JP2003116384A - フェノールオキシダーゼ遺伝子を導入した植物、及び該植物によるフェノールオキシダーゼの生産方法 - Google Patents

フェノールオキシダーゼ遺伝子を導入した植物、及び該植物によるフェノールオキシダーゼの生産方法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 フェノールオキシダーゼ遺伝子を導入した植
物、該植物によるフェノールオキシダーゼの生産方法、
及び、該植物を用いた利用した有害化学物質の分解除去
方法の提供。 【解決手段】 フェノールオキシダーゼをコードするDN
Aが導入され、そのDNAが発現している植物。前記植物を
水耕栽培することを特徴とする、フェノールオキシダー
ゼの生産方法。また、前記植物を有害化学物質により汚
染された環境で栽培することを特徴とする、有害化学物
質の分解除去方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、フェノールオキシ
ダーゼ遺伝子を導入した植物、該植物によるフェノール
オキシダーゼの生産方法、及び、該植物を用いた利用し
た有害化学物質の分解除去方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】フェノールオキシダーゼは、フェノール
類を酸化してo-キノンあるいはp-キノンに変換する酵素
であり、代表的な酵素としてラッカーゼがある。ラッカ
ーゼは動植物、菌類に広く存在し、近年、ラッカーゼ生
産能を有する菌体の菌体外酵素として得られている。菌
体外酵素のラッカーゼは、該酵素産生菌の培養濾液から
精製するか、アスペルギルス（Aspergillus）属のカビ
等を宿主にラッカーゼ遺伝子の組換えを行い、該形質転
換体を液体培養し、培養液からラッカーゼを採取するこ
とにより生産・精製している（YAVER, D.S. et al (199
6) Appl EnvironMicrobiol 62: 834-841, Berka, R. M.
et al (1997) Appl Environ Microbiol63: 3151-315
7）。しかし、ラッカーゼ産生菌、特に前記組換え体を
用いてラッカーゼを生産する場合、生産効率は高まる
が、一方で培養・精製等においてコストがかかるという
問題が生じる。そのため、排水処理（例えばパルプ漂白
排水中の有機塩素化合物の凝集沈殿処理）や有害化学物
質の分解（例えば塩素化フェノール類の分解）（Roy-Ar
cand, L and Archibald, F. S. (1991) Enzyme Microbi
al Technol 13: 194-203, Ricotta, A. et al (1996) B
ull Environ Contam Toxicol 57: 560-567, Johannes,
C. et al (1996) Appl Microbiol Biotechnol 46: 313-
317, Hoff, T. H. O. M. et al (1985) Appl Environ M
icrobiol 49: 1040-1045, Chivukula, M. U. R. A. and
Renganathhan, V. (1995) Appl EnvironMicrobiol 61:
4374-4377, Bollag J. -M. et al (1988) Appl Enviro
n Microbiol 54: 3086-3091, Amitai, G. et al (1998)
FEBS Lett 438: 195-200）、人工漆塗料の製造、飲料
の混濁防止、臨床分析等において、ラッカーゼの有用性
が多数報告されているが、実際には実用化には至ってお
らず、付加価値が高いと考えられるデニム生地の洗いと
脱色用にラッカーゼが製品化されているにとどまってい
る。
【０００３】従って、生産効率が高く、かつコスト的に
も望ましいフェノールオキシダーゼ、特に、ラッカーゼ
の簡便な生産方法が多分野において望まれている。しか
しながら、ラッカーゼ等のフェノールオキシダーゼの生
産方法について多くの特許出願や文献が確認されるが
（特開平9-56378、特表平9-503126、特表平9-505481、Y
AVER, D.S. et al (1996) Appl Environ Microbiol 62:
834-841, Berka, R. M.et al (1997) Appl Environ Mi
crobiol 63: 3151-3157等）、実用化の面から満足のい
くものは得られていなかった。
【０００４】一方、工業化学物質として生産されたPC
B、BHC及びDDTや非意図的生成物であるダイオキシンな
どの有害化学物質が高濃度でストックされていたり、環
境中に蓄積している場合の処理技術として、物理化学的
処理が開発されている。例えば、光化学分解、超臨界分
解、溶媒抽出分解、触媒酸化、気相水素還元、溶融燃
焼、還元雰囲気加熱処理及びガラス固化処理技術が実証
試験されている。しかし、土壌や河川などの環境中に蓄
積している低濃度の有害化学物質には、そうした物理化
学的手法は対費用効果の観点から実用的とはいえず、ま
た、現位置における処理法が必要とされる。こうした広
範囲に拡散した有害化学物質は低濃度であっても、内分
泌撹乱には十分な濃度レベルである。この問題を克服す
るための一つの手段として、有害化学物質を強力に分解
する微生物を利用したバイオ・レメデイエーションが行
われているが、こうした微生物浄化法にも問題点があ
る。それは、そうした微生物を長期にわたり優勢に維持
するために、微生物の接種と栄養源の散布を行なわなけ
ればならないことであり、汚染範囲が広いほど難しくな
る。
【０００５】このような観点に立ち、近年、植物を利用
した、ファイト・レメディエーション（植物による環境
