DE60226353T2 - Verfahren zur Bestimmung der Aktivität des Zellzyklus-Regulationsfaktors und Verfahren zur Diagnose von Krebs unter Verwendung desselben - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität des Zellzyklus-Regulationsfaktors und Verfahren zur Diagnose von Krebs unter Verwendung desselben Download PDF

Info

Publication number
DE60226353T2
DE60226353T2 DE60226353T DE60226353T DE60226353T2 DE 60226353 T2 DE60226353 T2 DE 60226353T2 DE 60226353 T DE60226353 T DE 60226353T DE 60226353 T DE60226353 T DE 60226353T DE 60226353 T2 DE60226353 T2 DE 60226353T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
substrate
labeling
cyclin
sample
cdk
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60226353T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60226353D1 (de
Inventor
Hideki Ishihara
Tomokazu Yoshida
Masatoshi Chuo-ku Kobe-shi Yamasaki
Sachiyo Tada
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sysmex Corp
Original Assignee
Sysmex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sysmex Corp filed Critical Sysmex Corp
Publication of DE60226353D1 publication Critical patent/DE60226353D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE60226353T2 publication Critical patent/DE60226353T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
  • 1. Bereich der Erfindung:
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Set von Reagentien für ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Zellzyklus-regulatorischen Faktors ohne Verwendung eines Radioisotops und ein Verfahren zur Diagnose von Krebs unter Verwendung dieses Verfahrens.
  • 2. Beschreibung des verwandten Stands der Technik:
  • Zellvermehrung ist ein fundamentales und wichtiges Merkmal von lebenden Organismen. Zellproliferation umfasst Teilung einer einzelnen Zelle in zwei Tochterzellen, und somatische Zellen teilen sich durch eine Mehrzahl von sequentiellen Reaktionen umfassend Wachstum der Zellen, Replikation der DNA, Verteilung der Chromosomen und Teilung der Zellen. Diese Kette von sequentiellen Reaktionen wird als Zellzyklus bezeichnet. Im Fall von eukaryontischen Zellen wird der Zellzyklus in vier Phasen unterteilt, d. h. eine Synthese (S) Phase während welcher die Replikation der DNA stattfindet, eine mitotische (M) Phase, während welcher die Teilung der Zelle stattfindet, eine Zwischenphase, (Gap 1, G1), welche zwischen der M-Phase und der nächsten S-Phase liegt und eine Zwischenphase 2 (Gap 2, G2), welche zwischen der S-Phase und der nächsten M-Phase liegt. In der G1-Phase erhalten Zellen Proliferationssignale, bereiten sich auf die Replikation der DNA vor und führen Metabolismus und Wachstum durch, welche notwendig sind für die Teilung von Zellen. In der G2-Phase bereiten sich die Zellen für die Teilung vor. In der G1-Phase wird ein Durchgangspunkt experimentell angenommen, welcher „R-Punkt" (Restriktionspunkt) für Sängerzellen und START für Hefe genannt wird. Üblicherweise vermehren sich Zellen in Antwort auf Proliferationssignale von außen. Die Zellen erhalten die Signale in der G1-Phase und durchlaufen den Zellzyklus. Nach dem Hindurchtreten durch einen bestimmten Punkt in der G1-Phase läuft der Zellzyklus von der S-Phase zur G2-Phase, der M-Phase und dann der G1-Phase ab, ohne zu stoppen, selbst wenn die Proliferationssignale nicht mehr weiter erhalten werden. Dieser bestimmte Punkt ist der R-Punkt oder START, und ist sozusagen ein Punkt, an welchem der Eintritt in den Zellzyklus-Ablauf bestimmt wird. Des Weiteren können Zellen den Zellzyklus verlassen und in eine Ruhephase (G0) eintreten, während welcher die Zellen nicht wachsen und sich nicht vermehren. Experimentell können die Zellen, welche in die Ruhephase eingetreten sind, in die G1-Phase zurückgeführt werden, wenn ein geeignetes Signal gegeben wird, und dazu induziert werden zu wachsen und sich wieder zu teilen. Es wird angenommen, dass eine Vielzahl von nicht wachsenden und sich nicht vermehrenden Zellen von mehrzelligen Organismen in der G0-Phase sind.
  • Es existieren vor allem zwei Gruppen von Zellzyklus-regulatorischen Faktoren in Zellen. Eine ist eine Gruppe von Kinasen, die positive regulatorische Faktoren sind und als Cyclin-abhängige Kinasen (CDKs) bezeichnet werden, und die andere ist eine Gruppe von CDK-Inhibitoren (CDKIs), welche negative regulatorische Faktoren sind. Die CDKs existieren im Cytoplasma in einer inaktiven Form. Die CDKs werden aktiviert, z. B. phosophoryliert, und bewegen sich in den Zellkern. Im Kern binden die CDKs an Cyclinmoleküle, um Komplexe mit Cyclin zu bilden (im Folgenden als aktivierte CDKs bezeichnet) und um den Fortschritt des Zellzylkus an verschiedenen Schritten des Zellzyklus positiv zu regulieren.
  • Auf der anderen Seite inaktivieren die CDKIs die CDKs durch Bindung an die aktivierten CDKs oder die einfachen CDK-Substanzen, wodurch der Zellzyklus negativ reguliert wird.
  • Es gibt nun sieben bekannte Arten von CDKs, d. h. CDK1, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6 und CDK7, an welche unterschiedliche Cycline binden. Genauer gesagt bindet CDK1 an Cyclin A oder B, CDK2 an Cyclin A oder E und CDK4 und CDK6 binden an Cyclin D1, D2 oder D3, um aktiviert zu werden. Die aktivierten CDKs kontrollieren spezifische Phasen des Zellzyklus. Die folgende Tabelle 1 zeigt CDKs in Bezug auf die Kontrolle des Zellzyklus, Cycline, welche funktionell an die CDKs binden und Phasen des Zellzyklus, während welcher die aktivierten CDKs wirken. TABELLE 1
    CDKs Cycline, die an CDKS binden Phasen des Zellzyklus, in welchen die aktivierten CDKs wirken
    CKD4, CDK6 Cyclin D1, D2, D3 G1
    CDK2 Cyclin E Übergangsperiode von G1 zu S
    CDK2 Cyclin A S
    CDK1 Cyclin A, B Übergangsperiode von S zu M, M
  • So wird der Zellzyklus kontrolliert und die Zellproliferation wird reguliert durch Aktivierung von unterschiedlichen Arten von CDKs. Die aktivierten CDKs sind Enzyme, welche Serinreste und Threoninreste in einem Protein als Substrat phosphorylieren. In einem in vitro-Reaktionssystem reagieren aktivierte CDK1 und CDK2 gut auf Histon H1 als Substrat und aktivierte CDK4 und CDK6 reagieren gut auf Rb (Retinoblastomprotein) als Substrat. In einer in vivo-Zellzylkus-Regulierung wird angenommen, dass die aktivierten CDKs Rb als physiologisches Substrat benötigen, es ist jedoch nicht bekannt, welche anderen Proteine als Substrate wirken.
  • Wie oben beschrieben, regulieren die CDKs und Cycline den Zellzyklus in enger Verbindung miteinander. Die Multiplikation des Cyclin-D1-Gens wird in einer großen Anzahl von Fällen des ösophagealen Krebses beobachtet, während Überexprimierung von Cyclin-D1-Gen in einer großen Anzahl von Fällen von Magenkrebs und Dickdarmkrebs beobachtet wird. Auf der anderen Seite wird die Multiplikation des Cyclin-E-Gens beobachtet in Magenkrebs und Dickdarmkrebs, wird jedoch nicht beobachtet in ösophagealem Krebs. Exzessive Expression von Cyclin E im Magen und Dickdarm tritt mit einer hohen Frequenz in Fällen von Adenom und Adenocarcinom auf und zeigt eine signifikante Korrelation mit der Bösartigkeit, wie Invasion, Fortschritt der Phasen, Metastase und dergleichen. Die Expression und Kinaseaktivität von CDK1 ist in den meisten Fällen von Magenkrebs und Dickdarmkrebs im Vergleich zu normalem Schleimhautgewebe bemerkenswert beschleunigt. Es ist bekannt, dass die gesteigerte Expression von Cyclingenen mit dem Fortschritt und der Bösartigkeit von verschiedenen Krebsarten korreliert (siehe Wataru Yasui, Sysmex Journal Web., S. 1 bis S. 10, Vol. 1, 2000).
  • Daher wird erwartet, dass die Messung der Aktivität der einzelnen Arten von CDKs gute Indizien für die Art und Bösartigkeit von Krankheiten mit einem Bezug zur Kontrolle des Zellzyklus bieten werden. In anderen Worten verringert sich die Expression von CDK2 im Allgemeinen am R-Punkt, und der Zellzyklus-Arrest und die Teilung der Zellen wird kontrolliert. Wenn jedoch die Expression von CDK2 am R-Punkt ansteigt, bedeutet dies, dass der Zellzyklus aufhört zu stoppen, d. h. es bedeutet einen Krankheitszustand wie Krebs.
  • Wenn die Expression von CDK4 oder CDK6 ansteigt, kann Magenkrebs oder Dickdarmkrebs erwartet werden, da eine beschleunigte Genexpression von Cyclin D1 in Magenkrebs und Dickdarmkrebs involviert ist, welches spezifisch an CDK4 oder CDK6 bindet. So wird angenommen, dass es möglich ist, die Art des Krebses zu bestimmen.
  • Üblicherweise wird die Aktivität von CDKs unter Verwendung von Radioisotopen bestimmt. Genauer gesagt, wird in der Gegenwart einer CDK, welche aus einem Zelllysat extrahiert wurde durch ein Immunpräzipitationsverfahren unter Verwendung eines Anti-CDK-Antikörpers, und deren Aktivität unbekannt ist, 32P-markiertes Adenosin 5'-O-(3-Triphosphat) (ATP) reagieren gelassen mit Serinresten oder Threoninresten in einem Substrat, um eine Monophosphatgruppe, abgeleitet von dem 32P-markierten ATP, einzuführen. Die Menge von 32P, die durch das Substrat aufgenommen wird, wird detektiert durch Autoradiographie oder durch einen Szintillationszähler. Dadurch wird die Menge des phosphorylierten Substrats gemessen und die Aktivität der CDK wird anhand der Menge des phosphorylierten Substrats berechnet.
