(L): Leucin; Met(M): Methionin; Asn(N): Asparagin; Pro(P): Prolin;
Gln(Q): Glutamin; Arg(R): Arginin; Ser(S): Serin; Thr(T): Threonine; Val(V): Valin; Trp(W): Tryptophan; Tyr(Y): Tyrosin; Glx(Z): Glutamin oder Glutaminsäure.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "(Einzelbuchstabe der Aminosäure)(Aminosäureposition)(Einzelbuchstabe der Aminosäure)" darauf, dass die erstgenannte Aminosäure an der entsprechenden Aminosäureposition von humanem Interferon-alpha mit letzterer Aminosäure substituiert wird. Zum Beispiel weist L26N darauf hin, dass Leucin, welches Nr. 26 des humanen Interferon-alpha-Wildtyps entspricht, mit Asparagin substituiert wird.
In der vorliegenden Beschreibung ist ein Primer zur Produktion einer Glykosylierungsstelle als "(Einzelbuchstabe der Aminosäure)(Aminosäureposition)(Einzelbuchstabe der Aminosäure) 1 oder 2" ausgedrückt, wobei 1 ein Primer ist, der komplementär zu einer Einzelstrangmatrize, die in 5'-3'-Richtung in einer Doppelstrangmatrize verläuft, und 2 ein Primer ist, der komplementär zu einer Einzelstrangmatrize ist, die in 3'-5'-Richtung in einer Doppelstrangmatrize verläuft.
Sekretionsproteine, die von eukaryotischen Zellen als Wirtszelle produziert wurden, können durch mindestens ein Oligosaccharid modifiziert werden. Es war bekannt, dass eine solche Glykosylierung genannte Modifikation die physikalischen Eigenschaften der Proteine stark beeinflussen und entscheidend für Stabilität, Sekretion und Lage der Proteine in einer Zelle sein kann. Richtige Glykosylierung kann für die biologische Aktivität notwendig sein. In der Praxis wird, wenn ein aus einer eukaryotischen Zelle gewonnenes Gen in einem Bakterium exprimiert wird, dem ein intrazellulärer Prozess zur Glykosylierung eines Proteins fehlt, ein Protein mit verschlechterter Aktivität aufgrund fehlender Glykosylierung produziert.
Die Glykosylierung findet an einer bestimmten Position abhängig von einem Polypeptidrückgrad statt und umfasst typischerweise zwei Typen. Einer ist die O-Glykosylierung, die die Bindung eines Oligosaccharids an die -OH-Gruppe eines Serin- oder Threoninrests beinhaltet und der andere ist die N-Glykosylierung, welche die Bindung eines Oligosaccharids an die NH-Gruppe eines Asparaginrests beinhaltet. Insbesondere findet die N-Glykosylierung in dem Fall statt, wenn eine spezifische Aminosäuresequenz vorliegt, und die Sequenz als Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T) bekannt ist, wobei X eine beliebige Aminosäure mit Ausnahme von Prolin sein kann. Das N-gebundene Oligosaccharid und das O-gebundene Oligosaccharid weisen unterschiedliche Strukturen auf und die bei jedem Typ vorliegenden Reste unterscheiden sich ebenfalls voneinander. Zum Beispiel ist beim O-gebunden Saccharidrest N-Acetylgalactosamin immer an Sarin oder Threonin gebunden, während beim N-gebundenen Saccharidrest N-Acetylgalactosamin immer an Asparagine gebunden ist. Das O-gebundene Oligosaccharid umfasst im Allgemeinen 4 oder weniger Saccharidreste, während das N-gebundene Oligosaccharid immer N-Acetylglucosamin und Mannose enthält und mindestens 5 Saccharidreste umfasst.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine aminosäuremodifizierte humane Interferon-alpha-Isoform zur Erhöhung der in-vivo-Stabilität eines Proteins, das mindestens eine der Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenzen umfasst, die an einer spezifischen Stelle gebildet sind, so dass Glykosylierung an der Stelle stattfindet.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckten, dass Glykosylierung durch Aminosäuremodifikation an einer beliebigen Region angeregt werden kann, mit Ausnahme der helikalen Region in der Aminosäuresequenz von humanem Interferon-alpha-Protein.
In einer Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine aminosäuremodifizierte humane Interferon-alpha-Isoform, bei der mindestens eine der Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenzen an den folgenden Aminosäurerestpositionen gebildet ist, so dass Glykosylierung an diesen Stellen stattfindet:

In einer bevorzugten Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine aminosäuremodifizierte humane Interferon-alpha-Isoform, bei der mindestens eine der Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenzen an den folgenden Aminosäurerestpositionen gebildet ist, so dass Glykosylierung an diesen Stellen stattfindet:

– Arg22-Thr52(Arg22-Arg-Ile-Ser-Leu-Phe-Phe-Gly-Phe-Prc-Gb-Glu-Glu-Phe-Gly-Asn-Gln-Phe-Gln-Lys-Ala-Glu-Thr52); und
– Lys134-Ser137(Lys134-Tyr-Ser137).

In einer mehr bevorzugten Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf eine aminosäuremodifizierte humane Interferon-alpha-Isoform, bei der die 26. Aminosäure Leucin mit Asparagin, die 34. Aminosäure Histidin und die 36. Aminosäure Phenylalanin mit jeweils Asparagin und Serin modifiziert sind, oder die alle diese Modifikationen aufweist.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Modifikation mindestens eines Nukleotids, so dass N-Glykosylierung bei einer DNA-Sequenz stattfinden kann, die für humanes Interferon-alpha kodiert, um eine zusätzliche Glykosylierungsstelle zu erhalten, das Einführen der DNA-Glykosylierung in eine eukaryotische Zelle, die die Glykosylierung ausführt, gefolgt von Expression, so dass die zusätzliche Glykosylierung natürlich erfolgt. Das zusätzlich glykosylierte humane Interferon-alpha der vorliegenden Erfindung wird durch Modifikation der DNA-Sequenz erzeugt, so dass die Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenz erweitert wird.
In einer Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Gen, das für eine aminosäuremodifizierte humane Interferon-alpha-Isoform kodiert, bei der mindestens eine der Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenzen an den folgenden Aminosäurerestpositionen gebildet ist, so dass Glykosylierung an diesen Stellen stattfindet:

– Cys1-Ser8(Cys1-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser8);
– Arg22-Thr52(Arg22-Arg-Ile-Ser-Leu-Phe-Ser-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-His-Asp-Phe-Gly-Phe-Pro)-Gln-Glu-Glu-Phe-Gly-Asn-Gln-Phe-Gln-Lys-Ala-Glu-Thr52);
– Ser68;
– Asp77;
– Lys134-Ser137(Lys134-Tyr-Ser137); und
– Gln158-Glu165(Gln158-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu165).