修復）による汚染浄化の試みがなされている。植物は、
太陽、水、無機イオンで独立栄養的に成長でき、種子を
管理することにより、広い範囲で栽培することができ
る。このため、持続的な環境浄化手法として注目されて
いる。
【０００６】これまでに検討されているファイト・レメ
ディエーションには、植物が本来有する解毒機構や蒸散
能力を活用したものがある。さらに、最近では、微生物
由来の遺伝子を導入することで、植物の環境汚染除去機
能を強化する試みがなされている。しかしながら、これ
まで検討されてきた形質転換植物による環境修復は、例
えば、農薬や重金属等の場合、細胞画分への輸送蓄積に
よるものであり、植物が枯死すれば、蓄積された環境汚
染物質が再度環境に放出され、根本的な浄化につながる
ものではなかった。さらに、有害化学物質がダイオキシ
ンやPCBの場合には、易分解性のものは分解されるが、
分解され難く、かつ毒性の高いものは濃縮蓄積されるこ
とが考えられるため、従来のファイト・レメディエーシ
ョンは不十分なものであると考えざるをえない。
【０００７】そうした経緯から、微生物由来の有害化学
物質分解酵素遺伝子を導入した形質転換植物を用い、植
物細胞内で直接有害化学物質を分解する試みが、2,4,6-
トリクロロフェノール（日本農芸化学大会講演要旨集、
p146, 1998）や、γ−ヘキサシクロヘキサン（日本農芸
化学大会講演要旨集、p89, 1997）についてなされてい
る。
【０００８】ところで、ラッカーゼは、多岐にわたる難
分解性化学物質を分解することが明らかにされている。
例えば、クロロフェノール、農薬、多環芳香族炭化水
素、アルキルフェノール、芳香族炭化水素、ニトロ化合
物をはじめとする内分泌撹乱物質を酸化的に分解する。
【０００９】従って、ラッカーゼ等のフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子を組み込み、その機能を発現できるような
植物を作製できれば、高生産可能であり、かつコスト的
にも望ましいフェノールオキシダーゼの生産方法が確立
できるとともに、さらには、環境中の有害化学物質の分
解除去に有用であるファイト・レメディエーションをも
達成することができる。
【００１０】しかしながら、植物に様々な外来遺伝子を
導入して形質転換植物を得る方法についてはすでに報告
があるが（特開平6-125782、特開平8-051986等）、活性
のあるフェノールオキシダーゼを植物に導入して根から
局所的に安定して該タンパク質を分泌生産することは困
難であり、これまで、そのような形質転換植物の作製、
該植物によるフェノールオキシダーゼの生産方法、及
び、該植物を用いたファイト・レメディエーションは報
告されていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、以上のよう
な技術的背景の下、ラッカーゼ等のフェノールオキシダ
ーゼ（以下、本発明のタンパク質と称する）を根から分
泌生産し得る植物を提供するとともに、該植物を用いた
有害化学物質の分解除去方法を提供することを目的とす
る。
【００１２】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意検討を重ねた結果、ラッカーゼ等の
フェノールオキシダーゼ遺伝子を導入した植物は該酵素
を根から分泌生産することができるとともに、該植物に
より有害化学物質を分解除去できることを見出し、本発
明を完成するに至った。
【００１３】すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１
０）を提供する。 （１）フェノールオキシダーゼをコードするDNAが導入
され、そのDNAが発現している植物。 （２）DNAが根において局所的に発現することを特徴と
する、（１）に記載の植物。 （３）フェノールオキシダーゼをコードするDNAが、ラ
ッカーゼをコードするDNAであることを特徴とする、
（１）又は（２）に記載の植物。 （４）ラッカーゼが分泌型ラッカーゼであることを特徴
とする（３）に記載の植物。 （５）ラッカーゼが担子菌由来のラッカーゼであること
を特徴とする、（３）に記載の植物。 （６）担子菌がカワラタケであることを特徴とする、
（５）に記載の植物。 （７）以下の(a)又は(b)のタンパク質： (a)配列番号１に記載のアミノ酸配列により表されるタ
ンパク質 (b)配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個又
は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸
配列により表され、かつラッカーゼ活性を有するタンパ
ク質、をコードするDNAが導入され、そのDNAが発現して
いる植物。 （８）植物が種子植物であることを特徴とする、（１）
〜（６）のいずれかに記載の植物。 （９）（１）〜（８）のいずれかに記載の植物を水耕栽
培溶液にて培養し、該栽培溶液からフェノールオキシダ
ーゼを採取することを特徴とする、フェノールオキシダ
ーゼの生産方法。 （１０）（１）〜（８）のいずれかに記載の植物を有害
化学物質により汚染された環境で栽培することを特徴と
する、有害化学物質の分解除去方法。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の植物は、フェノールオキシダーゼをコードする
DNAが導入され、そのDNAが発現している植物である。フ
ェノールオキシダーゼは、酸素の存在下にフェノール類
を酸化してo-キノンあるいはp-キノンに変換する酵素で
あり、チロシナーゼなどのポリフェノールだけでなくモ
ノフェノールにも作用するモノフェノール酸化酵素と、
ラッカーゼなどのｐ−ジフェノールのみに作用するジフ
