-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Gebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Pflanze, in die ein Laccase-Gen
eingebracht ist, ein Verfahren zur Herstellung von Laccase unter
Verwendung der Pflanze und ein Verfahren zur Zersetzung und Beseitigung gefährlicher
chemischer Substanzen unter Verwendung der Pflanze.
-
Beschreibung
des verwandten Fachgebiets
-
Phenoloxidase
ist ein Enzym, das Phenole in o-Chinon oder p-Chinon durch Oxidation
umwandelt, und Laccase ist ein repräsentatives Beispiel. Laccase
kommt weit verbreitet in Tieren und Pflanzen, und Pilzen, vor, und
in den letzten Jahren konnte Laccase als ein extrazelluläres Enzym
einer mikrobiellen Zelle mit der Fähigkeit, Laccase zu produzieren,
erhalten werden. Als ein extrazelluläres Enzym wird Laccase durch Reinigung
eines Kulturfiltrats von Zellen, die zur Herstellung des Enzyms
in der Lage sind, oder durch Ausführung einer genetischen Rekombination
mit Laccase-Genen in Wirten, z. B. Pilzen, wie der Aspergillus-Gattung, Kultivierung
der Transformante in einem flüssigen
Medium und Gewinnung von Laccase aus der Kulturlösung hergestellt und gereinigt
(YAVER, D.S. et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 834–841, Berka,
R. M. et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 3151–3157).
Allerdings wird, wenn man zur Herstellung von Laccase fähige Mikroorganismen,
insbesondere die obige Rekombinante, zur Produktion von Laccase
verwendet, die Produktionseffizienz erhöht, aber gleichzeitig entsteht
das Problem, dass Kultivierung und Reinigung usw. kostspielig sind.
Daher ist, obwohl es viele Berichte über die Nützlichkeit von Laccase bei
der Abwasserbehandlung (z. B. Koagulations-Präzipitations-Behandlung von
chlororganischen Verbindungen im Zusammenhang mit Dränage bei
der Zellstoffbleiche), Zersetzung von gefährlichen chemischen Substanzen
(z. B. Zersetzung von chlorierten Phenolen) (Roy-Arcand, L. und
Archibald, F. S. (1991) Enzyme Microbial Technol. 13: 194–203, Ricotta,
A. et al. (1996) Bull Environ. Contam. Toxicol. 57: 560–567, Johannes,
C. et al. (1996) Appl. Microbiol. Biotechnol. 46: 313–317, Hoff,
T. N. O. M. et al. (1985) Appl. Environ. Microbiol. 49: 1040–1045, Chivukala,
M. U. R. A. und Renganatthan, V. (1995) Appl. Environ. Microbiol.
61: 4374–4377,
Bollag, J.-M. et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 3086–3091, Amitai,
G. et al. (1998) FEBS Lett 438: 195–200), Produktion von künstlichen
Lackfarben, Verhinderung der Eintrübung von Getränken, klinischen
Analysen usw. gab, Laccase nicht wirklich zur praktischen Verwendung
gelangt. Auf eine kommerzielle Stufe wird Laccase somit lediglich
für das Waschen
und Entfärben
von Jeansstoff bzw. Denim, worin ein hoher zusätzlicher Wert gesehen wird,
gebracht.
-
In
vielen Gebieten liegt demnach ein Bedarf für ein einfaches Herstellungsverfahren
von Phenoloxidase, insbesondere Laccase, mit hoher Produktionseffizienz
und einem erwünschten
Preis-Leistungs-Verhältnis vor.
Obwohl zahlreiche Patentanmeldungen oder Dokumente über Herstellverfahren
von Phenoloxidase, z. B. Laccase (Offengelegte Japanische Patentanmeldung
(kokai) Nr. 9-56378, Offengelegte Japanische Patentanmeldung (kohyo)
Nr. 9-503126, Offengelegte Japanische Patentanmeldung (kohyo) Nr.
9-505481, YAVER, D. S. et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:
834–841,
Berka, R. M. et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 3151–3157, etc.),
bestätigt
wurden, wurde ein Verfahren, das aus praktischer Sicht zufrieden
stellend ist, bis jetzt nicht gefunden.
-
Andererseits
sind physikalisch-chemische Behandlungen als Behandlungstechnologien
für Fälle in Entwicklung,
worin gefährliche
chemische Substanzen, wie PCB, BHC und DDT, die als Industriechemikalien erzeugt
werden, oder Dioxine, die unbeabsichtigte Produkte sind, in hohen
Konzentrationen gelagert oder in der Umgebung akkumuliert werden.