  • Dieses Verfahren benötigt eine hohe Aufmerksamkeit bei der Handhabung der Substanzen und der Entsorgung von Abfallflüssigkeit, da es 32P verwendet, welches ein Radioisotop ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:
  • Dementsprechend ist ein Set von Reagentien für ein Verfahren erwünscht zur genauen Messung von Zellzyklus-regulatorischen Faktoren, ohne die Verwendung von Radioisotopen, und ein Verfahren zur Diagnose von Krebs auf der Basis der Messergebnisse.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Set von Reagentien für ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität einer Cyclin-abhängigen Kinase zur Verfügung, umfassend die Schritte:
    Vorbereiten einer Probe zur Messung eines Cyclin-abhängigen Kinase/Cyclin-Komplexes aus lebenden Zellen;
    Reagieren von Adenosin 5'-O-(3-Thiotriphosphat) (ATP-γS) mit einem Substrat für die Cyclin-abhängige Kinase in der Gegenwart der Probe, um eine Monothiophosphatgruppe an einem Serin- oder Threoninrest des Substrats einzuführen, unter der Bedingung, dass in Substraten, welche Cystein enthalten, dieser Rest durch einen Aminosäurerest, welcher keine Thiolgruppe enthält, substituiert ist;
    Markieren des Substrats durch Koppeln eines Markierungsfluorophors oder eines Markierungsenzyms mit einem Schwefelatom der eingeführten Monothiophosphatgruppe;
    Messen der Menge an Fluoreszenz von dem das Substrat markierenden Markierungsfluorophor oder Reagieren des Markierungsenzyms, welches das Substrat markiert, mit einer Substanz, welche ein optisch detektierbares Produkt durch Reaktion mit dem Markierungsenzym generiert, und optisches Messen der Menge des generierten Produkts; und
    Berechnen der Aktivität der Cyclin-abhängigen Kinase anhand der gemessenen Menge an Fluoreszenz oder der gemessenen Menge des generierten Produkts in Bezug auf eine vorgefertigte Standardkurve.
  • Somit betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere ein Set von Reagentien zur Bestimmung der Aktivität von Cyclin-abhängiger Kinase/Cyclin-Komplex, umfassend einen Anticyclin-abhängigen Kinase-Antikörper, ein Substrat für Cyclinabhängige Kinase, Adenosin 5'-O-(3-thiotriphosphat) (ATP-γS) und einen Markierungsfluorphor oder ein Markierungsenzym zum Markieren einer Thiophosphatgruppe, die erhalten werden kann durch Reagieren des Substrats mit ATP-γS.
  • Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung werden anhand der detaillierten Beschreibung, die nachstehend gegeben wird, noch einfacher deutlich. Es sollte jedoch verstanden werden, dass die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele lediglich zur Illustration angeführt werden, während sie die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung angeben.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN:
  • 1 zeigt eine Referenzkurve, die die Relation zwischen der Menge (ng/Schlitz) von biotinyliertem Actin und der Menge an Fluoreszenz (Zählung), erhalten in Beispiel 1, darstellt;
  • 2 zeigt eine Referenzkurve, die das Verhältnis zwischen der Menge (ng/Schlitz) von biotinyliertem Actin und der Menge an Fluoreszenz (Zählung), erhalten in Beispiel 2, darstellt;
  • 3 zeigt eine Fluoreszenzbande, erhalten in Beispiel 3;
  • 4 zeigt eine Referenzkurve zur Messung von aktivierter CDK2;
  • 5 zeigt eine Fluoreszenzbande, erhalten in Beispiel 5; und
  • 6 ist die graphische Darstellung, die in Beispiel 6 erhalten wurde.
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN:
  • Zur Verwendung der Reagentien zur Ausführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird zunächst eine Probe vorbereitet.
  • In der vorliegenden Erfindung kann die Probe, welche eine Cyclin-abhängige Kinase (CDK)/Cyclin-Komplex enthält, eine einzelne Art oder mehrere Arten von CDK/Cyclin-Komplexen enthalten, kann aber vorzugsweise eine einzige Art von CDK/Cyclin-Komplex enthalten.
  • Die Probe, welche einen CDK/Cyclin-Komplex (im Weiteren als aktivierte CDK bezeichnet) enthält und verwendet wird in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, wird hergestellt durch Solubilisieren von Zellen und Abtrennen einer Probe, enthalend die aktivierte CDK, die es zu bestimmen gilt aus einer Flüssigkeit, enthaltend die solubilisierten Zellen.
  • CDKs, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, umfassen CDK1, CDK2, CDK3, CDK4, CDK5, CDK6 und CDK7.
  • (1) Schritt des Solubilisierens der Zellen
  • Die Probe wird bereitet aus Zellen, die abgeleitet sind von Tieren, umfassend Menschen, wie eine Gewebeprobe (z. B. eine Biopsieprobe, eine chirurgisch entfernte Probe etc.). Die Probe soll getestet werden, ob sie einen CDK/Cyclin-Komplex enthält, sowie dessen Aktivität. Da einfache CDKs in Cytoplasma vorhanden sind und sich in aktivierte CDKs umwandeln durch Binden an Cycline im Nucleus, müssen die Zellen solubilisiert werden, um die aktivierten CDKs zu extrahieren.
  • Dementsprechend werden die Zellen zunächst solubilisiert durch chemische oder physikalische Zerstörung der Zellmembranen sowie der Kernmembran. Genauer gesagt, werden die Zellen vorzugsweise pulverisiert unter Verwendung eines Waring-Mixers, aufgesaugt und ausgestoßen unter Verwendung einer Spritze oder mit Ultraschall beschallt, z. B. in einem Puffer, enthaltend ein Tensid, einen Protease-Inhibitor und einen Phosophatase-Inhibitor.
  • Das Tensid wird verwendet, um Zellmembranen und Kernmembranen zu zerstören, so dass intrazelluläre Substanzen herausgenommen werden können. Das Tensid sollte jedoch derartige Oberflächen-aktive Eigenschaft aufweisen, dass die aktivierten CDKs nicht abgebaut werden. Beispiele davon umfassen Nonidet P-40, Triton X-100, Deoxycholinsäure und CHAPS. Die Konzentration des Tensids ist vorzugsweise 1 w/v % oder weniger.
  • Der Protease-Inhibitor wird verwendet zur Verhinderung, dass CDK- und Cyclin-Moleküle, welche Proteine sind, zerstört werden, wenn sie mit intrazellulären Substanzen gemischt werden, wenn die Zellmembranen und die Kernmembranen zerstört werden. Beispiele davon umfassen eine Mischung von Metallprotease-Inhibitoren, wie EDTA, EGTA etc., einen Serinprotease-Inhibitor, wie PMSF, Trypsin-Inhibitor, Chymotrypsin etc., und/oder einen Cysteinprotease-Inhibitor, wie Iodacetamid, E-64 etc., und einen Protease-Inhibitor-Cocktail, der kommerziell erhältlich ist von Sigma, welcher solche Protease-Inhibitoren vorgemischt enthält.
  • Der Phosphatase-Inhibitor wird verwendet, um zu verhindern, dass die aktivierte CDK, welche selbst ein Protein ist, seine Aktivität durch Hydrolyse ihrer Phosphatgruppen verändert. Beispiele davon umfassen einen Serin-/Threonin-Phosphatase-Inhibitor, wie Natriumfluorid und einen Tyrosin-Phosphatase-Inhibitor, wie Natriumorthovanadat (Na3VO4).
  • Nachdem die Zellen solubilisiert wurden, werden unlösliche Bestandteile aus dem Zelllysat durch Zentrifugation oder durch Filtration unter Verwendung eines Filters entfernt. Anschließend ist es bevorzugt vor der Auftrennung der Probe, enthaltend die aktivierten CDKs, die Gesamtmenge von Proteinen in dem Zelllysat zu messen entsprechend einem dem Fachmann bekannten Verfahren. Z. B. kann die Gesamtmenge von Proteinen gemessen werden unter Verwendung eines DC-Protein-Kits unter Verwendung von bovinem IgG als Referenz.
  • (2) Auftrennung einer Probe enthaltend aktivierte CDKs, die es zu bestimmen gilt
  • Die Probe, enthaltend die aktivierte CDK, deren Aktivität zu bestimmen ist, wird aus dem so erhaltenen Zelllysat zubereitet. Die Probe, enthaltend die aktivierte CDK, kann zubereitet werden, z. B. durch ein Immun-Präzipitationsverfahren.
  • Entsprechend dem Immun-Präzipitationsverfahren wird ein Anti-CDK-Antikörper mit einer Spezifität gegenüber einer von CDK1 bis 7, die zu bestimmen ist, verwendet.
  • Genauer gesagt, wird das Zelllysat, enthaltend eine spezifische Menge von Protein, mit einem Anti-CDK-Antikörper reagieren gelassen, der zu der aktivierten CDK korrespondiert, die es zu bestimmen gilt, und eine Suspension von Sepharose-Kügelchen (mit einem Gehalt an Kügelchen von 4 bis 6 v/v %), beschichtet mit Protein A, Protein G oder Anti-Hasen-IgG-Antikörper als Material zum Einfangen der Anti-CDK-Antikörper bei 0 bis 10°C für ein oder zwei Stunden reagieren gelassen. Da diese Kügelchen unlöslich sind, wird der Komplex aus dem Anti-CDK-Antikörper und der CDK, gebunden an die Kügelchen, unlöslich und präzipitiert.
  • Durch Immun-Präzipitation wird die gesamte CDK-Familie (umfassend die einfache CDK, die aktivierte CDK, den Komplex der aktivierten CDK und CDKI und den Komplex der CDK und CDKI) in der Flüssigkeit, enthaltend solubilisierte Zellen, gefangen. Dementsprechend ist die aktivierte CDK zusammen enthalten mit der einfachen CDK, dem Komplex der aktivierten CDK und CDKI und dem Komplex von CDK und CDKI in der vorbereiteten Probe. Jedoch bewirkt die inaktivierte CDK nicht die Monothiophosphorylierung des Substrats in der Gegenwart von ATP-γS. Wenn die vorliegende Erfindung durchgeführt wird in einer Probe enthaltend die inaktivierte CDK zur Bestimmung der Aktivität der aktivierten CDK, wird die Aktivität der inaktivierten CDK nicht detektiert und nur die Aktivität der aktivierten CDK wird bestimmt.
  • Anschließend werden die präzipitierten Kügelchen, an welche der Komplex der aktivierten CDK und des Anti-CDK-Antikörpers gebunden ist, gewaschen. Eine Pufferlösung zum Waschen der Kügelchen enthält Magnesiumchlorid, da die aktivierte CDK einen Komplex mit Magnesium bilden muss, damit später ATP-γS auf das Substrat und die aktivierte CDK wirken kann. Die Pufferlösung enthält auch, z. B., Dithiothreitol (DTT) als Stabilisator, der nötig ist zum Stabilisieren der Molekularstruktur des Substrats. Des Weiteren kann die Pufferlösung Albumin, eine Spur eines Tensids und/oder dergleichen enthalten.