ェノール酸化酵素が含まれる。このうち、酵素の用途の
多様性、酵素活性、有害化学物質の分解除去能力等から
ラッカーゼが特に好ましい。
【００１５】ラッカーゼは天然に広く動植物、菌類にお
いて存在し、いずれの起源からのラッカーゼも本発明に
利用することができるが、特に、酵素生産上の操作容易
性、（酵素の安定性、有害化学物質の毒性低減能力）等
の観点から種々の菌類、例えば、担子菌類、子嚢菌類、
不完全糸状菌類に由来するラッカーゼが好ましい。その
うち、特に担子菌から得られるラッカーゼが好適であ
る。担子菌としては、例えば、カワラタケ（Coriolus v
ersicolor）、スエヒロタケ（Schizophyllum commun
e）、ヒラタケ（Pleurotus ostreatus）等がある。ま
た、本発明の植物に導入し得るラッカーゼは分泌型ラッ
カーゼであってよい。ここで、分泌型ラッカーゼとは、
植物体外へタンパク質を分泌するために必要なシグナル
配列によって植物体外へ分泌されるラッカーゼのことを
意味する。
【００１６】植物に導入し得る本発明のタンパク質は、
配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有するもの
が挙げられ、担子菌から得られるラッカーゼ活性を有す
る天然のタンパク質だけでなく、その天然のタンパク質
に、活性を失わせない範囲内で、１若しくは数個のアミ
ノ酸を置換、欠失、付加して得られるタンパク質をも含
む。この配列のうち、アミノ酸位置１〜２１のアミノ酸
配列で示されるペプチドを含む領域はシグナル配列とし
て機能し、このシグナル配列によって本発明のタンパク
質が安定的に確実に植物体外に分泌され得る。シグナル
配列はタンパク質を分泌するための遺伝子であり、シグ
ナル配列はラッカーゼ遺伝子のＮ末端に機能的に結合し
ている。このため、形質転換植物から分泌型のタンパク
質、例えば、分泌型ラッカーゼを得ることを所望する場
合、配列番号１に示される、配列部分のアミノ酸位置１
〜２１のアミノ酸配列部分については、置換、欠失、付
加は避けるのが好ましい。
【００１７】上記のアミノ酸位置１〜２１のアミノ酸配
列で示される、ラッカーゼ遺伝子に天然に存在するシグ
ナル配列以外にも、公知のシグナル配列をフェノールオ
キシダーゼに連結することによって分泌生産することも
可能である。しかしながら、安定的に確実にラッカーゼ
を植物体外に分泌させることができるという点から、配
列番号１に示されるシグナル配列を含むアミノ酸配列を
有する分泌型ラッカーゼを用いるのが特に好ましい。
【００１８】植物に導入し得る本発明のタンパク質をコ
ードするDNAを単離するには、幾つかの遺伝子クローニ
ング方法を使用することができる。例えば、酵素を精製
し、そのアミノ酸配列を決定し、この配列をもとに合成
ヌクレオチドを作製し、ハイブリダイゼーション法によ
り遺伝子ライブラリーから選択できる。また、酵素の精
製を経ず、既知の遺伝子塩基配列情報を基にポリメラー
ゼチェインリアクション（PCR）に用いるプライマーを
作製し、PCRを行うことにより遺伝子の特定の領域、或
いは全領域を増幅し、単離する方法もある。
【００１９】植物に導入し得る本発明のタンパク質をコ
ードするDNAは、適当なプロモーター等と共に植物に導
入することにより、発現させることができる。プロモー
ターとしては、局所的な発現を可能にし得るプロモータ
ーが含まれ、例えば、根において強力な発現を可能にし
得るカリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーター(CM
V 35S-P)等を挙げることができる。また、この他、葉や
茎における局所的発現を促す公知のプロモーターを利用
できるが、産生されたタンパク質を分離・精製するため
の操作が煩雑になるため、根における強力な発現を可能
にし得るプロモーターの利用が特に好ましい。なお、こ
こで、局所的な発現とは、植物の局所においてのみ生じ
る発現だけではなく、他の部分と比較して、局所の発現
が一段と強力に生じ得るものも含まれることを意味す
る。その一段と強力に生じる程度とは、局所の発現が他
の部分の発現よりも約１／３〜１／２以上である場合を
いう。具体的には、根において局所的に発現し得ると
は、葉や茎においても発現を認めるが、根における発現
がそれらの部分の発現よりも著しく顕著であることを意
味する。
【００２０】さらに、発現を上昇させるプロモーターを
も導入可能である。そのようなプロモーターとしては、
例えば、CMV 35S-Pの上流の非翻訳領域（CMV 35S-up）
等を利用することができる。ターミネーターとしては、
植物細胞で機能するものであればよく、例えばノパリン
合成酵素遺伝子のターミネーターを挙げることができ
る。DNAの植物への導入は、エレクトロポレーション
法、パーティクルガンを用いる方法、及びアグロバクテ
リウムを用いる方法等、化学的、物理的、生物的方法を
用いて植物のゲノムに導入することが可能である。DNA
の導入された植物細胞は、抗生物質等の薬剤耐性等のマ
ーカーを利用することにより選抜され、再分化させるこ
とができる。
【００２１】本発明で使用できる植物は、細胞、組織、
器官からの再分化法が確立され、かつ遺伝子導入系が構
築されているものであればいずれの植物種にも適用でき
る。好ましい植物種としては、種子植物を例示すること
ができる。種子植物は、草本植物や木本植物のいずれで
もよいが、栽培上の容易性から草本植物が好ましく、例
えば、タバコ、イネ、芝草等が挙げられる。
【００２２】以上のようにして作製される形質転換植物
の根から本発明のタンパク質が分泌されるので、この植
物を水耕栽培溶液にて培養し、該栽培溶液から採取する
ことにより、不純物の少ない本発明のタンパク質を得る
ことが可能となる。水耕栽培溶液は、該形質転換植物が