Beispielsweise befinden sich die photochemische Zersetzung, die
superkritische Zersetzung, die Lösungsmittelextraktions-Zersetzung,
die katalytische Oxidation, die Dampfphasen-Hydrierungs-Reduktion,
die Schmelzverbrennung, die Hitzebehandlung in reduzierender Atmosphäre und die
Verglasungsbehandlung in der Validierungsprüfung. Jedoch sind diese physikalisch- chemischen Verfahren aus
Sicht der Kosteneffizienz für
gefährliche
chemische Substanzen, die in niedrigen Spiegeln in einer Umgebung,
wie im Boden oder in Flüssen
angereichert sind, nicht praktisch, und es werden darüber hinaus
in situ-Behandlungsverfahren
für diese
Stoffe benötigt.
Diese gefährlichen
chemischen Substanzen, verstreut über ein weites Gebiet, haben,
obwohl ihre Konzentrationen sogar gering sind, ausreichende Konzentrationsspiegel für endokrine
Störungen.
Als ein Mittel zur Überwindung
dieses Problems ist die biologische Sanierung ausgeführt worden,
und zwar unter Verwendung von Mikroorganismen, die gefährliche
chemische Substanzen stark zersetzen, aber ein derartiges Dekontaminationsverfahren
mit Mikroorganismen hat noch Nachteile. Das heißt, die Inokulation der Mikroorganismen
und Anwendung von Nährstoffquellen
muss durchgeführt
werden, um die Dominanz derartiger Mikroorganismen über einen
langen Zeitraum aufrecht zu erhalten, und dies wird schwieriger,
falls die kontaminierte Fläche
größer wird.
-
Von
dieser Perspektive aus wurden in den letzten Jahren Anstrengungen
zur Dekontamination mithilfe einer Phytosanierung (Wiederherstellung
der Umwelt mittels Pflanzen) unternommen, die Pflanzen benützt. Pflanzen
können
eigenständig
gezüchtet
werden, wobei sie ihre Nährstoffe
von der Sonne, aus Wasser und anorganischen Ionen beziehen, und
können
durch Überwachung
ihrer Samen extensiv kultiviert werden. Aus diesem Grund haben sie
als nachhaltiges Umweltdekontaminationsverfahren die Aufmerksamkeit
auf sich gezogen.
-
Die
Phytosanierung, die überprüft worden
ist, schließt
die Anwendung von Entgiftungsmechanismen oder Ausdünstungsfähigkeiten,
die Pflanzen inhärent
besitzen, ein. Darüber
hinaus wurden Anstrengungen zur Stärkung der Umweltdekontaminationsfunktion
von Pflanzen vor kurzem durch die Einführung von aus Mikroorganismen
stammenden Genen unternommen. Die bislang untersuchte Umweltsanierung
mittels transformierter Pflanzen geht jedoch, im Fall von z. B.
Agrochemikalien, Schwermetallen oder dergleichen, mit dem Transport
zu und der Anhäufung
dieser Substanzen in Zellfraktionen einher. Daher werden, wenn die
Pflanzen absterben, die akkumulierten Umwelt-verunreinigenden Stoffe
erneut in die Umwelt freigesetzt, und somit führt dies nicht zu einer grundlegenden
Lösung
für die
Dekontamination. Falls ferner die gefährlichen chemischen Substanzen
Dioxine oder PCB sind, ist es verhersagbar, dass leicht abbaubare
Substanzen zersetzt werden, während
schwer abbaubare und hochgiftige Substanzen verdichtet und angehäuft werden.
Das heißt,
es gibt keine andere Wahl, als die herkömmliche Phytosanierung für unzureichend
zu halten.
-
Vor
diesem Hintergrund sind Anstrengungen zur Zersetzung gefährlicher
chemischer Substanzen direkt in Pflanzenzellen unter Verwendung
transformierter Pflanzen, in die ein aus einem Mikroorganismus stammendes
Gen eines Enzyms zur Zersetzung einer gefährliche Chemikalie eingeführt worden
ist, im Hinblick auf 2,4,6-Trichlorphenol
(Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry,
Abstracts der Jahresversammlung, S. 164, 1998) oder γ-Hexacyclohexan
(Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry,
Abstracts der Jahresversammlung, S. 89, 1997) unternommen worden.
-
Zufällig ist
aufgeklärt
worden, dass Laccase verschiedene Chemikalien, die nicht leicht
abbaubar sind, zersetzen kann. Laccase kann das Endokrinsystem störende Chemikalien,
einschließlich
Chlorphenole, Agrochemikalien, polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe,
Alkylphenol, aromatische Kohlenwasserstoffe und Nitroverbindungen,
oxidativ zersetzen.
