CN113025337A - 一种土壤修复制剂的制备方法及其在土壤修复中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种土壤修复制剂的制备方法及其在土壤修复中的应用，属于土壤修复领域。本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该土壤修复制剂的制备方法，其特点在于：所述制备方法包括如下步骤：第一步、将漆酶加入pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液中制成漆酶溶液；第二步、加入复合载体，在温度为40°C、转速为150 rpm的恒温振荡培养箱中反应1～9 h；第三步、进行真空抽滤、并获得滤饼，滤饼经室温干燥后获得初级修复制剂；第四步、将此初级修复制剂添加至一定体积分数的交联剂体系中进行交联反应，交联时间为1～5 h；第五步、先后用去离子水和pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液进行充分冲洗，再经真空抽滤、并在室温干燥后获得土壤修复制剂。

Description

一种土壤修复制剂的制备方法及其在土壤修复中的应用

技术领域

本发明涉及一种土壤修复制剂的制备方法及其在土壤修复中的应用，属于土壤修复领域。

背景技术

在工业农业生产过程中，随着工业企业废物不达标排放、农资产品的过度施用等人为原因，加之污染物随着大气、雨水等沉降作用，土壤已然成为了多种污染物主要的汇集地。研究表明，土壤中有机污染物及重金属会通过不同渠道，如空气传播、食物链传播等进入人体，进而对人体健康构成严重威胁。现如今，工程修复实施过程中，针对多种污染物污染的复合型污染土壤多采用多种修复技术，进而对不同污染物进行修复，这不仅提高了修复成本及修复时间，而且在修复过程中用到的修复制剂的残留往往对被修复土壤也具有一定的影响，或造成二次污染，特别对于农用地土壤，可能会影响后期农作物的生长。因此，探究并发明一种“绿色多功能土壤修复制剂”具有重要意义。

漆酶（Laccase，EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶蛋白，来源广泛，在原核生物、植物、真菌以及昆虫体内均有发现，当其发生反应后生成唯一产物为水，不会造成二次污染，是一种理想的绿色天然催化剂，在催化降解环境介质中有机污染物的领域具有很好的应用前景。但在实际应用过程中由于外界条件的影响，往往会由于生物酶失去活性而造成应用效果不佳。

酶的固定化技术是通过物理或化学的处理方法将生物酶固定在固体载体上的技术，其在保证酶本身具有的高效性、专一性等催化特性的同时，还可以提高在应用过程中酶的稳定性、重复利用性和可操控性。在制备过程中，应选择合适的固定化载体及更有效的固定化方法，以此增强所制备产品的功效。

如中国专利申请公布号：CN 107398473A，申请公布日2017年11月28日的专利文件中，公开一种广谱型重金属污染土壤稳定化药剂的制备和使用方法，药剂制备原料包括重过磷酸钙、蒙脱石、高岭土、滑石粉以及膨润土等，具有廉价易得、安全可靠、使用方便、能针对多种重金属污染进行有效的稳定化修复等优点。但对于制得的土壤修复制剂也应注重考虑其添加对土壤理化性质的影响。研究表明，粘土矿物可能会带来土壤肥力降低、土壤结构性改变、土壤板结等问题。因此，对于载体的选择应考虑使用复合型材料，以增强产品的功能性。

再如中国专利授权公告号：CN 104209316B，授权公告日2016年5月4日的专利文件中，公开了一种固定化漆酶制备方法，包括以下步骤：将质量浓度为3%的海藻酸钠溶液恒温加热；冷却后将海藻酸钠胶体通过制粒器滴入质量浓度1%氯化钙溶液中，制成载体小球；载体小球经清洗后放入体积浓度1%戊二醛溶液中交联6h；载体表面干净后，将完成交联的载体小球移入游离态漆酶溶液中固定化4h，清洗后得到固定化漆酶。此方法制得的固定化漆酶具有成本低、绿色环保等优点，但是包埋法固定化漆酶存在扩散限制、易漏失、在土壤体系中无法均匀分布等缺点，且催化反应受传质阻力的影响，不宜催化降解大分子底物的反应，应用范围具有一定限制。因此，寻找一种合适的固定化载体，提高固定化效率及漆酶稳定性，并以此制备一种土壤修复制剂也是现阶段的重要工作之一。

有鉴于此，在申请号为201510465445.1的专利文献中公开了一种土壤修复方法及应用，本申请与对比文件相比具有以下区别：1、对比文件修复污染物仅为重金属，而本申请不仅可以修复重金属还可以降解土壤中有机污染物；2、对比文件发挥修复效能的主体为植物，所述修复制剂为促进植物吸收重金属，而本申请为修复制剂直接作用于污染物；3、对比文件修复周期为一年、较长，本申请修复周期短，效率高。