In einer bevorzugten Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Gen, das für eine aminosäuremodifizierte humane Interferon-alpha-Isoform kodiert, bei der mindestens eine Aminosäure mit einer anderen Aminosäure modifiziert ist, so dass die Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenz an den folgenden Aminosäurerestpositionen erweitert ist:

– Arg22-Thr52(Arg22-Arg-Ile-Ser-Leu-Phe-Ser-Phe-Gly-Phe-Pro-Gb-Glu-Glu-Phe-Gly-Asn-Gln-Phe-Gln-Lys-Ala-Glu-Thr52); und
– Lys134-Ser137(Lys134-Tyr-Ser137).

In einer mehr bevorzugten Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Gen, das für eine aminosäuremodifizierte humane Interferon-alpha-Isoform kodiert, bei der die 26. Aminosäure Leucin mit Asparagin, die 34. Aminosäure Histidin und die 36. Aminosäure Phenylalanin mit jeweils Asparagin und Serin modifiziert sind, oder die 134. Aminosäure Lysin mit Asparagin modifiziert ist, oder die alle diese Modifikationen aufweist.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Gen, das für humanes Interferon-alpha kodiert, aus einem Stamm zur Expression in Tierzellen gewonnen, der humanes Interferon-alpha produziert. Zur Genklonierung und Trennung können auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren eingesetzt werden.
Das auf die oben beschriebene Weise gewonnene humane Interferon-alpha-Gen kann in mindestens einem ausgewählten Codon modifiziert werden. In der vorliegenden Beschreibung kann Modifikation als Substitution eines oder mehrerer Codons auf einem Gen definiert werden, das für humanes Interferon-alpha kodiert, um eine Veränderung der Aminosäuresequenz des humanen Interferon-alphas herbeizuführen. Insbesondere bezieht sie sich auf die Substitution mindestens einer Aminosäure mit einer anderen Aminosäure, so dass die Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenz zur zusätzlichen N-Glykosylierung an der Aminosäuresequenz von humanem Interferon-alpha gebildet wird. Zum Beispiel in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung, in dem die 26. Aminosäure Leucin mit Asparagin substituiert ist, wird die Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenz gebildet, da es sich bei der 28. Aminosäure um Serin handelt, wodurch eine N-Glykosylierung stattfinden kann. Ebenso, wenn die 34. Aminosäure Histidin und die 36. Aminosäure Phenylalanin mit jeweils Asparagin und Serin substituiert sind, wird die Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenz gebildet, wodurch eine zusätzliche N-Glykosylierung stattfinden kann. Desweiteren, wenn die 134. Aminosäure Lysin mit Asparagin substituiert ist, wird die Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenz gebildet, da es sich bei der 136. Aminosäure um Serin handelt, wodurch eine N-Glykosylierung stattfinden kann.
In einer Ausführungsform wird ein synthetisches Oligonukleotid hergestellt, welches eine Codon umfasst, das für eine gewünschte Aminosäuremodifikation in humanem Interferon-alpha kodiert. Typischerweise wird ein Oligonukleotid mit einer Länge von etwa 25 Nukleotiden verwendet. Auch wenn ein Oligonukleotid mit einer kürzeren Länge eingesetzt werden kann, besitzt das optimale Oligonukleotid 12 bis 15 Nukleotide, die komplementär zu einer Matrize an beiden Seiten der Nukleotide sind, die für die Modifikation kodieren. Solche Oligonukleotide können mit der Matrizen-DNA in ausreichendem Maße hybridisiert werden. Die in der vorliegenden Erfindung zur Produktion einer zusätzlichen Glykosylierungsstelle verwendeten Oligonukleotide sind Tabelle 2 dargestellt. Diese Oligonukleotide können mithilfe von auf dem Fachgebiet bekannten Technologien synthetisiert werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine humane Interferon-alpha-Isoform-DNA, bei der eine Aminosäure modifiziert ist, vorgesehen. PCR wird durchgeführt, wobei humane Interferon-alpha-DNA als Matrize und ein synthetisches Oligonukleotid, das für eine Modifikation kodiert, als ein Primer verwendet wird. Im Erhitzungsschritt der PCR wird die Doppelstrangmatrize getrennt, und an jede der Einzelstrangmatrizen wird ein komplementärer Primer hybridisiert. DNA-Polymerase bindet Nukleotide, die komplementär zur Matrize sind, von der -OH-Gruppe des Primers, der für die Modifikation in 5'-3'-Richtung kodiert. Folglich enthält der zweite Strang den Primer, der für die Modifikation kodiert, und daher für die gewünschte Modifikation auf einem Gen kodiert. Der zweite Strang dient als Matrizen-DNA bei den wiederholten Replikationsschritten der PCR und das Gen, das für die Modifikation kodiert, wird fortlaufend amplifiziert. Zum Beispiel in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung wird PCR unter Verwendung von Wildtyp-Interferon-alpha-DNA als Matrize und Primerpaaren von IFN-A5' und L26N2 sowie L26N1 und IFN-A3' durchgeführt, um Leucin, den Aminosäurerest an 26. Stelle, mit Asparagin zu modifizieren. Daraufhin werden zwei DNA-Segmente erhalten, bei denen die 26. Aminosäureposition zu einem Codon abgeändert wird, das Asparagin anstelle von Leucin entspricht. Dann wird sekundäre PCR durchgeführt unter Verwendung der beiden so gewonnenen DNA-Segmente und IFN-A5' und IFN-A3 als Primerpaar, um ein modifiziertes Gen von IFN-alpha-L26N zu gewinnen, bei welchem die 26. Aminosäure mit Asparagin anstelle von Leucin modifiziert ist, so dass eine Glykosylierung stattfinden kann.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine humane Interferon-alpha-Isoform-DNA vorgesehen, die zwei oder mehr Aminosäuremodifikationen umfasst. Eine Mutation mit zwei oder mehr modifizierten Aminosäuren wird durch verschiedene Verfahren hergestellt. Wenn zwei oder mehr zu modifizierende Aminosäuren bei einem Polypeptid nebeneinander liegen, können sie gleichzeitig mithilfe eines Oligonukleotids mit allen kodierten Aminosäuremodifikationen modifiziert werden. Daher ist die Herstellung der Mutation dieselbe mit dem Verfahren zur Herstellung eines humanen Interferon-alpha-Gens mit einem modifizierten Nukleotid, abgesehen davon, dass ein Oligonukleotid als Primer zwei oder mehr Aminosäuremodifikationen aufweist. Wenn jedoch die beiden oder mehr Aminosäuren auf einem Polypeptid weit auseinander liegen (beabstandet durch 10 oder mehr Aminosäuren), ist es unmöglich, ein Oligonukleotid mit allen gewünschten kodierten Modifikationen herzustellen.