生育し、かつ、本発明のタンパク質を分泌し得る溶液で
あれば特に制限されないが、例えば、Murashige & Skoo
g培地を利用することができる。水耕栽培溶液に本発明
の形質転換植物を植え、該植物の成長に適した温度下に
おいて培養する。形質転換植物からフェノールオキシダ
ーゼが十分に分泌されるまでの期間は、利用する植物の
種類によって異なり、該酵素の分泌状態を確認しながら
培養期間を適宜設定できるが、通常、１週間程度であ
る。水耕栽培溶液中に分泌された本発明のタンパク質
は、通常の酵素分離・精製法によって採取することがで
きる。例えば、フェノールオキシダーゼを含む栽培溶液
を遠心分離にかけ、さらに限外濾過膜を用いて濃縮する
ことができる。さらに、フェノールオキシダーゼのN末
端もしくはC末端に６残基のヒスチジンを連結する構築
物を作成し、それを発現させることにより、例えば、固
定化金属アフィニティークロマトグラフィー精製レジン
で、簡便に該酵素を精製することができる。このように
して得られた酵素は、排水処理、人工漆塗料の製造、飲
料の混濁防止、臨床分析等の分野において利用すること
ができる。
【００２３】また、上述のように、本発明のタンパク質
には有害化学物質の分解除去作用があるので、本発明の
形質転換植物を有害化学物質により汚染された環境で栽
培することにより、持続的かつ自立的に、根圏における
有害物質を分解除去することも可能である。さらに、本
発明の形質転換植物から採取されたタンパク質を有害化
学物質により汚染された環境に散布することによっても
有害物質を分解除去することができる。ここで、有害化
学物質とは、人体に毒性又は内分泌撹乱性を示す物質で
あって、フェノールオキシダーゼ、特にラッカーゼによ
り分解もしくは毒性の低減が可能な物質をいう。具体的
には、クロロフェノール、農薬、多環芳香族炭化水素、
アルキルフェノール、芳香族炭化水素、ニトロ化合物を
例示できる。また、環境とは、例えば、土壌、湖沼、河
川などをいう。
【００２４】
【実施例】〔実施例１〕カワラタケのラッカーゼcDNAの
クローニング ラッカーゼをコードするcDNAを単離するために、DDBJ a
ccession No. D13372に登録されているカワラタケ（Cor
iolus versicolor IFO30340）のラッカーゼ・ゲノムの
塩基配列のなかからラッカーゼをコードする領域の上流
と下流領域、即ち、開始コドンより２０塩基また終始コ
ドンより２２塩基の塩基配列を選択し、オリゴヌクレオ
チドを化学合成した。
【００２５】上記のように作製したオリゴヌクレオチド
をプライマーに、カワラタケのcDNAを鋳型としてPCRを
行った。反応は、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で90秒
を25サイクル行った。反応には、Pyrobest DNAポリメラ
ーゼ（宝酒造）を用いた。反応液の一部を1.5％アガロ
ースゲルの電気泳動で分離したところ、予想したサイズ
にDNAの増幅物が認められた。増幅断片をアガロースよ
り切り出し、抽出した後、シークエンスに供した。これ
により、配列番号１に示す完全長のcDNAを得た。また、
対応するアミノ酸配列を配列番号２に示した。
【００２６】〔実施例２〕ベクターの構築と植物への導
入 制限酵素部位を導入したラッカーゼcDNAを得るために、
プライマーの合成を行った。各プライマーの塩基配列
は、以下の通りである。 LfXb:5'-ttgtttctagatgtcgaggtttcactctct-3' LBa:5'-aattggatccttactggtcgctcgggtcgagcg-3' 上記の合成DNAをプライマーに用い、配列番号１のラッ
カーゼcDNAをテンプレートとし、Pyrobest DNAポリメラ
ーゼによりPCRを行った。反応は、98℃で10秒、60℃で3
0秒、72℃で80秒を30サイクル行った。LfXbとLBaのプラ
イマーにより、完全長のラッカーゼcDNA（配列番号１）
にXba I制限部位とBam HI制限部位を付加した断片を得
て、これをpCR2.1に挿入した。塩基配列は、シークエン
スを行い確認した。
【００２７】上記で増幅したcDNA断片をpCR2.1から切り
だし、特に植物の根における強力な発現を可能にし得る
CMV 35S-Pを含むプラスミドpBI221のXba I、Bam HI部位
に挿入した。そのプラスミドをpfLac/pBI221と命名し
た。さらに、プラスミドpfLac/pBI221のCMV 35S-Pの上
流にあるHind III、Pst I部位にCMV 35S-upを挿入する
ことでラッカーゼ遺伝子の発現効率の向上を図った。得
られたプラスミドをpW35SfLac/pBI221と命名した。プラ
スミドpW35SfLac/pBI221をHind III、Bam HIで消化し、
CMV 35S-up、CMV35S-P及びラッカーゼ遺伝子を含む断片
をpBI121のHind III、Bam HI部位に挿入した。そのプラ
スミドをpW35SfLac /pBI121（図１）と命名した。
【００２８】pW35SfLac /pBI121を保持するアグロバク
テリウム・ツメファシエンスLBA4404株を用いて、タバ
コSR1 株に分泌型ラッカーゼ遺伝子を導入し、形質転換
植物体を得た。また、pBI121を保持するアグロバクテリ
ウム・ツメファシエンスLBA4404株を用いてタバコSR1株
の形質転換植物体を得、これを対照とした。これらの形
質転換植物体にそれぞれの遺伝子が導入されていること
は、各個体由来の全DNAを用いたサザン解析、PCR解析に
よって確かめた。
【００２９】〔実施例３〕形質転換植物体の根から分泌
されたラッカーゼ活性の検出 ショ糖含量を所定量の１／５にしたMurashige & Skoog
培地を水耕栽培溶液として調製した。体長20cm程度に生
