DE60224576T2 - Neues peptid sy - Google Patents

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Katsuhiro Yawatahama-shi OSAJIMA
Yasunori Ohzu-shi OOISHI
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Senmi Ekisu Co Ltd Ohzu
Senmi Ekisu Co Ltd
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Senmi Ekisu Co Ltd Ohzu
Senmi Ekisu Co Ltd
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Description

  • Technisches Gebiet, auf das sich die Erfindung bezieht
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Peptide SY und blutdrucksenkende Mittel und blutdrucksenkende funktionelle Nahrungsmittel, in denen Peptid SY zur Blutdrucksenkung verwendet wird. Ferner bezieht sie sich auf das Peptid SY-MD, das in Peptid SY enthalten ist, und ein Verfahren zu dessen Trennung.
  • Stand der Technik
  • Die betreffenden Erfinderentwickelten zuvor erfolgreich das neuen Peptid α-1000 mit einer ACE-Hemmungsaktivität (ACE = Angiotensin I umwandelndes Enzym) durch thermisches Denaturieren von Fischfleisch, Inaktivieren des autolytischen Enzyms, Hydrolysieren des Enzyms mit einer Protease, Inaktivieren des Enzyms und dann Abtrennen des Peptids α-1000, und erhielten bereits ihr Patentrecht ( JP Patent Nr. 3117779 : JP-A-5-271297 ).
  • EP-A-1094071 offenbart das Peptid Val-Tyr und das Peptid Y-2 mit antihypertensiver Aktivität, erhalten nach dem Eluieren des α-1000-Peptids mit 10%iger wässeriger Ethanollösung.
  • Probleme, die die Erfindung lösen soll
  • Mit der Zunahme von Krankheiten, die mit der Lebensweise verbunden sind, ist die neue Entwicklung neuer Komponenten, die wirksam die Auslösung von Hypertension verhindern oder den Blutdruck senken, unter Fachleuten gefragt, und die Erfindung erfüllt die Nachfrage des Standes der Technik.
  • Mittel zum Lösen der Probleme
  • Die betreffenden Erfinder führten Untersuchungen aus verschiedenen Aspekten für den Erhalt des vorgenannten Gegenstandes durch. Folglich fokussierten sich die betreffenden Erfinder erneut auf das ACE-hemmende Peptid α-1000, das von ihnen entwickelt wurde, und führten gewissenhafte Studien an verschiedenen Fraktionen durch. Infolgedessen fanden sie zum ersten Mal heraus, daß eine Fraktion mit einem höheren Gehalt an Dipeptid Val-Tyr eine höhere ACE-Hemmungsaktivität zeigt, und identifizierten, daß dieses Val-Tyr eine der Hauptkomponenten der blutdrucksenkenden Peptide ist.
  • Auf der Grundlage der vorhergehenden neuen nützlichen Ergebnisse entschieden sie, ein neues Gemisch aus Peptiden frisch zu entwickeln, das nicht nur einen hohen Val-Tyr-Gehalt, sondern ebenso weniger Bitterkeit aufweist und ausgezeichneten Geschmack und Stabilität zeigt, und führten ein Verfahren durch, bei dem ein Gemisch aus Peptiden (nämlich Peptid α-1000), erhalten durch Verarbeiten von Fischfleisch mit einer Protease, mit einem Peptid-adsorbierenden Harz (ODS-Harz) behandelt und einer Dreistufenelution, nämlich: Wasserelution, Flution mit einer wäßrigen Ethanollösung und Wasserelution, unterzogen wird. Infolgedessen erlangten sie die neue nützliche Erkenntnis, daß das meiste von Val-Tyr in Fischfleischpeptiden in der letzten Fraktion der ersten Wasserelution, der Fraktion der Flution von 11 bis 18% v/v wäßriger Ethanollösung und der Fraktion der letzten Wasserelution gewonnen wird.
  • Zu diesem Zweck wird ein Peptid, genannt SY, mit den folgenden physikochemischen Eigenschaften bereitgestellt:
    • (A) Molekulargewicht: 200 bis 10.000 (gemessen mit Hochleistungsflüssigchromatographie: ASAHIPAK GS-320),
    • (B) Schmelzpunkt: verfärbt und zersetzt bei 138 ± 3°C
    • (C) Löslichkeit in Lösungsmitteln: leicht löslich in Wasser, aber nahezu unlöslich in Ethanol, Aceton und Hexan,
    • (D) Erscheinung: weißes oder blaßgelbes Pulver,
    • (E) Flüssiger Zustand (pH): 4,0 bis 6,0
    • (F) Komponenten: Wasser 1 bis 5% w/w (Normaldruck, Wärmetrocknungsverfahren), Protein 84 bis 94% w/w (Mikro-Kjedahlverfahren), Lipid 0,5% w/w oder weniger (Soxhlet-Extraktionsverfahren), Asche 4 ± 2% w/w (Direktveraschungsverfahren), Na 1 bis 3% w/w (Atomabsorptionsspektroskopie)
    • (G) Physiologische Eigenschaften: enthaltend das Dipeptid Val-Tyr und mit einer ACE-Hemmungsaktivität,
    • (H) Infrarot-Absorptionsspektrum: 3
    • (I) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: 4.
  • Bevorzugt wird das Peptid SY durch das Sammeln und das Mischen von Peptidkomponenten hergestellt, welche aus einer Elutionsfraktionierung einer Peptidlösung mit einem Peptid-adsorbierenden Harz unter Verwendung von Wasser, einer wäßrigen Ethanollösung und Wasser in dieser Reihenfolge als Eluenten der Elutionsfraktionierung resultieren, in welcher die Peptidkomponenten in einem in 1 gezeigten Elutionsmuster eine letzte Fraktion der Wasserelution (1), eine Fraktion der 11 bis 18% v/v Ethanolelution und eine Fraktion der Wasserelution (2) sind, erhalten durch die entsprechenden nachstehend definierten Eluenten:
    • (1) letzte Fraktion der Wasserelution (1): Fraktion, erhalten unter Verwendung von Wasser als ein Eluent ab einem Zeitpunkt, ab dem ein Natrium (Na)-Gehalt der gesamten Flutions-Peptid-Fraktion (Peptid SY) von 1 bis 3 g/100 g beträgt, bis zu einem Sammelzeitpunkt der letzten Fraktion in der Wasserelution (1), ab dem der Natriumgehalt im Wesentlichen 0 g/100 g beträgt.
    • (2) Fraktion der Ethanolelution: Fraktion, als nächstes erhalten unter Verwendung der wäßrigen Ethanollösung mit einer Konzentration von 11 bis 18% v/v als ein Eluent, bis eine Menge an eluiertem Peptid hinter einem Peak liegt und bis annähernd zur Hälfte des Peaks reduziert ist.
    • (3) Fraktion der Wasserelution (2): Fraktion, danach erhalten unter Verwendung von Wasser als ein Eluent, bis die Elutionsfraktionierung vollständig ist.