Stattdessen sollten andere Verfahren eingesetzt werden. Das erste Verfahren besteht darin, einzelne Oligonukleotide, die jede Aminosäuremodifikation enthalten, herzustellen. Wenn die Oligonukleotide gleichzeitig an eine Einzelstrangmatrizen-DNA angelagert werden, kodiert der zweite aus der Matrize synthetisierte DNA-Strang für alle gewünschten Aminosäuremodifikationen. Ein weiteres Verfahren der vorliegenden Erfindung beinhaltet zwei- oder mehrmalige Mutagenese zur Produktion einer solchen Isoform. In der ersten Mutagenese wird die Wildtyp-DNA als Matrize verwendet, und ein Oligonukleotid, welches die erste gewünschte Aminosäuremodifikation enthält, wird an die Matrize angelagert, um eine heterogene DNA zu bilden (Heteroduplex). Bei der zweiten Mutagenese wird die in der ersten Mutagenese hergestellte modifizierte DNA als Matrize verwendet. Daher enthält diese Matrize bereits mindestens eine Modifikation. An diese Matrize wird ein Oligonukleotid mit mindestens einer zusätzlichen Aminosäuremodifikation angelagert, und die resultierende DNA weist alle Modifikationen der ersten und zweiten kodierten Mutagenese auf.
Die resultierende DNA kann als Matrize bei der dritten Mutagenese verwendet werden. Zusammengefasst besteht das obige Verfahren zur Modifikation zweier oder mehrerer Nukleotide aus der mehrmaligen Wiederholung eines Verfahrens zur Modifikation eines Nukleotids. Zum Beispiel wird in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung, um Leucin, die 26. Aminosäure des Interferon-alpha-Wildtyp-Proteins mit Asparagin und die 134. Aminosäure Lysin zur selben Zeit mit Asparagin zu modifizieren, zuerst die 134. Position modifiziert, und eine Modifikation der 26. Aminosäure wird unter Verwendung der zuvor modifizierten DNA als Matrize ausgeführt. Als Ergebnis erhält man ein humanes Interferon-alpha-Gen, bei dem die beiden Reste modifiziert sind.
Die DNA-Sequenzen, die gemäß der vorliegenden Erfindung für die humanen Interferon-alpha-Isoformen kodieren, können mit jedem beliebigen Standardverfahren, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, synthetisiert werden, z. B. unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers. (ex. Biosearch, Applied Biosystem^TM).
Die glykosylierte Isoform der vorliegenden Erfindung wird typischerweise hergestellt durch (a) Einfügen der DNA-Sequenz, die für die humane Interferon-alpha-Isoform kodiert, in einen Vektor mit einer oder mehr Expressionskontrollsequenzen, die funktionell mit der DNA-Sequenz verbunden sind, um deren Expression zu kontrollieren, (b) Transformation oder Transfektion eines Wirts mit dem resultierenden rekombinanten Expressionsvektor, (c) Kultivierung der transformierten oder transfizierten Zelle in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen, um die DNA-Sequenz der humanen Interferon-alpha-Isoform zu exprimieren, gefolgt von der Isolierung der glykosylierten humanen Interferon-alpha-Isoform.
In diesem Zusammenhang sieht die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle vor, die mit dem rekombinanten Expressionsvektor, der die DNA-Sequenz enthält, die für die humane Interferon-alpha-Isoform kodiert, transformiert oder transfiziert ist.
Natürlich sollte es klar sein, dass alle Vektoren und Expressionskontrollsequenzen ihre Funktionen zur Expression der DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung nicht gleichermaßen erfüllen. Ähnlich erfüllen nicht alle Wirtszellen ihre Funktionen gleichermaßen für dasselbe Expressionssystem. Jedoch können Fachleute einen Vektor, eine Expressionskontrollsequenz und eine Wirtszelle ohne übermäßiges Experimentieren in geeigneter Weise auswählen, ohne vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Bei der Auswahl eines Vektors, z. B., muss eine Wirtszelle berücksichtigt werden. Dies ist nötig, da der Vektor darin repliziert werden sollte.
Auch sollte die Anzahl der Replikationen berücksichtigt werden und die Fähigkeit, die Anzahl der Replikationen eines Vektors und die Expression von anderen Proteinen, für die der Vektor kodiert, z. B. die eines antibiotischen Markers zu kontrollieren. Bei der Auswahl einer Expressionskontrollsequenz, sollten verschiedene Faktoren berücksichtigt werden. Zum Beispiel muss die relative Stärke der Sequenz, die Kontrollierbarkeit und Kompatibilität mit der DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung, insbesondere im Hinblick auf eine möglich zweidimensionale Struktur berücksichtigt werden. Ebenso bei der Auswahl eines Wirts, der Kompatibilität mit einem ausgewählten Vektor, der Toxizität, den Sekretionseigenschaften und der Fähigkeit ein Polypeptid des durch die Nukleotidsequenz kodierten Produkts korrekt zu falten, der Fermentations- oder Kultivierungserfordernisse und -Bedingungen und der Reinigungsbereitschaft des von der Nukleotidsequenz kodierten Produkts.
Der hierin verwendete Begriff „Vektor" bezieht sich auf ein DNA-Molekül als Träger, der in der Lage ist ein fremdes Gen stabil in eine Wirtszelle einzuschleusen. Um als Vektor von Nutzen zu sein, kann ein Vektor repliziert werden, hat er ein Mittel, in eine Wirtszelle eingeschleust zu werden und seine eigene Anwesenheit nachzuweisen.
Der Begriff „rekombinanter Expressionsvektor" bezieht sich auf ein zyklisches DNA-Molekül, in welchem ein fremdes Gen funktionell mit einem Vektor verbunden ist, so dass das Gen in einer Wirtszelle exprimiert werden kann. Der rekombinante Expressionsvektor kann in mehreren Kopien hergestellt und heterogene DNA darin eingefügt werden. Wie auf dem Fachgebiet wohl bekannt ist, sollte das Gen funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz mit offenem Leserahmen verbunden sein, welche in einem ausgewählten Expressionswirt arbeiten kann, um den Expressionslevel eines transfizierten Gens in einer Wirtszelle zu erhöhen. Vorzugsweise ist das Gen in einem Expressionsvektor enthalten, der einen Selektionsmarker und einen Replikationsursprung umfasst. Wenn ein Expressionswirt eine eukaryotische Zelle ist, sollte der Expressionsvektor ferner einen Expressionsmarker umfassen, der in der eukaryotischen Expressionswirtszelle von Nutzen ist.
Verschiedene Expressionsvektoren können zur Expression der DNA-Sequenz, die für die humane Interferon-alpha-Isoform kodiert, verwendet werden. Vorzugsweise wird ein für eine eukaryotische Wirtszelle geeigneter Expressionsvektor eingesetzt, da die Glykosylierung an der humanen Interferon-alpha-Isoform stattfindet.
