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Die
Erfindung betrifft Analysegeräte
und Verfahren. Die analysierten Wirkungen können Zellwachstum und Replikation,
Absorption und Reflexion der einfallenden Strahlung und auch die
Emission oder andere als von Bestrahlung der Proben, in besonderen
Wellenbändern
beobachtete Eigenschaften aufweisen, beispielsweise Luminiszenz
oder Fluoreszenz.
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Das
wissenschaftliche Verständnis
von Biochemie hat sich in den letzten Jahrzehnten erheblich geändert. Biologische
Moleküle,
die einmal als feste Strukturen betrachtet wurden, sind nun bekannt
geworden dafür,
daß sie
schnelle, kontinuierliche Veränderungen
in der Form zeigen, welche, was ihre biologischen Funktionen anbelangt,
wichtig sind.
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Bekanntermaßen können biologische
Wirkungen sowohl in Bakterien- als auch Hefekulturen auftreten,
die Mikrowellenstrahlungen niedriger Intensität ausgesetzt werden. Die obigen
Beobachtungen sind möglicherweise
nicht vorhersagbar und die damit verbundenen Mechanismen werden
noch nicht vollständig
verstanden.
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Bekanntlich
ist die Form eines Moleküls
unlösbar
mit seiner Chemie verbunden, und in einem polaren System entsprechen
Schwingungsarten Frequenzen von Absorption der elektromagnetischen Strahlung
in dem mit Mikrowellen bestrahlten Bereich. Die selektive Ablagerung
von elektromagnetischer Energie modifiziert die Population ausgewählter Arten,
so die Änderung
der Form und damit die chemischen Eigenschaften des Moleküls. Daher kann
Mikrowellenstrahlung selektiv benutzt werden, um biochemische Prozesse
von ferne und nicht thermisch zu manipulieren und zu hinterfragen.
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Die
vorhandenen analytischen Apparate verwenden jedoch aufgrund von
Problemen der Ausbreitung von Mikrowellenenergie auf die analytische Probe
und beim Ermitteln ausreichender und relevanter Information aus
der Probe keine Mikrowellenstrahlung. Darüber hinaus gibt es bei der
Anwendung der elektromagnetischen Strahlung auf eine statische Kultur,
am besten beispielsweise eine Petrischale und dergleichen Beobachtungen,
die Wachstum, Nachbildung usw. der Kultur auf einer Schichtenbasis analysieren.
Wir haben vorher gesagt, daß es
wesentliche Vorteile gibt, die darin bestehen, daß eine biochemische
Probe kontinuierlich analysiert werden kann, so daß während aller
Phasen des Zellenwachstums Messungen durchgeführt werden können.
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Geschlossene
Systeme, die unkontrollierte Energieverluste auf ein Mindestmaß beschränken, wurden
ebenfalls eingesetzt, und zwar unter Verwendung einfacher Konstruktionen
auf der Grundlage von Wellenführungsabschnitten
oder unter Verwendung von Resonanzhohlräumen (siehe Furia, L., D. W.
Hill und O. P. Gandhi, 1986. Die Wirkung von Millimeterwellenstrahlung
auf das Wachstum von Saccharomyces cerevisiae. IEEE Trans. Biomed.
Eng 33: 993–999).
Obgleich die Möglichkeit
besteht, das massenhafte Entweichen von Energie in einem solchen
System mit hoher Genauigkeit zu messen, und zwar mit Hilfe der Rückführ- und Übertragungsverluste,
bleibt ein klares Verständnis
der Verteilung und Gleichförmigkeit
der in der Probe befindlichen Energie eine bedeutende Herausforderung,
insbesondere was die Eindringtiefe von mm-Wellen-Strahlung in losen
Materialien, beispielsweise destilliertes Wasser, anbelangt. Zu
anderen biologischen Wirkungen und die Merkmale elektromagnetischer
Strahlung, die auf sie einwirken können, gehören: Zellengenotype (beeinflußt durch
die Energie der elektromagnetischen Strahlung); Wachstumsstadium
(beeinflußt
durch die Frequenz der elektromagnetischen Strahlung); Zellensynchronismus
(beeinflußt
durch die Polarität
der elektromagnetischen Strahlung); Zellendichte (beeinflußt durch
die statische/besonders niedrige magnetische Feldfrequenz der elektromagnetischen
Strahlung); Oxidation (beeinflußt
durch die dauernde Einwirkung elektromagnetischer Strahlung); Latenz
(beeinflußt
durch die Modulation der elektromagnetischen Strahlung).
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Fröhlich (Int.
J. Quantum Chem. Vol. 2, S. 641, 1968) behauptete die Existenz von "Mikrowellen-Biophotonen". Kurz gesagt, es
wurde vorgeschlagen, daß alle
biologischen Systeme elektromagnetische Strahlung aussenden, deren
Spektralcharakteristiken ihren gegenwärtigen Status und ihre gegenwärtige Funktion
widerspiegeln. In gleicher Weise können Status und Funktion eines
beliebigen biologischen Systems dadurch manipuliert werden, daß sie elektromagnetischer
Strahlung einer gegebenen Spektralcharakteristik ausgesetzt werden.
Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung können dazu
dienen, diese Theorie zu untersuchen.
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Die
US-A 5 028 541 beschreibt
einen Zellendurchfluß,
bei dem die Zellen in Gegenwart eines elektromagnetischen Feldes
kultiviert werden, das mit Hilfe eines Mikrowellengenerators zu
dem Zweck erzeugt wird, die Temperatur der Kultur besser zu steuern.
Die
US-A 5 089 385 beschreibt
ein Verfahren zur Benutzung des Zellendurchflusses für die Kultivierung.
Die
US-A 4 948 975 offenbart
ein Bildsystem zur Quantifizierung geringer chemoluminiszenter Reaktionen
in einem elektromagnetischen Feld in nahezu Realzeit. Die
US-A 6 122 042 zeigt eine
fotometrische Analysevorrichtung zur Identifizierung von Objekteigenschaften
unter Verwendung einer Reihe von drei oder mehr LEDs/Fotodetektoren, die
optische Eigenschaften an verschiedenen Stellen einer Probe ermitteln.
Die
US-A 4 678 326 beschreibt eine
Vorrichtung zur gleichzeitigen Feststellung der Luminiszenz und
Trübung
unter Verwendung von Sammellinsen, die neben einer Kuvette angeordnet sind.
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Dazu
kommt, daß die
Erfinder festgestellt haben, daß mit
bevorzugten Techniken die Möglichkeit besteht,
die frequenzabhängigen
Wirkungen zu verringern, so daß die
Absorption längs
eines ausgeprägten,
modulierten oder gescannten Wellenbandes im wesentlichen gleichförmig ist
und keine starkfrequenzabhängigen
Effekte aufweist.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Vorrichtung zur Erzeugung einer kontinuierlichen Kulturprobe
vorgeschlagen, wie sie in dem folgenden Anspruch 1 definiert ist.
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Der
Steuerer kann so geartet sein, daß die Strömungsgeschwindigkeit so gesteuert
wird, daß sie
der Wachstumsgeschwindigkeit der Kultur in dem Behälter entspricht,
da die Luminiszenz- und Trübungssignale
die vorhandene Menge anzeigen, beispielsweise Bakterien. Die zweite
Strömungsgeschwindigkeit
wird gewöhnlich
bei einer Geschwindigkeit fixiert, die als ständig unter derjenigen der ersten
Strömungsgeschwindigkeit
liegend erwartet wird. Somit kann die Vorrichtung eine Kulturprobe
mit im wesentlichen konstanten Eigenschaften liefern. Der Steuerer
kann die erste Strömungsgeschwindigkeit unter
Verwendung eines Proportional Integral Derivative(PID)-Controllers
steuern. Der Behälter
kann eine Rühreinrichtung
und/oder einen Luftaustritt aufweisen.
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Die
Vorrichtung kann des weiteren mit einem zweiten Behälter versehen
sein, zu dem die Übertragungseinrichtung
die Kultur überträgt, wobei
die Kultur in dem zweiten Behälter
mit einer anderen Substanz vermischt wird. Die Substanz kann eine
Pufferlösung,
ein Gift, ein frisches Kulturmittel oder ein anderes Mittel sein.
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Die
Vorrichtung zur Messung der Luminiszenz kann einen Fotodetektor
aufweisen. Die Vorrichtung zur Messung der Trübung kann mit einer Lichtquelle
und einem Fotodetektor versehen sein, wobei der Fotodetektor so
angeordnet ist, daß er
den Lichtdurchgang durch die Kultur mißt. Die Lichtquelle kann in
vorher eingestellten Intervallen ein- und ausgeschaltet werden.