  • Danach wird die Aktivität der aktivierten CDK in der Probe bestimmt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung umfasst Monothiophosphorylierung des Serin- oder Threoninrestes des Substrats in der Gegenwart der aktivierten CDK, Markieren der resultierenden Thiophosphatgruppe und Messen der Markierung. In der vorliegenden Erfindung kann die aktivierte CDK, gebunden an den CDK-Antikörper, gefangen durch die Kügelchen, verwendet werden als aktivierte CDK.
    • (i) In der Gegenwart der aktivierten CDK wird ein Substrat, welches ein Substrat für die CDK darstellt, reagieren gelassen mit Adenosin 5'-O-(3-Thiotriphosphat) (ATP-γS), um eine Monothiophosphatgruppe, abgeleitet von ATP-γS, in eine Serin- oder Threoningruppe des Substrats einzuführen.
  • Üblicherweise wirken aktivierte CDKs, um ATP mit der Serin- oder Threoningruppe des Substrats zu reagieren, um eine Monophosphatgruppe, abgeleitet von ATP, einzuführen. In der vorliegenden Erfindung jedoch wird ATP-γS anstelle von ATP verwendet, um die Monothiophosphatgruppe anstelle der Monophosphatgruppe in die Serin- oder Threoningruppe des Substrats einzuführen.
  • Für Monothiophosphorylierung wird eine Flüssigkeit mit einem pH von 6,5 bis 8,5, vorzugsweise 7,4, enthaltend 0,1 bis 1,0 mg/ml des Substrats, reagieren gelassen mit 10 bis 100 Äquivalenten von ATP-γS in Bezug auf 1 Äquivalent des Substrats in der Gegenwart der aktivierten CDK bei 25 bis 40°C, vorzugsweise 37°C, für 5 Minuten bis 1 Stunde, vorzugsweise 10 Minuten.
  • Wie oben diskutiert, enthält die Probe nicht nur aktivierte CDK, sondern auch die inaktivierte CDK. Da jedoch nur die aktivierte CDK die Thiophosphatgruppen-Einführungsreaktion katalysiert, nimmt die inaktivierte CDK nicht an dem Verfahren der vorliegenden Erfindung teil.
  • Figure 00120001
  • Als Beispiel eines Substrats kann Histon H1 und Rb (Retinoblastomprotein) erwähnt werden für aktivierte CDK1 und CDK2 bzw. für aktivierte CD4 und CDK6.
  • In der vorliegenden Erfindung wird in Bezug auf Substrate wie Rb, welche notwendigerweise einen Cysteinrest in ihrem Molekül enthalten, der Rest durch einen Aminosäurerest, wie Alanin, ausgetauscht, welcher keine Thiolgruppe enthält. Dies dient der Vermeidung von Messfehlern infolge der Markierung der Thiolgruppe des Cysteinrests, der notwendigerweise in dem Substrat vorhanden ist, gleichzeitig mit dem Markieren des Schwefelatoms der Thiophosphatgruppe des Substrats (in die Thiophosphatgruppe, abgeleitet von ATP-γS durch die Aktivität der aktivierten CDK) mit dem Markierungsfluorophor oder dem Markierungsenzym.
  • In Bezug auf ein Substrat, welches notwendigerweise einen Cysteinrest in seinem Molekül enthält, mag es möglich sein, aus dem Substrat ein Substrat herzustellen, in welchem der Cysteinrest substituiert ist mit einem Aminosäurerest wie Alanin, welcher keinen Thiolrest enthält, durch PCR oder durch Modifizieren eines Gens des Substrats durch Punkt-Mutagenese und Expression des modifizierten Gens. Insbesondere wird in Bezug auf ein Substrat wie Rb, welches einen Cysteinrest enthält, ein rekombinanter Vektor erhalten durch Klonieren unter Verwendung des Oligonucleotidprimers Rb-1 (5'-ACA GGA TCC TTG CAG TAT GCT TCC-3'), Rb-2 (5'-GCT GTT AGC TAC CAT CTG ATT TAT-3'), Rb-3 (5'-ATG GTA GCT AAC AGC GAC CGT GTG-3') und Rb-7 (5'-GCG AAT TCA ATC CAT GCT ATC ATT-3'); der rekombinante Vektor wird exprimiert, um eine rekombinante DNA zu erhalten, in welcher ein Nucleotid, kodierend für einen Cysteinrest, ersetzt ist durch ein Nucleotid, kodierend für einen Alaninrest; und die rekombinante DNA wird exprimiert, um ein Substrat herzustellen, in welchem der Cysteinrest mit dem Alaninrest ersetzt wurde.
  • (ii) Markierung der Thiophosphatgruppe, die in das Substrat eingeführt wurde, und Messung der Menge an Markierung:
  • Um das Substrat zu markieren durch Koppeln des Markierungsfluorophors oder des Markierungsenzyms mit dem Schwefelatom der eingeführten Thiophosphatgruppe wird eine Flüssigkeit mit einem pH von 7,5 bis 9,0, vorzugsweise 8,5, enthaltend 0,1 bis 1,0 mg/ml des Substrats, in welches die Thiophosphatgruppe eingeführt wurde, reagiert mit 10 bis 100 Äquivalenten eines Markierungsfluorophors oder eines Markierungsenzyms mit einer funktionalen Gruppe, die mit der Thiolgruppe reagiert, in Bezug auf 1 Äquivalent des Substrats für 10 Minuten bis 2 Stunden. Diese Reaktion wird gestoppt durch Hinzufügen eines freien Thiols, z. B. β-ME (β-Mercaptoethanol), DTT (Dithiothreitol) oder dergleichen.
  • In dem Fall, in dem das Substrat markiert wird mit dem Markierungsfluorophor, wird die Menge an Fluoreszenz von dem Markierungsflourophor gemessen. Die gemessene Menge an Fluoreszent wird verglichen mit einer Referenzkurve, die zuvor hergestellt worden war anhand der Menge von Fluoreszenz gemessen von einer bekannten Menge des Substrats, und dadurch wird die Menge des markierten Substrats berechnet. Die Menge des markierten Substrats wird als Aktivitätswert der aktivierten CDK, die in der Probe enthalten ist, angesehen.
  • In dem Fall, in dem das Substrat markiert wurde mit dem Markierungsenzym wird das Markierungsenzym reagieren gelassen mit einer Substanz, die eine optisch detektierbare Substanz durch Reaktion mit dem Markierungsenzym erzeugt. Die Menge des erzeugten Produkts wird optisch gemessen und die gemessene Menge wird verglichen mit einer Referenzkurve, die zuvor hergestellt worden war, und dadurch wird der Aktivitätswert der aktivierten CDK, die in der Probe enthalten ist, berechnet. Hier bedeutet eine optisch detektierbare Substanz eine Substanz, deren Existenz durch die Messung von Fluoreszenz, Absorption und/oder dergleichen der Substanz detektiert werden kann.
  • Als Beispiele für den Markierungs-Fluorophor, der in der Lage ist, an das Schwefelatom der Thiophosphatgruppe zu binden, kann Fluorescin, Cumarin, Eosin, Phenanthrolin, Pyren, Rhodamin und dergleichen erwähnt werden, unter welchen Fluorescein bevorzugt ist. Damit die Markierungsfluorophore an das Schwefelatom der Thiophosphatgruppe binden, enthalten die Markierungsfluorophore funktionale Gruppen, wie ein Alkylhalid, Maleimid, Aziridinrest und dergleichen, welche mit der Thiolgruppe zum Markieren des Schwefelatoms der Thiophosphatgruppe reagieren.
  • Als Beispiele für das Markierungsfluorophor mit einer funktionalen Gruppe, welche mit der Thiolgruppe reagiert, kann Iodoacetyl-FITC (Fluoresceinisothiocyanat), 5-(Bromomethyl)fluorescein, Fluorescein-5-maleimid, 5-Iodoacetamidfluorescein (5-IAF), 6-Iodoacetamidfluorescein (6-IAF), 4-Bromomethyl-7-methoxycumarin, Eosin-5-iodoactamid, Eosin-5-maleimid, Eosin-5-iodoacetamid, N-(1,10-Phenenthrolin-5-yl)bromoacetamid, 1-Pyrenbutylchlorid, N-(1-Pyrenethyl)iodoacetamid, N-(1-Pyrenmethyl)iodoacetamid (PMIA-Amid), 1-Pyrenmethyliodacetat (PMIA-Ester), Rhodaminrot C2 Maleimid und dergleichen erwähnt werden, unter welchen Iodoacetyl-FITC bevorzugt ist.
  • Alternativ kann der Markierungsfluorophor eingeführt werden in die Thiophosphatgruppe durch Reagieren des Moleküls mit Biotin, welches eine funktionelle Gruppe hat, die mit dem Schwefelatom der Thiophosphatgruppe reagiert, z. B. Iodoacetylbiotin, und dann Reagieren des Moleküls mit einem Markierungsfluorophor, das kovalent an Avidin gebunden ist, um den Vorteil der Affinität von Biotin zu Avidin zu nutzen.
  • Das Markierungsenzym kann an das Schwefelatom der Thiophosphatgruppe eingeführt werden durch Einführen von Iodoacetylbiotin an das Schwefelatom und dann Reagieren des Moleküls mit einem Markierungsenzym, das kovalent an Avidin gebunden ist, welches Affinität zu Biotin aufweist. Als ein solches Enzym kann erwähnt werden β-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Peroxidase und dergleichen, unter welchen Peroxidase bevorzugt ist.
  • Die Menge des markierten Substrats kann gemessen werden durch Messung der Menge an Fluoreszenz von dem Markierungsfluorophor oder durch Reagieren lassen einer Substanz, welche ein durch Reaktion mit dem Markierungsenzym optisch detektierbares Produkt erzeugt, auf das mit dem Markierungsenzym markierte Substrat, und anschließende optische Messung des erzeugten Produkts.
  • Genauer gesagt, wird, wenn das Markierungsfluorophor verwendet wird, das Markierungsfluorophor angeregt durch eine spezifische Wellenlänge und analysiert durch einen Fluoreszenz-Bildanalysator. Die Wellenlänge des angewandten Lichts kann in Abhängigkeit von der Art des verwendeten Markierungsfluorophors unterschiedlich sein. Z. B. kann Licht mit einer Wellenlänge von 488 nm angewandt werden zur Anregung, wenn der Markierungsfluorophor Fluorescein ist.