Beispiele für Expressionsvektoren, die für eukaryotische Wirtszellen von Nutzen sind, umfassen Expressionskontrollsequenzen, die aus SV40, bovinem Papillomavirus, Adenovirus und Cytomegalovirus gewonnen wurden. Spezifische Beispiele für die Vektoren umfassen pCDNA3.1(+)\Hyg (Invitrogen, Carlsbad, Calif., USA) und pCI-neo (Stratagen, La Jolla, Calif., USA). Zu Expressionsvektoren, die für Hefezellen von Nutzen sind, gehören 2 μ Plasmid und Derivate davon, POT1-Vektor ( US-Pat. Nr. 4,931,373 ) und pPICZ A, B, oder C (Invitrogen). Zu Expressionvektoren, die für Insektenzellen von Nutzen sind, gehören pVL 941, pBluebac 4.5 and pMelbac (Invitrogen).
„Expressionskontrollsequenz" bezieht sich auf Nukleinsäuresequenzen, die notwendig oder nutzbringend für die Polypeptidexpression sind. Die jeweiligen Expressionskontrollsequenzen können eine eigene oder fremde auf einer Nukleinsäure sein, die für ein Polypeptid kodiert. Beispiele für die Kontrollsequenz beinhalten, ohne auf diese beschränkt zu sein, Leadersequenz, polyadenylierte Sequenz, Propeptidsequenz, Promoter, Enhancer oder Upstream-Aktivierungssequenz, Signalpeptidsequenz und Transkriptionsterminationsfaktor. Eine Expressionskontrollsequenz enthält einen Promoter.
Um die DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, können verschiedene Expressionskontrollsequenzen als Vektor verwendet werden. Beispiele für Expressionskontrollsequenzen, die dazu geeignet sind, Expression in Säugetierzellen einzuleiten, umfassen early und late Promoter von SV40 und Adenovirus, MT-1-(Metallothionein-Gen-)Promoter, humanes Cytomegalovirus early Gen (CMV), Rous-Sarcomavirus-(RSV-)Promoter und humanen Ubiquitin C-(UbC-)Promoter. Zur weiteren Verbesserung der Expression in Säugetierzellen kann ein synthetisches Intron in eine Nichttranskriptionsregion einer Nukleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, eingefügt werden.
Beispiele für Expressionskontrollsequenzen, die dazu geeignet sind, Expression in Insektenzellen einzuleiten, umfassen Polyhedrin-Promoter, P10-Promoter, Baculovirus 39K-delayed-early-Genpromoter und SV40-Polyadenylierungssequenz. Beispiele für Expressionskontrollsequenzen zur Verwendung in Hefezellen umfassen einen Promoter eines α-Matingsystems, Hefe-Triosephosphat-Isomerase-(TPI-)Promoter und ADH2-4c-Promoter. Beispiele für Expressionskontrollsequenzen, die zur Einleitung der Expression in Pilzzellen geeignet sind, umfassen ADH3-Promoter und Terminationsfaktor.
Eine andere Vektorkomponente, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, ist ein Signalpeptid. Diese Sequenz befindet sich typischerweise am 5'-Ende eines Gens, das für ein Protein kodiert, und wird somit zum Amino-Terminus des Proteins transkribiert. Die An- oder Abwesenheit eines Signalpeptids variiert in Abhängigkeit von einer Expressionswirtszelle, die bei der Produktion eines zu exprimierenden Polypeptids verwendet wird (je nachdem, ob das zu exprimierende Polypeptid ein intrazelluläres oder extrazelluläres Polypeptid ist), und von der Präferenz der Rückgewinnung von sezernierten Produkten. Das Signalpeptid liegt vor, wenn ein Polypeptid aus einer exprimierenden Zelle sezerniert wird. Wenn das Signalpeptid vorliegt, sollte es von einer Zelle, die zur Expression eines Polypeptids ausgewählt wurde, erkannt werden. Das Signalpeptid kann homolog zu einem Polypeptid sein (typischerweise mit dem Polypeptid assoziiert) oder heterolog zu einem Polypeptid sein (aus einem anderen als dem Polypeptid gewonnen) und kann homolog oder heterolog zu einer Wirtszelle sein.
Eine Nukleinsäure ist „funktionell verbunden" mit einer anderen Nukleinsäure, wenn sie in einem funktionellen Verhältnis angeordnet sind. Dies bedeutet, dass ein geeignetes Molekül (z. B. ein Transkriptionsaktivator) an (eine) regulierende Sequenz(en) bindet, an ein Gen oder (eine) regulierende Sequenz(en), die auf eine solche Art und Weise verbunden sind, dass die Expression des Gens moduliert wird. Zum Beispiel, wenn ein Präsequenz oder Signalsequenz an der Sekretion eines reifen Proteins beteiligt ist, sind sie mit dem Promoter funktionell verbunden. Wenn ein Promoter die Transkription einer kodierenden Sequenz beeinflusst, ist der Promoter funktionell mit der kodierenden Sequenz verbunden. Wenn eine ribosomale Bindungsstelle an einer Stelle lokalisiert ist, die in der Lage ist, eine kodierende Sequenz zu lesen, ist die ribosomale Bindungsstelle mit der kodierenden Sequenz funktionell verbunden. Allgemein bedeutet „funktionell verbunden", mit einer verbundenen DNA und einer Signalsequenz in Kontakt zu stehen und in einem Leserahmen zu sein.
Der Enhancer braucht jedoch nicht in Kontakt zu sein. Die Verbindung dieser Sequenzen wird durch Ligierung (Verbindung) an einer geeigneten Restriktionsenzymstelle ausgeführt. Wenn eine solche Stelle nicht existiert, kann ein konventionell synthetisierter Oligonukleotidadapter oder -linker verwendet werden.
Die Herstellung eines geeigneten Vektors, der ein Gen umfasst, das für die humane Interferon-alpha-Isoform und die obigen Komponenten kodiert (d. h. eine Kontrollsequenz), kann mithilfe einer einfachen rekombinanten Technologie durchgeführt werden. Um einen gewünschten Vektor herzustellen, werden die jeweiligen DNA-Segmente zuerst mit Restriktionsenzymen aufgeschlossen und dann miteinander ligiert, wobei eine bestimmte Ordnung und Orientierung berücksichtigt wird.
DNA kann mithilfe eines bestimmten Restriktionsenzyms in einem geeigneten Puffer aufgeschlossen werden.
Typischerweise werden 0,2–1 μg eines Plasmids oder eines DNA-Segments zusammen mit etwa 1 bis 2 Einheiten eines benötigten Restriktionsenzyms in etwa 20 μl eines Puffers verwendet. Ein geeigneter Puffer, DNA-Level, eine geeignete Inkubationszeit und Temperatur sind durch einen Hersteller des Restriktionsenzyms spezifiziert. Typischerweise ist eine Inkubationszeit von etwa 1 bis 2 Stunden bei 37 C geeignet, obwohl einige Enzyme eine höhere Temperatur benötigen. Nach der Inkubation können Enzyme und andere Verunreinigungen durch Extraktion der Aufschlusslösung mit einer Mischung aus Phenol und Chloroform entfernt werden, und DNA kann aus der wässrigen Phase durch Präzipitation mit Ethanol rückgewonnen werden. Hier sind Enden der DNA-Segmente miteinander kompatibel, so dass die DNA-Segmente einen funktionalen Vektor bilden können.