Beispielsweise kann die Lichtquelle eine LED-Gruppe für einen
50%-Betriebszyklus sein. Die Intensität der Lichtquelle kann im wesentlichen
gleich der Luminiszenz der Kultur sein. Die Luminiszenz- und Trübungssignale
können
als zusammengesetztes Signal ausgegeben und von dem Steuerer entschlüsselt werden.
In den Fällen,
in denen die Kultur zu dem zweiten Behälter übertragen wird, kann die Vorrichtung
die Trübung
der Kultur in dem zweiten und/oder ersten Behälter messen.
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Die
Zufuhrvorrichtung und/oder die Übertragungsvorrichtung
können
eine Pumpe aufweisen. Die Einrichtung kann in einer lichtdichten
Kammer eingehäust
sein. Die Einrichtung kann des weiteren mit einer Vorrichtung zur
Steuerung der Temperatur in der Kammer versehen sein. Die Einrichtung
kann ferner eine elektromagnetische Abschirmung für die Kammer
besitzen.
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Gemäß einem
anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Herstellung einer kontinuierlichen, luminiszierenden Kulturprobe geschaffen,
das die folgenden Schritte aufweist:
Zufuhr eines ersten Kulturmediums
mit einer ersten Strömungsgeschwindigkeit
zu einem Behälter zwecks
Aufzucht; Erzeugung eines Luminiszenzsignals, das eine Messung der
Luminiszenz der Kultur im Behälter
darstellt; Erzeugung eines Trübungssignals,
das eine Messung der Trübung
der Kultur in dem Behälter
beinhaltet; Übertragung
der Kultur von dem Behälter
mit einer zweiten Strömungsgeschwindigkeit,
wobei die erste Strömungsgeschwindigkeit gemäß den Luminiszenz-
und Trübungssignalen
gesteuert wird.
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Obgleich
die Erfindung oben beschrieben worden ist, gilt sie auch für jegliche
erfinderische Kombinationen der obigen oder in der folgenden Beschreibung
genannten Merkmale. Die Erfindung kann auf verschiedenen Wegen ausgeführt werden, und
eine Ausführungsform
wird im folgenden, allerdings nur beispielshal ber, unter Bezug auf
die beigefügten
Zeichnungen, beschrieben. In der Zeichnung sind:
Diese und
andere Merkmale, Gesichtspunkte und Vorteile der bevorzugten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden detaillierten
Beschreibung zusammen mit den Zeichnungen vollständig beschrieben. In den Zeichnungen sind:
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1 ist
eine Ansicht einer Versuchsvorrichtung für ein Belichtungssystem, das
zu dem Zwecke dargestellt ist, zu der kontinuierlichen Kulturprobenherstellung
der vorliegenden Erfindung zu führen;
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2 ist
eine Grafik der gemessenen und simulierten S11 und
S21 Werte in der Vorrichtung von 1;
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3 ist
eine Grafik von gemessenen und simulierten spezifischen Absorptionsgeschwindigkeitswerten
(SAR) für
die Vorrichtung von 1;
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4 ist
eine schematische Ansicht eines biochemischen Mikrowellenanalysators;
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5 ist
eine schematische Ansicht einer anderen Ausführungsform des Analysators,
spezialisiert auf die Luminiszenzmessung der Probe, wobei die Vorrichtung
Probenherstellungskomponenten und Auswertungskomponenten aufweist;
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6 ist
eine schematische Ansicht einiger der Probenherstellungskomponenten;
und
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7 ist
eine schematische Ansicht einer der Auswertungskomponenten.
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Am
Anfang beschreiben wir eine vorläufige Studie,
die sich auf ein Belichtungssystem zur Minimierung von besonderen
Geräte
und Maßnahmen, wie
beispielsweise Widerstandsfalschanpassung, Konvektionswirkungen
und Hotspots, und wir beschreiben dann eine erste Ausführungsform
des biochemischen Mikrowellenanalysators.
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Bei
der vorangegangenen Untersuchung wurde das Belichtungssystem modelliert,
um die Versuchsprobe zu optimieren, und zwar im Hinblick darauf,
daß eine
Mikrowellenquelle im Frequenzbereich wandert. Um das Muster zu bewerten,
wurde eine Strahlungszelle gebaut, und mit einem automatischen Netzwerkanalysator
wurden Messungen durchgeführt.
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Ansoft
HFSS (erhältlich
von der Ansoft Corporation), ein 3D-Auflöser, der das finite Elementverfahren
benutzt, wurde für
die gesamte Simulationsarbeit verwendet. Die vorangehenden Versuche
sowie die Bewertung wurden in einer Belichtungszelle vorgenommen,
die als einfache Vielöffnungsvorrichtung angesehen
werden kann. Die anfängliche
Konstruktion konzentrierte sich mehr auf eine optimale Dosismessung
als auf den Vorteil schnell zur Verfügung stehender Kulturflaschen
und -schalen im Mikrobiologielabor. Eine Anzahl Entwürfe wurde
bewertet, und eine Zweiöffnungs-Vorrichtung,
im wesentlichen eine gerade Wellenführung, bei der die Probe und
der Halter (Kuvette) durch den Wellenführungshohlraum gesteckt sind,
wurde als besonders gelungen festgestellt. Die Einsteckschlitze
für die
Kuvette wurden in der Mitte der Wellenführungsbreitseitenwand positioniert,
um das Weiterschreiten in den freien Raum auf ein Mindestmaß zu beschränken. Bei
diesem Zweiöffnungs-Schema
kann die Mikrowellenstrahlung entweder i) in der Kuvette und der
Probe absorbiert werden, ii) reflektiert werden (S11),
iii) übertragen
werden (S21) oder iv) in den freien Raum
abgegeben werden, und zwar durch eine unendlich kleine Art des Fortschreitens
oder durch Leckage aus dem Wellenführungsschlitz. Simulierte elektrische
Feldstärken
in der Probe können
dazu dienen, eine lokale Verteilung herzuleiten (spezielle Absorptionsgeschwindigkeit SAR)
sowie Öffnungsparameter "S". Eine quantitative Bewertung der "Hotspots" und der Bereiche,
die gleichermaßen
Konvektionswirkungen erzeugen, wurde vorgenommen. Lokale SAR-Werte
wurden von dem HFSS-Nachprozessor auf einem kartesischen Gitter
mit vom Benutzer definierbaren Abstand entnommen. SARlocal = σ|E|2/ρm
- ρm
- = Massendichte
- σ
- = effektive Leitfähigkeit
- E
- = elektrisches Feld
V/M
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Die
Positionierung und die Konstruktion des Probenhalters (Kuvette)
sind zur Optimierung der Strahlungszelle wichtig. Ausgewählte Materialien bieten
eine Kombi nation von Bioverträglichkeit
und guten Mikrowellenübertragungseigenschaften,
beispielsweise PTFE, Quarz und Siliziumgummi. Ein weiterer wichtiger
Parameter ist die Probendicke, da die Mikrowelleneindringung relativ
oberflächlich
ist. Ultradünne
Filme bieten die beste lokale SAR-Homogenität, was jedoch gegen die Erfordernisse
der Praxis beim Betreiben eines Strömungssystems aufgewogen werden
muß. Eine
0,5 mm Probenbohrung wurde als Kompromiß gewählt. Eine rohrförmige Kuvettengeometrie
hat die lokale SAR-Gleichförmigkeit verbessert,
da "Kanten-"Effekte beseitigt
wurden. Eine Kuvette mit einem Innendurchmesser von 1 mm reicht
für die
Probenabsorption eines beträchtlichen Teils
der einfallenden Energie aus, und ergab immer noch eine ausreichende Übertragung,
um die frequenzabhängigen
Absorptionseigenschaften der Kuvette zu bestimmen. Wichtig ist auch
der Impedanzvergleich, der durch Auswahl eines niedrigen (< 20°) Einsteckwinkels
zur Waagerechten verbessert werden kann, obgleich dies die SAR senkt.
Die Dicke der Wellenführungswand
wurde vergrößert, um
sicherzustellen, daß praktisch
die ganze Strahlung absorbiert wurde und nicht in den freien Raum
wanderte. Die Sauerstoffpermeabilität war ein weiterer Faktor bei der
Auswahl des Kuvettenmaterials.
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Die
Vorhersagequalitäten
der Simulation waren von einer genauen Darstellung der dielektrischen Eigenschaften
für Bezugsflüssigkeiten
und Kuvettenmaterialien abhängig.
Eine Mustertabelle, die den 27,5–35 GHz-Bereich bei 25°C abdeckt,
wurde sowohl für
reines Wasser als auch für
salzhaltiges Wasser (3% NaCl) unter Verwendung der Debye-Gleichung
errechnet sowie eine modifizierte Version mit zusätzlichen
Werten für
den Salzgehalt. Die zusätzlichen
Bestandteile der marinen Kulturmedien hatten wenig Einfluß auf die
dielektrischen Eigenschaften. Die Werte für Quarz und PTFE waren schnell
aus der Literatur erhältlich
und zwei Werte, die für
Silizium zur Verfügung
standen, wurden interpoliert.