  • Wenn ein Markierungsenzym verwendet wird, wird ein Substrat, welches einen Fluorphor erzeugen wird durch Reaktion mit dem Markierungsenzym zu dem Substrat, das mit dem Markierungsenzym markiert ist, hinzugefügt, um den Fluorophor zu erzeugen durch Reaktion mit dem Markierungsenzym. Der erzeugte Fluorphor wird angeregt mit Licht, das eine bestimmte Wellenlänge aufweist, und die emittierte Fluoreszenz wird detektiert. Das Substrat, welches ein Fluorophor durch Reaktion mit dem Markierungsenzym erzeugt, kann ECL-plus sein für den Fall, in dem das Markierungsenzym Peroxidase ist. Ein geeignetes Substrat kann ausgewählt werden in Abhängigkeit von dem verwendeten Markierungsenzym.
  • Die Menge des Markierungsflouorophors oder die Menge des Fluorophors, der durch die Reaktion erzeugt wurde, wird gemessen und aufgetragen auf die Standardkurve, die zuvor hergestellt worden war, um die Aktivität der aktivierten CDK zu berechnen. Die Reaktionsflüssigkeit des markierten Substrats muss in einem solchen Maße verdünnt werden, dass die Menge der Fluoreszenz des Markierungsfluorophors oder des durch die Reaktion mit dem Markierungsenzym erzeugten Fluorophors in den Bereich der Standardkurve fällt. Z. B. kann die Reaktionsflüssigkeit 100- bis 500-fach verdünnt werden. Als Verdünnungsmittel können TBS (50 mM Tris-HCl bei pH 7,5, 150 mM NaCl), Wasser, eine wässrige Natriumchloridlösung und dergleichen verwendet werden. Im Fall einer wässrigen Natriumchloridlösung beträgt die Konzentration von Natriumchlorid vorzugsweise 100 bis 500 mM. Im Fall, in dem die Reaktionsflüssigkeit verdünnt wird, wird die Verdünnung bei der Berechnung der Aktivität der aktivierten CDK berücksichtigt. Die resultierende Aktivität der aktivierten CDK ist die Aktivität der aktivierten CDK in einer spezifischen Menge von Protein, entnommen aus dem gesamten Protein der vorbereiteten Probe.
  • Die Standardkurve wird vorzugsweise zuvor erzeugt unter Verwendung einer bekannten Menge des Substrats, in welches eine Thiolgruppe eingeführt wurde. Es kann auch stattdessen biotinyliertes Actin verwendet werden. Von biotinyliertem Actin ist bekannt, dass es das gleiche Reaktionsverhalten mit dem Markierungsfluorophor oder dem Markierungsenzym aufweist wie das Substrat, in welches Thiolgruppen eingeführt wurden. In diesem Fall muss die Aktivität der aktivierten CDK berechnet werden anhand der Menge des biotinylierten Actins.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Diagnose von Krebs, wie Magenkrebs, Darmkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs, Ösophagealkrebs, Prostatakrebs, Leberkrebs, Nierenkrebs, Blasenkrebs, Hautkrebs, Uteruskrebs, Hirntumor, Osteosarcom und Myelom zur Verfügung anhand der Ergebnisse der CDK-Aktivität, die durch das Bestimmungsverfahren der vorliegenden Erfindung bestimmt wurden.
  • BEISPIELE
  • Beispielhaftes Verfahren 1 (Bestimmung der Aktivität von CDK1: Verwendung von Histon H1 als Substrat und Verwendung von Peroxidasemarkierung)
  • Erster Schritt:
  • In einem Eisbad wurden HeLa-Zellen (Karzinomzellen des Uteruscervix) lysiert in einem Lysepuffer, enthaltend 0,1 w/v % NP40 (Tensid Nonidet P-40), 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 5 mM EDTA, 50 mM Natriumfluorid, 1 mM Natriumorthovanadat und 100 μl/ml Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma), im Verhältnis von 1 × 107 Zellen/5 ml Puffer, durch 10-fach wiederholtes Aufsaugen und Ausstoßen mit einer 5 ml Spritze, die mit einer 23G Nadel ausgestattet war. So wurde ein Zelllysat hergestellt. Unlösliche Anteile wurden durch Zentrifugation bei 4°C und 15.000 Upm für 5 Minuten entfernt. Die Gesamtmenge von Protein, die im Überstand enthalten war, wurde mit einem DC-Protein-Kit (Bio-Rad) unter Verwendung von Rinder-IgG als Referenz bestimmt.
  • Zweiter Schritt:
  • Eine Probe wurde hergestellt durch Hinzufügen von 10 μg des lysierten Proteins in einer Gesamtmenge von 500 μl Lysepuffer in ein Eppendorf-Röhrchen mit 1,5 ml Volumen. Zu der vorbereiteten Probe wurde 10 μl eines polyklonalen Anti-CDK-Antikörpers (Santa Cruz Biotechnology) hinzugefügt. Eine 1:1 (Sepharosekügelchen:Lysepuffer) Aufschlemmung von 60 μl Sepharosekügelchen (zuletzt 30 μl enthaltene Kügelchen), beschichtet mit Protein A, wurde zu der resultierenden Probe hinzugefügt, welche bei 4°C für eine Stunde unter ständigem Rotieren inkubiert wurde. Die Kügelchen wurden aus der Probe genommen und mit 1 ml des Lysepuffers zweimal gewaschen. Dann wurden die Kügelchen einmal mit 1 ml eines Kinasepuffers, enthaltend 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM Magnesiumchlorid (MgCl2) und 1 mM DTT gewaschen. Die Kügelchen wurden wieder suspendiert in 15 μl Kinasepuffer.
  • Dritter Schritt:
  • Zu der erhaltenen Suspension wurde 10 μl einer Histon-H1-Lösung (0,1 mg/ml Lösung in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4) hinzugefügt. Dann wurden 10 μl einer ATP-γS-Lösung (10 mM wässrige Lösung) zu der Suspension hinzugefügt. Die resultierende Suspension wurde bei 37°C für 10 Minuten unter ständigem Schütteln inkubiert. Die Kügelchen wurden durch Zentrifugation bei 10.000 Upm für 10 Sekunden präzipitiert und 30 μl des Überstands wurden gesammelt. Zu dem Überstand wurde 25 μl eines Bindungspuffers, enthaltend 150 mM Tris-HCl und 5 mM EDTA bei pH 9,2 hinzugefügt, da pH 8,5 die optimale Bedingung für die Bindungsreaktion von Iodacetylbiotin mit Thiophosphorsäure ist. Zu dem resultierenden Überstand wurden 20 μl einer 40 mM PEO-Iodacetylbiotin-Lösung (Pierce) (in einem 20 mM Phosphatpuffer bei pH 6,0) hinzugefügt. Der Überstand wurde im Dunklen bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubiert. Die Reaktion mit Iodacetylbiotin wurde durch Hinzufügen von 7,5 μl β-ME (β-Mercaptoethanol) gestoppt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde mit TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid) verdünnt.
  • Vierter Schritt:
  • 50 μl der verdünnten Reaktionslösung wurde auf eine PVDF-Membran unter Verwendung eines Slot-Blotters platziert und absorbiert. Die Membran wurde einmal mit 50 ml TBS-T (eine TBS-Lösung, enthaltend 0,05 w/v % Tween 20) gewaschen. Um zu verhindern, dass die Membran mit Avidin-Peroxidase reagiert, wurde ein hydrophobischer Teil der Membran zuvor mit BSA (Rinderserumablumin) blockiert. Genauer gesagt, wurde die Membran blockiert mit 3 w/v % BSA in TBS-T bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Die Membran wurde reagieren gelassen mit Avidin-Peroxidase (Vector) (50.000-fach verdünnt mit TBS-T) bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Die Membran wurde mit 50 ml TBS-T dreimal gewaschen. Dann wurde die Membran mit ECL-plus (Amersham) für 5 Minuten reagieren gelassen. Eine Lösung von ECL-plus wurde gemäß den Herstellerinstruktionen hergestellt. Die Reaktion wurde durch Waschen der Membran mit 200 ml Wasser gestoppt. Fluoreszenzbanden wurden visualisiert durch einen Molecular Imager (Bio-Rad) und quantifiziert.
  • Beispielhaftes Verfahren 2 (Bestimmung der Aktivität von CDK1: Verwendung von Histon H1 als Substrat unter Verwendung von FITC-Markierung)
  • Dieses Verfahren wurde in derselben Weise durchgeführt, wie das beispielhafte Verfahren 1, außer, dass Avidin-FITC anstelle von Avidin-Peroxidase verwendet wurde und ECL-plus wurde in dem obigen vierten Schritt nicht mit der Membran reagieren gelassen.
  • Beispielhaftes Verfahren 3 (Bestimmung der Aktivität von CDK2: Verwendung von Histon H1 als Substrat und Verwendung von FITC-Markierung)
  • Erster Schritt:
  • Gewebe mit einem Nassgewicht von 10 mg bis 50 mg wurde in ein Eppendorf-Röhrchen (1,5 ml Volumen) platziert, zu welchem 800 μl des im ersten Schritt des beispielhaften Verfahrens 1 erwähnten Lysepuffer hinzugefügt wurden. Die Mischung wurde mit einem Stößel zerrieben. Die Grundbewegung des Stößels, das links und rechts Drehen um 90° bei einem Anpressdruck von 5 kg wurde 10 Mal wiederholt. Die resultierende grobe Flüssigkeit von solubilisierten Zellen wurde durch eine Spritze (1 ml Volumen), bestückt mit Glaswolle (eta 0,1 g Gewicht) und ausgestattet mit einem Scheibenfilter (Milipore) mit einer Porengröße von 0,45 μm an ihrer Spitze durchgedrückt. Dadurch wurde eine Flüssigkeit von solubilisierten Zellen hergestellt, aus welcher unlösliche Bestandteile und Fette entfernt waren. Die Gesamtmenge von Protein, die in dem Überstand enthalten war, wurde durch einen DC-Protein-Kit (Bio-Rad) unter Verwendung von Rinder-IgG als Standard gemessen.
  • Zweiter Schritt:
  • Der zweite Schritt wurde in derselben Weise durchgeführt, wie der zweite Schritt des beispielhaften Verfahrens 1.
  • Dritter Schritt:
  • Zu der Suspension wurden 10 μl einer Histon-H1-Lösung (0,1 mg/ml Lösung in 50 mM Tris-HCl, pH 7,4) hinzugefügt. Dann wurden 10 μl einer ATP-γS-Lösung (10 mM wässrige Lösung) zu der Suspension hinzugefügt. Die resultierende Suspension wurde inkubiert bei 37°C für 90 Minuten unter ständigem Schütteln. Die Kügelchen wurden durch Zentrifugation bei 1.000 Upm für 10 Sekunden präzipitiert und 30 μl Überstand wurden gesammelt. Zu 18 μl des Überstandes wurden 15 μl eines Bindungspuffers, enthaltend 150 mM Tris-HCl, pH 9,2, und 5 mM EDTA hinzugefügt. Zu dem resultierenden Überstand wurden 10 μl einer 5 mM Iodacetylfluorescein-Lösung (Pierce) (in 50 mM Phosphatpuffer bei pH 6,0 und 50% Dimethylsulfoxid) hinzugefügt. Die Mischung wurde im Dunklen bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubiert. Die Reaktion von Iodacetamidofluorescein wurde gestoppt durch Hinzufügen von 43 μl β-ME. Die Reaktionsflüssigkeit wurde 5-fach bis 10-fach mit TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid) verdünnt.