-
Wenn
dementsprechend Gene für
Phenoloxidase, z. B. Laccase, eingebaut werden, und Pflanzen, die eine
Funktion der Gene exprimieren können,
präpariert
werden, kann ein Verfahren zur Herstellung von Phenoloxidase in
hohen Ausbeuten und zu erwünschten
Kosten errichtet werden. Ebenso ist es darüber hinaus möglich, eine
Phytosanierung zu bewerkstelligen, die zur Zersetzung und Beseitigung
gefährlicher
Chemikalien aus der Umwelt nützlich
ist.
-
Obwohl
es bereits Berichte (Offengelegte Japanische Patentanmeldung (kokai)
Nr. 6-125872, Nr. 8-051986, etc.) über Verfahren zum Erhalt transformierter
Pflanzen durch Einführung
verschiedener fremder Gene in Pflanzen gab, ist es schwierig, aktive
Phenoloxidase in Pflanzen einzubringen und eine stabile Sekretion
und Produktion des Proteins am Ort ihrer Wurzeln zu ermöglichen.
Bis jetzt gab es keine Berichte über
die Präparation
derartiger transformierter Pflanzen, Verfahren zur Herstellung von
Phenoloxidase durch derartige Pflanzen und eine Phytosanierung unter
Verwendung derartiger Pflanzen.
-
Die
WO 00/20615 beschreibt die Verwendung von Laccase-Genvektoren, die
Signalsequenzen einschließen
können,
welche die Expression in die Zellwand der Pflanze dirigiert, und
zusätzlich
Sequenzen einschließen
können,
welche die Expression in das endoplasmatische Retikulum der Pflanzenzelle
hineinbringen. Die Laccase-Expression kann auch zu den Samen der
Pflanze dirigiert werden. Die Pflanze mit dem Laccase-Gen kann zusätzlich eine
Substanz enthalten, die ein Mediator der Laccase-Entholzung ist.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Vor
dem oben erwähnten
technischen Hintergrund ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung,
eine Pflanze bereit zu stellen, die Laccase (hierin nachstehend
als "Protein der
vorliegenden Erfindung" bezeichnet) produzieren
und aus einer Wurzel davon sekretieren kann, und ein Verfahren zur
Zersetzung und Beseitigung gefährlicher
Chemikalien unter Verwendung der Pflanze.
-
Die
Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben intensive Untersuchungen
zur Lösung
der obigen Probleme angestellt. Als ein Ergebnis haben sie festgestellt,
dass eine Pflanze, in die ein Gen für Laccase eingebracht wird,
das Enzym produzieren und aus der Wurzel davon sekretieren kann
und derartige Pflanzen die Zersetzung und Beseitigung gefährlicher
chemischer Substanzen ermöglichen,
wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wird.
-
Das
heißt,
die vorliegende Erfindung stellt eine Pflanze bereit, die eine heterologe
DNA, die eine Laccase, abgeleitet aus Basidiomyoceten, codiert,
enthält,
die mit einer Signalsequenz der Laccase verknüpft ist, worin die heterologe
DNA unter der Regulation eines Promotors, der eine starke Expression
in der Wurzel ermöglicht,
in der Wurzel stärker
als in anderen Pflanzenteilen exprimiert und die resultierende Laccase
aus der Wurzel der Pflanze sekretiert wird.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ferner bereit:
- – ein Verfahren
zur Herstellung von Laccase, umfassend:
Kultivieren einer erfindungsgemäßen Pflanze
in einer Wasser-Kulturlösung;
und Gewinnen der Laccase aus der Kulturlösung; und
- – ein
Verfahren zur Zersetzung und Beseitigung gefährlicher chemischer Substanzen
aus der Umwelt, umfassend:
Kultivieren einer erfindungsgemäßen Pflanze
in der mit einer gefährlichen
chemischen Substanz kontaminierten Umwelt.
-
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
Die 1 zeigt
die Struktur des Plasmids pW35SfLac/pBI121.
-
Die 2 zeigt
die Ergebnisse, die bei der Ausführung
der isoelektrischen Fokussierung und der Aktivitätsanfärbung von in die Kulturlösungen sekretierter
Laccase erzielt wurden.
-
BESCHREIBUNG DER SEQUENZAUFLISTUNG
-
- SEQ ID NR:1 ist Volllängen-Laccase-cDNA.
- SEQ ID NR:2 ist die korrespondierende Aminosäuresequenz.
- SEQ ID NR:3 ist Primer LfXb.
- SEQ ID NR:4 ist Primer LBa.