Die aufgeschlossenen DNA-Segmente werden klassifiziert und mittels Elektrophorese nach ihrer Größe selektiert. DNA kann der Elektrophorese mit einer Agarose- oder Polyacrylamidmatrix unterzogen werden. Die Selektion der Matrix kann mit einer Größe des zu isolierenden DNA-Segments bestimmt werden. Nach der Elektrophorese wird die DNA aus der Matrix durch Elektroelution extrahiert. Wenn eine Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt verwendet wird, wird die Agarose geschmolzen und DNA daraus extrahiert.
Die zu ligierenden DNA-Segmente sollten in einer gleichen molaren Menge zu der Lösung hinzugegeben werden. Die Lösung enthält ATP, Ligasepuffer, Ligasen wie z. B. etwa 10 Einheiten T4-Ligase pro 0,5 μg DNA. Um ein DNA-Segment an einen Vektor zu ligieren, sollte der Vektor durch Aufschluss mit einem geeigneten Restriktionsenzym linearisiert werden. Der linearisierte Vektor wird mit alkalischer Phosphatase oder alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt. Die Behandlung mit Phosphorylase verhindert die Selbstligierung eines Vektors während des Ligierungsschrittes. Der durch das oben beschriebene Verfahren zubereitete rekombinante Expressionsvektor wird dann zur Transformation oder Transfektion einer Wirtszelle verwendet.
Bei der Auswahl der Wirtszelle wird eine Wirtszelle mit einer hohen DNA-Einführungseffizienz ausgewählt, die eine hohe Expressionseffizienz der eingeführten DNA aufweist. Insbesondere werden bei der vorliegenden Erfindung eukaryotische Wirtszellen zur Ausführung der Glykosylierung bei der humanen Interferon-alpha-Isoform verwendet. Geeignete Beispiele für Hefewirtszellen umfassen Saccharomyces- und Hansenulastämme. Geeignete Beispiele für Pilzwirtszellenzellen umfassen Tricoderma-, Fusarium- und Aspergillusstämme. Geeignete Beispiele für Insektenwirtszellen umfassen Lepidopterazelllienien, wie z. B. Sf9 oder Sf21. Geeignete Beispiele für Säugetierwirtszellen umfassen CHO-Zelllinie, COS-Zelllinien, wie z. B. COS 1, COS 7, BHK-Zelllinien und Tierzellen wie z. B. Mauszellen, gewebekultivierte Pflanzenzellen und menschliche Zellen.
Polynukleotide können in eine Wirtszelle eingeführt werden mit Verfahren, die in grundlegenden experimentellen Handbüchern beschrieben sind, wie z. B. [Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)] und [Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning 2. Auflage]. Bevorzugte Verfahren zur Einführung eines Polynukleotids in eine Wirtszelle umfassen z. B. Calciumphosphat-Transfektion, DAEA-Dextran vermittelte Transfektion, Transvektion, Mikroinjektion, kationische lipid-vermittelte-Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Scrape Logding, ballistische Einführung oder Infektion.
Bei dem Produktionsverfahren der vorliegenden Erfindung werden Wirtszellen in einem Nährmedium kultiviert, welches für Polypepdidproduktion unter Einsatz einer bekannten Technologie geeignet ist. Z. B. können Zellen in einem geeigneten Medium in einem Fermenter für das Labor- oder die Industrie unter Bedingungen kultiviert werden, die akzeptabel sind für die Expression und/oder Sekretion eines Polypeptids, durch Fermentation im kleinen oder großen Maßstab, Schüttelkolbenkultur. Die Kultivierung wird mithilfe einer bekannten Technologie in einem geeigneten Nährmedium durchgeführt, welches Kohlenstoff, eine Stickstoffquelle und anorganische Salze enthält. Das Medium ist Fachleuten wohl bekannt und ist im Handel erhältlich oder kann produziert werden. Wenn ein Peptid direkt in ein Nährmedium sezerniert wird, kann das Polypeptid direkt aus dem Medium isoliert werden. Wenn ein Peptid nicht sezerniert wird kann es aus dem Zelllysat isoliert werden.
Ein Polypeptid kann mit einem auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren isoliert werden. Zum Beispiel kann es aus einem Nährmedium durch traditionelle Verfahren isoliert werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Zentrifugation, Filtration, Extraktion, Sprühtrocknung, Eindampfen oder Präzipitation. Desweiteren kann ein Polypeptid durch verschiedene öffentlich bekannte Verfahren gereinigt werden, einschließlich Chromatographie (z. B. Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, hydrophile, hydrophobe Chromatographie, Größenausschlusschromatographie), Elektrophorese, fraktionierte Löslichkeit (z. B. Ammoniumsulfatpräzipitation), SDS-PAGE oder Extraktion.
Die vorliegende Erfindung sieht eine glykosylierte humane Interferon-alpha-Isoform mit einer zusätzlichen Glykosylierung vor, die man durch die oben beschriebene Prozedur erhalten kann. In der vorliegenden Beschreibung kann die glykosylierte humane Interferon-alpha-Isoform als Expressionsprodukt definiert werden, welches durch das Einführen des Interferon-alpha-Gens erhalten wird, welches dazu modifiziert ist, die Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T)-Sequenz in eine eukaryotische Wirtszelle zu erweitern, gefolgt von Expression, so dass Glykosylierung spontan stattfinden kann. Das heißt, sie bezieht sich auf ein heterogenes Molekül, gebildet durch kovalente Bindung von Zuckerresten an die Asparagin -NH-Gruppe von Asn-X-Ser/Thr(N-X-S/T), eine zusätzliche Glykosylierungsstelle der humanen Interferon-alpha-Isoform.
Die vorliegende Erfindung sieht eine pharmazeutische Zusammensetzung vor, die eine glykosylierte Interferon-alpha-Isoform mit einer zusätzlichen Glykosylierung und einem pharmazeutisch zulässigen Träger umfasst. Eine therapeutische Zubereitung der glykosylierten humanen Interferon-alpha-Isoform zur therapeutischen Verabreichung kann in einen lyophilisierten Kuchen und eine wässrige Lösung formuliert werden, wobei ein beliebiger pharmazeutisch zulässiger Träger, Hilfsstoff, Stabilisator und die glykosylierte humane Interferon-alpha-Isoform in einer gewünschten Reinheit kombiniert werden. Eine Zubereitung zur parenteralen Verabreichung kann durch Kombination der glykosylierten humanen Interferon-alpha-Isoform mit einem pharmazeutischen Träger in eine verabreichbare Formulierung (Lösung, Suspension oder Emulsion) zubereitet werden.