  • Vierter Schritt:
  • 50 μl der verdünnten Reaktionsflüssigkeit wurde auf eine PVDF-Membran unter Verwendung eines Schlitz-Blotters aufgebracht und absorbiert. Die Membran wurde mit 50 mM TBS-T (eine TBS-Lösung enthaltend 0,05 w/v % Tween 20) für 10 Minuten dreimal unter Schütteln gewaschen. Danach wurde die Membran mit 200 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Fluoreszenzbanden wurden visualisiert durch einen Molecular Imager (Bio-Rad) und quantifiziert durch einen Image-Analyzer.
  • Beispielhaftes Verfahren 4 (Bestimmung der Aktivität von CDK2: Verwendung von Histon H1 als Substrat und Verwendung von FITC-Markierung)
  • Erster Schritt:
  • Dieser Schritt wurde in ähnlicher Weise durchgeführt wie der erste Schritt des beispielhaften Verfahrens 1 unter Verwendung einer K562-Zelllinie.
  • Zweiter Schritt:
  • Proben wurden in abgestuften Konzentrationen von 0, 25, 50, 100 und 200 μg/ml der Gesamtmenge an Protein der Solubilisierten K562-Zellen in 500 μl Lysepuffer vorbereitet und in Eppendorf-Röhrchen gegeben. Zu jeder der Proben wurden 10 μl polyklonale Anti-CDK-Antikörper (200 μg/ml, Santa Cruz Biotechnology) hinzugefügt. Zu den resultierenden Proben wurde eine 1:1 (Sepharosekügelchen:Lysepuffer) Aufschlemmung von 40 μl Sepharosekügelchen, beschichtet mit Protein A, hinzugefügt. Die Proben wurden bei 4°C für 1 Stunde unter kontinuierlicher Rotation inkubiert. Die Kügelchen wurden aus den Proben herausgenommen und mit 1 ml Lysepuffer zweimal gewaschen. Dann wurden die Kügelchen einmal mit 100 mM Tris-HCl bei pH 7,4 und 100 mM Natriumchlorid und weiter mit 100 mM Tris-HCL bei pH 7,4 gewaschen.
  • Dritter Schritt:
  • Zu den Kügelchen wurde 50 μl einer Kinasepuffer-Lösung, enthaltend Histon H1 (40 mM Tris-HCl, pH 7,4, 18 mM Magnesiumchlorid, 2 mM ATP-γS, 6 μg/Test-Histon H1) hinzugefügt. Die resultierende Suspension wurde bei 37°C für 90 Minuten unter ständigem Schütteln inkubiert. Die Kügelchen wurden präzipitiert durch Zentrifugation bei 1.000 Upm für 10 Sekunden und 36 μl Überstand wurden gesammelt. Zu 36 μl des Überstands wurden 30 μl eines Bindungspuffers, enthaltend 150 mM Tris-HCl und 2,5 mM EDTA bei pH 9,2 hinzugefügt. Des Weiteren wurden 20 μl einer 35 mM PEO-Iodacetylbiotin-Lösung (Pierce) (in einem 50 mM Phosphatpuffer bei pH 6,0) hinzugefügt. Die resultierende Mischung wurde im Dunklen bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch Hinzufügen einer äquivalenten Menge (86 μl) β-ME. Die Reaktionsflüssigkeit wurde 5- bis 10-fach verdünnt mit TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM Natriumchlorid).
  • Vierter Schritt:
  • 50 μl der verdünnten Reaktionsflüssigkeit wurden unter Verwendung eines Schlitz-Blotters auf eine PVDF-Membran aufgebracht und absorbiert. Die erhaltene Membran wurde mit 1 w/v % BSA für 30 Minuten blockiert und mit TBS für 5 Minuten gewaschen. Die Reaktion wurde durchgeführt in einer Lösung von Avidin-FITC (Pierce) (500-fach verdünnt mit TBS) bei 37°C für 60 Minuten. Nach der Reaktion wurde die Membran dreimal mit TBS gewaschen und einmal mit Wasser, und getrocknet. Fluoreszenzbanden wurden visualisiert durch einen Molecular Imager (Bio-Rad) und gemessen.
  • Produktionsbeispiel 1 (Produktion eines rekombinanten Vektors kodierend für Rb (Retinoblastomprotein), dessen Cysteinrest substituiert ist mit einem Alaninrest und ein Protein, produziert durch die Expression des Vektors.
  • (1) Konstruktion des Expressionsvektors
  • Zunächst wurde eine cDNA, kodierend für humanes Rb, kloniert aus einer cDNA-Bibliothek (Stratagene) der menschlichen Placenta.
  • Zur Konstruktion eines Plasmids zur Expression eines C-Terminus (von Leu 769 bis Lys 928) von menschlichem Rb, dessen Cys 853 einzig zu Ala modifiziert war, wurde eine Zwei-Stufen-PCR durchgeführt unter Verwendung von Oligonucleotidprimern mit pJ3Ω-Vektor, enthaltend die Gesamtlängen-cDNA von menschlichem Rb.
  • 1. Erste PCR
  • Zunächst wurde zum Amplifizieren einer Region von menschlichem Rb-Protein korrespondierend zu Leu769 bis Asp921, und Substituieren von Cys853 durch Ala zur gleichen Zeit, die Zwei-Stufen-PCR durchgeführt unter Verwendung von vier Arten von Primer. Die verwendeten Primer waren Primer Rb-1 (5'-ACA GGA TCC TTG CAG TAT GCT TCC-3', in welchem eine BamHI-Stelle (unterstrichen) eingeführt war) und Rb-7 (5'-GCG AAT TCA ATC CAT GCT ATC ATT-3', in welchem eine EcoRI-Stelle (unterstrichen) eingeführt war), welches die Primer an den beiden Enden waren, ein Primer Rb-2, dessen 853-Position zu einem Ala-Codon (AGC) verändert worden war (5'-GCT GTT AGC TAC CAT CTG ATT TAT-3', das Punkt-modifizierte Codon wird unterstrichen gezeigt) und dessen komplementäre Primer Rb-3 (5'-ATG GTA GCT AAC AGC GAC CGT GTG-3'). Die PCR wurde ausgeführt mit einem Primer-Set Rb-1/Rb-2 und einem Primer-Set Rb-3/Rb-7 unter Verwendung der Gesamtlängen-cDNA von menschlichem Rb als Matrize unter den folgenden Reaktionsbedingungen, um PCR-Fragmente 1 und 2 zu erhalten, welche komplementär waren in Regionen, die korrespondieren zu dem Primer Rb-2 und Primer Rb-3. Zusammensetzung der Reaktionsflüssigkeit (für Fragment 1 korrespondierend zu Nucleotid 2305 bis 2565)
    PJ3 Ω-Rb 250 ng
    Taq DNA-Polymerase (TaKaRa Ex Taq, Takara Shuzo) 0,03 U
    Puffer für TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo)
    MgCl2 (Takara Shuzo) 2 mM
    dNTPs (Takara Shuzo) 250 μM
    Primer Rb-1 1 μM
    Primer Rb-2 1 μM
    Gesamt 50 μl
    Zusammensetzung der Reaktionsflüssigkeit (für Fragment 2 korrespondierend zu Nucleotid 2551 bis 2763)
    PJ3 Ω-Rb 250 ng
    Taq DNA-Polymerase (TaKaRa Ex Taq, Takara Shuzo) 0,03 U
    Puffer für TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo)
    MgCl2 (Takara Shuzo) 2 mM
    dNTPs (Takara Shuzo) 250 μM
    Primer Rb-3 1 μM
    Primer Rb-7 1 μM
    Gesamt 50 μl
  • Reaktionstemperatur
    • 95°C für 5 Minuten
    • 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute, 72°C für 1 Minute (15 Zyklen)
    • 72°C für 2 Minuten
  • 2. Behandlung des Überhangs
  • Ein 3'-Überhang der PCR-Produkte wurde mit Klenow unter den folgenden Bedingungen behandelt. Zusammensetzung der Reaktionsflüssigkeiten PCR-Fragment 1 und 2
    Klenow-Fragment (Takara Shuzo) 0,07 U
    Puffer für Klenow-Fragment (Takara Shuzo)
    dNTPs (Takara Shuzo) 250 μM
  • Reaktionstemperatur
    • 37°C für 1 Stunde
  • 3. Zweite PCR
  • Danach wurde unter Verwendung einer Mischung der PCR-Produkte als Matrize eine PCR durchgeführt mit einem Primer-Set Rb-1/Rb-7 an beiden Enden unter den folgenden Reaktionsbedingungen, um ein DNA-Fragment von 470 bp korrespondierend zu Leu769 bis Asp921 zu amplifizieren, in welchem Cys853 durch Ala substituiert war. Zusammensetzung der Reaktionsflüssigkeit Klenow-behandeltes PCR-Fragment 1 und 2
    Taq DNA-Polymerase (TaKaRa Ex Taq, Takara Shuzo) 0,03 U
    Puffer für TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo)
    MgCl2 (Takara Shuzo) 2 mM
    dNTPs (Takara Shuzo) 250 μM
    Primer Rb-1 1 μM
    Primer Rb-7 1 μM
    Gesamt 50 μl
  • Reaktionstemperatur
    • 95°C für 5 Minuten
    • 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute, 72°C für 1 Minute (15 Zyklen)
    • 72°C für 2 Minuten
  • 4. Klonieren in pMe1BacA
  • Um ein Rb-Protein zu exprimieren, das ein Sekretionssignal am N-Terminus hinzugefügt hat, wurde, nachdem das DNA-Fragment von 470 bp, amplifiziert im vorangehenden Schritt 3, mit BamHI und EcoRI verdaut worden war, das verdaute Fragment in die BamHI-Stelle und die EcoRI-Stelle von pMe1BacA (Invitrogen) inseriert. Das erhaltene Plasmid wurde als pMe1BacA-Rb bezeichnet.