  • Bevorzugt wird Peptid SY unter Verwendung einer wäßrigen Lösung von Peptid α-1000 hergestellt, welches von Fischfleisch abgeleitet ist und die folgenden physikochemischen Eigenschaften als eine Peptidlösung aufweist:
    • (a) Molekulargewicht: 200 bis 10.000 (gemessen mit Sephadex G25 Säulenchromatographie),
    • (b) Schmelzpunkt: verfärbt bei 119°C (Zersetzungspunkt),
    • (c) Spezifisches Drehvermögen: [α]D 20 = –22°,
    • (d) Löslichkeit in Lösungsmitteln: leicht löslich in Wasser, aber nahezu unlöslich in Ethanol, Aceton und Hexan,
    • (e) Aufteilung in sauren, neutralen oder basischen Charakter: neutral,
    • (f) Erscheinung, Komponenten: weißes Pulver, Wasser, 5,14% (verringerter Druck, Wärmetrocknungsverfahren), Protein 87,5% (Kjeldahlverfahren mit einem Stickstoff/Protein-Umwandlungskoeffizienten von 6,25), Lipid 0% w/w (Soxhlet-Extraktionsverfahren), Asche 5,0% (Direktveraschungsverfahren),
    • (g) Charakteristik: Gemisch von Peptiden, welche von Fischfleisch abgeleitet sind und durch Erwärmen des Fischfleisches zur Deaktivierung seines autolytischen Enzyms und Hydrolysieren des resultierenden Fleisches mit einer Protease erhalten sind.
  • Die Erfindung bezieht sich ebenso auf ein blutdrucksenkendes Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Peptid SY, wie oben definiert, als einen aktiven Bestandteil enthält.
  • Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein blutdrucksenkendes funktionelles Nahrungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß das Nahrungsmittel Peptid SY, wie oben definiert, ist oder dieses Peptid SY enthält.
  • Geeigneterweise liegt das obige Nahrungsmittel der flüssigen oder der festen Form vor.
  • Daher wurde bestätigt, daß ein Gemisch aus der letzten Fraktion der ersten Wasserelution, der Fraktion der Flution von 11 bis 18% v/v wäßriger Ethanollösung und der Fraktion der letzten Wasserelution ein komplett neues blutdrucksenkendes Gemisch aus Peptiden ist, das nicht nur einen hohen Val-Tyr-Gehalt, sondern ebenso weniger Bitterkeit aufweist und ausgezeichneten Geschmack und ebenso Stabilität zeigt. Dies wurde als neues Gemisch aus Peptiden identifiziert und hier als Peptid SY bezeichnet.
  • Ferner wurde in der Erfindung nur die Fraktion der Flution von 11 bis 18% v/v wäßriger Ethanollösung isoliert und untersucht. Dann wurde ein neues Gemisch aus Peptiden mit einem ziemlich niedrigen Na-Gehalt von 0,1 bis 0,2% (in Peptid SY beträgt der Na-Gehalt 1 bis 3%) erhalten, und diese Fraktion wurde als Peptid SY-MD bezeichnet.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine graphische Darstellung eines Peptid SY-Elutionsmusters in Beispiel 1.
  • 2 zeigt das Molekulargewicht (MW) von Peptid SY.
  • 3 zeigt ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Peptid SY.
  • 4 zeigt ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Peptid SY.
  • 5 zeigt ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Peptid α-1000.
  • 6 zeigt ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Peptid α-1000.
  • 7 zeigt ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum von Peptid SY-MD. (Peptid SY-MD wird als „Peptid SY-Peptid Y-2 in 1 bezeichnet)
  • 8 zeigt ein Infrarot-Absorptionsspektrum von Peptid SY-MD.
  • In der Erfindung wurden für die kontinuierliche Gewinnung eines Gemisches aus Peptiden mit einem so hohen Val-Tyr-Gehalt wie möglich unter Verwendung von Peptid α-1000 als Ausgangsmaterial durchgeführt.
  • Folglich wird nach der Behandlung von Peptid α-1000 mit einem ODS-Harz ein Teil einer Fraktion (letzte Fraktion), eluiert unter Zugabe von Wasser, erhalten, und eine Fraktion, eluiert unter Zugabe einer wäßrigen Ethanollösung, wurde dann danach erhalten. An diesem Punkt wurde herausgefunden, daß, da ein Teil des Wassers, das in der Wasserelution (1) verwendet wird, zurückbleibt, die Ethanolkonzentration 11 bis 18% v/v, bevorzugt von 14 bis 16% v/v, beträgt.
  • Ferner wurden beim Erhalt von Peptid SY die Zeit des Beginns der Sammlung beim Sammeln der beabsichtigten letzten Fraktion der Wasserelution (1), die Zeit des Beendens dieser (nämlich die Zeit des Beginns der Flution der wäßrigen Ethanollösung) und die Zeit des Beendens der Flution der wäßrigen Ethanollösung (Zeit des Beginns der Wasserelution (2)) und die Zeit des Beendens der Wasserelution (2) durch Messen oder Überwachen der Fraktionierungszeit, des Salzgehalts, der Bx- und UV-Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm spezifiziert bzw. bewertet, um ein Verfahren zur Herstellung von Peptid SY durch ein bestimmtes kontinuierliches System zu etablieren. Auf der Grundlage dieser nützlichen neuen Ergebnisse wurden weitere Studien durchgeführt. Schließlich wurde die Erfindung vervollständigt.
  • Die physikochemischen Eigenschaften von Peptid SY der Erfindung sind nachstehend gezeigt.
  • Physikochemische Eigenschaften von Peptid SY
    • (A) Molekulargewicht: 200 bis 10.000 (gemessen mit Hochleistungsflüssigchromatographie: ASAHIPAK GS-320), 2,
    • (B) Schmelzpunkt: verfärbt und zersetzt bei 138 ± 3°C,
    • (C) Löslichkeit in Lösungsmitteln: leicht löslich in Wasser, aber nahezu unlöslich in Ethanol, Aceton und Hexan,
    • (D) Erscheinung: weißes oder blaßgelbes Pulver,
    • (E) Flüssiger Zustand (pH): 4,0 bis 6,0
    • (F) Komponenten: Wasser 1 bis 5% w/w (Normaldruck, Wärmetrocknungsverfahren), Protein 84 bis 94% w/w (Mikro-Kjeldahlverfahren), Lipid 0,5% w/w oder weniger (Soxhlet-Extraktionsverfahren), Asche 4 ± 2% w/w (Direktveraschungsverfahren),
    • (G) Physiologische Eigenschaften: enthaltend das Dipeptid Val-Tyr und mit einer ACE-Hemmungsaktivitt,
    • (H) Infrarot-Absorptionsspektrum: 3,
    • (I) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: 4,
    • (J) spezifisches Drehvermögen: [α]D 20 = –40° bis –51°.
  • Das Peptid SY der Erfindung wird folgendermaßen hergestellt.
  • Das heißt, das Peptid SY wird durch das Sammeln und das Mischen von Peptidkomponenten hergestellt, welche aus einer Elutionsfraktionierung einer Peptidlösung mit einem Peptid-adsorbierenden Harz unter Verwendung von Wasser, einer wäßri gen Ethanollösung und Wasser in dieser Reihenfolge als Eluenten der Elutionsfraktionierung resultieren, in welcher die Peptidkomponenten in einem in 1 gezeigten Elutionsmuster eine letzte Fraktion der Wasserelution (1), eine Fraktion der 11 bis 18% v/v Ethanolelution (Flution mit 15% v/v wäßriger Ethanollösung wird in 1 gezeigt) und eine Fraktion der Wasserelution (2) sind, erhalten durch die entsprechenden nachstehend definierten Eluenten:
    • (1) letzte Fraktion der Wasserelution (1): Fraktion, erhalten unter Verwendung von Wasser als ein Eluent ab einem Zeitpunkt, ab dem ein Natrium (Na)-Gehalt des Peptids (Peptid SY) in der Wasserelution (1) von 1 bis 3 g/100 g beträgt, bis zu einem Sammelzeitpunkt der letzten Fraktion in der Wasserelution (1), ab dem der Natriumgehalt im Wesentlichen 0 g/100 g beträgt,
    • (2) Fraktion der 11 bis 18% v/v Ethanolelution: Fraktion, als nächstes erhalten unter Verwendung der wäßrigen Ethanollösung mit einer Konzentration von 11 bis 18% v/v als ein Eluent, bis eine Menge an eluierten Peptiden hinter einem Peak liegt und bis annähernd zur Hälfte des Peaks reduziert ist (nur diese Fraktion wird isoliert und als Peptid SY-MD bezeichnet),
    • (3) Fraktion der Wasserelution (2): Fraktion, danach erhalten unter Verwendung von Wasser als ein Eluent, bis die Elutionsfraktionierung vollständig ist.