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Wie
aus 1 ersichtlich, wurde die simulationsoptimierte
Aufnahmezelle 10 aus einem Kupferblock hergestellt und
dann mit Gold elektroplattiert. Die Dicot-Konstruktion ermöglichte, daß die sterile Kuvette 12 durch
ein Schraubsystem, in dem symmetrische Abschnitte die Zelle bilden,
mit der Trennwand in der Mitte der wellenführenden Breitseitenwand, angeordnet
und gesichert wurde. Die Grenzfläche
zwischen dem Netzanalysator 14 und der Strahlungszellenöffnung wurde
von einem koaxialen Wellenführungsadapter 16,
dem flexiblem Wellenführungsabschnitt
und einem Wellenführungsbogen
gebildet, und zwar verdoppelt und so positioniert, daß ein zweites
Glied des Testsatzes auf Öffnung 2 entstand.
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Der
Erwerb von "S"-Parameterdaten geschah
mit einem Netzanalysator (8510c–Hewlett Packard),
der durch ein IEEE 488 Interface und eine Software, die durch Verwendung
einer grafischen Interface-Sprache geschrieben wurde, ferngesteuert wurde.
Eine Antworteichung geschah zu Null in der Testanordnung, und zwar
sowohl für
die Rückkehr- als
auch für
die Übertragungsverluste.
Messungen wurden für
die Rückkehr-
und Übertragungsverluste der
leeren Strahlungszelle selbst durchgeführt und waren vernachlässigbar.
Schließlich
wurde die leere Kuvette zur Eichung jeglicher zusätzlicher
Verluste eingesetzt.
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Die
rückgeführte (S11) und die übertragene Energie (S21) wurden an 51 Punkten in dem 27,5–35 GHz-Frequenzbereich
nach Proben beurteilt. Das Kuvettenmaterial war PTFE mit reinem
Wasser als Bezugsprobe. Die Temperatur wurde während des Experiments auf 25°C +– 1°C gehalten.
Dieses wurde mit den S11- und S21-Parametern
verglichen, die bei denselben Frequenzen erzeugt worden sind, jedoch
durch Simulation und mit identischen Konvergenzkriterium für jeden
Punkt. 2 zeigt die gemessenen und simulierten S11- und S21-Werte.
S21 simuliert und gemessen wich systematisch
um annähernd
2 dB ab. S11 war viel kleiner, und obgleich
ein vorhergesagtes Merkmal experimentell nicht beobachtet werden
konnte, hatte dies auf die gesamte Probe SAR wenig Auswirkung. 3 vergleicht
die gemessene und die simulierte Probe SAR mit einer Quellenenergie
von 1 mW, die gut korrelierte. Die Variation über das Band wurde bei guter
Impedanzanpassung minimiert.
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Unter
Bezug auf 4 ist festzustellen, daß das biochemische
Mikrowellenanalysegerät 40,
das in der Zeichnung dargestellt ist, ein Probenrohr 42 aus
geeignetem Material, beispielsweise PTFE, Quarz oder Siliziumgummi,
aufweist, wobei das Rohr einen relativ kleinen Innendurchmesser
(typischerweise etwa 1 mm) aufweist und einen Probenweg aus einem
Speichergefäß (nicht
gezeigt) zu einer Probenaustrittsöffnung (nicht gezeigt) besitzt
und gewöhnlich
weggeworfen wird. Das Probenrohr 42 bildet einen Probenweg,
an dem verschiedene Komponenten angeordnet sind. Somit durchläuft die
Probe einen Strömungsregler 44,
der beispielsweise ein einfaches Ventil sein kann oder eine komplexere
Vorrichtung, die das Strömungsgeschwindigkeitsprofil über dem
Querschnitt des Probenrohres ändert
oder die Trübung
der Probe einstellen kann.
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Drei
elektromagnetische Strahlungsdetektoren 46 sind an zustromseitigen,
mittelstromseitigen und abstromseitigen Positionen, wie in der Zeichnung
gezeigt, angeordnet. Die Strahlungsdetektoren 46 können Vorrichtungen
für ein
breites Spektrum sein oder sie können
fein abgestimmt sein, um in einem speziellen, begrenzten, schmalen
Wellenband nach Strahlung "auszuschauen". Beispielsweise
können
die Detektoren in einem I. R. Thermographieverfahren Verwendung
finden. Eine Temperatursonde oder Sensor 46A und eine Temperatursteuereinrichtung 46B sind
ebenfalls längs
des Probenrohres 42 angeordnet.
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Zwei
elektromagnetische Strahlungsquellen 48, die Strahlung
von einem breiten Spektrum aussenden, beispielsweise Mikrowellen,
infrarotes Licht, sichtbares Licht und ultraviolettes Licht, sind
gegen den Probenpfad gerichtet. Diese können wieder ein breites Spektrum
Energie abstrahlen oder auf ein spezielles, schmales Wellenband
eingestellt sein. In der Nähe
des Zentrums des Probenpfades verläuft das Probenrohr 42 schräg durch
einen Wellenführungsblock
rechtwinkliger Form 50, der an dem einen Ende eine Mikrowellenquelle 52 und
an dem anderen Ende einen Mikrowellendetektor 54 aufweist.
Das Probenrohr 42 erstreckt sich durch ein Loch in der Mitte
der einen Breitseite des Wellenführungsblocks und
tritt durch ein Loch in der gegenüberliegenden Wand des Wellenführungsblocks
aus. Bei einer Ausführungsform
kann auch eine Ultraschallquelle 48A längs des Probenrohres angeordnet
werden.
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An
dem Ende des Probenpfades ist ein Pumpmechanismus 56 angeordnet,
der dazu dient, die Flüssigkeit
auf dem Pfad entlang zu ziehen.
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Die
verschiedenen oben beschriebenen Komponenten werden von einem automatischen Regler 58 gesteuert,
der eine Frequenzverschiebung der verschiedenen Strahlungs- oder
Energiequellen vornimmt oder besondere Energieeingangsprofile herstellt
und auch die verschiedenen Strahlungsdetektoren entsprechend steuert
bzw. regelt.
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5 zeigt
eine weitere Ausführungsform, die
hauptsächlich
zur Analysierung von Wechseln in der Luminiszenz dient. Die Vorrichtung
weist allgemein bei 501 Probenvorbereitungskomponenten
auf, die zur Herstellung einer Probe für die Analyse- und Auswerteinrichtung
dient und allgemein bei 502 gezeigt ist, um die Analysen
durchzuführen.
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Zu
den Probenvorbereitungskomponenten 501 gehören eine
kontinuierliche Kulturherstellungsvorrichtung 504, eine
Medienzufuhr 506, eine Pufferzufuhr 508, die alle
mit einer Mischkammer 510 verbunden sind. Der Abfall aus
der Mischkammer wird in einem Abfallsammler 512 ausgetragen.
Die in der Kammer 510 gemischte Probe wird einem segmentierten
Strömungsroboter 514 zugeführt. Der
Roboter 514 weist ein Rohr 514B auf, dessen eines
Ende in die Probenzufuhr in der Mischkammer 510 hineingeführt und
aus ihr herausbewegt wird, sowie eine Pumpeinrichtung 514A,
die im folgenden beschrieben wird.
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Die
von dem Roboter 514 hergestellte segmentierte Probe wird
an die AuswerteinRichtung 502 abgegeben, die eine Belichtungszelle 516 aufweist, welche
in einer isothermen 518 angeordnet ist. Daten, die sich
auf die Ergebnisse der in der Zelle 516 durchgeführten Belichtung
ergeben, werden an einen Vektornetzanalysator 520 übertragen.
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Die
Kammer 518 soll fremde Quellen der elektromagnetischen
Strahlung ausschließen,
da veränderliche
Größen in der
Umwelt, wie beispielsweise statische und zeitabhängige Magnetfelder, RF-Felder
und Temperatur, bei der Einführung
biologischer Effekte berücksichtigt
worden sind. In der Kammer sind keine mit Energie betriebenen Ausrüstungen
wie Pumpen und Motoren angeordnet, und das Probenlicht wird durch
Verwendung von Faseroptiken an Fotoverstärkerröhren gekoppelt, die außerhalb
der Kammer 518 liegen.
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Eine
wirksame elektromagnetische Abschirmung wird dadurch erreicht, daß die Belichtungskammer
mit 2 mm mu-Metallblech 522 ausgekleidet wird, das ausreicht,
um das Hintergrundfeld auf ein mittleres Niveau von weniger als
1 μT zu
dämpfen. Ein
statisches Gleichstromfeld wird in der Nullfluß-Kammer unter Verwendung eines
Helmholtz-Spulensatzes und einer konstanten Stromzufuhr erzeugt.