  • 5. PCR
  • Unter Verwendung des erhaltenen Plasmids als Matrize wurde PCR durchgeführt unter Verwendung von Primer Rb-9 (5'-GCG AAT TCA TGA AAT TCT TAG TCA-3', in welchen die EcoRI-Stelle eingeführt worden war, wie unterstrichen) und Primer Rb-5 (5'-GTT CTC GAG TCA ATC CAT GCT ATC ATT-3', in welchen die XhoI-Stelle eingeführt worden war, wie unterstrichen) unter den folgenden Bedingungen, um das DNA-Fragment mit 540 bp zu amplifizieren, zu welchem das Sekretionssignal hinzugefügt wurde. Zusammensetzung der Reaktionsflüssigkeit
    pMe1BacA-Rb 250 ng
    Taq DNA-Polymerase (TaKaRa Ex Taq, Takara Shuzo) 0,03 U
    Puffer für TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo)
    MgCl2 (Takara Shuzo) 2 mM
    dNTPs (Takara Shuzo) 250 μM
    Primer Rb-9 1 μM
    Primer Rb-5 1 μM
    Gesamt 50 μl
  • Reaktionstemperatur
    • 94°C für 5 Minuten
    • 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 1 Minute, 72°C für 1 Minute (25 Zyklen)
    • 72°C für 2 Minuten
  • 6. Klonieren in pFastBac1
  • Das 540 bp DNA-Fragment, enthaltend das Sekretionssignal, amplifiziert in dem vorangehenden Schritt 5, wurde mit EcoRI und XhoI verdaut und wurde dann an der EcoRI-Stelle und der XhoI-Stelle von pFastBac1 (Lifetech) eingeführt.
  • (2) Isolation von rekombinantem Virus durch Bac-To-Bac Baculovirus-Expressions-System (Lifetech)
  • Das in dem vorangehenden Schritt 6 erhaltene Expressionsplasmid wurde zum Isolieren eines rekombinanten Virus verwendet, d. h., entsprechend den Herstellerangaben.
  • (3) Expression
  • Insektenzellen (High Five Cell, Invitrogen) wurden infiziert mit der Flüssigkeit des rekombinanten Virus, der im vorangegangenen Schritt (2) hergestellt worden war, unter den Bedingungen von MOI = 10, um einen Bereich korrespondierend zu Leu769 bis Asp921, enthaltend Cys853 substituiert durch Ala, zu exprimieren. Die Sekretion des exprimierten Proteins in ein Medium (CELL405, JRH Biosciences) wurde bestätigt durch Western-Blotting unter Verwendung eines anti-menschlichen Rb-polyclonalen Antikörpers (Rb(C-15), Santa Cruz), und das Medium wurde fünf Tage nach der Infektion geerntet.
  • (4) Reinigung des exprimierten Proteins
  • Das Medium, enthaltend das rekombinante Rb-Protein, erhalten in dem vorhergehenden Schritt (3), wurde ausgetauscht durch 50 mM MES-Puffer (pH 6,0) durch eine PD-10-Säule (Pharmacia), und dann wurde das Protein eluiert durch eine CM-5pW-Säule (Tosoh) unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl. Die Elution des rekombinanten Rb-Proteins bei etwa 0,3 M NaCl wurde bestätigt durch Western-Blotten unter Verwendung eines anti-menschlichen Rb-polyclonalen Antikörpers (Rb(C-15), Santa Cruz).
  • Das erhaltene Protein wurde anstelle von Histon H1 als Substrat verwendet in dem dritten Schritt des beispielhaften Verfahrens 1 zur Bestimmung von CDK4 oder CDK6.
  • Beispielhaftes Verfahren 5 (Bestimmung von aktivierter CDK4: Verwendung des rekombinanten menschlichen Rb, hergestellt im Produktionsbeispiel 1, als Substrat und FITC-Markierung
  • Erster Schritt:
  • Dieser Schritt wurde in der gleichen Weise durchgeführt, wie der erste Schritt des beispielhaften Verfahrens 3.
  • Zweiter Schritt:
  • Proben wurden zubereitet durch Platzieren der solubilisierten K562-Zellen und Lysepuffer in 1,5 ml Eppendorft-Röhrchen, so dass 0, 50, 100, 125 und 250 μg des Gesamtproteins in 500 μg Lysepuffer waren. Zu jeder der Proben wurden 10 μl eines polyclonalen Anti-CDK4-Antikörpers (200 μg/ml, Santa Cruz Biotechnology) hinzugefügt. Eine 1:1 (Sepharosekügelchen:Lysepuffer) Aufschlemmung von 40 μl Sepharosekügelchen, beschichtet mit Protein A, wurde zu den resultierenden Proben hinzugefügt, welche bei 4°C für 1 Stunde unter kontinuierlicher Rotation inkubiert wurden. Die Kügelchen wurden aus den Proben genommen und zweimal mit 1 ml Lysepuffer gewaschen. Dann wurden die Kügelchen einmal mit 100 mM Tris-HCl bei pH 7,4 und 100 mM Natriumchlorid und des Weiteren einmal mit 100 mM Tris-HCl bei pH 7,4 gewaschen.
  • Dritter Schritt:
  • Zu den erhaltenen Kügelchen wurden 50 μl einer Phosphorylierungslösung, enthaltend das rekombinante menschliche Rb-Protein, hergestellt im Produktionsbeispiel 1 (40 mM Tris-HCl, pH 7,4, 200 mM Magnesiumchlorid, 3,3 mM ATP-γS, 20 μl rekombinante menschliche Rb-Proteinlösung: 50 mM MES-Puffer, pH 6,0) hinzugefügt. Die resultierende Suspension wurde bei 37°C für 90 Minuten unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Die Kügelchen wurden durch Zentrifugation bei 1.000 Upm für 10 Sekunden präzipitiert und 36 μl Überstand wurde gesammelt. Zu 36 μl des Überstands wurden 30 μl eines Bindungspuffers, enthaltend 150 mM Tris-HCl, und 2,5 mM EDTA bei pH 9,2 hinzugefügt. Zu dem resultierenden Überstand wurden 20 μl einer 50 mM PEO-Iodacetylbiotin-Lösung (Pierce) (in einem 50 mM Phosphatpuffer, pH 6,0) hinzugefügt. Der Überstand wurde im Dunklen bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubiert. Danach wurde der Überstand behandelt mit einer äquivalenten Menge (86 μl) eines SDS-Proben-Ladepuffers (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 8,4 SDS, 10% β-ME, 25% Glycerin, Bromphenol blau) bei 100°C für 5 Minuten.
  • Vierter Schritt:
  • Die im dritten Schritt hergestellten Proben wurden der SDS-PAGE unterworfen unter der Bedingung von 20 μl/Spur (vorgegossenes Gel, 4–20% Gradient, 10 mm × 10 mm, Daiichi Kagaku Yakuhin). Die Bedingungen der SDS-PAGE waren entsprechend den Anweisungen von Daiichi Kagaku Yakuhin (60 mA, 40 Minuten). Nach der SDS-PAGE wurde das in dem Gel aufgetrennte Protein elektrisch transferiert auf eine PVDF-Membran (10 V, 30 Minuten, Western-Blotting). Die erhaltene Membran wurde mit 4 w/v % BSA für 30 Minuten blockiert und mit TBS-T für 5 Minuten gewaschen. Anschließend wurde die Membran mit einer Lösung von Avidin-FITC (Pierce) (1.000-fach verdünnt mit TBS-T) bei 37°C für 30 Minuten reagieren gelassen. Nach der Reaktion wurde die Membran zweimal mit TBS-T gewaschen und einmal mit Wasser, und getrocknet. Fluoreszenzbanden wurden durch einen Molecular Imager (BioRad) visualisiert und gemessen.
  • Bestimmung der Aktivität von aktivierter CDK1
  • 1. Produktion einer Standardkurve unter Verwendung von biotinyliertem Actin (BA) als Referenz-Substanz
  • Proben von BA wurden hergestellt in abgestuften Konzentrationen von 0 bis 1.000 ng/ml und 50 μl jeder Probe wurde in einen Schlitz gegeben. Die Probe in dem Schlitz wurde behandelt, wie im vierten Schritt des beispielhaften Verfahrens 1. Da BA markiert ist mit Peroxidase, stellt BA einen Fluorophor aus ECL-plus (Fluoreszenzsubstrat) in dem vierten Schritt her. Die Menge an Fluoreszenz wird gemessen für die Fluorophore, die in den Proben, enthaltend die abgestuften Konzentrationen von BA, erzeugt wurden, und angegeben durch Zählungswerte (CNT). Die erhaltenen Daten werden aufgetragen gegen die BA-Konzentration in der Abszisse und dem CNT-Wert auf der Ordinate, und eine Standardkurve wird unter den in dem beispielhaften Verfahren 1 gezeigten Reaktionsbedingungen hergestellt. 1 zeigt die erhaltene Standardkurve.
  • In derselben Weise werden die Probe in den Schlitzen behandelt wie im vierten Schritt des beispielhaften Verfahrens 1, und eine Standardkurve wird hergestellt in der oben beschriebenen Weise unter den Reaktionsbedingungen des beispielhaften Verfahrens 2. 2 zeigt die erhaltene Standardkurve.