  • Das Peptide α-1000, das ein Ausgangsmaterial von Peptid SY der Erfindung ist, wird nachstehend beschrieben.
  • Das Peptid α-1000 wird unter Verwendung von Fischen und Schalentieren als Rohmaterialien hergestellt. Beispielsweise kann es gemäß dem Patent Nr. 3117779 hergestellt werden. Zunächst werden Fische und Schalentiere in Fleischsammlern, Entgrätern oder dergleichen verarbeitet, um ihr Fleisch abzulösen. Es ist wünschenswert, daß die Rohmaterialien so frisch wie möglich sind. Das getrennte Fischfleisch wird zerkleinert und in mehrere Klumpen von zerkleinertem Fischfleisch mit einem Gewicht von jeweils ungefähr 10 kg geteilt und diese Fleischklumpen können als solche der nächsten Behandlung unterzogen werden. Es ist ebenso ratsam, daß sie schnell mit einem Spray aus kalter Luft zwischen –20 und –50°C, beispielsweise ungefähr –30°C, gefroren und bei zwischen –20 und –25°C gelagert werden, und sie werden bei Bedarf verwendet.
  • Als die Fische und Schalentiere können Fische mit rotem Fleisch, wie Sardine, Saurel, Thunfisch, Bonito, Makrelenhecht und Makrele, Fische mit weißem Fleisch, wie Flunder, Goldbrasse, Sillaginoid, Gizzard Shad, Dorsch, Hering und Yellowtail, Knorpelfische, wie Hai und Rochen, Frischwasserfische, wie Teichstint, Karpfen, Rotforelle und „Yamame" (eine Art Forelle), und Tiefseefische, wie Granulose und Anglerfisch, Garnele, Krabbe, Oktopus, Mysidacea und dergleichen, geeigneterweise verwendet werden.
  • Das gesammelte Fisch- und Schalentierfleisch wurde mit einem Fleischwolf oder dergleichen zerkleinert, und Wasser wurde in einer Menge des %- bis 20fachen, bevorzugt des 1- bis 10fachen des Rohmaterials, bezogen auf das Gewicht, zugegeben. Dann wurde dies wärmebehandelt, um dadurch das autolytische Enzym zu deaktivieren, Bakterien abzutöten und das Protein thermisch zu denaturieren, wodurch die Wirksamkeit der anschließenden enzymatischen Reaktion erhöht wurde. Als Erwärmungsbedingungen können jegliche Bedingungen verwendet werden, so lange wie diese Funktionen hervorgebracht werden. Beispielsweise sind die Bedingungen 65°C oder mehr und 2 bis 60 Minuten, bevorzugt 80°C oder mehr und 5 bis 30 Minuten.
  • Dann wurde ein alkalisches Mittel wie wäßriger Ammoniak oder eine wäßrige Lösung aus Natrium- (Kalium-)hydroxid zugegeben, um den pH auf einen entsprechenden Wert einer Protease, die verwendet werden soll, einzustellen (beispielsweise pH von 7,5 oder mehr, bevorzugt 8 oder mehr für eine Alkaliprotease). Das Fleisch wird bei einer Temperatur, die für ein Enzym geeignet ist, erhitzt (sie variiert mit dem Enzym, das verwendet werden soll, aber beträgt 20 bis 65°C; 35 bis 60°C, bevorzugt 40 bis 55°C für eine Alkaliprotease), und unter Zugabe einer Protease für 30 Minuten bis 30 Stunden behandelt (30 Minuten bis 25 Stunden, bevorzugt 1 bis 17 Stunden für eine Alkaliprotease).
  • Enzyme, die ein Protein bei neutralen oder alkalischen Bedingungen abbauen können, können alle als eine Protease entweder einzeln oder in Kombination verwendet werden. Proteasen können nicht nur von Tieren und Pflanzen abgeleitet werden, sondern ebenso von Mikroorganismen. Pepsin, Renin, Trypsin, Chymotrypsin, Papain und Bromelain sowie bakterielle Proteasen, filamentöse Proteasen, aktinomyzetische Proteasen und dergleichen können weitgehend verwendet werden. Diese Enzyme sind im allgemeinen auf dem Markt erhältlich. In Abhängigkeit ihrer Zwecke können ungereinigte Enzyme und feste oder flüssige Enzym-enthaltende Substanzen wie Enzym-enthaltende Kulturen und Koji ebenso verwendet werden. Die Menge des Enzyms, das zugegeben werden soll, kann zwischen 0,1% und 5,0% liegen.
  • Wenn erforderlich, wird das Fleisch neutralisiert, und dann bei einer Temperatur von 70°C (bevorzugt 80°C) oder mehr für 2 bis 60 Minuten (bevorzugt 5 bis 30 Minuten) gehalten, um das Enzym zu deaktivieren und die anschließende Trennung zu erleichtern. Nach der Deaktivierung durch Erhitzen werden grobe Verunreinigungen mit einem Vibrosieb oder dergleichen getrennt, und das resultierende Produkt wird mit Jector, wenn erforderlich, behandelt, und dann einer Ultrazentrifugation unterzogen, um die schwimmenden Verunreinigungen und die ausgefällten Verunreinigungen zu entfernen.
  • Dann wird das Produkt unter Verwendung eines Filterhilfsmittels aus Diatomeenerde oder dergleichen (beispielsweise Celite) filtriert und das Filtrat mit Aktivkohle verarbeitet (in einer Menge von 0,05 bis 20% w/v, bevorzugt 0,1 bis 10% w/v; 20 bis 65°C, bevorzugt 25 bis 60°C; 15 Minuten bis 4 Stunden, bevorzugt 30 Minuten bis 2 Stunden), um es geruchlos zu machen, zu entfärben und zu reinigen.
  • Dieses Produkt wird in einer üblichen Weise konzentriert (bis ungefähr 30 Bx), beispielsweise unter reduziertem Druck (von 0 bis 50°C). Wenn erforderlich, wird dieses dann erneut einer (Ultra)zentrifugation oder Filtration unterzogen, um eine Peptidlösung zu erhalten. Die so erhaltene Peptidlösung wird sterilisiert (durch UHTST (Ultrahocherhitzungskurzzeit, eine Art Sterilisator) oder in irgendeiner anderen üblichen Weise), und dann in Behälter gefüllt, wodurch ein Produkt (α-1000 (flüssig)) bereitgestellt wird. Wenn erforderlich, kann dieses ebenso weiter konzentriert oder eher verdünnt werden, oder kann zu einem Pulverprodukt von 60-Mesh oder so in einer üblichen Weise, beispielsweise durch Sprühtrocknen oder Gefriertrocknen, pulverisiert werden, und das Pulver kann in Behälter, wie Beutel, verpackt werden, um ein Produkt (α-1000 (Pulver)) bereitzustellen. Von diesen Produkten wird das flüssige Produkt gekühlt oder eingefroren und gelagert, und das Pulverprodukt wird an einem trockenen, kalten, dunklen Platz gelagert.
  • Das so erhaltene flüssige, pastenartige oder pulverförmige Peptid ist α-1000.
  • Die physikochemischen Figenschaften von Peptid α-1000 (sprühgetrocknetes Pulver) sind nachstehend gezeigt.