Die Feldintensität
ist über
den 0–120 μT-Bereich
variabel, der den normalen physiologischen Belichtungsbereich simuliert.
Die Gleichförmigkeit
des magnetischen Feldes über
den Analysebereich ist besser als 1%.
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Bioluminiszenz
und andere biologische Variablen sind auf kleine Temperaturschwankungen
sehr empfänglich.
Die Temperatursteuerung wird dadurch erreicht, daß Wasser
durch ein Kühlsystem
umgewälzt
wird (schematisch bei 524 gezeigt), und zwar einschließlich eines
Netzes aus Kupferrohr, das in gutem thermischen Kontakt mit den
mu-Metallwänden 522 steht.
Das Kühlsystem 524 ist
auch ein Wasserbad mit integriertem Kühler und Erhitzer (hergestellt
von Grant, U. K.) und behält
die Behältertemperatur,
wenn das Wasser mit einer Menge von 16 L min–1 umgewälzt wird.
Die Belichtungskammer ist isoliert. Eine externe Temperatursonde,
die ein Pt 100-Platin-Widerstandsthermometer verwendet, dient als
Wasserbadthermostat und kann die Wassertemperatur innerhalb +–0,1°C halten,
und zwar über
den Bereich von 5–50°C. Die Wasserbadtemperatur
wird computergesteuert und kann programmiert werden, um durch einen
gegebenen Bereich anzusteigen oder zu verlaufen.
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6 zeigt
im größeren Detail
einige Komponenten 501 zur Herstellung kontinuierlicher
Proben, die dem segmentierten Strömungsroboter 514 zugeführt werden
sollen.
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Die
Herstellungsvorrichtung 504 für kontinuierliche Kulturen
weist einen Fermentierungsbehälter 602 auf,
der aus einem 50 ml "Quickfit" Testrohr besteht,
das so modifiziert wurde, daß es
einen Überlauf 603 mit
einem 20 ml-Arbeitsvolumen aufweist. Der Behälter 602 befindet
sich in einem zylindrischen Halter 602A. Zusatzteile an
dem Behälter 602,
die über
einen Dreiwegeadapter angeschlossen sind, bilden ein Aufgußrohr, ein
Trockenrohr 605, das wie ein Luftaustritt wirkt, und zwei
Spritzköpfe,
die in Reihe geschaltet sind, um ein "Zurückwachsen" in einen Zufuhrbehälter (nicht
gezeigt) für
Nährstoffe
zur Förderung
des Wachstums der Kultur. Das Mittel wird aus dem Speicher 506 für das Wachsen
dem Behälter 602 mit
Hilfe eines Rohres zugeführt,
das in eine Pumpe 604 gesteckt ist. Der Mittelspeicher 506 weist 10
Liter autoklave Behälter
auf, die für
viele Wochen kontinuierlichen Betrieb ausreichen.
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Luft
kann in den Behälter 602 durch
einen Inline-Filter (HEPA-VENT, 99,97% ≥ 0,3 μm, Whatman, U. K.) mit einer
Geschwindigkeit von 130 ml min–1 gepumpt werden, um
die Kultur über
ein Aufgußrohr
mit Sauerstoff zu versorgen. Das Trocknungsrohr 605 kann
lose mit Baumwolle verpackt sein, um Verschmutzung zu verhindern,
und kann eine kleine positive Druckdifferenz zwischen dem Behälter 602 und seiner
Umgebung aufrechterhalten. Der Kulturbehälter 602 ist auf einem
kleinvolumigen magnetischen Rührer 606 gelagert
(Variomag mono, H + P Labortechnik, München, Deutschland), gebaut
für kontinuierlichen
Gebrauch und angetrieben mit 300 Upm mit Hilfe von Siliziumgummirohrverbindungen.
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Die
Mischkammer 510 bildet ein Gefäß 612 mit einem 5
ml Arbeitsvolumen, verbunden mit dem Kulturbehälter 602 und kann
dem System zusätzliche Flexibilität verleihen.
Das Mischgefäß 612 und
der Kulturbehälter 602 sind
durch ein Rohr miteinander verbunden, das mit einer peristaltischen
Pumpe 614 versehen ist. Die Pumpe 614 überträgt kontinuierlich Material
aus dem Kulturbehälter 602 zum
Mischkessel 612, und zwar mit einer niedrigeren Geschwindigkeit
als die der Mediumförderpumpe 604,
die den Kulturbehälter 602 beliefert
(im Durchschnitt über
eine Stunde), so daß der
Kulturbehälter
nicht entleert wird. Die Steuerung in einer geschlossenen Schleife
ist besser als in einer offenen Schleife, obgleich die Ingangsetzung
des Mittelflusses intermittierend sein kann und es nicht möglich ist,
den Kulturbehälter
direkt an die Mischkammer zu koppeln. Der Seitenarmüberlauf 603 hält in dem Kulturbehälter eine
konstante Menge.
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Das
Mischgefäß 612 kann
so gebaut sein, daß das
aus dem Kulturbehälter 602 übertragene Material
mit einem Produkt verdünnt
wird, das von einer Pumpe 616 durch ein Rohr gepumpt wird.
Das Rohr kann einen Versorgungspuffer beliefern (wie bei Sauerstoffmessungen
erforderlich), und zwar von der Pufferzufuhr 508, ein Gift
oder frisches Medium aus dem Mediumspeicher 506. Die Verdünnungsrate kann
typischerweise daß sich
10fache des Mischbehälters 602 betragen,
wobei beabsichtigt ist, sicherzustellen, daß eine konstante Menge des
Mittels pro Flüssigkeitsvolumen
vorhanden ist. Das Mischgefäß 612 weist
auch einen Seitenarmüberlauf 618 zur
Aufrechterhaltung eines konstanten Volumens auf. Das aus den Überläufen 603 und 618 austretende
Material kann zu der Abfallsammelkomponente 512 laufen. Das
Mischgefäß 612 wird
unter Verwendung eines Rührers 617 gerührt, obgleich
kein zusätzlicher
Sauerstoffeintrag erforderlich sein kann, und zwar aufgrund der
ausgezeichneten Oberfläche
des Gefäßes. Die
Probe wird durch ein Rohr mit Hilfe einer Pumpe 519 zu
dem segmentierten Strömungsroboter 514 gefördert.
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Alternativ
dazu kann erwünscht
sein, zusätzliche
Mittel einzuführen,
die bei der Belichtung mit Mikrowellenstrahlung synergetisch wirken
oder die Vergrößerung der
Empfindlichkeit des Biolumineszenzabschirmsystems abpuffern. Eine
Anordnung aus Rohr und Pumpe kann zur Lieferung einer anderen Substanz
vorgesehen werden, die mit dem Material vermischt wird, das aus
dem Kulturbehälter 602 übertragen
wird.
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Der
Kulturbehälter 602,
die Rührer 606, 617 und
das Mischgefäß 612 befinden
sich vorzugsweise bei 20°C
+– 0,1°C in einem
geringfügig
dichten Brutofen 601. Die Temperaturstabilität ist bei
einem Medium wie beispielsweise phosphorhaltigem Phenylradikal,
bei dem zwischen 20°C
und 25°C
ein 50-fache Änderung
der Luminiszenz auftritt, sehr wichtig.
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Der
Medienbehälter 506,
die peristaltischen Förderpumpen 604, 614, 616 (101
U/R, hergestellt von Watson Marlow, Cornwall, U. K.) sowie der Computer
sind vorzugsweise außerhalb
des Brutofens 601 angeordnet.
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Die
kontinuierliche Kulturvorrichtung 504 sowie die Mischkammer 510 werden
von einem computerbasierten Regler 621 gesteuert, der die
Mediumzufuhr in Abhängigkeit
von den Fluktuationen in der Bioluminiszenz und der Trübung der
Probe betätigt. Der
Computer kann auch zur Aufzeichnung von Messungen verwendet werden,
die sich auf die Luminiszenz der erzeugten Probe beziehen. Die Messungen können mit
einem Fotodetektor 624 durchgeführt werden, der in dem Kulturbehälterhalter 602A angebracht
ist. Dies kann den Lichtfluß aus
dem Kulturbehälter 602 maximieren,
der als Flächenquelle
betrachtet werden kann. Die Trübung
läßt sich
optisch messen durch Feststellen der Schwankungsintensität eines
Lichtstrahls (550 nm), der von einer LED 623 erzeugt wird,
welche in dem Behälterhalter 602A angebracht
ist. Die LED ist dem Fotodetektor 624 zugewendet und in
dem Behälterhalter 602A an
einer Stelle angebracht, die im wesentlichen diametral derjenigen
gegenüberliegt,
an der der Fotodetektor 624 befestigt ist. Auf diese Weise
mißt der
Fotodetektor 624 das durch den Kulturbehälter 602 fallende
Licht sowie die Luminiszenz selbst des im Behälter befindlichen Materials.