有鉴于此，在申请号为201911215411.1的专利文献中公开了一种微生物土壤修复剂及应用和重金属污染土壤修复方法，本申请与对比文件相比具有以下区别：1、对比文件修复污染物仅为重金属，而本申请不仅可以修复重金属还可以降解土壤中有机污染物；2、对比文件土壤修复制剂为微生物菌剂，研究表明微生物菌株是通过产生并释放生物酶达到降解和修复目的，本申请直接利用商业用酶，生物酶具有高效，价廉等优点，且生物酶具有更宽泛的生存环境条件较于微生物菌剂；3、本申请制作流程简单，易操作，成本较低，避免了复杂的微生物复合菌制剂的制备和培养。

有鉴于此，在申请号为202010678171 .5的专利文献中公开了一种污染土壤修复制剂、制备方法、修复装置及应用，本申请与对比文件相比具有以下区别：

1、对比文件修复污染物仅为重金属，而本申请不仅可以修复重金属还可以降解土壤中有机污染物；2、对比文件制备流程较为复杂，且引入金属镍，可能会造成二次污染的风险，本发明所用原料均为绿色无害材料，本申请修复制剂为环境友好型，且本申请制作流程简单，易操作，成本较低，避免了复杂的微生物复合菌制剂的制备和培养；3、对比文件使用时需在一定修复装置内进行，本申请施用环境条件宽泛，与常规修复制剂使用方法相似，操作简便。

生物炭是一种多孔结构的固体材料，是利用生物质在缺氧或厌氧条件下经热化学转化而成。高岭土是一种非金属矿产，是一种以高岭石族粘土矿物为主的粘土和粘土岩。相对于其他固定化材料，生物炭和高岭土具有简单易得，具有丰富的孔隙结构吸附性能强，不会在应用过程中造成二次污染，环境友好型等优点。另一方面，生物炭的引入可减少和避免单一矿物材料施用带来的土壤肥力降低、土壤结构性改变、土壤板结等问题，可以改善土壤环境，提供土壤微量元素，增加土壤环境生物多样性等，且具有更加丰富多样的孔隙结构和基团，可提升固定效率和稳定化效果。因此，生物炭和高岭土可以作为一种理想的酶固定化材料，并以此制备出一种“绿色多功能土壤修复制剂”。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足，而提供一种成本低、固定率高、稳定性强、适用范围广、环境友好型的土壤修复制剂的制备方法及其在土壤修复中的应用，解决了制备成本高、固定率低、稳定性较低等弊端。

另一方面发明的土壤修复制剂（ZK-TX020）在土壤中的施加不仅可以在漆酶的催化作用下降解土壤中的有机污染物，而且由于复合载体的多孔结构可以对于土壤中的重金属可以起到稳定化的效果，降低其浸出浓度；更重要地，土壤修复制剂（ZK-TX020）的制备材料均为绿色无害材料，在使用过程中不会造成二次污染。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该土壤修复制剂的制备方法，其特点在于：所述制备方法包括如下步骤：

第一步、将漆酶加入pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液中制成漆酶溶液；

第二步、加入复合载体（生物炭：高岭土=2:1，v/v），在温度为40 °C、转速为150rpm的恒温振荡培养箱中反应1～9 h；

第三步、进行真空抽滤、并获得滤饼，滤饼经室温干燥后获得初级修复制剂；

第四步、将此初级修复制剂添加至一定体积分数的交联剂体系中进行交联反应，交联时间为1～5 h；

第五步、先后用去离子水和pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液进行充分冲洗，再经真空抽滤、并在室温干燥后获得土壤修复制剂（ZK-TX020）。

进一步地，所述第一步中，漆酶为购买的漆酶固体粉末（CAS号为80498-15-3），产自米曲霉菌种（Aspergillusoryzae），漆酶酶活为1000 U/g；漆酶溶液配置方法为称取500mg漆酶固体粉末，添加至200 mL、pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液混匀溶解并旋涡分离后取上清液所得。

进一步地，所述第二步中，复合载体经预处理后所得，复合载体的添加量为300mg/100 mL漆酶溶液；复合载体包括生物炭和高岭土；

生物炭是以毛竹为原料，首先经过5次去离子水冲洗以去除表面黏附物及灰尘，随后在通风处进行初步风干，将风干后的毛竹放置于80 °C烘箱中过夜干燥、粉碎，获得毛竹碎屑；将毛竹碎屑放置于坩埚中，盖上盖子，置于程序最终控温为600 °C的马弗炉中炭化6h，经冷却至室温后取出，获得生物炭；