Der pharmazeutisch zulässige Träger, Hilfsstoff oder Stabilisator weist keine Toxizität gegenüber einem Patienten auf, der diese in einer zu verabreichenden Dosis und Konzentration erhält, und diese sind mit anderen Inhaltsstoffen kompatibel. Die Zubereitung sollte beispielsweise kein Oxidationsmittel oder andere Substanzen enthalten, die dafür bekannt sind, dass sie für ein Polypeptid schädlich sind.
Zu geeigneten Trägern gehören Puffer, wie z. B. Phosphorsäure, Zitronensäure und andere organische Säuren, Antioxidanzien, wie z. B. Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide, Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine und Immunglobulin; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B, Glycin, Glutamin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, wie z. B. Mannose oder Dextrin, Disaccharide, andere Kohlenhydrate, Chelatbildner, wie z. B. EDTA; Metallionen, wie z. B. Zink, Kobalt oder Kupfer; Zuckeralkohole, wie z. B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium und/oder nicht-ionische Tenside, wie z. B. Tween, Pluronic oder Polyethylenglykol (PEG).
Um die glykosylierte humane Interferon-alpha-Isoform zur therapeutischen Verabreichung zu verwenden, sollte sie sterilisiert werden. Die Sterilisation kann auf einfache Weise durch Filtration durch eine sterile Filtermembran durchgeführt werden.
Die therapeutische Zusammensetzung der glykosylierten humanen Interferon-alpha-Isoform wird typischerweise in einem Behälter gelagert, der eine sterile Zugangsöffnung aufweist, wie z. B. ein vaskulärer Injektionsbeutel mit einem Deckel, durch welchen eine subkutane Injektionsnadel hindurch stechen kann, oder eine Phiole. Das humane Interferon-alpha wird als eine wässrige Lösung oder lyophilisierte Zubereitung in einem Einzel- oder Mehrfachdosenbehälter gelagert, z. B. eine verschlossene Phiole oder Ampulle. Im Falle der lyophilisierten Zubereitung werden 5 ml sterilisierte und gefilterte 1%ige (w/v) wässrige humane Interferon-alpha-Lösung in eine 10 ml Phiole gefüllt und die Mischung wird lyophilisiert. Die Injektion kann durch Wiederherstellung des lyophilisierten humanen Interferon-alphas mit bakteriostatischem Wasser für Injektionszwecke zubereitet werden.
Die glykosylierte humane Interferon-alpha-Isoform kann direkt an Tiere mithilfe geeigneter Technologie verabreicht werden, einschließlich parenteraler Verabreichung, oder lokal oder systemisch verabreicht werden. Ein spezieller Verabreichungsweg kann bestimmt werden, beispielsweise in Abhängigkeit von der Fallgeschichte des Patienten, einschließlich Nebenwirkungen, welche beim Interferon-alpha anerkannt sind oder zu erwarten sind. Beispiele der parenteralen Verabreichung umfassen subkutane, intramuskuläre, intravaskuläre, intraarterielle, intraperitoneale Verabreichung. Am meisten bevorzugt wird die Verabreichung durch Dauerinjektion durchgeführt (beispielsweise mit einer Minipumpe, wie z. B. einer Osmosepumpe) oder durch Injektion über z. B. den intravaskulären oder subkutanen Weg. Die glykosylierte humane Interferon-alpha-Isoform wird vorzugsweise subkutan verabreicht.
Die glykosylierte humane Interferon-alpha-Isoform wird einem Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" kann als die Menge definiert werden, die ausreichend ist, eine gewünschte therapeutische Wirkung bei einem bestimmten Krankheitszustand und einer bestimmten Verabreichungsmethode vorzuweisen. Die humane Interferon-alpha-Zusammensetzung zur Behandlung sollte zubereitet und verabreicht werden unter Berücksichtigung bestimmter zu behandelnder Krankheitszustände, klinischer Zustände individueller Patienten (speziell der Nebenwirkung, die mit der Behandlung mit humanem Interferon-alpha einhergehen, des Zielortes der glykosylierten humanen Interferon-alpha-Isoform, der Verabreichungsmethode, dem Verabreichungsschema, anderer Faktoren, die Fachleuten bekannt und mit bevorzugten medizinischen Praktiken konsistent sind. Die therapeutisch wirksame Menge bei der Behandlung mit der glykosylierten humanen Interferon-alpha-Isoform wird durch die obigen Kriterien bestimmt. Eine tägliche wirksame Menge der glykosylierten humanen Interferon-alpha-Isoform gemäß der vorliegenden Erfindung liegt im Bereich von etwa 2 × 10⁶ Einheiten bis 500 × 10⁶ Einheiten.
Nun wird die vorliegende Erfindung in weiteren Einzelheiten anhand der folgenden Beispiele beschrieben. Die Beispiele dienen jedoch lediglich der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, und die Erfindung ist nicht auf diese beschränkt.
<Beispiel 1>
Zubereitung des humanen Interferon-alpha-Gens
Als humanes Interferon-alpha-Gen wurde ein Stamm eingesetzt, der modifiziertes Interferon-alpha produziert, und der sich im Besitz des Antragstellers befindet. Das Interferon-alpha-Gen im Besitz des Antragstellers umfasste nicht die gesamte Sequenz zur Expression in E. coli. Daher wurde PCR unter Verwendung eines 5 chemisch synthetisierten Oligonukleotids ausgeführt, um die gesamte Sequenz herzustellen. Das humane Interferon-alpha-Gen ohne sie gesamte Sequenz wurde unter Verwendung des synthetischen PiaE5-1 und IFN-A5'-Oligonukleotids amplifiziert. Das amplifizierte DNA-Segment wurde mit PCR unter Verwendung eines synthetischen Oligonukleotids von PiaE5-2 und IFN-A3' amplifiziert, um die Vollängensignalsequenz am 5'-Ende des humanen Interferon-alpha-Gens einzuführen. Die verwendeten synthetischen Oligonukleotide sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Als Primer verwendete synthetische Oligodeoxynukleotide zur Herstellung der gesamten Sequenz.
<Beispiel 2>
Auswahl einer Modifikationsstelle auf einem humanen Interferon-alpha-Gen
Um eine Stelle zur zusätzlichen Glykosylierung auf humanem Interferon-alpha auszuwählen, wurde das Ergebnis der Referenz [Walter (Structure (1996) Vol. 4, 1453)] verwendet. Bei der Auswahl einer Stelle wurde zuerst die helikale Region der Aminosäuresequenz des humanen Interferon-alpha-Proteins ausgeschlossen (1). Aus der Sequenz mit der ausgeschlossenen helikalen Region wurde eine zweite Stelle ausgewählt, unter Berücksichtigung, dass die 106. Aminosäure, der Threoninrest des Interferon-Wildtyps eine dreidimensionale O-Glykosylierung aufweist. Aus der als zweites gewählten Stelle wurde schließlich eine Stelle, an der N-Glykosylierung ohne Weiteres zu einem Motiv umgewandelt werden könnte, ausgewählt. Wie in 1 dargestellt lagen die Stellen, an denen die Modifikation zum Hinzufügen einer zusätzlichen Glykosylierungsstelle versucht wurde, bei L26, H34 und F36 sowie K134, wo die 26. Aminosäure Leucin mit Asparagin, die 34. Aminosäure Histidin und die 36. Aminosäure Phenylalanin mit Asparagin und Serin modifiziert wurden und die 134. Aminosäure Lysin mit Asparagin modifiziert wurde. Es werden synthetische Oligonukleotide, die in dieser Studie eingesetzt wurden, dargestellt. Die Richtung des Pfeils repräsentiert die 5'->3'-Richtung der jeweiligen Oligodeoxynukleotide.