-
Diese
Patentbeschreibung schließt
die Inhalte, wie sie in der Patentbeschreibung und/oder den Zeichnungen
der Japanischen Patentanmeldung Nr. 2001-309824, die ein Prioritätsdokument
der vorliegenden Anmeldung ist, offenbart sind, ein.
-
BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
-
Eine
Pflanze der vorliegenden Erfindung ist eine Pflanze, die eine heterologe
DNA umfasst, die eine Phenoloxidase, genauer gesagt, eine aus Basidiomyoceten
abgeleitete Laccase, codiert, worin die genannte heterologe DNA
imstande ist, in der genannten Pflanze exprimiert zu werden. Phenoloxidase
ist ein Enzym, das Phenole oxidiert, um sie dadurch in o-Chinon
oder p-Chinon in der Anwesenheit von Sauerstoff umzuwandeln. Es
schließt
Enzyme der Monophenoloxidation, wie Tyrosinase, die nicht nur auf
Polyphenole, sondern auch auf Monophenole einwirken, und Enzyme
der Diphenoloxidation, wie Laccase, die nur auf p-Diphenole einwirken,
ein.
-
Eine
heterologe DNA ist eine solche, die in eine Pflanze eingeführt werden
soll oder in eine Pflanze eingeführt
worden ist, und somit eine Pflanze der Erfindung entstehen lässt, d.
h., eine transgene Pflanze. Eine heterologe DNA kann Sequenzen umfassen,
die aus einer anderen Spezies stammen als die Pflanze, welche die
heterologe DNA umfasst. Tatsächlich
kann die heterologe DNA Sequenzen umfassen, die nicht pflanzlichen
Ursprungs sind. Solche Sequenzen können zum Beispiel aus einem
Bakterium, einem Pilz oder einer unterschiedlichen Pflanzenart stammen.
Alternativ oder zusätzlich
kann eine heterologe DNA Sequenzen, die ihren Ursprung in der die
heterologe DNA umfassenden Spezies haben, umfassen oder im Wesentlichen
daraus bestehen. In dem zuletzt genannten Fall kann eine erfindungsgemäße Pflanze
somit mehr als eine Kopie eines Gens, das natürlicherweise in der fraglichen
Spezies vorkommt, umfassen. Selbstverständlich kann eine heterologe
DNA Sequenzen, die in der zu transformierenden Spezies ihren Ursprung
haben, und Sequenzen, die nicht in der zu transformierenden Spezies
ihren Ursprung haben, umfassen.
-
Die
Laccase wird aus einer Basidiomyocete erhalten. Beispiele von Basidiomyoceten
schließen
Mikroorganismen ein, die zu den Gattungen Coriolus, Schizophyllum
oder Pleurotus gehören,
zum Beispiel Coriolus versicolor, Schizophyllum commune und Pleurotus
ostreatus, ein.
-
Weiterhin
ist die Laccase eine sekretorische Laccase. Der Ausdruck "sekretorische Laccase" bedeutet hierin
eine Laccase, die mittels einer Signalsequenz, die notwendig ist,
um Proteine aus Pflanzenkörpern
nach außen
zu sekretieren, aus Pflanzenkörpern
nach außen
sekretiert wird.
-
Für die Proteine
der vorliegenden Erfindung, die in Pflanzen eingebracht werden können, kann
ein Protein mit der Aminosäuresequenz
der SEQ ID NR:1 angegeben werden. Weiterhin schließen die
Proteine der vorliegenden Erfindung nicht nur ein natürliches
aus einer Basidiomyocete erhaltenes Protein mit Laccase-Aktivität ein, sondern
auch ein Protein, das eine Substitution, Deletion oder Addition
einer oder mehrerer Aminosäuren
in Bezug auf das natürliche
Protein enthält,
sofern das Protein die Aktivität
nicht verliert.
-
Das
von einer erfindungsgemäßen Pflanze
exprimierte Polypeptid kann eine Aminosäuresequenz aufweisen, welche
die Deletion, Substitution oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren in
Bezug auf die in SEQ ID NR:2 gezeigte Aminosäuresequenz enthält (sofern
es noch Laccase-Aktivität
an den Tag legt). Die Sequenz der SEQ ID NR:2 kann somit durch Insertion,
Deletion, Addition (beispielsweise N-terminale oder C-terminale
Addition) oder Substitution einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure modifiziert
vorliegen. Es kann mehr als eine solche Aminosäuremodifikation vorgenommen
werden, beispielsweise 1, mindestens 5, mindestens 10, mindestens
20, mindestens 30, mindestens 50 bis etwa 70, 80, 100 oder 150 derartige
Modifikationen. Diese Modifikationstypen können zum Erhalt eines durch
eine erfindungsgemäße Pflanze
exprimierten Proteins kombiniert werden. Aminosäuresubstitutionen werden vorzugsweise
konservative Substitutionen, beispielsweise entsprechend der folgenden
Tabelle, sein. Aminosäuren
in demselben Block in der zweiten Spalte und vorzugsweise in derselben
Zeile der dritten Spalte können
gegeneinander substituiert werden.