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Alternativ
dazu oder zusätzlich
kann ein Fotodetektor 625 in einem Halter sitzen, der das
Mischgefäß 612 auf
einer Seite des Gefäßes umgibt,
die dem benachbarten Kulturbehälter 602 abgewendet ist.
Auf diese Weise kann das von der LED 623 erzeugte Licht
durch den Kulturbehälter 602 und
auch das Mischgefäß 612 fallen,
um von dem Fotodetektor 625 gemessen zu werden. In diesem
Fall kann der Fotodetektor 624, der zwischen dem LED 623 und der
Fotodiode 625 angeordnet ist, durch einen Vorverstärker ersetzt
werden, um die Luminiszenzmessung zu unterstützen. Es versteht sich, daß die Lichtquelle
und/oder die Lichtdetektoren auch an anderen Stellen in der Vorrichtung
angeordnet werden können,
und zwar in Abhängigkeit
von der Art der gewünschten
Messung.
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Die
LED 625 kann von dem Regler 621 mit einem 50%igen
Arbeitszyklus angetrieben werden. Wenn die Fotodetektoren 624/625 ein
zusammengesetztes Lichtsignal empfangen, sobald die LED aktiv ist
(d. h. von der Kultur in dem Behälter 602 sowie
von der LED erzeugtes Licht), müssen
die Signale für
die Bioluminiszenz und die Trübung
in einem späteren Stadium
entschlüsselt
werden. Die LED-Intensität kann
unter Verwendung eines Potentiometers auf annähernd denselben Wert wie die
Bioluminiszenz eingestellt werden. Eine zusätzliche einstellbare Zielstufe
kann dazu dienen, das Fotodetektorsignal vor der Digitalisierung
zu konditionieren.
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Das
Fotodetektorsignal kann unter Verwendung einer Differentialtyptechnik
mit einem 12-Bit (1 in 4096) Wechselstrom-/Gleichstromwandler 626 (PCI-6023E,
National Instruments Corp. Austin Texas) bei einer Frequenz von
1 KHz digitalisiert werden. Die Erwerbgeschwindigkeit und das Timing
werden durch eine Software gesteuert (Labview 6.0, National Instruments),
die auf dem Regler 621 läuft, und die hereinkommenden
Daten werden in einem kreisförmigen
Puffer verarbeitet. Ein digitaler Filter 628 mit niedrigem
Durchlaß entfernt
das Geräusch,
das die Belüftung
und das Rühren
des Kulturbehälters
betrifft. Das Signal wird weiter bearbeitet, um separate Kanäle für die Trübung und
Luminiszenz bei 0,5 Hz zu schaffen. Diese können in Realzeit dargestellt
und durch den computerisierten Regler 621 gespeichert werden.
Das bearbeitete Signal hat die erforderliche Stabilität, um in
dem Steuersystem verwendet zu werden.
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Die
Steuerung der Pumpen 604, 614 muß auf einer
Kombination der Messungen basieren, die sowohl bezüglich der
Lichtemission als auch der Trübung
gemacht werden. Bei dem von Wardley-Smith B, White D und Lowe A,
J. Appl. Bact. 39, 337 (1975), berichteten Steuersystem wurde eine
Förderpumpe aktiviert,
sobald eine festgelegte Luminiszenz oder Trübungsschwelle erreicht war.
Dieses Kultursystem wies auch eine offene Schleifenkomponente in
Form eines Zeitmessers auf, der die Mediumförderpumpe bei Änderung
der Luminiszenz oder Trübung
eingeschaltet hat (für
den Fall, daß sie
nach einer bestimmten Zeit nicht eingeschaltet war). Eine vorteilhafte "Fenster"-Einstellung bestimmte
den Abfall in dem gemessenen Parameter, der erforderlich war, um
die Pumpe auszuschalten. Bei der mit Bezug auf 6 beschriebenen
Ausführungsform
kann die relative Gewichtung jeder Steuerkomponente für jeden Organismus/Beanspruchung
ausgewählt
und optimiert werden. Auf diese Weise kann der Regler 621 mit
der komple xen Antwort der Kulturbehälter-Luminiszenz in Abhängigkeit
von der Einleitung des Zufuhrmediums arbeiten.
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Im
Gegensatz zu "Fenster"-Steuersystemen, bei
denen die Förderpumpe
pulsmoduliert arbeitet, ist der Proportional Integral Derivate(PID)-Regler 621-Ausgang
proportional. Der Regler kann die Mediumförderpumpe 604 mit
Hilfe eines analogen Signals steuern. Der normalisierte Ausgang,
der sich aus den Messungen von Trübung und Luminiszenz ergibt,
sowie die Zeitmessung werden in ein analoges Signal verwandelt (CIO-DDA06/JR,
12-Bit D/A conversion card, Measurement Computing, Mass., U. S.
A.), das der Pumpe 604 zugeführt wird. Während des Wachsens der Kultur
kann die mittlere Mediumfließgeschwindigkeit
der Mediumzufuhrpumpe 604 etwa 3,7 ml/h betragen (Verdünnungsgrad 0,18/h),
wobei die Übertragungspumpe 614 mit
einer maximalen Fließgeschwindigkeit
von etwa 3 ml/h arbeitet. Die Übertragungs-
bzw. Fördergeschwindigkeit
der Pumpe 614 kann auf 2/3 der zeitlichen Durchschnittsliefermediumgeschwindigkeit
der Pumpe 604 begrenzt werden, um ein Entleeren des Kulturbehältervolumens
zu verhindern. Die Einführung von
frischem Medium in den Mischbehälter 612 ermöglicht Experimente
mit (jedoch ausschließlich) Kulturen
mit expotentieller Wachstumsphase, obgleich die Software, die auf
dem Regler 621 läuft,
verlangen kann, die Latenz zwischen dem Mischgefäß 612 und dem Abschirmsystem 502 zu
berücksichtigen,
die variabel ist und von der Systemströmungsgeschwindigkeit abhängt.
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Die
Probenherstellungskomponenten 501, die oben beschrieben
wurden, sind relativ einfach aufgebaut und lassen sich zur Zufuhr
von lumineszenten Bakterien mit konstanten Eigenschaften für entweder
die Laborbenutzung oder die Abschirmung von Umgebungsverschmutzungen
verwenden. Darüber
hinaus können
Bakterien eingesetzt werden, um empfindliche (< 1 nM) Sauerstoffmessungen durchzuführen. Die
kulturerzeugende Vorrichtung 504 kann allein oder in Kombination
als Chemostat, Trübungstat
oder "Bioluminostat" gebaut sein, wobei
die bakterielle Bioluminiszenz die steuernde veränderliche Größe ist.
Während
der Versuche, die über
längere
Zeitperioden ausgeführt
wurden (beispielsweise über
eine Woche), wurde herausgefunden, daß es möglich ist, die Luminiszenz
innerhalb 5% eines vorher eingestellten Wertes zu halten, obgleich
zufällig ein
nichtbioluminiszenter "Mutant" dominant wurde. In
diesem Fall war die Lichtemission unwiederbringlich verloren. Das
kontinuierliche Kultursystem ist auch für das Wachstum von wiedervereinigten
Mikroorganismen geeignet, die entweder konstitutionsmäßig Liziferaseausdrücken oder
als Folge der Spannungsfördereraktivität. Der duale Satzpunktsteuerer kann
beispielsweise für
Forschung und industrielle Anwendungen Bedeutung haben, da er eine
sofortige Prozeßsteuerung
ermöglicht,
oder als ein Schlußfolgerungsverfahren
zur Optimierung von Biomassenprodukt-Ergebnisverhältnissen.
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Die
kontinuierliche Kulturvorrichtung 504 eignet sich zur Kultivierung
von von Haus aus bioluminiszenten Bakterien über längere Zeitspannen. Ihr kleiner
Aufbau verhindert gewisse Probleme, die beim Betrieb früherer Vorrichtungen über lange
Zeiträume
aufgetreten sind: Auf der Reagenzseite benutzen die Bakterien sehr
kleine Medienvolumina und auf der Instrumentenseite wird ein preiswertes
Fotodiodenlichtfeststellungssystem auf Zeitbasis mehrfach geschaltet,
so daß die
Abgabe der Forderung für Fotovervielfältiger und
Hochspannungsstromzufuhr entspricht. Die Vorrichtung 504 erfordert
keine zusätzliche
Instrumentierung, wie beispielsweise pH und gelösten Sauerstoffsensoren.