Um das humane Interferon-alpha-Protein zu reinigen, wurde eine zusätzliche Aminosäuresequenz (HisEK) zwischen der Präsequenz und der Aminosäuresequenz des reifen humanen Interferon-alpha-Proteins eingefügt. Die Aminosäuresequenz war M-G-G-S-H-H-H-H-H-H-G-D-D-D-D-K-. Durch Einfügen dieser Aminosäuresequenz, kann das exprimierte humane Interferon-alpha-Proteinderivat mit Metall-Affinitäts-Säulenchromatografie isoliert werden. Das isolierte Protein wurde mit Enterokinase behandelt und der Metall-Affinitäts- Säulenchromatographie unterzogen, um nur humanes Interferon-alpha-Proteinderivat zu erhalten.
Das Einfügen der HisEK-Sequenz wurde durch Amplifikation von DNA an der Präsequenz-Region durch PCR mit IFN-A5 und alpha:1 Primer durchgeführt, gefolgt von Aufschluss mit dem Restriktionsenzym NcoI. Dann wurde die reife humane Interferon-alpha-Gen-Region primär mit alpha:2 und IFN-A3 amplifiziert. Das resultierende DNA-Segment wurde sekundär mit HisEK:2 und IFN-A3 und dann mit HisEK:1 und IFN-A3 amplifiziert, um ein DNA-Segment zu erhalten. Das resultierende DNA-Segment wurde mit dem Restriktionsenzym NcoI aufgeschlossen und die beiden resultierenden DNA-Segmente wurden mithilfe von T4-DNA-Ligase zusammengefügt.
Das zusammengefügte Interferon-alpha-Gen wurde erneut durch PCR mithilfe von IFN-A5 und IFN-A3-Primern amplifiziert. Das amplifizierte DNA-Segment wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BamHI aufgeschlossen und in den pcDNA3.1Hygro+ -Plasmidvektor, der mit den gleichen Restriktionsenzymen aufgeschlossen wurde, mithilfe von T4-DNA-Ligase eingefügt, um einen Expressionsvektor zu bilden.
<Beispiel 3>
Herstellung der humanen Interferon-alpha-Isoform
Ein Gen, welches für humanes Interferon-alpha kodiert, mit mindestens einer modifizierten Aminosäure um eine zusätzliche Glykosylierungsstelle bereitzustellen, kann durch PCR mithilfe eines synthetischen Oligodeoxynukleotids als Primer modifiziert werden. Die verwendeten Oligodeoxynukleotide sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Zur Herstellung zusätzlicher Glykosylierung verwendete Synthetische Oligodeoxynukleotide
(1) Herstellung der L26N-modifizierten humanen Interferon-alpha-Isoform (3)
Das in Beispiel 1 gewonnene humane Interferon-alpha-Gen wurde durch PCR mit synthetischen Oligonukleotidprimern, IFN-A5' und L26N2, L26N1 und IFN-A3' amplifiziert, um DNA-Segmente herzustellen. Jedes der hergestellten DNA-Segmente wurde gereinigt, mit 0,2 M NaOH/2 mM EDTA denaturiert und PCR unterzogen, um ein Gen, bei dem eine Aminosäure an einer gewünschten Stelle geändert ist (Leu-Asn), herzustellen. Als Ergebnis wurden zwei DNA-Segmente, die mit einem Codon substituiert waren, das Asparagin anstelle von Leucin an der 26. Aminosäureposition entspricht, erhalten. Die beiden DNA-Segmente wurden sekundärer PCR unterzogen, unter Verwendung eines Primerpaares von IFN-A5' und IFN-A3', um ein modifiziertes Gen von IFN-alpha-L26N zu erhalten, bei welchem die 26. Aminosäure mit Asparagin modifiziert ist, so dass eine zusätzliche Glykosylierung stattfinden kann.
(2) Herstellung des H34NF36S-modifizierten humanen Interferon-alpha-Isoform-Derivats (4)
Mithilfe desselben Verfahrens wie für das L26N-modifizierte humane Interferon-alpha-Derivat wurde das humane Interferon-alpha-Gen durch PCR mit den synthetischen Oligonukleotiden IFN-A5 und H34NF36S:2 sowie H34NF36S:1 und IFN-A3 amplifiziert, um DNA-Segmente herzustellen.
Jedes der DNA-Segmente wurde gereinigt und demselben Verfahren wie oben beschrieben unterzogen, um ein IFN-alpha H34NF36S-modifiziertes Gen herzustellen, bei welchem Histidin an der 34. Aminosäureposition mit Asparagin getauscht wurde, und Phenylalanin an der 36. Aminosäureposition mit Serin getauscht wurde.
(3) Herstellung K134N-modifizierter humaner Interferon-alpha-Isoform (5)
Unter Verwendung desselben Verfahrens wie für das L26N-modifizierte humane Interferon-alpha-Derivat wurde das humane Interferon-alpha-Gen durch PCR mit den synthetischen Oligodeoxynukleotiden IFN-A5' und K134N2 sowie K134N1 und IFN-A3' amplifiziert, um DNA-Segmente herzustellen.
Als Ergebnis wurden, wie in 4 dargestellt, zwei mit einem Codon substituierte DNA-Segmente, die Asparagin anstelle von Lysin an der 134. Aminosäureposition entsprechen, erhalten.
Die beiden DNA-Segmente wurden sekundärer PCR unterzogen, unter Verwendung eines Primerpaares von IFN-A5' und IFN-A3', um ein modifiziertes Gen von IFN-alpha-K134N zu gewinnen, bei welchem die 134. Aminosäure mit Asparagin modifiziert ist, so dass eine zusätzliche Glykosylierung stattfinden kann.
(4) Herstellung eines humanen Interferon-alpha-Derivats, bei dem sowohl L26N als auch H34NF36S modifiziert sind (6)
Demselben Verfahren wie für das L26N modifizierte humane Interferon-alpha-Derivat wurde gefolgt unter Verwendung von H34NF36S modifiziertem humanen Interferon-alpha-Derivat.