育させた、実施例２で作製の形質転換植物体タバコSR1
株を植え、２８℃で培養した。１週間培養後、培養液１
０mlを取り、それを12,000xgで１５分間遠心し、分子量
１０，０００以下を除外する限外濾過膜を用いて１／
１，０００に濃縮した。このときの蛋白濃度は１０μg/
１０μｌであった。この溶液を等電点電気泳動により展
開し、４−クロロ−１−ナフトールにより活性染色し
た。その結果を図２に示す。図中、１はカワラタケの粗
酵素液、２〜１２は形質転換植物体の培養液の濃縮物、
C1及びC2は対照植物（pBI121のみを導入した植物）の培
養液の濃縮物の結果である。図２から明らかなように、
ラッカーゼ遺伝子を導入した形質転換植物の栽培溶液か
らだけ、該遺伝子がコードするラッカーゼの等電点であ
るpI３．５付近に明瞭なバンドが認められた（図２中の
２から１１）。また、同条件で調製した、pBI121のみを
導入した対照植物の培養液には全くバンドが認められな
かった（図２中のＣ１とＣ２）。
【００３０】以上の結果から、ラッカーゼ遺伝子を導入
した形質転換植物は、その根から活性のあるラッカーゼ
を分泌していることが明らかとなった。従って、草本類
や木本類にラッカーゼ遺伝子を導入し、それら遺伝子を
形質転換植物体で発現させることによって、ラッカーゼ
を形質転換植物体の根から分泌させることが出来ること
が確認された。
【００３１】
【発明の効果】本発明によるフェノールオキシダーゼ遺
伝子が導入された植物によって、効率よく、かつ低コス
トでフェノールオキシダーゼを生産することができる。
また、この植物を有害化学物質により汚染された環境で
栽培することにより、有害化学物質を分解除去すること
ができる。
【００３２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology <120> Phenoloxidase gene transferred plant and a method for producing ph enoloxidase using the plant <130> 325-01317 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1563 <212> DNA <213> Coriolus versicolor <220> <221> CDS <222> (1)..(1563) <400> 1 atg tcg agg ttt cac tct ctt ctc gct ttc gtc gtt gct tcc ctt acg 48 Met Ser Arg Phe His Ser Leu Leu Ala Phe Val Val Ala Ser Leu Thr 1 5 10 15 gct gtg gcc cac gct ggt atc ggt ccc gtc gcc gac ctc acc atc acc 96 Ala Val Ala His Ala Gly Ile Gly Pro Val Ala Asp Leu Thr Ile Thr 20 25 30 aac gca gcg gtc agc cct gat ggg ttt tct cgc cag gcc gtc gtc gtg 144 Asn Ala Ala Val Ser Pro Asp Gly Phe Ser Arg Gln Ala Val Val Val 35 40 45 aac ggc ggc acc cct gga cct ctc atc acc ggt aac atg ggg gat cgc 192 Asn Gly Gly Thr Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Asn Met Gly Asp Arg 50 55 60 ttc cag ctc aat gtc atc gac aac ctc acc aac cac acg atg ctg aag 240 Phe Gln Leu Asn Val Ile Asp Asn Leu Thr Asn His Thr Met Leu Lys 65 70 75 80 agc acc agt att cac tgg cac ggt ttc ttc cag aag ggc acg aac tgg 288 Ser Thr Ser Ile His Trp His Gly Phe Phe Gln Lys Gly Thr Asn Trp 85 90 95 gcc gac ggt ccc gcc ttc atc aac cag tgc ccg atc tca tct ggt cac 336 Ala Asp Gly Pro Ala Phe Ile Asn Gln Cys Pro Ile Ser Ser Gly His 100 105 110 tcg ttc ctg tac gac ttc cag gtt cct gac cag gct ggc acc ttc tgg 384 Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Gln Val Pro Asp Gln Ala Gly Thr Phe Trp 115 120 125 tac cac agt cac ttg tcc acg cag tac tgt gat ggt ctg agg ggt ccg 432 Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly Pro 130 135 140 ttc gtt gtt tac gag ccg aat gag ccg gcc gcc gac ttg tac gac gtc 480 Phe Val Val Tyr Glu Pro Asn Glu Pro Ala Ala Asp Leu Tyr Asp Val 145 150 155 160 gac aac gac gac act