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Die
Synthese des Luziferasesystems und das Erscheinen von Bioluminiszenz
bei wachsenden bakteriellen Kulturen wird mit Hilfe vieler interaktiver Faktoren
gesteuert: Wachstumsgeschwindigkeit, Sauerstoffkonzentration, N-Acylhomoserine
Lakton-Selbsteinleiter, Temperatur, Salz und Ernährungsbedingungen sowie die
Abwesenheit von kataboliter Unterdrückung, um nur einige der vielen
klar identifizierten Faktoren zu nennen. Da Sauerstoff ein wesentlicher
Mitfaktor bei den biochemischen Reaktionen ist, der für Bioluminiszenz
benötigt
wird, wurde in einem Experiment, bei dem der Rührer und die Luftzufuhr abgeschaltet
waren, eine scharfe Änderung
in der Leuchtintensität
nach etwa 4,5 Minuten festgestellt, sobald gelöster Sauerstoff durch Ausatmung
unter der Schwelle nicht mehr vorhanden war, auf die Sauerstoffemission
begrenzt ist. Die Bioluminiszenz nahm dann rasch ab (t½ = 0,34
min) und oszillierte über
dem "Restglüh"-Intensitätsspiegel
mit einer Periode von etwa 0,6 min. Die Wiederaufnahme des Rührens und
der Luftzufuhr ergab einen Überschuß, nämlich das "exzessive Blitz"-Phänomen, das als
Ausdruck einer Anhäufung
eines Luziferasekomplexes unter anaeroben Bedingungen ausgelegt
wurde.
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Obgleich
hauptsächlich
als Generator zur Prüfung
der Giftigkeit sowie zu experimentellen Zwecken vorgesehen, kann
die Vorrichtung 504 gleichermaßen ein nützliches Werkzeug für die Optimierung von
industriellen Prozessen sein. F. Marincs, Appl. Microbiol. Biotechnol.
53, 536 (2000) beschreibt die Online-Überwachung
des Wachstums bei einer Einzelkultur unter Verwendung einer Ket te
von Escherichia-Kolibakterien, die für die konstitutive Bioluminiszenz
aufbereitet waren. Dieses Dokument schlägt vor, daß beim Messen der Bioluminiszenz
eine indirekte Messung der Lebensfähigkeit, des Wachstums und
der metabolischen Aktivität
vorgenommen werden könnte,
die sonst komplizierte Probentechniken wie beispielsweise Strömungszellmessung,
erfordern. Dies wird weiter erhärtet
durch die Tatsache, daß gezeigt
wurde, daß Luziferaseaktivität beim Wachsen
von bakteriellen Populationen der Pseudomonas-Fluoreszenz proportional
der Biomasse ist. Ein gewöhnliches
Problem in Fermentationsprozessen ist die Anhäufung einer großen Biomasse,
jedoch mit einem weniger als optimalen Produktergebnis, was durch
Online-Überwachung
der Bioluminiszenz vermieden werden kann. Darüber hinaus kann in Systemen,
in denen fremde Gene durch Verwendung verschiedener Promoter ausgedrückt werden,
eine weitere Optimierung durch Messung der Lichtemission von mit
diesen Promotern aufgeschmolzenen Lichtgenen erfolgen.
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Die
Strömungsgeschwindigkeiten,
bei denen die Vorrichtung arbeitet, entsprechen der laminaren Strömung. Laminare
Strömung
in Rohren hat ein parabolisches Profil und ebenso in den Versuchskomponenten
der Vorrichtung, wobei eine Detektoranordnung das Signal von jedem
Detektor zerlegen muß. Infolge
der Schwierigkeiten, die bei der Signalzerlegung mit anderen interaktiven
physikalischen Phänomenen,
beispielsweise Diffusion und Konvektion, wird die segmentierte Strömung benutzt.
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Ein
wichtiger Parameter im Versuchsabschnitt dieses Instruments ist
die Residenz/Übergangszeit
der Probe, die in Verbindung mit der mm-Wellenenergiequelle die
Proben-"Dosis" bestimmt. Der segmentierte
Strömungsroboter 514 weist
eine peristaltische Pumpe mit 8 Rollen-Mikrokassette auf (Watson
Marlow 595U), die zwischen der Mischkammer und der Analysekammer
angeordnet ist. Die Strömungsgeschwindigkeit
wird durch die Labview-Software und eine 16-Bit-D/A-Umwandlungskarte
(PCI-DAS 1602/16, Measurement Computing, Mass., U. S. A.) gesteuert.
Die peristaltische Pumpe steuert die Strömung, wenn die Rollen vorrücken, wobei
das Rohr zusammengepreßt
wird. Um diese Wirkung auf ein Mindestmaß zu beschränken, war eine Pumpe mit drei
möglichen
Köpfen
ausgewählt
worden, und die Strömung
aufgeteilt und bei jedem Impuls außerhalb der Phase wieder zusammengeführt. Auch
wurde ein besonders geeignetes Rohrmaterial verwendet. Normalerweise
wird, wenn die Pumpe mit ihrer niedrigsten Fördergeschwindigkeit läuft, kein
Pulsieren festgestellt.
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Die
Aufteilung der Strömung
in Segmente läßt sich
durch Verwendung des Gegendrucks erreichen, der von der peristaltischen
Pumpe mit 8 Rollen erzeugt wird, sowie durch einen sich hin- und
herbewegendes Rohr aus rostfreiem Stahl (0,2 mm Bohrung), das den
Mischtank mit Proben beschickt und eingeleitete kontrollierte Luftblasen.
Die Hin- und Herbewegung wurde unter Verwendung einer Zähler-/Zeitgebertafel
(National Instruments 6023E, U. S. A.) erzeugt, die unter Benutzung
eines Labview-Programms zum Antrieb eines linearen Schrittmotors programmiert
worden ist. Die gewünschte
Länge der Probe
in dem Rohr und dem Raum-/Probenverhältnis wird unter Verwendung
eines Software-Zeitgebers gesteuert, der das Edelstahlrohr veranlaßt, entweder in
dem Kulturmedium oder in dem Mischbehälterluftraum zu liegen. Zwischen
dem von dem Roboter 514 kommenden und zur Belichtungszelle 516 führenden Leitung
braucht keine Unterbrechung zu bestehen.
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7 gibt
Einzelheiten der Strömung
durch die Belichtungszelle 516 wieder, die in der isothermen
Kammer 518 enthalten ist.
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Die
Durchströmungsbelichtungszelle 516 ist eine
mit zwei Öffnungen
versehene Vorrichtung, die sich auf eine grundlegende Wellenführungsgerade stützt, wobei
das Probenrohr 804 den Wellenführungsraum 806 in
der Wellenführung
durchschneidet. Die aneinandergrenzenden Wellenführungsabschnitte treten aus
der Belichtungszelle durch gegenüberliegende
Paneele aus. Hochfrequente elektromagnetische Simulationssoftware
(Ansoft, HFSS), die die finite Elementenmethode benutzt, läßt sich
zur Charakterisierung der Belichtungszellenleistung vor der Vektornetzwerkanalyse
durch die Komponente 520 einsetzen. Ein kleiner (< 12°) Rohreinsteckwinkel verbesserte
die Vergleichskennzeichen über
das Band.
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In
der Zwei-Öffnungs-Einstellung
wird die mm-Wellenstrahlung entweder i) in der Probe und der Rohrwand
absorbiert, ii) reflektiert (Ausgang an der Öffnung S11 der 5),
iii) übertragen
(Ausgang an der Öffnung
S21 der 4) oder
sie wandert allmählich
erlöschend
(beispielsweise Leckage) an einer Stelle in den freien Raum, wo
daß sich
Probenrohr in die Führung
eintritt (falls nicht unterdrückt, würde dieses
Fortschreiten einen unkontrollierten Verlust der Signalenergie von
der Probe darstellen).
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Die
Rohreintrittspunkte, die Wellenführungswanddicke,
der Kuvettendurchmesser und sein Material (Dielektrizitätskonstante)
lassen sich so wählen,
daß die
Möglichkeit
der grundlegenden Wellenführungsfortschreitung
längs des
Rohres auf ein Mindestmaß beschränkt wird.
Die Wirkung kann als vernachlässigbar
betrachtet werden, typischerweise liegt sie 30 dB tiefer als der
Energiespiegel in der Mitte der Zelle. Die Rohrmaterialien sind
auf der Basis ihrer Bioverträglichkeit,
Sauerstoffpermeabilität
und mm-Welle sowie optischen Übertragungseigenschaften
auszuwählen.
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Einer
der eine größere Herausforderung
bildenden Aspekte der Strahlungszellenkonstruktion betrifft die
mikroskopische Abgabe von Energie in der Testprobe. Inhomogene Verteilung
der Energie kann zu "Hotspots" führen, die
die durchschnittlich absorbierte Energie weit übersteigen. Kleine jedoch schnelle Änderungen
in der Temperatur können
Konvektionsphänomene
schaffen, die fälschlich
als ein nicht-thermischer Effekt interpretiert werden. Ultradünne Filme
können
die beste räumliche
Verteilung der Energie in einer Probe bewirken. Als Kompromiß kann eine
0,5 mm-Bohrung Verwendung finden, da diese sicherstellt, daß das Wachsen
auf den Wänden des
Strömungssystems
nicht ungewöhnlich
schnell stattfindet. Ein erheblicher Anteil der einfallenden Energie
wird in dieser 0,5 mm-Probe absorbiert. Die abgerundeten Ränder oder
Ecken des Rohres haben die örtliche
SAR-Homogenität
verbessert, da "Rand"-Effekte beseitigt
wurden. Durch Simulierung spezieller Absorption in der Probe wurden
die lokale SAR-Verteilung und die Öffnungs-Parameter verbessert.