(5) Herstellung einer humanen Interferon-alpha-Isoform, bei der sowohl L26N als auch K134N modifiziert sind (7)
Auf dasselbe Verfahren für das L26N-modifizierte humane Interferon-alpha-Derivat folgte unter Verwendung K134N-modifizierter humaner Interferon-alpha-Isoform. Mit anderen Worten, die 134. Position wurde mithilfe desselben Verfahrens wie in 5 dargestellt modifiziert, und unter Verwendung des Produkts als Matrize wurde die 26. Position mithilfe desselben Verfahrens wie in 3 dargestellt modifiziert. Als Ergebnis wurde ein humanes Interferon-alpha-Gen mit zwei gleichzeitig modifizierten Stellen erhalten.
<Beispiel 4>
Transfektion in CHO-Zellen und Expression
In einer 60 mm Zellkulturschale wurden CHO-Zellen (DG44) bis zu 40–80%iger Konfluenz (1–4 × 10⁵ Zellen/60 mm Schale) gezüchtet. 3 μl Superfectin-Reagenz (BM) und 97 μl Zellkulturmedium (α-MEM mit Medium, kein Serum, keine Antibiotika) wurden gut vermischt und DNA des humanen Interferon-alpha-Derivat-Expressionsvektors (0,1 μg/μl oder mehr, etwa 2 μg) und Vektor pLTRdhfr26 (ATCC37295, etwa 0,2 μg) mit dhfr, wurden dazugegeben. Nach einer Reaktionszeit von 5–10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Mischung zu den hergestellten Zellen hinzugegeben. Nach einem Tag wurde das Medium gegen ein Medium ausgetauscht, welches 200 μl Hygromycin enthielt (α-MEM ohne Medium, 10% FBS) und etwa 7 bis 10 Tage kultiviert. In dem Medium mit Hygromycin in einer Konzentration von 200 μg/ml wurden Zelllinien mit eingeführten humanen Interferon-alpha-Derivaten ausgewählt. Jede dieser ausgewählten Zelllinien wurde kultiviert und zur Expression von humanem Interferon-alpha-Derivat bestätigt, mithilfe von humanem Interferon-alpha-(Hu-INF-α-)Multi-Specific ELISA Kit (PBL, Product No. 41105–1;).
<Beispiel 5>
Reinigung der humanen Interferon-alpha-Derivate
Die Reinigung der in CHO-Zellen exprimierten humanen Interferon-alpha-Derivate erfolgte durch Verdichten des Kulturfluids mithilfe von Centriprep (Mw Cut 10 000, Millipore), und indem es einem Metallaffinitätsverfahren mithilfe von ProBond Purification System (Invitrogen) unterzogen wurde.
<Beispiel 6>
Pharmakokinetischer Test bei Ratten
Um zu untersuchen, ob die Testsubstanzen tatsächlich in lebenden Körpern aufrechterhalten werden können, wurden Sprague-Dawley-Ratten verwendet. Den Tieren wurde humanes Interferon-Derivat in einer Dosierung von 1 × 10⁶ U/Kg Körpergewicht injiziert. Jede Gruppe umfasste 4 Tiere. Um die Blutkonzentration zu bestätigen, wurde alle 30 Minuten eine Blutprobe genommen. Die Blutproben wurden mithilfe von humanem Interferon-alpha-(Hu-INF-α-)Multi-Specific ELISA Kit analysiert.
GEWERBLICHE VERWENDBARKEIT
Die glykosylierte humane Interferon-alpha-Isoform der vorliegenden Erfindung besitzt erhöhte in-vivo-Stabilität und kann somit die Dosis in klinischen Anwendungen und die Häufigkeit der Verabreichung reduzieren.
Während die vorliegende Erfindung mit Bezug auf die besonderen veranschaulichenden Ausführungsformen beschrieben wurde, ist sie nicht durch die Ausführungsformen beschränkt, sondern nur durch die angehängten Ansprüche. Sequenzprotokoll

Claims

Aminosäure-modifizierte humane Interferon-alpha-Isoform, welche mindestens eine Sequenz Asn-X-Ser/Thr aufweist, die durch eine Aminosäuresubstitution oder mehrere Aminosäuresubstitutionen an den folgenden Positionen von Aminosäureresten gebildet ist: – Cys1-Ser8(Cys1-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser8); – Arg22-Thr52(Arg22-Arg-Ile-Ser-Leu-Phe-Ser-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-His-Asp-Phe-Gly-Phe-Pro-Gln-Glu-Glu-Phe-Gly-Asn-Gln-Phe-Gln-Lys-Ala-Glu-Thr52); – Ser68; – Asp77; – Lys134-Ser137(Lys134-Tyr-Ser137); and – Gln158-Glu165(Gln158-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu165). {so dass die Glykosylierung an mindestens einer dieser Stellen stattfindet}
Aminosäure-modifizierte humane Interferon-alpha-Isoform nach Anspruch 1, welche Leucin 26 modifiziert mit Asparagin, Histidin 34 und Phenylalanin 36 modifiziert mit Asparagin beziehungsweise Serin oder Lysin 134 modifiziert mit Asparagin oder alle diese Modifikationen aufweist.
Gen, das für eine mit einer Aminosäure modifizierten humanen Interferon-alpha-Isoform kodiert, welche mindestens eine Sequenz Asn-X-Ser/Thr aufweist, die durch eine Aminosäuresubstitution oder mehrere Aminosäuresubstitutionen an den folgenden Positionen von Aminosäureresten gebildet ist: – Cys1-Ser8(Cys1-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser8); – Arg22-Thr52(Arg22-Arg-Ile-Ser-Leu-Phe-Ser-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-His-Asp-Phe-Gly-Phe-Pro-Gln-Glu-Glu-Phe-Gly-Asn-Gln-Phe-Gln-Lys-Ala-Glu-Thr52); – Ser68; – Asp77; – Lys134-Ser137(Lys134-Tyr-Ser137); and – Gln158-Glu165(Gln158-Glu-Ser-Leu-Arg-Ser-Lys-Glu165). {so dass die Glykosylierung an mindestens einer dieser Stellen stattfindet}
Gen nach Anspruch 3, wobei das humane Interferon alpha Leucin 26 modifiziert mit Asparagin, Histidin 34 und Phenylalanin 36 modifiziert mit Asparagin beziehungsweise Serin oder Lysin 134 modifiziert mit Asparagin oder alle diese Modifikationen aufweist.
Verfahren zur Herstellung einer glykosylierten humanen Interferon-alpha-Isoform, welches die folgenden Schritte umfasst: Kultivierung einer eukaryotischen Wirtszelle, welche mit einem Expressionsvektor transformiert oder transfiziert wurde, welcher ein Gen umfasst, das für die Interferon-alpha-Isoform nach Anspruch 3 oder 4 kodiert, und Isolierung einer glykosylierten humanen Interferon-alpha-Isoform aus der Kultur.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche die glykosylierte humane Interferon-alpha-Isoform nach Anspruch 1 oder 2 und einen pharmazeutisch zulässigen Trägerstoff umfasst.