高岭土为购买所得，CAS号为1332-58-7。

进一步地，所述第四步中，交联剂为戊二醛（Glutaraldehyde，CAS号为111-30-8），交联剂体积分数为0.5%。

进一步地，所述第五步中，室温为25～30 °C。

进一步地，所述复合载体按如下方法制备：

将生物炭研磨，过100目筛，得到生物炭粉；将生物炭粉加入质量浓度为5%的NaOH溶液中，在室温环境下、转速为150 rpm磁力搅拌2 h，真空抽滤，滤饼在80 °C环境下烘干24h；将烘干后的生物炭放置在通有流速为200 mL/min氮气流的管式炉中，以10 °C/min的升温速率升温至600 °C并保温2 h，去离子水清洗后用0.1M的HCl溶液进行中和，最后用去离子水清洗至中性并在60 °C烘箱内烘干，完成生物炭的预处理；NaOH溶液和HCl溶液体积用量以生物炭粉重量计为20 mL/g；

购买的高岭土经风干、碾压、破碎后，过100目筛，得到高岭土粉末；将高岭土粉末添加至质量浓度为5%的NaOH溶液中，在室温环境下、转速为150 rpm磁力搅拌5 h，真空抽滤，滤饼用去离子水冲洗5～6次，在80 °C环境下进行干燥；将干燥后的高岭土添加至0.1M的HCl溶液，室温条件下150 rpm震荡5 h；真空抽滤，滤饼经去离子水冲洗至中性后，在80 °C环境下烘干备用；

将预处理后的生物炭及高岭土按照体积比2:1的比例进行混合，混合均匀后得到复合载体。

进一步地，本发明的另一个技术目的在于提供一种土壤修复制剂在土壤修复中的应用。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的。

一种采用所述的制备方法制得的土壤修复制剂在土壤修复中的应用，其特点在于：所述应用是将土壤修复制剂（ZK-TX020）及其土壤修复配剂（ZK-TXP24）加入有机污染物及重金属污染的土壤中，调节土壤pH为3.5～5.0，土壤质量的含水量为15%～45%，在30～45°C的温度条件下养护2～6天，土壤修复制剂（ZK-TX020）的添加量为50 mg/g土壤。

进一步地，所述土壤修复配剂（ZK-TXP24）为2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS，CAS号为30931-67-0）、香草醛（vanillin，VAN，CAS号为121-33-5）和1-羟基苯并三唑（1-Hydroxybenzotriazole，HBT，CAS号为2592-95-2）中的一种或多种。

进一步地，土壤修复配剂（ZK-TXP24）的添加量为1 mmol/g土壤；

土壤pH值用质量浓度10%氧化钙溶液或30%醋酸溶液进行调节，优选所述土壤pH为4.5，含水率为30%，优选温度为40 °C。

进一步地，所述有机污染及重金属污染的土壤中有机污染物为蒽（Anthracene，CAS号为120-12-7）、苯并[a]芘（Benzo[a]pyrene，CAS号为50-32-8）、毒死蜱（Chlorpyrifos，CAS号为2921-88-2）、异丙隆（Isoproturon，CAS号为34123-59-6）和戊唑醇（Tebuconazole，CAS号为107534-96-3）中的一种或多种，污染的土壤中有机污染物污染浓度为20 mg/kg；

所述有机污染及重金属污染的土壤中重金属为砷（Arsenic，CAS号为7440-38-2）、镉（Cadmium，CAS号为7440-43-9）和铅（Lead，CAS号为7439-92-1）中的一种或多种，污染的土壤中重金属污染浓度为150 mg/kg。

相比现有技术，本发明具有以下优点：

（1）本发明所选用的土壤修复制剂（ZK-TX020）的制备材料为漆酶、生物炭及高岭土，三者均具有简单易得，且制备成本不高等特点，因此本发明所述ZK-TX020具有更加便捷、更加经济等优点；另一方面，相对于单一载体固定的方式，本发明中的土壤修复制剂（ZK-TX020）是采用复合载体（生物炭：高岭土=2:1，v/v）进行制备，具有更加丰富多样的孔隙结构和基团，提升了固定效率和稳定化效果，且土壤修复制剂（ZK-TX020）性状为固体粉末，在污染土壤体系中可方便做到均匀分布，操作方法简单；此外，土壤修复制剂（ZK-TX020）的制备材料均取自于自然环境介质，相对于传统的用化学制剂作为修复制剂进行土壤修复的方面来看，土壤修复制剂（ZK-TX020）不会对修复土壤与环境造成二次污染，是一种清洁无污染、环境友好型的土壤修复制剂。