Eine quantitative Bewertung der "Hotspots" sowie der Bereiche,
die wahrscheinlich Konvektionswirkungen hervorrufen, kann vorgenommen
werden.
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Die
biologische Antwort auf die mm-Wellen-Belichtung wird unter Verwendung
eines auf Bioluminiszenz gestützten
Berichtsystems ausgewertet. Lichtemission tritt gewöhnlich im
blau-grünen
Bereich auf und ist von geringer Intensität. Aufgrund des potentiell
niedrigen Signalpegels und des Wunsches, das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis zu
verbessern, werden Photon-zähl-Fotomultiplier-Rohres
verwendet (H7474, Hammamatsu Corp.). Licht wird unter Verwendung
eines Kollimators mit einer 2 mm Öffnung (Oz Optics 2522), das
dem Probenrohr ausgesetzt wird, überprüft. Die
Kollimatorführungen
sind in die Durchflußzellenwand
zwecks Lichtüberwachung während der
Belichtung eingebaut. Vor und nach der Bestrahlung werden entlang
des Pfades des Rohres, wenn dieses in die Zelle eintritt und aus
ihr austritt, Lichtprüfpositionen
angeordnet. Ein universeller optischer Faserstrang liefert über einen
SMA-Anschluß an
das Fotomultiplierrohr ein Signal. Die Kollimation bedeutet, daß die Raumauflösung des
Lichtdetektors auf Kosten der an die Lichtquelle gekoppelten Effizienz
des Detektors verbessert werden kann. Jeder Detektor integriert
die Photonenzählung.
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Das
Analysesystem soll die statistisch bedeutsamen Änderungen in der Bioluminiszenz
zwischen der belichteten mm-Welle und den unbelichteten Zellkulturen
als Funktion von Parametern wie beispielsweise mm-Wellenintensität und Frequenz
erfassen. Das Analysesystem kann entweder in einer auf Suche optimierten
Weise arbeiten, und zwar unter Verwendung eines automatischen Eichsystems, oder
auf mehr statistisch robuste Weise, die sowohl das Kalibriersystem
als auch formale Kontrollen beinhaltet.
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Eine
Reihe Kollimatorkanäle 810 sind
längs desjenigen
Teiles des Probenrohres 804 angeordnet, welche bioluminiszente
Segmente 808 enthalten, die beim Durchlauf durch die Bestrahlungszone 809 der Strahlung
ausgesetzt waren. Da die Segmente 808 jeden Kollimator
queren, wird ein charakteristischer Anstieg und Abfall in der Zählrate beobachtet,
die eine Wellenform erzeugt, welche dem Niedrig-Hoch-Zuständen eines
digitalen Signals ähnelt. Ein
Schwellenalgorithmus läßt sich
zur Feststellung der vorderen und hinteren Ränder jedes Segmentes einsetzen,
so daß jedes
Segment bei einer bekannten Strömungsgeschwindigkeit
geführt
werden kann, wenn es durch die Detektorreihe läuft. Vorfälle wie beispielsweise Stufenwechsel
in der Frequenz, Energie sind randbedingt und treten als solche
Segmente in die Zelle 516 ein.
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Die
Analyse wird durch Integration der Zählrate von dem Mittelbereich 811 jedes
Segments 808 durchgeführt,
der dann zur Berechnung eines statistischen Maßes der Bioluminiszenz dient,
das in eine Datei eingeschrieben wird. Der Mittelbereich 811 stellt
etwa 70% des Abstandes zwischen den vorderen und hinteren Rändern des
Segments 808 dar. Die Bioluminiszenz wird auf diese Weise
an jedem Kollimator in der Reihe gemessen und mit dem Vorbelichtungsdetektorwert
verglichen. Dieser Vergleich geschieht sehr einfach dadurch, daß jeder
Detektorkanal aufeinanderfolgend gestattet wird, und zwar mit einer
zeitlichen Verzögerung,
so daß der
erste Wert in jeder Datei, der jedem Detektorkanal entspricht, das
erste zu analysierende Segment bildet.
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Obgleich
die durch den Abstand zwischen den Kollimatorkanälen verursachte Verzögerung relativ
kurz ist, versteht es sich, daß die
Vorrichtung so abgeändert
werden kann, daß Belichtungseffekte
bei der Bestrahlung der Probe über
einen längeren
Zeitraum, der zu untersuchen ist, ermöglicht werden. So kann beispielsweise
das Probenrohr bewegliche Ventile aufweisen, die den Segmenten ermöglichen, für eine gewünschte Zeitspanne
zu verweilen, bevor sie sich weiterbewegen können, um von dem nächsten Kollimatorkanal
gemessen zu werden, oder bevor die Messung durch denselben Kanal
wiederholt wird.
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Das
Vergleichssystem ist ein Tabellenkalkulationsprogramm, das mit Hilfe
der Dateien arbeitet, die von jedem Detektorkanal hergestellt werden.
Ein Verhältnis
wird zwischen der Intensität
der Bioluminiszenz an dem Vorbelichtungsdetektor und dann an jedem
anderen folgenden Detektor in einer Reihe berechnet. In der Tabellenkalkulation
ist dies die erste Spalte. Das Analysesystem benutzt relative Anderungen
in der Intensität
der Bioluminiszenz. Diese wird mit den Durchschnittswerten einer
Reihe unbelichteter Eichungssegmente verglichen. Ausreichende Segmente
dienen bei der Eichungssequenz zur Bestimmung der statistischen
Grundwerte der unbelichteten Segment-Bioluminiszenz, so beispielsweise der
Standardabweichung. Die statistischen Grundwerte der Eichungsreihe
dienen zur Festsetzung einer Schwelle für Bioeffektermittlungsanwärter.
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Unbelichtete
Eichungssequenzen flankieren belichtete Sequenzen der Segmente 808.
Ein Vergleichsprogramm bewertet den Wert jedes Segments durch die
Detektorreihe und berechnet einen Index der biologischen Aktivität auf der
Basis eines Vergleichs mit einer unbelichteten Reihe Eichungsimpulse.
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Beim
Arbeiten in seiner einfachsten Art und Weise ordnet der Analysator
Segmente in belichtete und unbelichtete "Eichungs-"Folgen. Die Eichungsfolgen weisen eine
durchgehende Reihe von Segmenten auf, die von einer belichteten
Reihe flankiert wird. Die Eichungsreihen dienen zwei Zwecken. Zunächst kann
durch Berechnung von mittleren Niveaus über die Reihe das systematische
Abdriften über
die belichtete Reihe fein austariert werden. Des weiteren wird die
Standardabweichung der Eichsegmentreihe dazu benutzt, für die Ermittlung
der zukünftigen
biologischen Effekte eine Schwelle festzusetzen.
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Es
wird angenommen, daß das
Aussetzen der Probe der Strahlung eine nicht-thermische Wirkung entfaltet, die die
Konfiguration/Form der Molekularstruktur und die chemischen Eigenschaften
(beispielsweise Luminiszenz) der Probe verändert. Die Feststellung kann
dazu dienen, einen "Fingerabdruck" für die Probe
zu schaffen. Ein Beispiel kann ein gesundes menschliches Gewebe
sein, das Mikrowellenstrahlung mit gegebenen Spektraleigenschaften
emittiert (eine Funktion der Frequenz, Intenstität, Phase, Polarisation und
Zeit). Sollte jedoch das Gewebe vorkrebsartig (oder krebsartig)
sein, dann können
sich die Spektraleigenschaften ändern.
Die Ermittlung einer derartigen Änderung
bildet eine Möglichkeit
der frühen
Diagnose. Umgekehrt können Krebszellen
auf Bestrahlen mit Mikrowellenstrahlen bestimmter Spektraleigenschaften
reagieren (nicht notwendigerweise bezogen auf jene irgendeiner emittierten
Strahlung), und zwar indem sie den Tod solcher Zellen (Apoptosis)
einleiten, während
die umgebenden gesunden Zellen unberührt bleiben. Die Vorrichtung
kann dazu dienen, experimentell letzteres zu bestimmen und als ein
Forschungswerkzeug zur Errichtung der Existenz der vorherigen beizutragen.
Beispielsweise können
sowohl gesunde als auch durch Krebs befallende Zellen mit einem
luminiszenten (oder fluoreszenten) Protein behaftet werden, und
Proben der einen oder anderen Zellen könnten in die Vorrichtung eingeführt werden.