-
-
Proteine
mit einer kürzeren
Aminosäuresequenz
als SEQ ID NR:2, d. h., Fragmente, können ebenfalls von einer erfindungsgemäßen Pflanze
exprimiert werden. Beispielsweise kann ein Peptid in der Länge von mindestens
100 Aminosäuren
oder mindestens 200 Aminosäuren
bis hin zu etwa 300, 400 oder 500 Aminosäuren von einer erfindungsgemäßen Pflanze
exprimiert werden (sofern es noch Laccase-Aktivität zeigt).
-
In
dieser Sequenz hat ein Bereich, umfassend ein Peptid, das durch
die Aminosäuresequenz
der Aminosäurepositionen
1 bis 21 repräsentiert
wird, die Funktion einer Signalsequenz, und diese Signalsequenz macht
es möglich,
dass das Protein der vorliegenden Erfindung beständig und zuverlässig aus
Pflanzenkörpern
nach außen
sekretiert wird. Die Signalsequenz ist ein Gen zur Sekretion des
Proteins und ist funktional mit dem N-Terminus des Laccase-Gens
verknüpft.
Daher ist es vorzuziehen, wenn der Erhalt eines sekretorischen Proteins,
z. B. sekretorische Laccase, aus einer transformierten Pflanze erwünscht ist,
Substitutionen, Deletionen und Additionen in der Aminosäuresequenz
der Aminosäurepositionen
1 bis 21 in der in SEQ ID NR:1 gezeigten Aminosäuresequenz zu vermeiden. Insbesondere
ist es vorzuziehen, die sekretorische Laccase mit der die in SEQ
ID NR:1 gezeigte Signalsequenz umfassenden Aminosäuresequenz
einzusetzen, weil es möglich
ist, Laccase beständig
und zuverlässig
aus Pflanzenkörpern
nach außen
zu sekretieren.
-
Um
die das Protein der vorliegenden Erfindung codierende DNA zu isolieren,
die in Pflanzen eingebracht werden kann, können Genklonierungsverfahren
angewendet werden. Beispielsweise gibt es ein Verfahren, worin ein
Enzym gereinigt wird, eine Aminosäuresequenz ermittelt wird und
synthetische Nukleotide, beruhend auf der Sequenz, um die DNA aus
einer Genbibliothek durch Hybridisierung zu selektieren, präpariert werden.
Darüber
hinaus gibt es auch ein Verfahren, worin für PCR (Polymerasekettenreaktion)
verwendete Primer, beruhend auf der bekannten Gennukleotid-Sequenzinformation
präpariert
werden, ohne das Enzym zu reinigen, um einen spezifischen Bereich
oder einen gesamten Bereich des Gens mittels PCR-Durchführung zu amplifizieren und
zu isolieren.
-
Die
das Protein der vorliegenden Erfindung codierende DNA, die in Pflanzen
eingebracht werden kann, kann durch ihr Einbringen in Pflanzen mit
einem geeigneten Promotor exprimiert werden. Der Promotor ermöglicht die
lokale Expression in Wurzeln. Beispielsweise kann Blumenkohl-Mosaik-Virus
35S-Promotor (CMV 35S-P), der eine starke Expression in Wurzeln
ermöglicht,
verwendet werden. Somit ermöglicht
der Promotor eine starke Expression in Wurzeln. Hierin wird angemerkt,
das der Ausdruck "lokale
Expression" nicht nur
eine lediglich in einem bestimmten örtlichen Teil der Pflanze vorkommende
Expression bedeutet, sondern auch eine lokale Expression, wo eine
Expression in einem bestimmten Teil verglichen mit anderen Teilen
viel stärker
ist. Viel stärker
zu sein, bezieht sich für
den Grad der Expression auf einen Fall, worin die interessierende
Expression um etwa das 1/3- bis 1/2-fache im Vergleich mit der Expression
anderer Teile stärker
ist. Wenn gesagt wird, dass DNA "lokal
in Wurzeln exprimiert werden kann", bedeutet dieser Ausdruck spezifisch, dass,
obwohl eine Expression in Blättern
oder Stängeln
beobachtet werden kann, die Expression in Wurzeln deutlicher bemerkbar
ist als Expressionen in jenen Teilen.