gtc att acc ctc gtg gat tgg tac cac gtc gcc 528 Asp Asn Asp Asp Thr Val Ile Thr Leu Val Asp Trp Tyr His Val Ala 165 170 175 gcg aac gtg ggc cct gcc ttc cct ctc ggc gcc gat gcg acc ctc atc 576 Ala Asn Val Gly Pro Ala Phe Pro Leu Gly Ala Asp Ala Thr Leu Ile 180 185 190 aat ggc aag gga cgc tcc ccc agc acg acc acc gcg gac ctc tct gtt 624 Asn Gly Lys Gly Arg Ser Pro Ser Thr Thr Thr Ala Asp Leu Ser Val 195 200 205 atc agc gtc acc ccg ggt aaa cgg tac cgt ttc cgc ctg gtg tcc ctg 672 Ile Ser Val Thr Pro Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Leu 210 215 220 tcg tgc gac ccc aac tac acg ttc agc atc gat ggt cac aac atg acg 720 Ser Cys Asp Pro Asn Tyr Thr Phe Ser Ile Asp Gly His Asn Met Thr 225 230 235 240 atc atc gag acc gac tcg atc aac acg gcg ccc ctc gtg gtc gac tcc 768 Ile Ile Glu Thr Asp Ser Ile Asn Thr Ala Pro Leu Val Val Asp Ser 245 250 255 att cag atc ttc gcc gcc cag cgt tac tcc ttc gtg ctc gag gcc aac 816 Ile Gln Ile Phe Ala Ala Gln Arg Tyr Ser Phe Val Leu Glu Ala Asn 260 265 270 cag gcc gtc gac aac tac tgg att cgc gcc aac ccc aac ttc ggt aac 864 Gln Ala Val Asp Asn Tyr Trp Ile Arg Ala Asn Pro Asn Phe Gly Asn 275 280 285 gtc ggg ttc acc ggc ggc atc aac tcg gct atc ctc cgc tac gat ggt 912 Val Gly Phe Thr Gly Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Asp Gly 290 295 300 gcc gct gcc gtc gag ccc act acc acg cag acc act tcg acc gag ccg 960 Ala Ala Ala Val Glu Pro Thr Thr Thr Gln Thr Thr Ser Thr Glu Pro 305 310 315 320 ctc aat gag gtc aac ctg cac ccg ttg gtt gcc acc gct gtt cct ggc 1008 Leu Asn Glu Val Asn Leu His Pro Leu Val Ala Thr Ala Val Pro Gly 325 330 335 tct ccg ttt gcg ggt ggt gtc gac ctg gcc atc aac atg gcg ttc aac 1056 Ser Pro Phe Ala Gly Gly Val Asp Leu Ala Ile Asn Met Ala Phe Asn 340 345 350 ttc aac ggc acc aac ttc ttc atc aac ggc gcg tct ttc acg ccc ccg 1104 Phe Asn Gly Thr Asn Phe Phe Ile Asn Gly Ala Ser Phe Thr Pro Pro 355 360 365 acc gtg cct gtc ctc ctc cag atc atc agc ggc gcg cag aac gcg caa 1152 Thr Val Pro Val Leu Leu Gln Ile Ile Ser Gly Ala Gln Asn Ala Gln 370 375 380 gac ctc ctg ccc tct ggc agc gtc tac tcg ctc ccc tcg aac gcc gac 1200 Asp Leu Leu Pro Ser Gly Ser Val Tyr Ser Leu Pro Ser Asn Ala Asp 385 390 395 400 atc gag atc tcg ttc ccc gcc acc gcc gcc gcc cct ggt gcg ccc cac 1248 Ile Glu Ile Ser Phe Pro Ala Thr Ala Ala Ala Pro Gly Ala Pro His 405 410 415 ccc ttc cac ttg cac ggg cac gcg ttc ggc gtc gtc cgc agc gcc ggc 1296 Pro Phe His Leu His Gly His Ala Phe Gly Val Val Arg Ser Ala Gly 420 425 430 agc aca gtc tac aac tac gac aac ccc atc ttc cgc gac gtc gtc agc 1344 Ser Thr Val Tyr Asn Tyr Asp Asn Pro Ile Phe Arg Asp Val Val Ser 435 440 445 acg ggg acg cct gcg gcc ggt gac aac gtc acc atc cgc ttc cgc acc 1392 Thr Gly Thr Pro Ala Ala Gly Asp Asn Val Thr Ile Arg Phe Arg Thr 450 455 460 gac aac ccc ggc ccg tgg ttc ctc cat tgc cac atc gac ttc cac ctc 1440 Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile Asp Phe His Leu 465 470 475 480 gag ggc ggt ttc ggc gtc gtg ttg gcg gag gac atc gcc gac gtt gcg 1488 Glu Gly Gly Phe Gly Val Val Leu Ala Glu Asp Ile Ala Asp Val Ala 485 490 495 tcg gcg aac ccc gtg ccc cag gcg tgg tcc gac ctc tgc ccg acc tac 1536 Ser Ala Asn Pro Val Pro Gln Ala Trp Ser Asp Leu Cys Pro Thr Tyr 500 505 510 gat gcg ctc gac ccg agc gac cag taa 1563 Asp Ala Leu Asp Pro Ser Asp Gln 515 520 <210> 2 <211> 520 <212> PRT <213> Coriolus versicolor <400> 2 Met Ser Arg Phe His Ser Leu Leu Ala Phe Val Val Ala Ser Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Ala His Ala Gly Ile Gly Pro Val Ala Asp Leu Thr Ile Thr 20 25 30 Asn Ala Ala Val Ser Pro Asp Gly Phe Ser Arg Gln Ala Val Val Val 35 40 45 Asn Gly Gly Thr Pro Gly Pro Leu Ile Thr Gly Asn Met Gly Asp Arg 50 55 60 Phe Gln Leu Asn Val Ile Asp Asn Leu Thr Asn His Thr Met Leu Lys 65 70 75 80 Ser Thr Ser Ile His Trp His Gly Phe Phe Gln Lys Gly Thr Asn Trp 85 90 95 Ala Asp Gly Pro Ala Phe Ile Asn Gln Cys Pro Ile Ser Ser Gly His 100 105 110 Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Gln Val Pro Asp Gln Ala Gly Thr Phe Trp 115 120 125 Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gln Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly Pro 130 135 140 Phe Val Val Tyr Glu Pro Asn Glu Pro Ala Ala Asp Leu Tyr Asp Val 145 150 155 160 Asp Asn Asp Asp Thr Val Ile Thr Leu Val Asp Trp Tyr His Val Ala 165 170 175 Ala Asn Val Gly Pro Ala Phe Pro Leu Gly Ala Asp Ala Thr Leu Ile 180 185 190 Asn Gly Lys Gly Arg Ser Pro Ser Thr Thr Thr Ala Asp Leu Ser Val 195 200 205 Ile Ser Val Thr Pro Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser Leu 210 215 220 Ser Cys Asp Pro Asn Tyr Thr Phe Ser Ile Asp Gly His Asn Met Thr 225 230 235 240 Ile Ile Glu Thr Asp Ser Ile Asn Thr Ala Pro Leu Val Val Asp Ser 245 250 255 Ile Gln Ile Phe Ala Ala Gln Arg Tyr Ser Phe Val Leu Glu Ala Asn 260 265 270 Gln Ala Val Asp Asn Tyr Trp Ile Arg Ala Asn Pro Asn Phe Gly Asn 275 280 285 Val Gly Phe Thr Gly Gly Ile Asn Ser Ala Ile Leu Arg Tyr Asp Gly 290 295 300 Ala Ala Ala Val Glu Pro Thr Thr Thr Gln Thr Thr Ser Thr Glu Pro 305 310 315 320 Leu Asn Glu Val Asn Leu His Pro Leu Val Ala Thr Ala Val Pro Gly 325 330 335 Ser Pro Phe Ala Gly Gly Val Asp Leu Ala Ile Asn Met Ala Phe Asn 340 345 350 Phe Asn Gly Thr Asn Phe Phe Ile Asn Gly Ala Ser Phe Thr Pro Pro 355 360 365 Thr Val Pro Val Leu Leu Gln Ile Ile Ser Gly Ala Gln Asn Ala Gln 370 375 380 Asp Leu Leu Pro Ser Gly Ser Val Tyr Ser Leu Pro Ser Asn Ala Asp 385 390 395 400 Ile Glu Ile Ser Phe Pro Ala Thr Ala Ala Ala Pro Gly Ala Pro His 405 410 415 Pro Phe His Leu His Gly His Ala Phe Gly Val Val Arg Ser Ala Gly 420 425 430 Ser Thr Val Tyr Asn Tyr Asp Asn Pro Ile Phe Arg Asp Val Val Ser 435 440 445 Thr Gly Thr Pro Ala Ala Gly Asp Asn Val Thr Ile Arg Phe Arg Thr 450 455 460 Asp Asn Pro Gly Pro Trp Phe Leu His Cys His Ile Asp Phe His Leu 465 470 475 480 Glu Gly Gly Phe Gly Val Val Leu Ala Glu Asp Ile Ala Asp Val Ala 485 490 495 Ser Ala Asn Pro Val Pro Gln Ala Trp Ser Asp Leu Cys Pro Thr Tyr 500 505 510 Asp Ala Leu Asp Pro Ser Asp Gln 515 520 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer LfXb <400> 3 ttgtttctag atgtcgaggt ttcactctct 30 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer LBa <400> 4 aattggatcc ttactggtcg ctcgggtcga gcg 33
【００３３】
【配列表フリーテキスト】配列番号３：プライマー LfX
b 配列番号４：プライマー LBa
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpW35SfLac /pBI121の構造を示す図
である。
【図２】栽培溶液中に分泌されたラッカーゼを等電点電
気泳動し、活性染色した図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ ４Ｄ０４０ Ｆターム(参考） 2B030 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 AA17 BA08 CA02 DA01 GA11 HA20 4B050 CC03 DD05 EE10 LL10 4B065 AA71Y AA88X AB01 AC15 AC20 BA01 BD50 CA28 CA53 CA56 4D004 AA41 AB06 AB07 CA20 CC07 4D040 CC02

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 フェノールオキシダーゼをコードするDN
    Aが導入され、そのDNAが発現している植物。
  2. 【請求項２】 DNAが根において局所的に発現すること
    を特徴とする、請求項１に記載の植物。
  3. 【請求項３】 フェノールオキシダーゼをコードするDN
    Aが、ラッカーゼをコードするDNAであることを特徴とす
    る、請求項１又は２に記載の植物。
  4. 【請求項４】 ラッカーゼが分泌型ラッカーゼであるこ
    とを特徴とする、請求項３に記載の植物。
  5. 【請求項５】 ラッカーゼが担子菌由来のラッカーゼで
    あることを特徴とする、請求項３に記載の植物。
  6. 【請求項６】 担子菌がカワラタケであることを特徴と
    する、請求項５に記載の植物。
  7. 【請求項７】 以下の(a)又は(b)のタンパク質： (a)配列番号１に記載のアミノ酸配列により表されるタ
    ンパク質 (b)配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１個又
    は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸
    配列により表され、かつラッカーゼ活性を有するタンパ
    ク質、をコードするDNAが導入され、そのDNAが発現して
    いる植物。
  8. 【請求項８】 植物が種子植物であることを特徴とす
    る、請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物。
  9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の植
    物を水耕栽培溶液にて培養し、該栽培溶液からフェノー
    ルオキシダーゼを採取することを特徴とする、フェノー
    ルオキシダーゼの生産方法。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜８のいずれか１項に記載の
    植物を有害化学物質により汚染された環境で栽培するこ
    とを特徴とする、有害化学物質の分解除去方法。
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