  • Physikochemische Eigenschaften von Peptid α-1000 (Pulver)
    • (A) Molekulargewicht: 200 bis 10.000 (gemessen mit Sephadex G25 Säulenchromatographie),
    • (B) Schmelzpunkt: verfärbt bei 119°C (Zersetzungspunkt),
    • (C) Spezifisches Drehvermögen: [α]D 20 = –22°
    • (D) Löslichkeit in Lösungsmitteln: leicht löslich in Wasser; aber nahezu unlöslich in Ethanol, Aceton und Hexan,
    • (E) Aufteilung in sauren, neutralen oder basischen Charakter: neutral, pH von 6,0 bis 8,0 (10%ige wäßrige Lösung),
    • (F) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: 5,
    • (G) Infrarot-Absorptionsspektrum: 6,
    • (H) Erscheinung, Komponenten: weißes Pulver, Wasser 5,14% (reduzierter Druck, Wärmetrocknungsverfahren); Protein 87,5% (Kjeldahlverfahren mit einem Stickstoff/Protein-Umwandlungskoeffizienten von 6,25); Lipid 0% (Soxhlet-Extraktionsverfahren); Asche 5,0% (Direktveraschungsverfahren),
    • (I) Charakteristik: Gemisch von Peptiden, welche von Fischfleisch abgeleitet sind und durch Erwärmen des Fischfleisches zur Deaktivierung seines autolytischen Enzyms und Hydrolysieren des resultierenden Fleisches mit einer Protease erhalten werden,
    • (J) Zusammensetzung von Aminosäuren; wie nachstehend gezeigt.
    Punkte im analytischen Test alle Aminosäuren Ergebnisse (%)
    Arginin 3,34
    Lysin 6,86
    Histidin 3,34
    Phenylalanin 2,33
    Tyrosin 2,01
    Leucin 6,35
    Isoleucin 3,27
    Methionin 2,26
    Valin 4,16
    Alanin 5,17
    Glycin 3,59
    Prolin 2,15
    Glutaminsäure 12,35
    Serin 3,30
    Threonin 3,70
    Asparaginsäure 8,36
    Tryptophan 0,32
    Cystin 0,47
    Gesamtmenge 73,33
  • Analytisches Verfahren: Gemessen durch ein automatisches Aminosäure-Analyseverfahren (vorausgesetzt, daß Cystin durch Oxidation mit Perameisensäure und dann Hydrolyse mit Salzsäure gemessen wurde. Tryptophan wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie gemessen).
  • Das so erhaltene Peptid α-1000 wird auf ein Peptid-adsorbierendes Harz, wie ein ODS-Harz oder dergleichen, direkt aufgetragen, wenn flüssig, oder nach der Zugabe von Wasser, wenn pulverförmig, um die „Lösungsladung" durchzuführen, gezeigt in
  • 1. Nebenbei sind in bezug auf das Harz alle Typen von Harzen verfügbar, so lange wie sie Peptid-adsorbierende Harze sind. Beispielsweise werden verschiedene ODS-Harze, YMC ODS-AQ 120-S50 (Marke) und ein hydrophobes adsorbierendes Harz SEPABEADS SP207 (Marke für ein Produkt von Mitsubishi Chemical Corporation), wenn erforderlich, verwendet.
  • Infolge der Studien aus verschiedenen Aspekten bezüglich eines Gemisches aus Peptiden, die einen hohen Val-Tyr-Gehalt und wenig Bitterkeit aufweisen und ausgezeichneten Geschmack und Stabilität zeigen, unter drucksenkenden Gemischen von Peptiden (beispielsweise α-1000), gebildet durch Verarbeiten von Fischfleisch mit einer Protease, hatte die Erfindung zum ersten Mal Erfolg beim Sammeln der beabsichtigten Fraktionen aus den vorhergehenden verschiedenen Fraktionen und Mischen dieser. Das neue drucksenkende Gemisch von Peptiden, das so durch Sammeln und Mischen der Fraktionen gebildet wird, wurde als Peptid SY bezeichnet.
  • Das Peptid SY kann durch Sammeln der Fraktionen aus den vorhergehenden eluierten Fraktionen hergestellt werden. Ein Beispiel eines Elutionsmusters der Eluate ist in 1 gezeigt.
  • Das Peptid SY gemäß der Erfindung kann, wie in 1 gezeigt, durch Zugeben von beispielsweise α-1000 zu dem Peptid-adsorbierenden Harz (Lösungsladung), dann Durchführen der Flution mit Wasser (Wasserelution (1)) und Mischen einer letzten Fraktion der Wasserelution (1), einer Fraktion einer 11 bis 18% v/v Ethanolelution, die mit einer 11 bis 18% v/v wäßrigen Ethanollösung eluiert wird, und einer Fraktion einer Wasserelution (2), die mit Wasser eluiert wird, hergestellt werden. Der Zeitpunkt für den Beginn der Sammlung der Peptid-SY-Fraktion und die Zeitpunkte zum Verändern der Eluenten kann auf der Basis von mindestens einem gemessenen Wert von Bx, dem Salzgehalt, UV (Absorption bei 280 nm) und Na oder auf der Basis der Fraktionierungszeit bestimmt werden. Es ist ebenso möglich, diese Punkte in Echtzeiten genau zu überwachen und die Bestimmungen mit einem Computer durchzuführen.
  • Beispielsweise kann in dem Elutionsmuster von 1 eine Zeit für den Beginn der Fraktionierung für die letzte Fraktion der Wasserelution (1) von Peptid SY folgendermaßen durch Messen des Werts des Salzgehalts bestimmt werden.
    • i) Wenn die Fraktion von Minute 0 nach Beginn der Wasserelution gesammelt wird, wird der Na-Gehalt mehr als 4 g/100 g betragen. Daher ist ein Material mit einem hohen Na-Gehalt aus Sicht eines blutdrucksenkenden Mittels unerwünscht.
    • ii) Wenn die Sammlung nach 20 Minuten ab dem Beginn der Wasserelution durchgeführt wird, beträgt der zulässige Bereich des Na-Gehalts 1 bis 3 g/100 g.
    • iii) Wenn die Sammlung nach dieser Zeit beginnt, verringert sich der Na-Gehalt weiter, aber der Salzgehalt ist zu niedrig. Folglich wird wahrscheinlich Guanin, das in Peptid SY enthalten ist, in der Konzentration ausgefällt, und Verunreinigungen werden manchmal gebildet, was unerwünscht ist.
    • iv) Folglich beginnt die Sammlung nach 20 Minuten ab dem Beginn der Wasserelution und der Na-Gehalt beträgt ungefähr 1 bis 3 g/100 g.
  • Eine Endzeit des Sammelns der Fraktion der Wasserelution (1) ist eine Zeit, ab der der Na-Gehalt im Wesentlichen 0 g/100 g beträgt.
  • Dann wird ab dieser Zeit die 11 bis 18% v/v wässerige Ethanollösung anstelle von Wasser zugegeben. Wenn die Menge des eluierten Peptids hinter einem Peak liegt und bis annähernd zur Hälfte des Peaks reduziert ist, wird die Zugabe der wäßrigen Ethanollösung gestoppt, und die hier erhaltene Fraktion wird als eine Fraktion der 11 bis 18% v/v Ethanolelution bezeichnet. (Nur die Fraktion der 11 bis 18% v/v Ethanolelution wird isoliert und wird zu Peptid SY-MD, das beinah frei von Na ist).