-
Weiterhin
ist es möglich,
in eine Pflanze einen Promotor einzubringen, der die Expression
verstärkt. Als
ein Beispiel für
den Promotor kann ein untranslatierter Bereich in (CMV 35S-up),
stromaufwärts
des CMV 35S-P gelegen, verwendet werden.
-
Jeder
beliebige Terminator kann verwendet werden, sofern er noch in Pflanzenzellen
arbeitet, zum Beispiel kann der Terminator eines Nopalin-Synthase-Gens
verwendet werden.
-
Zur
DNA-Einbringung in Pflanzen können
chemische, physikalische und biologische Verfahren angewendet werden,
wobei Elektroporation, ein eine Teilchenkanone verwendendes Verfahren
und ein Agrobacterium verwendendes Verfahren eingeschlossen sind,
um DNA in ein Pflanzengenom einzubringen. Pflanzenzellen, in die
DNA eingebracht wird, können
selektiert und erneut durch die Verwendung eines Markers, wie die
Arzneimittelresistenz-Eigenschaft von Antibiotika und dergleichen,
differenziert werden.
-
Die
in der vorliegenden Erfindung verwendbaren Pflanzen schließen jedwede
Pflanzenspezies ein, sofern das Verfahren zur erneuten Differenzierung
von Zellen, Geweben oder Organen etabliert und das Geneinbringungssystem
konstruiert ist. Als wünschenswerte
Pflanzenarten können
Samenpflanzen beispielhaft angegeben werden. Obwohl die Samenpflanzen
sowohl krautartige Pflanzen wie auch holzartige Pflanzen sein können, sind
krautartige Pflanzen wegen der Einfachheit in der Kultivierung wünschenswert,
und Beispiele davon schließen
Tabak, Reis und Rasengras ein.
-
Da
das Protein der vorliegenden Erfindung aus den Wurzeln der wie oben
präparierten
transformierten Pflanzen sekretiert wird, kann das Protein der vorliegenden
Erfindung mit geringen Verunreinigungen durch Kultivieren der Pflanzen
in einer Wasserkultur-Lösung
und Gewinnen des Proteins aus der Kulturlösung erhalten werden. Die Wasserkultur-Lösung ist
nicht speziell eingeschränkt,
sofern sie es noch den transformierten Pflanzen darin ermöglicht,
zu wachsen und das Protein der vorliegenden Erfindung zu sekretieren,
und Murashige & Skoog-Medium kann zum Beispiel
verwendet werden. Die transformierte Pflanze der vorliegenden Erfindung
wird in die Wasserkultur-Lösung
gepflanzt und bei geeigneten Temperaturen für ihr Wachstum kultiviert.
Die erforderliche Zeitdauer für
eine ausreichende Sekretion von Laccase aus den transformierten
Pflanzen variiert in Abhängigkeit
von der Pflanzenart, die verwendet werden soll. Somit kann während der
Beobachtung des Sekretionszustands des Enzyms eine angemessene Kultivierungsdauer
ermittelt werden. Üblicherweise
beträgt
die Dauer jedoch annähernd
eine Woche. Das in die Wasserkultur-Lösung sekretierte erfindungsgemäße Protein
kann durch allgemein übliche
Trenn- und Reinigungsverfahren für
Enzyme gewonnen werden. Beispielsweise wird die Laccase enthaltende
Kulturlösung
zentrifugiert und unter Verwendung eines Ultrafilters weiter konzentriert.
Weiterhin wird ein Konstrukt, in dem 6 Histidinreste mit dem N-
oder C-Terminus verknüpft
sind, präpariert
und seine Expression zugelassen, und dies kann die Reinigung des
Enzyms durch Reinigungsharz der Affinitätschromatographie mit immobilisiertem
Metall vereinfachen. Das so erhaltene Enzym kann für die Gebiete
der Abwasserbehandlung, Herstellung künstlicher Lackfarben, Eintrübungsverhinderung
von Getränken,
klinische Analyse etc. verwendet werden.