  • 2. Berechnung der Aktivität von aktivierter CDK1
  • In Bezug auf die beispielhaften Verfahren 1 und 2 wurden Leerproben hergestellt, welche behandelt werden gemäß dem beispielhaften Verfahren 1, außer dass der Anti-CDK-Antikörper nicht hinzugefügt wurde. Die Menge an Fluoreszenz von den Leerproben wurde gemessen. Die erhaltenen CNT-Werte wurden in BA-Konzentrationen umgewandelt unter Verwendung der Standardkurven, die für die beispielhaften Verfahren A und B hergestellt worden waren, wie oben beschrieben. Die Aktivität der aktivierten CDK wird berechnet durch Substituieren der erhaltenen BA-Konzentrationen in der folgenden Formel: {(die umgewandelte BA-Konzentration einer Probe) – (die umgewandelte BA-Konzentration der Leerprobe)) × (das Verdünnungsverhältnis der Probe) = (die Aktivität der aktivierten CDK1) Formel 1
  • Falls die erzeugte Standardkurve keine sigmoide Kurve, sondern eine lineare Kurve ist (z. B. exemplarisches Verfahren 2), kann die Aktivität der aktivierten CDK berechnet werden durch Berechnen (den CNT-Wert einer Probe) – (den CNT-Wert der Leerprobe), Umwandeln des erhaltenen Rests in eine BA-Konzentration unter Verwendung der Standardkurve und Substituieren der umgewandelten BA-Konzentration in der folgenden Formel: (die umgewandelte BA-Konzentration des Rests des CNT-Werts der Probe minus des CNT-Werts der Leerprobe) × (dem Verdünnungsverhältnis der Probe) = (die Aktivität der aktivierten CDK) Formel 2
  • Beispiel 1 (Messung der Aktivität von aktivierter CDK1 einer Probe, behandelt entsprechend dem beispielhaften Verfahren 1)
  • Die Menge an Fluoreszenz von 450-fach verdünnten Proben, hergestellt durch das beispielhafte Verfahren 1 unter Verwendung des Anti-CDK1-Antikörpers wurde wie oben beschrieben gemessen. Probe 1 wurde hergestellt unter Verwendung von HeLa-Zellen in der Wachstumsphase und Probe 2 wurde hergestellt unter Verwendung von HeLa-Zellen in der stationären Phase. Da die Standardkurve eine sigmoidale Kurve wie in 1 gezeigt war, wurde die Aktivität der aktivierten CDK1 berechnet unter Verwendung von Formel 1, d. h. durch Herstellen von Leerproben, wie oben beschrieben, Messen der Menge an Fluoreszenz der Leerprobe und Substituieren des CNT-Werts der Leerproben und der Proben in Formel 1. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2
    CNT-Wert Aktivität von aktivierter CDK1 (ng/Schlitz)
    Probe 1 147,6 6921,4
    Leerwert von Probe 1 68,7
    Probe 2 133,3 5121,85
    Leerwert von Probe 2 69,1
  • Beispiel 2 (Bestimmung der Aktivität von aktivierter CDK1 in einer Probe, behandelt entsprechend dem beispielhaften Verfahren 2)
  • Die Menge an Fluoreszenz von 100-fach verdünnter Probe, hergestellt durch das beispielhafte Verfahren 2 unter Verwendung des Anti-CDK1-Antikörpers, wurde wie oben beschrieben gemessen. Da die Standardkurve linear war, wie in 2 gezeigt, ergab sich, dass die Aktivität der aktivierten CDK1 unter Verwendung von entweder Formel 1 oder Formel 2 berechnet werden konnte.
  • Bestimmung der Aktivität von aktivierter CDK2
  • Beispiel 3 (Bestimmung der Aktivität von aktivierter CDK2 in Proben, behandelt entsprechend dem beispielhaften Verfahren 3)
  • Probe 3 wurde hergestellt unter Verwendung des Anti-CKD2-Antikörpers gemäß dem beispielhaften Verfahren 3. Als Kontrollen wurden Probe 4 hergestellt entsprechend dem beispiehlaften Verfahren 3, ohne Verwendung des Anti-CDK2-Antikörpers, und Probe 5 wurde hergestellt entsprechend dem beispielhaften Verfahren 3, außer dass ein nicht-spezifischer IgG-Antikörper verwendet wurde anstelle des Anti-CDK2-Antikörpers im zweiten Schritt. Die Fluoreszenzbanden von Proben 3 bis 5 werden in 3 gezeigt. Die Fluoreszenzmenge der Banden wurde numerisch dargestellt durch einen Molecular Imager (BioRad). Die erhaltenen Fluoreszenzmengen werden in Tabelle 3 gezeigt. TABELLE 3
    CNT-Wert
    Probe 3 363
    Probe 4 198
    Probe 5 192
  • Die obigen Ergebnisse zeigen, dass eine nicht-spezifische Reaktion nicht beobachtet wurde in dem Fall, in dem der nicht-spezifische IgG-Antikörper anstelle des Anti-CDK2-Antikörpers hinzugefügt worden war (Probe 5) und daher war es möglich, die Aktivität der aktivierten CDK2 zu bestimmen durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung.
  • Beispiel 4 (Bestimmung der Aktivität von aktivierter CDK2 der Probe, behandelt entsprechend dem beispielhaften Verfahren 4)
  • 1. Herstellung der Standardkurve unter Verwendung von K562-Zelllinie (prämyelocytische Leukämie) als Referenzsubstanz
  • Die Menge an Fluoreszenz wurde gemessen anhand von Proben mit abgestuften Konzentrationen von 0 bis 200 μg/ml, hergestellt gemäß dem beispielhaften Verfahren 4, und dargestellt durch CNT-Werte. Die erhaltenen Daten wurden aufgetragen mit der Konzentration der K562-Zelllinie auf der Abszisse und dem CNT-Wert auf der Ordinate, um eine Standardkurve zu erzeugen. Die erhaltene Standardkurve wird in 4 gezeigt.
  • 2. Berechnung der Aktivität der aktivierten CDK2
  • Eine Probe wurde hergestellt entsprechend dem beispielhaften Verfahren 4, außer dass eine unbekannte Probe verwendet wurde anstelle der Probe von solubilisierten K562-Zellen. Die Menge an Fluoreszenz in der Probe wurde gemessen, und der erhaltene CNT-Wert wurde umgewandelt in eine CDK2-Aktivität der solubilisierten K562-Zellen unter Verwendung der oben hergestellten Standardkurve, um die Aktivität zu berechnen.
  • Bestimmung der Aktivität von aktivierter CDK4
  • Beispiel 5 (Bestimmung der Aktivität von aktivierter CDK4 der Proben, behandelt gemäß dem beispielhaften Verfahren 5)
  • Probe 6 wurde zubereitet entsprechend dem beispielhaften Verfahren 5 unter Verwendung des Anti-CDK4-Antikörpers. Als Kontrolle wurde Probe 7 hergestellt entsprechend dem beispielhaften Verfahren 5, außer dass der Anti-CDK4-Antikörper nicht verwendet wurde. Die Fluoreszenzbanden von Probe 6 und 7 werden in 5 gezeigt.
  • Beispiel zum Nachweis der Spezifität der Messung aktiverter CDK2 zur Aktivität von CDK2 unter Verwendung eines CDK-spezifischen Inhibitors
  • Beispiel 6 (Im Fall der aktivierten CDK2)
  • Erster Schritt:
  • Dieser Schritt wurde in derselben Weise durchgeführt, wie der erste Schritt des beispielhaften Verahrens 1 unter Verwendung der K562-Zelllinie (prämyelocytische Leukämie).
  • Zweiter Schritt:
  • Eine Probe wurde vorbereitet durch Platzieren der solubiliserten K562-Zellen und des Lysepuffers in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen, so dass 250 μg der Gesamtmenge des Proteins der solubilisierten K562-Zellen in 500 μl des Lysepuffers enthalten waren. Zu dieser Probe wurden 10 μl eines polyclonalen Anti-CDK2-Antikörpers (200 μg/ml, Santa Cruz Biotechnology) hinzugefügt. Eine 1:1 (Sepharosekügelchen:Lysepuffer) Aufschlemmung von 40 μl Sepharosekügelchen, beschichtet mit Protein A, wurde zu der resultierenden Probe hinzugefügt, welche bei 4°C für 1 Stunde unter kontinuierlichem Rotieren inkubiert wurde. Die Kügelchen wurden aus der Probe entfernt und mit 1 ml des Lysepuffers zweimal gewaschen. Dann wurden die Kügelchen einmal mit 100 mM Tris-HCl bei pH 7,4 und 100 mM Natriumchlorid und weiter einmal mit 100 mM Tris-HCl von pH 7,4 gewaschen.
  • Dritter Schritt:
  • Als CDK-Inhibitor wurde Butyrolacton I (Calbiochem) verwendet, welches ein Inhibitor der CDK1 und CDK2 war, und Staurosporin (Calbiochem), welches ein breites Inhibitionsspektrum, umfassend Inhibitionen von CDK2, aufweist. Phosphorylierungslösungen (40 mM Tris-HCl, pH 7,4, 18 mM Magnesiumchlorid, 2 mM ATP-γS, 6 μg/Test-Histon H1), 50 μl, enthaltend Histon H1 und die CDK-Inhibitoren (Endkonzentration von 0, 1, 10, 30, 100 μM Butyrolacton, oder Endkonzentration von 0, 0,3, 1, 10, 30 μM Staurosporin) wurden zu den Kügelchen hinzugefügt. Die resultierenden Suspensionen wurden bei 37°C für 90 Minuten unter ständigem Schütteln inkubiert. Die Kügelchen wurden durch Zentrifugation bei 1.000 Upm für 10 Sekunden präzipitiert und 36 μl Überstand wurden gesammelt. Zu 36 μl des Überstands wurden 30 μl Bindungspuffer, enthaltend 150 mM Tris-HCl und 5 mM EDTA bei pH 9,2 hinzugefügt. Des Weiteren wurden 20 μl einer 50 mM PEO-Iodacetylbiotin-Lösung (Pierce) (50 mM Phosphatpuffer, pH 6,0) hinzugefügt und die resultierende Mischung wurde im Dunklen bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubiert. Danach wurde die Mischung behandelt mit einer äquivalenten Menge (86 μl) eines SDS-Proben-Ladepuffers (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 10% β-ME, 25% Glycerol, Bromphenolblau) bei 100°C für 5 Minuten.
  • Vierter Schritt:
  • Die im dritten Schritt vorbereiteten Proben wurden der SDS-PAGE unterworfen unter der Bedingung von 20 μl/Spur (vorgegossenes Gel, 4–20% Gradient, 10 mm × 10 mm, Daiichi Kagaku Yakuhin). Die Bedingungen der SDS-PAGE waren entsprechend den Anweisungen von Daiichi Kagaku Yakuhin (60 mA, 40 Minuten). Nach der SDS-PAGE wurde das in dem Gel aufgetrennte Protein elektrisch transferiert auf eine PVDF-Membran (10 V, 30 Minuten, Western-Blotting). Die erhaltene Membran wurde mit 4 w/v % BSA für 30 Minuten blockiert und mit TBS-T für 5 Minuten gewaschen. Anschließend wurde die Membran reagieren gelassen in einer Lösung von Avidin-FITC (Pierce) (1.000-fach verdünnt mit TBS-T) bei 37°C für 30 Minuten. Nach der Reaktion wurde die Membran mit TBS-T zweimal gewaschen und einmal mit Wasser, und getrocknet. Fluoreszenzbanden wurden visualisiert durch einen Molecular Imager (BioRad) und gemessen.
  • Die visualisierten Fluoreszenzbanden wurden numerisch und graphisch dargestellt durch einen Image Analyzer. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt, worin „keines" das Ergebnis des obigen Schritts darstellt, ohne Hinzufügen der CDK-Inhibitoren, „DMSO" stellt das Ergebnis des obigen Schritts mit Hinzufügen nur des Lösungsmittels (Dimethylsulfoxid) für die CDK-Inhibitoren dar und IP (–) stellt das Ergebnis des obigen Schritts ohne Hinzufügen des CDK2-Antikörpers dar. Wie in 6 gezeigt, wird die Aktivität von CDK2 inhibiert in Abhängigkeit von der Menge der Inhibitoren. Die Ergebnisse zeigen, dass die bestimmte Aktivität spezifisch für CDK2 war.