Die Auswirkung verschiedener Bestrahlungsprogramme könnte durch
Analysierung der Änderung
im Lichtausgang von den entsprechenden Proben bestimmt werden.
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Ein
Verhältnis
zwischen gemessener Lichtintensität am ersten Vorbelichtungsdetektor 810A und der
an jeder Nachbelichtungsdetektorstation gemessenen Luminiszenz der
Segmente läßt sich
erhalten. Dieser Teil des Analysesystems weist ein einzelnes "Vergleichs-"Programm auf, das
kontinuierlich Daten in Arbeitsblatt eingibt. Ein biologischer Aktivitätsindex wird
für jedes
Segment auf der Grundlage einer Abweichung von dem Mittel der Eichungsreihe
errechnet.
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Die
Datenanalyse-Software ermöglicht,
daß das
System auf einer sehr niedrigen Schwelle für einen Kandidaten der biologischen
Wirkungsschwelle arbeitet, typischerweise mit dem zweifachen der Standardabweichung
der Eichungsreihe. Somit arbeiten annähernd 5% der belichteten Segmente
anfänglich
als Kandidat für
biologische Vorfälle.
Wenn ein solcher Vorfall eintritt, wird eine automatische Wiederholung
dieses Teils des steuerbaren Parameterraums bewirkt, und das System
wird unbeschränkt wiederholen.
Auf diese Weise kann das System hohe Empfindlichkeit mit keinen
falschen Einflüssen
kombinieren. Eine Rückkopplungsschleife
wird so gebildet, daß der
Mikrowellen-Synthesegenerator eine immer höhere Frequenzauflösung liefert.
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Es
wird darauf hingewiesen, daß die
Eichungsimpulse in vielerlei Hinsicht wie herkömmliche Kontrollimpulse wirken,
jedoch eine formalere Kontrollbewertung dadurch erhalten werden
kann, daß zufällige Läufe festgesetzt
werden, in denen eine normal belichtete Reihe einer unbelichteten
Kontrolle ausgesetzt wird.
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Diese
statistischen Werte sind auf Diskette geschrieben. Das Programm
für den
Kollimatorkanal 1 (Vorbestrahlungs-Wellenführung) 7 verwendet ebenfalls
die Segmentermittlung zusammen mit der Strömungsgeschwindigkeit, um die
Amplitude und Frequenz der Netzanalyse zu kontrollieren bzw. zu steuern.
Die Ergebnisse können
auf einem Bildschirm von der Betriebsperson gelesen werden, die das
Experiment überwacht,
falls erforderlich und/oder es steht für Zwischenanwendungsfälle bzw. weitere
Arbeitsvorgänge
zur Verfügung.
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Zur
Demonstration der Arbeitskennzeichen der Vorrichtung wurde das natürliche Bioluminiszenzbakterium
Photobacterium Phosphoreum 844 verwendet, das vorher in
Giftermittlungssystemen eingesetzt worden ist. Dieser Prototyp wurde
unter Verwendung eines bakteriell bioluminiszenzbasierten Berichtsystems
des Typs, wie er bei einer ökotoxischen Überwachung
benutzt wird, getestet.
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Die
kontinuierliche Kultur und die analytische Technologie, die in dieser
Anmeldung beschrieben sind, weichen erheblich von anderen Arbeiten
dieser Art ab, und zwar darin, daß sie um eine kontinuierliche
Kulturvorrichtung gebaut sind. Dadurch werden Zellen in einem einheitlichen
physiologischen Zustand zu Testzwecken einer Durchflußbelichtungseinrichtung
zugeführt.
Bakterielle Zellen, die unter Chargenbedingungen wachsen, wachsen
nicht exponentiell, wenn die Ernährungskonzentrationen
beschränkt
sind. Die Anwendung einer kontinuierlichen Kultur ermöglicht,
daß biologisch
variable Werte kontrolliert werden und die Reproduzierbarkeit der
Experimente verbessert wird. Häufig
können
Energiedichte und Umweltvariable sich in Bezug auf eine Testprobe
in einem gleichförmigen
physiologischen Stadium ändern.
Durch Verwendung einer Durchflußvorrichtung
ist es möglich,
Probleme der aufeinanderfolgenden Belichtung einer Testprobe und
sich kumulierende Erwärmungseffekte
zu vermeiden.
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Obgleich
die gesamte Periode einer Lichtemission von Kulturen in der Praxis
etwa 20 Stunden beträgt,
kann die Reaktion leuchtender Bakterien auf toxische Stoffe während dieser
Zeitspanne nicht konstant bleiben. Dazu kommt, daß aufeinander folgendes
Aussetzen der Giftstoffe auch die Leistung des Biosensors beschädigen kann.
Es ist daher erwünscht,
eine kontinuierliche Zufuhr von Bakterien mit konstanten Eigenschaften,
insbesondere konstanter Luminiszenz, mit der oben beschriebenen kontinuierlichen
Kulturvorrichtung zu schaffen, so daß diese ihre Aufgabe erfüllen kann.
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Jedoch
begünstigt
die "nicht-substantielle" Natur von elektromagnetischen
Feldern erhebliche Vorteile, so daß man komplizierende Faktoren
wie beispielsweise Absorption, Verteilung (im Sinne von chemischen
Barrieren wie Zellmembranen), Biotransformation und Eliminierung
ausschließen
kann. Die Probe in der Belichtungskammer wird effektiv in Ruhe gehalten,
wenn die Zellen in einem konsistenten physiologischen Zustand zugeführt werden
und unter bestimmten Bedingungen und Wachstumsgeschwindigkeiten
wachsen. Diese Konfiguration beseitigt gewisse biologische veränderliche
Größen, die
gemeinsam die Analyse einer Zellprobe im Hinblick auf die Sensibilität für einen
speziellen Untersuchungsparameter bestimmen können.
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In
Untersuchungen, die der Überprüfung der Giftigkeit
einer Chemikalie dienten, wird der Begriff "Dosis" verwendet, um die Konzentration und
Zeit zu beschreiben, der die Zellen ausgesetzt sind. Bei der Aussetzung
elektromagnetischer Feldsysteme bezieht sich "Dosis" auf die in einer Probe absorbierte Energie.
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Das
beschriebene System vereinfacht das Management der Energieabgabe
an die analytische Probe. Es ermöglicht
die systematische Forschung im Frequenzbereich für biochemische Wirkungen von
Mikrowellen. Es ermöglicht
die Überwachung des
Pegels eines geeigneten Berichters, beispielsweise der Luminiszenz
oder Fluoreszenz, vor, während
und/oder nach der Mikrowellenbestrahlung. Es ermöglicht außerdem, daß analytische Proben nur einmal
bestrahlt werden, um dadurch kumulative Effekte zu vermeiden. Es
erleichtert die Erforschung jedes relevanten Parameters, und zwar
unabhängig von
den anderen, wie verlangt. Eine oder mehrere radioaktive Quellen
oder Generatoren desselben oder unterschiedlichen Typs lassen sich
mit einem oder mehreren Detektoren einsetzen, um denselben oder verschiedene
Strahlungsarten festzustellen.
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Die
Vorrichtung kann auch eine Probenöffnung (nicht gezeigt) aufweisen,
um die Herausnahme eines Teils von dem Teilstrom zu physikalischen Testzwecken
un abhängig
von dem System zu ermöglichen,
beispielsweise Ausbreiten und Wachsen.
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Die
Vorrichtung kann auch eine Einrichtung zur Feststellung des Zellenstoffwechsels,
der Zellenzusammensetzung, Zellengröße, Zellenanzahl und Zellenvitalität einer
Probe aufweisen, und zwar entweder in dem Probenrohr oder außerhalb
des Rohres.
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Da
die Ergebnisse der Experimente, die unter Verwendung der Vorrichtung
vorgenommen werden können,
möglicherweise
von Personen benötigt werden,
die keinen direkten Zugang zu der Vorrichtung haben, kann ein Kommunikationsnetz
für die Übertragung
der experimentellen Fragen und Ergebnisse Verwendung finden. Dies
kann auf mehrere Weisen aufgebaut werden. So kann beispielsweise eine
Webseite vorgesehen werden, die ein Formblatt zur Vervollständigung
von Details des benutzten Medium-/Medientyps aufweist, ferner erfragt,
welche Messungen verlangt werden, die Eigenschaften der Strahlungsart
oder -arten, der das Medium ausgesetzt werden soll, usw. Diese Details
können
dann über
das Netz an einen Ort übertragen
werden, der mit der Vorrichtung ausgerüstet ist. Das Experiment läßt sich
daraufhin gemäß der Anfrage
durchführen, und
die Ergebnisse können
an die Partei, die die Anfrage über
das Netz gestellt hat, berichtet werden.