  • Es ist ratsam, daß eine Zeit, ab der die Zugabe der 11 bis 18% v/v wäßrigen Ethanollösung gestoppt wird und die Zugabe von Wasser verändert wird, eine Zeit ist, ab der die Wasserelution (2) beginnt, aber der UV-Absorptionswert bei einer Wellenlänge von 280 nm, der die gesamte Peptidmenge zeigt, sich abrupt verringert und annähernd die Hälfte des Peaks erreicht, und daß eine Endzeit eine Zeit ist, ab der die UV-Absorptionswerte null erreichen, wodurch ein stationärer Zustand erreicht wird. Die hier erhaltene Fraktion wird als Fraktion der Wasserelution (2) bezeichnet.
  • Das Produkt, hier erhalten durch Sammeln (1) der letzten Fraktion der Wasserelution (1), (2) der Fraktion der 11 bis 18% v/v Ethanolelution und (3) der Fraktion der Wasserelution (2), entweder separat oder kontinuierlich, und deren Mischen, ist das Peptid SY der Erfindung.
  • Daher kann die Fraktion, einschließlich der letzten Fraktion, gebildet während der Fraktionierung für die Fraktion der Wasserelution (1), der Fraktion der 11 bis 18% v/v Ethanolelution und der Fraktion der Wasserelution (2) in dieser Reihenfolge, als Peptid SY gemäß der Erfindung erhalten werden (ausgedrückt als Sardinen-Peptid SY in 1).
  • Ferner entspricht die „15% Ethanolelution", gezeigt in 1, dem Peptid SY-MD.
  • Das Peptid SY enthält ein Dipeptid (Valyl-Tyrosin; hierin nachstehend manchmal als Val-Tyr oder VY bezeichnet), welches die betreffenden Erfinder zum ersten Mal als eine der Hauptkomponenten von blutdrucksenkenden Peptiden bei einer hohen Konzentration bestätigten (VY-Gewinnungsrate: wenn sie als 100% in α-1000 bewertet wird, beträgt sie 90 bis 95% in SY, während sie 65 bis 75% in SY-MD beträgt), und zeigt nicht nur eine ziemlich hohe ACE-Hemmungsaktivität, sondern ebenso einen stark verbesserten Geschmack. Da das Peptid SY-MD frei von der letzten Fraktion der Wasserelution (1) ist, bleibt jedoch Bitterkeit zurück. Da es beinah frei von Natrium ist, wird ein nützliches blutdrucksenkendes Mittel für die bereitgestellt, die kein Natrium einnehmen können.
  • Das heißt, der Anteil der „Lösungsladung" zeigt einen starken Geschmack, aber weist leichten Fischgeruch, der aus dem Rohmaterial stammt, und einen hohen Na-Gehalt auf. Trotzdem wird die letzte Fraktion der Wasserelution (1) in bezug auf Fischgeruch, der aus dem Rohmaterial stammt, verringert und weist einen ziemlich guten Geschmack auf.
  • Folglich kann durch Einführen der letzten Fraktion der Wasserelution (1) ein Peptidmaterial „Peptid SY", aus dem VY in einer großen Menge gewonnen werden kann und ausgezeichneten Geschmack und Stabilität im Vergleich zu Peptid SY-MD aufweist, erhalten werden.
  • Außerdem werden eine blutdrucksenkende Aktivität sowie Funktionen, wie Calcium- oder Ionenabsorptions-beschleunigende Funktion, eine cholesterinsenkende Funktion und eine Blutzuckerspiegel-senkende Funktion, in Peptid SY oder Peptid SY-MD bestätigt.
  • Die physikochemischen Eigenschaften von Peptid SY sind folgendermaßen.
  • Physikochemische Eigenschaften von Peptid SY
    • (A) Molekulargewicht: 200 bis 10.000 (2),
    • (B) Schmelzpunkt: verfärbt und zersetzt bei 138 ± 3°C,
    • (C) Löslichkeit in Lösungsmitteln: leicht löslich in Wasser, aber nahezu unlöslich in Ethanol, Aceton und Hexan,
    • (D) Erscheinung: weißes oder blaßgelbes Pulver,
    • (E) flüssiger Zustand (pH): 4,0 bis 6,0,
    • (F) Komponenten: Wasser 1 bis 5% w/w (Normaldruck, Wärmetrocknungsverfahren) Protein 84 bis 94% w/w (Micro-Kjeldahlverfahren) Lipid 0,5% w/w oder weniger (Soxhlet-Extraktionsverfahren) Asche 4 ± 2% w/w (Direktveraschungsverfahren) Na 1 bis 3% w/w (Atomabsorptionsspektroskopie),
    • (G) Physiologische Eigenschaften: enthaltend das Dipeptid Val-Tyr und mit einer ACE-Hemmungsaktivität,
    • (H) Infrarot-Absorptionsspektrum: 3,
    • (I) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: 4,
    • (J) spezifisches Drehvermögen: [α]D 20 = –40° bis –51°,
    • (K) ACE-Hemmungsaktivitätswert (IC50): 200 μg/ml oder weniger (gemessen durch ein Cushman-Modifikationsverfahren),
    • (J) Zusammensetzung der Hauptaminosäuren
    Aminosäuren analytischer Wert (%)
    Asparaginsäure 8,0 bis 9,2
    Glutaminsäure 9,5 bis 12,0
    Valin 4,5 bis 5,5
    Methionin 2,5 bis 3,8
    Isoleucin 4,5 bis 5,2
    Leucin 7,3 bis 8,5
    Tyrosin 3,4 bis 4,8
    Phenylalanin 4,5 bis 5,5
    Histidin 3,0 bis 3,8
    Lysin 6,5 bis 7,8
    Arginin 5,0 bis 6,0
    • (analytisches Verfahren: gemessen durch ein automatisches Aminosäure-Analyse-Verfahren)
  • Ferner sind die physikochemischen Eigenschaften von Peptid SY-MD folgendermaßen.
  • Physikochemische Eigenschaften von Peptid SY-MD
    • (A) Molekulargewicht: 200 bis 10.000,
    • (B) Schmelzpunkt: verfärbt und zersetzt bei 138 ± 3°C,
    • (C) Löslichkeit in Lösungsmitteln: leicht löslich in Wasser, aber nahezu unlöslich in Ethanol, Aceton und Hexan,
    • (D) Erscheinung: weißes oder hellgelbes Pulver,
    • (E) flüssiger Zustand (pH): 4,0 bis 6,0,
    • (F) Komponenten: Wasser 2 bis 6% w/w (Normaldruck, Wärmetrocknungsverfahren), Protein 90 bis 98% w/w (Micro-Kjeldahlverfahren), Lipid 0,5% w/w oder weniger (Soxhlet-Extraktionsverfahren), Asche 3,0% w/w oder weniger (Direktveraschungsverfahren), Na 0,1 bis 0,2% w/w (Atomabsorptionsspektroskopie),
    • (G) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: 7,
    • (H) Infrarot-Absorptionsspektrum: 8.
  • Peptid SY und Peptid SY-MD gemäß der Erfindung sind neue Peptidgemische, die bisher unbekannt waren. Sie zeigen eine ausgezeichnete blutdrucksenkende Aktivität, und sind hinsichtlich der Sicherheit nicht problematisch. Folglich können sie ebenso als ein Gemisch aus Peptiden für ein blutdrucksenkendes Mittel oder Nahrungsmittel zur spezifizierten gesundheitlichen Verwendung, um den Blutdruck zu senken, verwendet werden. Deshalb können das Peptid SY und das Peptid SY-MD als Nahrungsmittel oder Tierfutterzusätze, wie Würze und Nahrungsergänzungsstoffe, verwendet werden, und können ebenso aufgrund der vorhergehenden speziellen physiologischen Aktivitäten als Medikamente oder als Infusionen, Gesundheitskost und Nahrungsergänzungsstoffe zur klinischen Verwendung, um hypertensiven Störungen vorzubeugen oder diese zu behandeln, weitgehend verwendet werden.