  • Wie oben gezeigt, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Aktivität von Cyclin-abhängigen Kinasen genau und ohne Verwendung von Radioisotopen bestimmen.

Claims (9)

  1. Ein Set von Reagenzien zur Bestimmung der Aktivität von Cyclin-abhängiger Kinase/Cyclinkomplex, umfassend einen Antikörper gegen Cyclin-abhängige Kinase, ein Substrat für Cyclin-abhängige Kinase, Adenosin-5'-O-(3-thiotriphosphat) (ATP-γS) und einen Markierungsfluorophor oder ein Markierungsenzym zum Markieren einer Thiophosphatgruppe, erhältlich durch Reagieren des Substrats und ATP-γS.
  2. Set von Reagenzien gemäß Anspruch 1, worin besagte Cyclin-abhängige Kinase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CDK1, CDK2, CDK4 und CDK6.
  3. Set von Reagenzien gemäß Anspruch 1 oder 2, des weiteren umfassend einen Lysepuffer.
  4. Set von Reagenzien gemäß Anspruch 3, worin besagter Lysepuffer ein Tensid enthält, einen Proteaseinhibitor und einen Phosphataseinhibitor.
  5. Set von Reagenzien gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin besagte Cyclin-abhängige Kinase CDK1 oder CDK2 ist und besagtes Substrat Histon H1 ist.
  6. Set von Reagenzien gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin besagte Cyclin-abhängige Kinase CDK4 oder CDK6 ist und besagtes Substrat Rb ist, dessen Cysteinrest substituiert wurde durch einen Aminosäurerest, der keinen Thiolrest enthält.
  7. Set von Reagenzien gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der besagte Markierungsfluorophor ein Fluoreszenzfarbstoff ist.
  8. Set von Reagenzien gemäß Anspruch 7, worin der besagte Fluoreszenzfarbstoff FITC ist.
  9. Set von Reagenzien gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das besagte Markierungsenzym Peroxidase ist.
DE60226353T 2001-02-14 2002-02-14 Verfahren zur Bestimmung der Aktivität des Zellzyklus-Regulationsfaktors und Verfahren zur Diagnose von Krebs unter Verwendung desselben Expired - Lifetime DE60226353T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001037115 2001-02-14
JP2001037115 2001-02-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60226353D1 DE60226353D1 (de) 2008-06-12
DE60226353T2 true DE60226353T2 (de) 2009-06-10

Family

ID=18900293

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60226353T Expired - Lifetime DE60226353T2 (de) 2001-02-14 2002-02-14 Verfahren zur Bestimmung der Aktivität des Zellzyklus-Regulationsfaktors und Verfahren zur Diagnose von Krebs unter Verwendung desselben
DE60223432T Expired - Lifetime DE60223432T2 (de) 2001-02-14 2002-02-14 Verfahren zur Bestimmung der Aktivität des Zellzyklus-Regulationsfaktors und Verfahren zur Diagnose von Krebs unter Verwendung desselben

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60223432T Expired - Lifetime DE60223432T2 (de) 2001-02-14 2002-02-14 Verfahren zur Bestimmung der Aktivität des Zellzyklus-Regulationsfaktors und Verfahren zur Diagnose von Krebs unter Verwendung desselben

Country Status (4)

Country Link
US (2) US7338774B2 (de)
EP (2) EP1233060B1 (de)
AT (2) ATE378400T1 (de)
DE (2) DE60226353T2 (de)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE458830T1 (de) * 2003-02-26 2010-03-15 Sysmex Corp Verfahren zur untersuchung einer zelle
US8921057B2 (en) * 2004-05-31 2014-12-30 Sysmex Corporation Method of assessing properties of mammalian cells, and method of diagnosing cancer using the same
EP1767648A4 (de) * 2004-06-01 2009-08-05 Sysmex Corp Verfahren zur messung von enzymaktivität und säule zur verwendung bei der messung von enzymaktivität
EP1634603A1 (de) * 2004-08-26 2006-03-15 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum Behandlung von transformierten oder infizierten biologischen Zellen
US7348159B2 (en) * 2005-04-20 2008-03-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Methods for determining phosphoryltransferase activity using adenosine 5'-triphosphate (ATP)-gamma-S
ATE400815T1 (de) 2005-08-01 2008-07-15 Sysmex Corp Verfahren zur beurteilung der beschaffenheit maligner tumore
JP4766969B2 (ja) * 2005-09-14 2011-09-07 シスメックス株式会社 組織性質判定装置
JP4841266B2 (ja) 2005-09-27 2011-12-21 シスメックス株式会社 被検出物質の検出方法
JP2007097448A (ja) * 2005-09-30 2007-04-19 Sysmex Corp 組織の性質判定用試薬キット
JP5111902B2 (ja) * 2007-03-14 2013-01-09 シスメックス株式会社 癌の診断支援装置
US8921114B2 (en) 2007-08-24 2014-12-30 Sysmex Corporation Diagnosis support system for cancer, diagnosis support information providing method for cancer, and computer program product
JP2010057486A (ja) 2008-09-02 2010-03-18 Sysmex Corp 化学療法に対するがん患者の応答の予測方法
JP5830249B2 (ja) 2010-03-31 2015-12-09 シスメックス株式会社 癌細胞のアンスラサイクリン系抗癌剤への感受性の判定方法及びコンピュータプログラム
JP6002379B2 (ja) 2011-11-29 2016-10-05 シスメックス株式会社 癌の再発リスクの判定方法及びその利用
JP6214449B2 (ja) * 2014-03-31 2017-10-18 シスメックス株式会社 キナーゼ活性の測定方法
CN106324255A (zh) * 2016-08-17 2017-01-11 山东博科生物产业有限公司 一种稳定性强的生化用特种蛋白液体复合质控品
CN106876715B (zh) * 2017-03-30 2020-03-17 湖北金泉新材料有限责任公司 一种含碳纳米管的正极浆料、其制备方法及用途

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4252783A (en) * 1979-06-18 1981-02-24 Syva Company Reducing fluorescent background in fluorescent immunoassays
DE3049033A1 (de) * 1980-12-24 1982-07-22 Licentia Patent-Verwaltungs-Gmbh, 6000 Frankfurt "ringinterferometer"
US5518911A (en) * 1995-01-06 1996-05-21 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Human PAK65
WO1998002571A1 (en) * 1996-07-16 1998-01-22 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
AU735127B2 (en) * 1997-08-07 2001-06-28 Regents Of The University Of California, The Purine inhibitor of protein kinases, G proteins and polymerases
EP1036192B1 (de) * 1997-12-05 2003-02-26 PHARMACIA & UPJOHN COMPANY Fluoreszenz-basierte hts-(high throughput screening)assayverfahren für proteinkinase und phosphatase
GB2334578A (en) 1998-02-18 1999-08-25 Univ Liverpool Diagnosis of cancer involving assay of levels of cyclin-dependent kinase (CDK) isoenzymes

Also Published As

Publication number Publication date
DE60226353D1 (de) 2008-06-12
EP1609854A1 (de) 2005-12-28
US20020164673A1 (en) 2002-11-07
ATE393821T1 (de) 2008-05-15
DE60223432D1 (de) 2007-12-27
EP1233060A3 (de) 2003-10-15
EP1609854B1 (de) 2008-04-30
US20070264624A1 (en) 2007-11-15
US7338774B2 (en) 2008-03-04
ATE378400T1 (de) 2007-11-15
DE60223432T2 (de) 2008-09-18
EP1233060A2 (de) 2002-08-21
EP1233060B1 (de) 2007-11-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE60226353T2 (de) Verfahren zur Bestimmung der Aktivität des Zellzyklus-Regulationsfaktors und Verfahren zur Diagnose von Krebs unter Verwendung desselben
DE69907154T2 (de) Krebsbehandlung
Tansey et al. Ca (2+)-dependent phosphorylation of myosin light chain kinase decreases the Ca2+ sensitivity of light chain phosphorylation within smooth muscle cells
EP1767647B1 (de) Verfahren zur beurteilung der malignität einer säuger-krebszelle
DE60013124T2 (de) Reverse transkriptase testsatz, dessen benutzung, und verfahren zur analyse der rt-aktivität in biologischen proben
JP4036655B2 (ja) 細胞周期調節因子の活性の測定法と該測定法に使用される試薬
Rininger et al. Time course comparison of cell-cycle protein expression following partial hepatectomy and WY14, 643-induced hepatic cell proliferation in F344 rats.
Ring et al. Mitochondrial energy metabolism is required for lifespan extension by the spastic paraplegia-associated protein spartin
WO2013024118A1 (de) Verwendung von ccne2 als stratifikationsmarker bei der behandlung von brusttumoren mit neuen pan-cdk-inhibitoren
EP1634603A1 (de) Behandlung von transformierten oder infizierten biologischen Zellen
Sachinidis et al. Low-density lipoprotein elevates intracellular calcium and pH in vascular smooth muscle cells and fibroblasts without mediation of LDL receptor
DE60217665T2 (de) Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Thymidinkinase-1 und dessen Verwendung
DE10108263A1 (de) Analyse von Modifizierungen und Demodifizierungen von Proteinen mit Ubiquitinverwandten Proteinen mittels FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Zheng et al. A near-infrared light-controlled, ultrasensitive one-step photoelectrochemical detection of dual cell apoptosis indicators in living cancer cells
EP1282827B1 (de) Verfahren zum selektieren von inhibitoren für enzyme
Laasmaa et al. Cardiomyocytes from female compared to male mice have larger ryanodine receptor clusters and higher calcium spark frequency
Neufeld et al. mRNA fluorescence in situ hybridization to determine overlapping gene expression in whole‐mount mouse embryos
WO2000041696A1 (de) Verwendung von 5-ht5-liganden zur behandlung neurodegenerativer und neuropsychiatrischer störungen
DE69817338T2 (de) Verfahren zum nachweis von autoimmun-pathologien
KR101365206B1 (ko) 심장근육병 진단용 마커 Ｏｒａｉ１
Yao et al. Host nuclear abnormalities and depletion of nuclear antigens induced in Trichinella spiralis-infected muscle cells by the anthelmintic mebendazole
ES2354616T3 (es) Método para evaluar la malignidad de una célula de mamífero cancerosa.
Koizumi et al. Fungerin, a fungal alkaloid, arrests the cell cycle in M phase by inhibition of microtubule polymerization
Schek et al. Chemical probe mediated visualization of protein S-palmitoylation in patient tissue samples
Métivier et al. Mechanisms of Kinesin-1 activation by Ensconsin/MAP7 in vivo

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition