CN104209316B - 固定化漆酶对克百威与毒死蜱污染土壤的修复方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固定化漆酶对克百威和毒死蜱污染土壤的修复方法,即将固定化漆酶分别用于克百威和毒死蜱污染的土壤进行修复,土壤采用泥浆,水土比为3:1,其中农药的初始浓度为100mg/L,固定化漆酶投入泥浆中的量为20g/60ml,温度为25~45℃,pH值为5~9,每隔8h进行一次农药降解率的测定。本发明可以在较宽的pH、温度及盐浓度范围内处理中、高浓度的污染物,在不产生二次污染的情况下,使克百威或毒死蜱污染的土壤得到有效的修复。
Description
技术领域:
本发明属于环保领域,具体的说是采用两种方法对漆酶进行固定化并采用固定化漆酶对克百威与毒死蜱污染土壤的修复方法。
背景技术:
漆酶(laccase)亦称为对苯二酚氧化酶,是一种含铜的氧化还原酶,属于氧化酶的蓝铜家族,广泛存在于植物、细菌和几乎所有的真菌中。漆酶具有较好的底物专一性和稳定性,可降解多环芳烃化合物(PAHs)、氯化芳香化合物、苯酚和甾体类激素及其衍生物等多种化合物,另外漆酶在进行反应时产生的副产物只有水,完全称得上是一种“生态友善”的酶,在环保方面具有巨大的应用价值。
与直接利用游离态漆酶相比,先将漆酶经过物理或化学的方法固定在某一载体上再加以利用具有以下几点优势:1.酶稳定性有所提高,游离态漆酶在使用过程中易随环境的变化而变性失活,将其固定化后可明显提高漆酶的稳定性;2.固定化漆酶易从反应系统中分离,同时反应也较易于控制;3.完成降解后,固定化漆酶可进行回收、重复利用;4.酶固定化后便于运输和贮存。
发明内容:
发明目的:
本发明涉及一种固定化漆酶对克百威与毒死蜱污染土壤的修复方法,其目的是采用固定化后的真菌漆酶来降解土壤中的克百威与毒死蜱,为农药污染土壤的修复开辟一条新的途径。
技术方案:
一种固定化漆酶对克百威与毒死蜱污染土壤的修复方法,其特征在于:具体步骤如下:利用固定化漆酶对克百威或毒死蜱污染的土壤进行修复,土壤采用泥浆,水土比为3:1,污染物的初始浓度为100mg/L,固定化漆酶投入泥浆中的量为20g/60ml,温度为25-45℃,pH值为5-9,降解时间为72h。
对漆酶进行固定的一种方法如下:
将质量浓度为3%的海藻酸钠溶液在60℃恒温加热,并不断搅拌至海藻酸钠完全溶解为均匀的胶体,静置至海藻酸钠胶体完全冷却,将海藻酸钠胶体通过制粒器滴入装有质量浓度1%氯化钙溶液的烧杯中(氯化钙的主要作用是包裹住海藻酸钠胶体,制得的载体表面为氯化钙,里面为海藻酸钠),制成直径为3.0mm-7.0mm的载体小球;载体小球在120r/min、25℃条件下振荡4h后取出,使用蒸馏水反复、多次冲洗,直至氯化钙溶液完全洗净;随后将载体小球放入装有体积浓度1%戊二醛溶液的锥形瓶中,交联6h;取出并用蒸馏水多次洗涤小球,直至载体表面的戊二醛被完全洗净;最后将完成交联的载体小球移入装有游离态漆酶的锥形瓶中,于120r/min、25℃条件下在恒温摇床中固定化4h,取出并洗去小球表面的游离态漆酶,得到固定化漆酶。
对漆酶进行固定的另一种方法如下:
将质量浓度为2%的海藻酸钠溶液在60℃恒温加热,并不断搅拌至海藻酸钠完全溶解为均匀的胶体,静置至海藻酸钠胶体完全冷却,随后在海藻酸钠胶体中加入占混合溶液质量1%的活性炭粉末(此处指加入的活性炭质量为混合溶液(这里忽略海藻酸钠的质量,计算上单指其中蒸馏水的质量)质量的1%,例:该种载体为0.4g海藻酸钠加上20ml蒸馏水,混合成为胶体后再加入0.2g的活性炭,此时其中有2%的海藻酸钠、1%的活性炭),匀速搅拌使活性炭粉末在其中分布均匀;之后将混合的胶体通过制粒器滴入装有质量浓度1%氯化钙溶液的烧杯中,制成直径为3.0mm-7.0mm的载体小球;载体小球在120r/min、25℃条件下振荡4h后取出,使用蒸馏水反复、多次冲洗,直至氯化钙溶液完全洗净;随后将载体小球放入装有游离态漆酶的锥形瓶中,于120r/min、25℃条件下在恒温摇床中固定化4h,取出并洗去小球表面的游离态漆酶,即得到固定化漆酶。
优点及效果:
本发明提出了一种固定化漆酶对克百威与毒死蜱污染土壤的修复方法,具有如下优点:
1.成本较低:发明中采用的固定化载体材料主要有海藻酸钠、氯化钙、活性炭,这些材料都具有来源丰富、价格低廉等特点,另外漆酶也是自然界中广泛存在的一种酶类,较易于获得;
2.绿色环保:发明中所用的大部分材料都具有无毒无害、性质稳定、生物相容以及抗微生物分解等特点,在使用中不会造成二次污染;
3.发明中固定化漆酶的制备或农药的降解都可在正常条件下进行,同时操作也较简便,因而可进行大范围的推广。
将两种固定化漆酶应用于克百威与毒死蜱的降解工作中,利用高效液相色谱法测定农药的降解率,得出两种固定化漆酶对克百威或毒死蜱都具有较好的降解效果。
具体实施方式:
一种固定化漆酶对克百威和毒死蜱污染土壤的修复方法,其特征在于:具体方法步骤如下:利用固定化漆酶对克百威或毒死蜱污染的土壤进行修复,土壤采用泥浆,水土比为3:1,污染物的初始浓度为100mg/L,固定化漆酶投入泥浆中的量为20g/60ml,温度为25-45℃,pH值为5-9,降解时间为72h,每隔8h进行一次农药降解率的测定。
本发明同时以农药空白、载体空白和游离态漆酶作为对照。考虑到固定化漆酶在环境中应用时会受到一些环境影响因子的影响,故对其进行了一定的研究,首先考察不同温度(25℃、35℃和45℃)对固定化漆酶降解农药的影响,其次检验不同的pH值对降解过程的影响,其中设定的pH分别为5、7和9,每隔8h进行一次农药降解率的测定。
第一种对漆酶的固定化方法采用了海藻酸钠为主要载体材料,具体操作如下:
准确称取0.6g海藻酸钠、1g氯化钙分别于100ml、500ml的烧杯中,向其中再分别加入20ml、99ml的蒸馏水。在60℃左右恒温加热海藻酸钠溶液,并不断搅拌至海藻酸钠完全溶解为均匀的胶体,静置一段时间。将冷却完全的海藻酸钠胶体通过制粒器滴入装有氯化钙溶液的500ml烧杯中,制成直径为4.0mm的载体小球。小球在120r/min、25℃条件下振荡4h后取出,使用蒸馏水反复、多次冲洗,直至氯化钙溶液完全洗净。随后将载体小球放入装有1%戊二醛溶液的250ml锥形瓶中,交联6h。取出并用蒸馏水多次洗涤小球,直至载体表面的戊二醛被完全洗净。最后将完成交联的载体小球移入装有游离态漆酶的250ml锥形瓶中,于120r/min、25℃条件下在恒温摇床中固定化4h,取出并洗去小球表面的游离态漆酶,制备完成后固定化漆酶可放入冰箱中冷藏备用。
第二种对漆酶的固定化方法采用了海藻酸钠、活性炭粉末为主要的载体材料,具体操作如下:
准确称取0.4g海藻酸钠、1g氯化钙分别于100ml、500ml的烧杯中,向其中再分别加入20ml、99ml的蒸馏水,另外再称取0.4g的活性炭粉末备用。在60℃左右恒温加热海藻酸钠溶液,并不断搅拌至海藻酸钠完全溶解为均匀的胶体,静置一段时间。在冷却完全的海藻酸钠胶体中加入准备好的活性炭粉末,匀速搅拌使活性炭粉末在其中分布均匀。之后将混合的胶体通过制粒器滴入装有氯化钙溶液的500ml烧杯中,制成直径为4.0mm的载体小球。小球在120r/min、25℃条件下振荡4h后取出,使用蒸馏水反复、多次冲洗,直至氯化钙溶液完全洗净。随后将载体小球放入装有游离态漆酶的250ml锥形瓶中,于120r/min、25℃条件下在恒温摇床中固定化4h,取出并洗去小球表面的游离态漆酶,制备完成后固定化漆酶可放入冰箱中冷藏备用。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明,但本发明的保护范围不受实施例的限制。
实施例1:
在相同温度、pH和振荡速度的条件下,将两种固定化漆酶、游离态漆酶分别放入含有100mg/L克百威与毒死蜱的泥浆中,每隔8h测定一次两种固定化漆酶以及游离态漆酶对克百威和毒死蜱的降解率,72h后得出固定化漆酶或游离态漆酶对两种农药都具有一定的降解效果,且前48h内的降解速率要快一些,同时随着降解时间的增加固定化漆酶的降解效果明显要优于游离态漆酶。这初步说明,从降解率的角度来看,本发明中的漆酶用于修复克百威或毒死蜱污染的土壤是可行的。
表1固定化漆酶、游离态漆酶对两种农药的降解率比较
实施例2:
设置反应降解时的温度为35℃,pH为5.0、7.0、9.0,将两种固定化漆酶分别投入含有100mg/L克百威或毒死蜱的泥浆中,在120r/min的条件下振荡,每隔8h测定一次农药的降解率,72h后两种固定化漆酶对于克百威或毒死蜱的降解率都可达到60%以上,同时两种固定化漆酶都在pH为5.0时对农药具有较好的降解效果。另外由于活性炭的吸附作用,第二种固定化漆酶的降解效果要略优于第一种固定化漆酶对农药的降解效果。
表2不同pH值下固定化漆酶降解农药的相关参数
实施例3:
设置反应降解时的pH为5.0,温度为25℃、35℃、45℃,将两种固定化漆酶分别投入含有100mg/L克百威或毒死蜱的泥浆中,在120r/min的条件下振荡,每隔8h测定一次农药的降解率,72h后两种固定化漆酶对于克百威或毒死蜱的降解率同样都可达到70%以上,而当温度为35℃时,固定化漆酶对克百威或毒死蜱的降解率达到了最高值,第一种固定化漆酶对克百威的降解率为83.27%,对毒死蜱的降解率为79.66%,第二种固定化漆酶对克百威的降解率为91.40%。对毒死蜱的降解率为87.31%。
实施例4:
准确称取0.6g海藻酸钠、1g氯化钙分别于100ml、500ml的烧杯中,向其中再分别加入20ml、99ml的蒸馏水。在60℃恒温加热海藻酸钠溶液,并不断搅拌至海藻酸钠完全溶解为均匀的胶体,静置一段时间。将冷却完全的海藻酸钠胶体通过制粒器滴入装有氯化钙溶液的500ml烧杯中,制成直径为4.0mm的载体小球。小球在120r/min、25℃条件下振荡4h后取出,使用蒸馏水反复、多次冲洗,直至氯化钙溶液完全洗净。随后载体小球移入装有游离态漆酶的250ml锥形瓶中,于120r/min、25℃条件下在恒温摇床中固定化4h,取出并洗去小球表面的游离态漆酶,放入冰箱中冷藏备用。取20g固定化漆酶小球放入含有100mg/L克百威或毒死蜱的泥浆中,调节pH为5.0,温度为35℃,每隔8h测定一次农药的降解率,得出固定化漆酶在最初的48h内降解速率较快,72h后克百威与毒死蜱的降解率可分别到达85.31%和80.49%。
实施例5:
准确称取0.4g海藻酸钠、1g氯化钙分别于100ml、500ml的烧杯中,向其中再分别加入20ml、99ml的蒸馏水,另外再称取0.2g的活性炭粉末备用。在60℃恒温加热海藻酸钠溶液,并不断搅拌至海藻酸钠完全溶解为均匀的胶体,静置一段时间。在冷却完全的海藻酸钠胶体中加入准备好的活性炭粉末,匀速搅拌使活性炭粉末在其中分布均匀。之后将混合的胶体通过制粒器滴入装有氯化钙溶液的500ml烧杯中,制成直径为4.0mm的载体小球。小球在120r/min、25℃条件下振荡4h后取出,使用蒸馏水反复、多次冲洗,直至氯化钙溶液完全洗净。随后将载体小球放入装有游离态漆酶的250ml锥形瓶中,于120r/min、25℃条件下在恒温摇床中固定化4h,取出并洗去小球表面的游离态漆酶,放入冰箱中冷藏备用。取20g固定化漆酶小球放入含有100mg/L克百威或毒死蜱的土壤泥浆中,调节pH为5.0,温度为35℃,每隔8h测定一次农药的降解率,得出固定化漆酶在最初的48h内降解速率较快,72h后克百威与毒死蜱的降解率可分别到达89.72%和85.64%。
实施例6:
将混合的胶体通过制粒器滴入装有氯化钙溶液的烧杯中,制成直径为3.0mm的载体小球,其他条件同实施例4。
实施例7:
将混合的胶体通过制粒器滴入装有氯化钙溶液的烧杯中,制成直径为7.0mm的载体小球,其他条件同实施例5。
结论:采用本发明中的固定化漆酶分别对克百威与毒死蜱污染的土壤进行修复,通过农药降解率的测定可知该发明可有效的修复有机污染土壤。
Claims (1)
1.一种固定化漆酶对克百威与毒死蜱污染土壤的修复方法,其特征在于:具体步骤如下:利用固定化漆酶对克百威与毒死蜱污染的土壤进行修复,土壤采用泥浆,水土比为3:1,污染物的初始浓度为100mg/L,固定化漆酶投入泥浆中的量为20g/60ml,温度为25-45℃,pH值为5-9,降解时间为72h;
对漆酶进行固定的方法如下:
将质量浓度为3%的海藻酸钠溶液在60℃恒温加热,并不断搅拌至海藻酸钠完全溶解为均匀的胶体,静置至海藻酸钠胶体完全冷却,将海藻酸钠胶体通过制粒器滴入装有质量浓度1%氯化钙溶液的烧杯中,制成直径为3.0mm-7.0mm的载体小球;载体小球在120r/min、25℃条件下振荡4h后取出,使用蒸馏水反复、多次冲洗,直至氯化钙溶液完全洗净;随后将载体小球放入装有体积浓度1%戊二醛溶液的锥形瓶中,交联6h;取出并用蒸馏水多次洗涤载体小球,直至载体小球表面的戊二醛被完全洗净;最后将完成交联的载体小球移入装有游离态漆酶的锥形瓶中,于120r/min、25℃条件下在恒温摇床中固定化4h,取出并洗去载体小球表面的游离态漆酶,得到固定化漆酶;
或将质量浓度为2%的海藻酸钠溶液在60℃恒温加热,并不断搅拌至海藻酸钠完全溶解为均匀的胶体,静置至海藻酸钠胶体完全冷却,随后在海藻酸钠胶体中加入占混合溶液质量1%的活性炭粉末,匀速搅拌使活性炭粉末在其中分布均匀;之后将混合的胶体通过制粒器滴入装有质量浓度1%氯化钙溶液的烧杯中,制成直径为3.0mm-7.0mm的载体小球;载体小球在120r/min、25℃条件下振荡4h后取出,使用蒸馏水反复、多次冲洗,直至氯化钙溶液完全洗净;随后将载体小球放入装有游离态漆酶的锥形瓶中,于120r/min、25℃条件下在恒温摇床中固定化4h,取出并洗去载体小球表面的游离态漆酶,即得到固定化漆酶。
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