  • Peptid SY und Peptid SY-MD können, wenn als Nahrungsmittel verwendet, entweder als solche oder in Kombination mit anderen Nahrungsmitteln oder Nahrungsmittelinhaltsstoffen in einer üblichen Weise, wenn erforderlich, zugegeben werden. Ferner können das Peptid SY und Peptid SY-MD entweder oral oder parenteral verabreicht werden, wenn sie als Medikamente verwendet werden. Bei der oralen Verabreichung können das Peptid SY und das Peptid SY-MD zu beispielsweise Tabletten, Körnchen, Partikeln, Kapseln, Pulvern oder Drinks in einer üblichen Weise formuliert werden. Bei der parenteralen Verabreichung können das Peptid SY und das Peptid SY-MD als Injektionen, Tröpfchen, Zäpfchen oder dergleichen verwendet werden.
  • Die Erfindung wird in bezug auf das Referenzbeispiel und die Beispiele nachstehend spezieller dargestellt.
  • Referenzbeispiel
  • Frische Sardinen wurden in einem Entgräter verarbeitet, um das Fleisch zu sammeln. Das gesammelte Fleisch wurde zerkleinert und in mehrere Klumpen von zerkleinertem Fleisch mit einem Gewicht von jeweils 10 kg geteilt, und diese Fleischklumpen wurden schnell bei –30°C oder weniger eingefroren. Jeder Fleischklumpen wurde dann in einer Mühle zermahlen, und dieselbe Menge Wasser wurde dann dazugegeben. Das Gemisch wurde in einen Tank gegeben, und bei 100°C für zugegeben. Das Gemisch wurde in einen Tank gegeben, und bei 100°C für 10 Minuten erhitzt, um das autolytische Enzym zu deaktivieren und das Fleisch thermisch zu denaturieren. Anschließend wurde wässeriger Ammoniak zugegeben, um den pH auf 9,5 einzustellen.
  • Eine 0,1%ige Lösung eines kommerziell erhältlichen Alkaliproteaseproduktes wurde zugegeben, und das Fleisch wurde bei 50°C für 17,5 Stunden gehalten, um die Zersetzung mit dem Enzym durchzuführen. Dann wurde dieses für 15 Minuten gekocht, um das Enzym zu deaktivieren.
  • Dies wurde durch ein Vibrosieb (150 Mesh) geführt, durch Jector bei 5.000 U/min behandelt und dann in einem Sharpless-Zentrifugalabscheider (15.000 U/min) verarbeitet. Dies wurde unter Verwendung eines Filterhilfsmittels aus Diatomeenerde filtriert, wodurch eine Peptidlösung bereitgestellt wurde.
  • Aktivkohle wurde zu der oben erhaltenen Peptidlösung in einer Menge von 1% w/v zugegeben, bei 30°C für 60 Minuten gerührt und dann filtriert, wodurch ein Filtrat erhalten wurde. Dieses Filtrat wurde unter reduziertem Druck (20°C) in einer üblichen Weise konzentriert und dann durch UHTST in einer üblichen Weise sterilisiert, wodurch ein α-1000 (flüssiges) Produkt erhalten wurde. Dieses wurde weiter in einer üblichen Weise sprühgetrocknet, wodurch ein α-1000 (pulverförmiges) Produkt mit einer Teilchengröße von 60 Mesh erhalten wurde. Diese Produkte wurden eingefroren bzw. gelagert.
  • Beispiel 1
  • Eine Lösung wurde durch Lösen von 5 g Peptid α-1000 (Pulver), erhalten im Referenzbeispiel, in 500 ml deionisiertem Wasser gebildet und durch eine Säule (3,5 × 13 cm) aus hydrophobem adsorbierendem Harz SEPABEADS SP207 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation) geführt, um die Säule mit der α-1000-Lösung (Lösungsladung) zu füllen. Dann wurden gemäß dem Elutionsmuster in 1 Wasser, eine 15%ige wäßrigen Ethanollösung und Wasser in dieser Reihenfolge in Mengen von jeweils 500 ml zugegeben, und alle Fraktionen von Sardinenpeptid SY in 1, nämlich die letzte Fraktion der Wasserelution (1), die Fraktion der 15% Ethanolelution und die Fraktion der Wasserelution (2), wurden gesammelt und gemischt. Das Gemisch wurde gefriergetrocknet, wodurch 2,1 g von Peptid SY (Pulver) erhalten wurden. Der Na-Gehalt von Peptid SY betrug 1,45% w/w (gemessen durch Atomabsorptionsspektroskopie).
  • Beispiel 2
  • Eine Lösung wurde durch Lösen von 5 g Peptid α-1000 (Pulver), erhalten im Referenzbeispiel, in 500 ml deionisiertem Wasser gebildet, und durch eine Säule (3,5 × 13 cm) von hydrophobem adsorbierendem Harz SEPABEADS SP207 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation) geführt, um die Säule mit der α-1000-Lösung (Lösungsladung) zu füllen. Unter allen Fraktionen des Sardinenpeptids SY, gezeigt in dem Elutionsmuster von 1, wurde nur die Fraktion der 15% Ethanolelution isoliert und gesammelt. Dies wurde gefriergetrocknet, wodurch 1,7 g Peptid SY-MD (Pulver) erhalten wurden. Der Na-Gehalt von Peptid SY-MD betrug 0,124% w/w (gemessen durch Atomabsorptionsspektroskopie).
  • Beispiel 3
  • (Herstellung von Drinks) Tabelle der Formulierung eines 100-ml-Drinks
    flüssige Fructose-Glucose 4,5 g
    Zuckeralkohol 1 g
    Säuerungsmittel 0,2 g
    Aromastoff 0,13 g
    Süßungsmittel (Stevia) 0,03 g
    Karamellfarbstoff 0,02 g
    Peptid SY (Pulver) 0,5 g
    (erhalten in Beispiel 1)
    gereinigtes Wasser zur Einstellung des Gesamtvolumens auf 100 ml
    Tabelle der Formulierung eines 50-ml-Drinks
    flüssige Fructose-Glucose 10 g
    Aromastoff 0,3 g
    Säuerungsmittel 0,16 g
    Süßungsmittel (Stevia) 0,015 g
    Peptid SY (Pulver) 0,5 g
    (erhalten in Beispiel 1)
    gereinigtes Wasser zur Einstellung des Gesamtvolumens auf 50 ml
    Tabelle der Formulierung eines 30-ml-Drinks
    flüssige Fructose-Glucose 5 g
    Aromastoff 0,25 g
    Säuerungsmittel 0,1 g
    Süßungsmittel (Stevia) 0,015 g
    Peptid SY (Pulver) 0,5 g
    (erhalten in Beispiel 1)
    gereinigtes Wasser zur Einstellung des Gesamtvolumens auf 30 ml
  • Die vorhergehenden Komponenten wurden gemischt und bei 60°C gelöst, und dann Plattensterilisation bei 128°C für 10 Sekunden unterzogen. Die resultierenden Gemische wurden dann bei 90°C in 100 ml, 50 ml und 30 ml gut gewaschene braune Flaschen gefüllt. Die Flaschen konnten bei Raumtemperatur abkühlen und wurden dann schnell unter laufendem Wasser in einem Bad abgekühlt, um die Drinks herzustellen.
  • Beispiel 4
  • (Herstellung von Tabletten)
  • Tabletten wurden gemäß der folgenden Formulierung hergestellt.