-
Darüber hinaus
besitzt das Protein der vorliegenden Erfindung eine Funktion, gefährliche
chemische Substanzen, wie oben beschrieben, zu zersetzen und zu
beseitigen. Daher können
gefährliche
chemische Substanzen in der Wurzelbildungszone nachhaltig und eigenständig durch
Kultivieren der transformierten Pflanze der vorliegenden Erfindung
in mit gefährlichen
chemischen Substanzen kontaminierten Umgebungen zersetzt und beseitigt
werden. Weiterhin ist es möglich,
gefährliche chemische
Substanzen zu zersetzen und zu beseitigen, indem das aus der transformierten
Pflanze der vorliegenden Erfindung gewonnene Protein über die
mit gefährlichen
chemischen Substanzen kontaminierten Umgebungen gesprüht wird.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "gefährliche
chemischen Substanzen" Substanzen,
die für
menschliche Körper
Giftigkeit zeigen oder eine Störung
des endokrinen Systems hervorrufen, und Substanzen, die durch Laccase
zersetzt werden können
oder deren Giftigkeit durch Laccase reduziert werden kann. Spezifischer
gesagt umfassen Beispiele davon Chlorphenole, Agrochemikalien, polycyclische
aromatische Kohlenwasserstoffe, Alkylphenol, aromatische Kohlenwasserstoffe
und Nitroverbindungen. Zusätzlich
bedeutet der Ausdruck "Umwelt bzw.
Umgebung" beispielsweise
Erdböden,
Seen, Flüsse
und dergleichen.
-
BEISPIELE
-
[Beispiel 1] Klonierung
von Laccase-cDNA aus Coriolus versicolor
-
Zur
Isolierung von Laccase codierender cDNA wurde eine Nukleotidsequenz
von stromaufwärts
und stromabwärts
zur Laccase codierenden Region gelegenen Bereichen, d. h., 20 Nukleotide
ab dem Startcodon und 22 Nukleotide ab dem Stopcodon, aus Nukleotidsequenzen
von Laccase-Genomen von Coriolus versicolor IFO 30340, der unter
der DDBJ-Zugangsnr. D13372 registriert ist, selektiert. Im Anschluss
daran wurde ein Oligonukleotid chemisch synthetisiert.
-
Eine
PCR wurde unter Verwendung der oben präparierten Oligonukleotide als
Primer und cDNA von Coriolus versicolor als eine Matrize ausgeführt. Die
PCR-Reaktionsbedingungen
betrugen 25 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55°C und 90
Sekunden bei 72°C.
Pyrobest-DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co. Ltd.) wurde für die Reaktion
verwendet. Ein Teil der Reaktionslösung wurde einer Elektrophorese mit
1,5%-igem Agarosegel zur Trennung unterzogen, und danach wurden
DNA-Amplifizierungsprodukte mit der erwarteten Größe begutachtet.
Fragmente der amplifizierten Produkte wurden aus der Agarose ausgeschnitten
und extrahiert, und dann einem Sequenzieren unterzogen, wodurch
die in SEQ ID NO:1 bezeichnete Volllängen-cDNA erhalten wurde. Weiterhin
ist eine dazu korrespondierende Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:2 gezeigt.
-
[Beispiel 2] Konstruktion
eines Vektors und dessen Einbringung in eine Pflanze
-
Zum
Erhalt von Laccase-cDNA, in die eine Restriktionsenzym-Stelle eingeführt ist,
wurden Primer synthetisiert. Die Nukleotidsequenzen der entsprechenden
Primer sind wie folgt.
LfXb: 5'-ttgtttctagatgtcgaggtttcactctct-3'
LBa: 5'-aattggatccttactggtcgctcgggtcgagcg-3'
-
Unter
Verwendung der oben synthetisierten DNA als Primer und Laccase-cDNA
der SEQ ID NO:1 als Matrize wurde mittels Pyrobest-DNA-Polymerase
eine PCR ausgeführt.
Die PCR-Reaktionsbedingungen betrugen 30 Zyklen von 10 Sekunden
bei 98°C,
30 Sekunden bei 60°C,
80 Sekunden bei 72°C.
Ein Fragment, in dem Xba I- und Bam HI-Restriktionsstellen an Volllängen-Laccase-cDNA
(SEQ ID NR:1) angefügt
waren, wurde mithilfe der LfXb- und LBa-Primer erhalten und wurde
in pCR2.1 insertiert. Die Nukleotidsequenz wurde durch Sequenzieren
bestätigt.
-
Das
oben amplifizierte cDNA-Fragment wurde aus pCR2.1 ausgeschnitten
und in Xba I-, Bam HI-Stellen von Plasmid pBI221, umfassend CMV
35S-P, der eine starke Expression besonders in Pflanzenwurzeln ermöglicht,
insertiert. Dieses Plasmid wurde als pfLac/pBI221 bezeichnet.
-
Weiterhin
wurde CMV 35S-up in stromaufwärts
vom CMV 35S-P gelegene Hind III- und
Pst I-Stellen des Plasmids pfLac/pBI221 insertiert, wodurch eine
Verstärkung
der Expressionseffizienz des Laccase-Gens angestrebt wird. Das erhaltene
Plasmid wurde als pW35SfLac/pBI221 bezeichnet.
-
Das
Plasmid pW35SfLac/pBI221 wurde mit Hind III und Bam HI verdaut,
und ein Fragment, das CMV 35S-up, CMV 35S-P und das Laccase-Gen
enthielt, wurde in Hind III-, Bam HI-Stellen von pBI121 insertiert. Dieses
Plasmid wurde als pW35SfLac/pBI121 (1) bezeichnet.
-
Ein
Agrobacterium tumefaciens LBA4404-Stamm, der pW35SfLac/pBI121 in
sich trägt,
wurde zur Einbringung eines Gens für sekretorische Laccase in
den Tabak SR1-Stamm verwendet, wodurch eine transformante Pflanze
erhalten wurde. Zusätzlich
wurde eine transformante Pflanze des Tabak SR1-Stamms unter Verwendung
des Agrobacterium tumefaciens LBA4404-Stamms, der pBI121 in sich
trägt erhalten,
die als Kontrolle verwendet wurde. Southern-Analyse und PCR-Analyse wurden mit
aus jedem der Individuen abgeleiteter Gesamt-DNA durchgeführt, wodurch
bestätigt
wurde, dass jedes Gen in jede dieser transformierten Pflanzen eingebracht
worden war.
-
[Beispiel 3] Detektion
von aus Wurzeln transformierter Pflanzen sekretierter Laccase-Aktivität
-
Murashige & Skoog-Medium,
das ein Fünftel
der vorgeschriebenen Saccharosemenge enthielt, wurde als Wasserkultur-Lösung zubereitet.
Die transformierten Tobacco SR1-Stamm-Pflanzen, die in Beispiel
2 präpariert
und bis auf ungefähr
20 cm Länge
gezüchtet
worden waren, wurden in die Kulturlösung eingepflanzt und bei 28°C kultiviert.
Nach einer Kultivierung von einer Woche wurden 10 ml der Kulturlösung gesammelt, bei
12 000 g für
15 Minuten zentrifugiert und auf eine Konzentration von 1/1 000
mittels eines Ultrafilters, der Moleküle mit einem Molekulargewicht
von 10 000 und darunter eliminiert, konzentriert. Danach betrug
die Proteinkonzentration 10 μg/10 μl. Diese
Lösung
wurde mittels des Verfahrens der isoelektrischen Fokussierung entwickelt
und einer Aktivitätsanfärbung mit
4-Chlor-1-naphthol
unterzogen. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
In der Figur repräsentieren
die Ziffer 1, die Ziffern 2 bis 12, und C1 bis C2 die Ergebnisse
für eine
rohe Enzymlösung
aus Coriolus versicolor, Konzentrate aus der Kulturlösung der
transformierten Pflanzen bzw. Kontrollpflanzen (in die lediglich
pBI121 eingebracht wurde). Wie es aus 2 deutlich
wird, wurde eine Bande in der Gegend von pl 3,5, der einen isoelektrischen
Punkt von Laccase darstellt (Ziffern 2 bis 11 in 2),
nur bei der Kulturlösung
der transformierten Pflanze, in die ein Laccase-Gen eingebracht
wurde, deutlich beobachtet. Darüber
hinaus wurde keine Bande in der Kulturlösung, die unter denselben Bedingungen
präpariert
wurde, bei den Kontrollpflanzen, in die lediglich pBI121 eingebracht
wurde (C1 und C2 in 2) beobachtet.
-
Entsprechend
den oben festgestellten Ergebnissen wurde klargestellt, dass die
transformierte Pflanze mit einem darin eingebrachten Laccase-Gen
aus ihren Wurzeln Aktivität
aufweisende Laccase sekretiert. Daher ist es bestätigt, dass
es möglich
ist, eine transformierte Pflanze in die Lage zu versetzen, Laccase
aus ihren Wurzeln zu sekretieren, indem Laccase-Gene in krautartige
Pflanzen oder in holzartige Pflanzen eingebracht werden, und die
Expression in den transformierten Pflanzen zugelassen wird.
-
WIRKUNG DER
ERFINDUNG
-
Eine
Pflanze der vorliegenden Erfindung, in die ein Laccase-Gen eingebracht
ist, ermöglicht
eine effiziente und kostengünstige
Herstellung von Laccase. Weiterhin können gefährliche chemische Substanzen durch
Kultivieren dieser Pflanze in einer mit gefährlichen chemischen Substanzen
kontaminierten Umwelt zersetzt und beseitigt werden. SEQUENZAUFLISTUNG