  • 500 g Peptid SY (Pulver), erhalten in Beispiel 1, 356 g eines reduzierenden dicken Maltosesirups, 100 g kristalline Cellulose, 40 g Saccharosefettsäureester und 4 g eines Süßungsmittels (Stevia) wurden gemischt, und dieses Gemisch wurde mit einer Kompressionstablettiermaschine gepreßt, wodurch rohe Tabletten gebildet wurden (250 mg × 4.000 Stück). Die rohen Tabletten wurden mit einer Schellacklösung in einer Menge von 7,5 mg pro Tablette beschichtet, wodurch 4.000 Tabletten, enthaltend Peptid SY (Pulver), in einer Menge von 500 mg pro 4 Tabletten hergestellt wurden.
  • Beispiel 5
  • Beispiele zum Verabreichen der Drinks, hergestellt in Beispiel 3, werden beschrieben.
  • (1) Im Fall eines 30-ml-Drinks
  • Das Peptid SY wurde in einer Menge von 0,5 g/Drink verwendet. Personen, die unter leichter Hypertension leiden, wurden in eine Peptidverabreichungsgruppe und eine Placebogruppe gemäß einem zufälligen Doppelblindtest unterteilt, um eine klinische Untersuchung durchzuführen. Jeder nahm einen Drink jeden Tag. Nach 4 Wochen war der obere Blutdruck von nur der Peptidverabreichungsgruppe signifikant um 10,6 mmHg bzw. der untere Blutdruck davon um 5,6 mmHg, in bezug auf den Durchschnittswert, verringert.
  • (2) Im Fall eines 50-ml-Drinks
  • Ebenso wurden Personen, die unter leichter Hypertension leiden, in eine Peptidverabreichungsgruppe und eine Placebogruppe gemäß einem zufälligen Doppelblindtest unterteilt, um eine klinisch Untersuchung durchzuführen. Jeder nahm einen Drink jeden Tag. Nach 4 Wochen war der obere Blutdruck von nur der Peptidverabreichungsgruppe signifikant um 10,2 mmHg bzw. der untere Blutdruck davon um 3,8 mmHg, in bezug auf den Durchschnittswert, verringert.
  • (3) Im Fall eines 100-ml-Drinks
  • Ebenso wurde eine klinische Untersuchung durchgeführt. Nach 4 Wochen war der obere Blutdruck von nur der Peptidverabreichungsgruppe signifikant um 8,2 mmHg bzw. der untere Blutdruck davon um 3,0 mmHg, in bezug auf den Durchschnittswert, verringert.
  • Folglich wurde in allen Fällen durch Einnehmen des Drinks, enthaltend 0,5 g/Drink des Peptids SY einmal am Tag, der Blutdruck der Personen, die unter leichter Hypertension leiden, signifikant bei einem Signifikanzlevel von 1% oder weniger ohne Beeinflussung der subjektiven und objektiven Symptome verringert.
  • Beispiel 6
  • Ein Beispiel zum Verabreichten der Tabletten, hergestellt in Beispiel 4, wird beschrieben.
  • Ein Placebokontroll-Doppelblind-Verabreichungstest wurde für 88 Personen durchgeführt, die Personen mit einem normal hohen Blutdruck und Personen, die unter leichter Hypertension leiden, waren.
  • Sie nahmen Tabletten bei einer Dosis von 4 Tabletten am Tag (0,5 g/Tag als Peptid SY). Folglich betrug in der Peptid-SY-Verabreichungsgruppe (44 Personen) der obere Blutdruck (systolischer Blutdruck) 148 ± 11 mmHg und der untere Blutdruck (diastolischer Blutdruck) betrug 92 ± 14 mmHg zu Beginn des Tests, während der obere Blutdruck signifikant auf 138 ± 12 mmHg nach 4 Wochen und auf 134 ± 9 mmHg nach 8 Wochen verringert wurde, und der untere Blutdruck signifikant auf 84 ± 11 mmHg nach 4 Wochen und 83 ± 10 mmHg nach 8 Wochen verringert wurde. Bei der Placebogruppe (44 Personen) wurde keine signifikante Veränderung festgestellt. Ferner wurden Nebenwirkungen, wie trockener Husten, in keiner dieser Gruppen überhaupt beobachtet. Daher wurde die blutdrucksenkende Wirkung der Tabletten, die Peptid SY enthalten, unter diesen Personen mit normal hohem Blutdruck und den Personen, die unter leichter Hypertension leiden, bestätigt.
  • Beispiel 7
  • (Herstellung eines Drinks) Tabelle der Formulierung eines 100-ml-Drinks
    flüssige Fructose-Glucose 4,5 g
    Zuckeralkohol 1 g
    Säuerungsmittel 0,2 g
    Aromastoff 0,13 g
    Süßungsmittel (Stevia) 0,03 g
    Karamellfarbstoff 0,02 g
    Peptid SY-MD (Pulver) 0,5 g
    (erhalten in Beispiel 2)
    gereinigtes Wasser zur Einstellung des Gesamtvolumens auf 100 ml
  • Dieser 100-mI-Drink enthielt Peptid SY-MD bei einer Dosis von 500 mg/Drink und die Komponenten waren: Wasser 96,7 g, Protein 0,5 g, Zucker 4,5 g, Brennwert 19 kCal, Natrium 7,4 mg und Sorbitol 0,66 g.
  • Ein Doppelblindvergleichstest wurde unter Verwendung eines Drinks, enthaltend 0,5 g/Drink von diesem Peptid SY-MD, an einem Tag für Versuchspersonen durchgeführt, nämlich Personen mit einem normal hohen Blutdruck mit einem systolischen Blutdruck von 130 bis 140 mmHg und einem diastolischen Blutdruck von 80 bis 90 mmHg und Personen, die unter leichter Hypertension leiden, mit einem systolischen Blutdruck von 140 bis 160 mmHg und einem diastolischen Blutdruck von 90 bis 100 mmHg.
  • Infolgedessen wurde in der Placebodrink-Verabreichungsgruppe kein signifikanter Unterschied in bezug auf die Veränderung des Blutdrucks festgestellt, während in der Peptiddrink-Verabreichungsgruppe nach 4 Wochen der systolische Blutdruck signifikant um 14,7 mmHg und der diastolische Blutdruck um 7,6 mmHg im Vergleich zu denen vor der Verabreichung verringert waren. Daher wurde die Wirksamkeit von Peptid SY-MD bestätigt.
  • Beispiel 8
  • (Herstellung von Tabletten)
  • Tabletten wurden gemäß der folgenden Formulierung hergestellt.
  • 500 g Peptid SY-MD (Pulver), erhalten in Beispiel 2, 356 g eines reduzierenden dikken Maltosesirups, 100 g kristalline Cellulose, 40 g Saccharosefettsäureester und 4 g Süßstoff (Stevia) wurden gemischt, und dieses Gemisch wurde mit einer Kompressionstablettiermaschine gepreßt, um rohe Tabletten (250 mg × 4.000 Stück) zu bilden. Die rohen Tabletten wurden mit einer Schellacklösung in einer Menge von 7,5 mg pro Tablette überzogen, wodurch 4.000 Tabletten, enthaltend Peptid SY-MD (Pulver), in einer Menge von 500 mg pro 4 Tabletten hergestellt wurden.
  • Die Komponenten davon waren: Wasser 3,3 g, Protein 44,2 g, Zucker 3,5 g, Asche 1,6 g, Kohlenhydrat 47,4 g und Natrium 566 mg, pro 100 g, und der Brennwert betrug 398 kCal.
  • Ein Doppelblind-Vergleichstest wurde für 12 Wochen unter Verwendung der Tabletten bei einer Dosis von 4 Tabletten/Tag (Verabreichung 0,5 g/Tag als Peptid SY-MD) und Placebo, frei von Peptid SY-MD, als eine Kontrolle durchgeführt. Unter 40 Versuchspersonen, die Personen mit einem normal hohen Blutdruck und Personen, die unter leichter Hypertension leiden, waren, zeigte die Gruppe der Verabreichung der Peptid SY-MD-enthaltenden Tabletten eine signifikante Blutdrucksenkung hinsichtlich sowohl des systolischen Blutdrucks (SBP) als auch des diastolischen Blutdrucks (DBP) im Vergleich zu denen vor der Verabreichung. Das heißt, vor der Verabreichung betrug der SBP 145,4 mmHg und der DBP 86,8 mmHg, während am Ende des Tests der SBP 134,7 mmHg und der DBP 83,0 mmHg betrug. In der Placebogruppe wurde keine signifikante Veränderung des Blutdrucks beobachtet. Während der 12 Wochen traten keine subjektiven Symptome wie Nebenwirkungen auf.
  • Wirkungen der Erfindung
  • Peptid SY und Peptid SY-MD gemäß der Erfindung weisen ausgezeichnete blutdrucksenkende Funktion auf, da jedes Val-Tyr enthält, das als eine blutdrucksenkende Komponente ermittelt wurde, nämlich eine Hauptkomponente eines blutdruck senkenden Peptids bei einer hohen Konzentration. Ferner weist durch Einführen eines Teils einer Fraktion der Wasserelution Peptid SY die Merkmale auf, daß es frei von Bitterkeit ist und ausgezeichneten Geschmack und Stabilität zeigt. Da das neue und sehr effektive Peptid SY gemäß der Erfindung die vorhergehenden Merkmale zeigt, kann es nicht nur als Lebensmittel und Drinks an sich oder als Additive sondern ebenso als Gesundheitskost zum Inhibieren oder Vorbeugen von Blutdruckerhöhung aufgrund der ausgezeichneten ACE-Hemmungsaktivität verwendet werden. Außerdem kann es vorteilhafterweise als Mittel wie ein ACE-Hemmer und ein blutdrucksenkendes Mittel durch Formulieren in verschiedene Dosierungsformen verwendet werden.
  • Das neue Peptid SY und Peptid SY-MD zeigen, wie aus der vorhergehenden Beschreibung hervorgeht, ausgezeichnete blutdrucksenkende Aktivität. Ferner sind sie von Fischfleisch abgeleitet und rufen daher kein Sicherheitsproblem hervor (tatsächlich wurde, wenn jedes gewaltsam oral an Ratten bei einer Dosis von 500 mg/Tag verabreicht wurde, selbst nach 10 Tagen keine akute Toxizität beobachtet). Folglich kann jedes als ein Gemisch aus Peptiden für ein blutdrucksenkendes Mittel oder für Lebensmittel zur speziellen Gesundheitsverwendung zur Senkung des Blutdrucks verwendet werden.

Claims (6)

  1. Peptid SY mit den folgenden physikochemischen Eigenschaften: (A) Molekulargewicht: 200 bis 10.000 (gemessen mit Hochleistungsflüssigchromatographie: ASAHIPAK GS-320), (B) Schmelzpunkt: verfärbt und zersetzt bei 138 ± 3°C, (C) Löslichkeit in Lösungsmitteln: leicht löslich in Wasser, aber nahezu unlöslich in Ethanol, Aceton und Hexan, (D) Erscheinung: weißes oder blassgelbes Pulver, (E) Flüssiger Zustand (pH): 4,0 bis 6,0, (F) Komponenten: Wasser 1 bis 5% w/w (Normaldruck, Wärmetrocknungsverfahren), Protein 84 bis 94% w/w (Mikro-Kjeldahlverfahren), Lipid 0,5% w/w oder weniger (Soxhlet-Extraktionsverfahren), Asche 4 ± 2% w/w (Direktveraschungsverfahren), Na 1 bis 3% w/w (Atomabsorptionsspektroskopie), (G) Physiologische Eigenschaften: enthaltend das Dipeptid Val-Tyr und mit einer ACE-Hemmungsaktivität, (H) Infrarot-Absorptionsspektrum: 3, (I) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: 4.
  2. Peptid SY nach Anspruch 1, welches durch das Sammeln und das Mischen von Peptidkomponenten hergestellt ist, welche aus einer Elutionsfraktionierung einer Peptidlösung mit einem Peptid-absorbierenden Harz unter Verwendung von Wasser, einer wässrigen Ethanollösung und Wasser in dieser Reihenfolge als Eluenten der Elutionsfraktionierung resultieren, in welcher die Peptidkomponenten in einem in 1 gezeigten Elutionsmuster eine letzte Fraktion der Wasserelution (1), eine Fraktion der 11 bis 18% v/v Ethanolelution und eine Fraktion der Wasserelution (2) sind, erhalten durch die entsprechenden nachstehend definierten Eluenten: (1) letzte Fraktion der Wasserelution (1): Fraktion, erhalten unter Verwendung von Wasser als ein Eluent ab einem Zeitpunkt, ab dem ein Natrium (Na)-Gehalt der gesamten Flutions-Peptid-Fraktion (Peptid SY) von 1 bis 3 g/100 g beträgt, bis zu einem Sammelzeitpunkt der letzten Fraktion in der Wasserelution (1), ab dem der Natriumgehalt im Wesentlichen 0 g/100 g beträgt. (2) Fraktion der Ethanolelution: Fraktion, als nächstes erhalten unter Verwendung der wässrigen Ethanollösung mit einer Konzentration von 11 bis 18% v/v als ein Eluent, bis eine Menge an eluiertem Peptid hinter einem Peak liegt und bis annähernd zur Hälfte des Peaks reduziert ist. (3) Fraktion der Wasserelution (2): Fraktion, danach erhalten unter Verwendung von Wasser als ein Eluent, bis die Elutionsfraktionierung vollständig ist.
  3. Peptid SY nach Anspruch 1 oder 2, das unter Verwendung einer wässrigen Lösung von Peptid α-1000 hergestellt ist, welches von Fischfleisch abgeleitet ist und die folgenden physikochemischen Eigenschaften als eine Peptidlösung aufweist: (a) Molekulargewicht: 200 bis 10.000 (gemessen mit Sephadex G25 Säulenchromatographie), (b) Schmelzpunkt: verfärbt bei 119°C (Zersetzungspunkt), (c) spezifisches Drehvermögen: [α]D 20 = –22°, (d) Löslichkeit in Lösungsmitteln: leicht löslich in Wasser, aber nahezu unlöslich in Ethanol, Aceton und Hexan, (e) Aufteilung in sauren, neutralen oder basischen Charakter: neutral, (f) Erscheinung, Komponenten: weißes Pulver, Wasser 5,14% (verringerter Druck, Wärmetrocknungsverfahren), Protein 87,5% (Kjeldahlverfahren mit einem Stickstoff/Protein-Umwandlungskoeffizienten von 6,25), Lipid 0% w/w (Soxhlet-Extraktionsverfahren), Asche 5% (Direktveraschungsverfahren), (g) Charakteristik: Gemisch von Peptiden, welche von Fischfleisch abgeleitet sind und durch Erwärmen des Fischfleisches zur Deaktivierung seines autolytischen Enzyms und Hydrolysieren des resultierenden Fleisches mit einer Protease erhalten sind.
  4. Blutdrucksenkendes Mittel, dadurch gekennzeichnet, dass es Peptid SY nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als einen aktiven Bestandteil enthält.
  5. Blutdrucksenkendes funktionelles Nahrungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass das Nahrungsmittel Peptid SY nach einem der Ansprüche 1 bis 3 ist, oder Peptid SY nach einem der Ansprüche 1 bis 3 enthält.
  6. Nahrungsmittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Nahrungsmittel in der flüssigen oder der festen Form vorliegt.
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