（2）本发明首先对复合载体进行了预处理，预处理工作可使得土壤修复制剂（ZK-TX020）具有更高的活性，因为活化处理使得复合载体具有更大比表面积和更多孔隙结构，进而增强其结合能力，固定效率更高；另一方面，土壤修复制剂（ZK-TX020）的制备方法是采用物理吸附及交联两种固定化方式进行制备，提升了结合程度和固定效率；此外，通过上述方法制备的土壤修复制剂（ZK-TX020）具有很强的热稳定性和酸碱稳定性，延长了修复制剂在土壤修复过程中的作用时间，且具有反应条件范围广等优点。

（3）本发明中的土壤修复制剂（ZK-TX020）在被用来修复有机污染及重金属复合污染土壤的过程中，有机污染物具有较好的去除效率，在优选条件下五种有机污染物的去除率在75.1%～94.6%之间；此外，经过2～6天的养护，被修复土壤中两种重金属的浸出浓度均显著降低，且可达到修复效果。因此，该土壤修复制剂具有修复效果好、适用范围广等优点。

附图说明

图1：固定化时间对土壤修复制剂（ZK-TX020）固定率的影响图。

图2：交联反应时间对土壤修复制剂（ZK-TX020）固定率的影响图。

图3：土壤修复制剂（ZK-TX020）的热稳定性变化图。

图4：土壤修复制剂（ZK-TX020）的酸碱稳定性变化图。

图5：环境温度对土壤修复制剂（ZK-TX020）降解土壤中有机污染物的影响图。

图6：土壤pH对土壤修复制剂（ZK-TX020）降解土壤中有机污染物的影响图。

图7：土壤含水率对土壤修复制剂（ZK-TX020）降解土壤中有机污染物的影响图。

图8：关于土壤修复制剂（ZK-TX020）的施加污染土壤中重金属浸出浓度变化图。

具体实施方式

下面结合附图并通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。

实施例。

参见图1至图8所示，须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。同时，本说明书中若有引用如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

本实施例中的土壤修复制剂的制备方法，包括如下步骤：

第一步、将漆酶加入pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液中制成漆酶溶液；

第二步、加入复合载体（生物炭：高岭土=2:1，v/v），在温度为40 °C、转速为150rpm的恒温振荡培养箱中反应1～9 h；

第三步、进行真空抽滤、并获得滤饼，滤饼经室温干燥后获得初级修复制剂；

第四步、将此初级修复制剂添加至一定体积分数的交联剂体系中进行交联反应，交联时间为1～5 h；

第五步、先后用去离子水和pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液进行充分冲洗，再经真空抽滤、并在室温干燥后获得土壤修复制剂（ZK-TX020）。

所述第一步中，漆酶为购买的漆酶固体粉末（CAS号为80498-15-3），产自米曲霉菌种（Aspergillusoryzae），漆酶酶活为1000 U/g；所述米曲霉菌种（Aspergillusoryzae）属于黄曲霉群，曲霉属中的一种。

所述第一步中，漆酶溶液配置方法为称取500mg漆酶固体粉末，添加至200 mL、pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液混匀溶解并旋涡分离后取上清液所得。

所述第二步中，复合载体经预处理后所得，复合载体的添加量为300 mg/100 mL漆酶溶液。

所述第二步中，复合载体包括生物炭和高岭土。

所述第二步中，生物炭是以毛竹为原料，首先经过5次去离子水冲洗以去除表面黏附物及灰尘，随后在通风处进行初步风干，将风干后的毛竹放置于80 °C烘箱中过夜干燥、粉碎，获得毛竹碎屑；将毛竹碎屑放置于坩埚中，盖上盖子，置于程序最终控温为600 °C的马弗炉中炭化6 h，经冷却至室温后取出，获得生物炭。

所述第二步中，高岭土为购买所得，CAS号为1332-58-7。

所述第二步中，所述复合载体按如下方法制备：将生物炭研磨，过100目筛，得到生物炭粉；将生物炭粉加入质量浓度为5%的NaOH溶液中，在室温环境下、转速为150 rpm磁力搅拌2 h，真空抽滤，滤饼在80 °C环境下烘干24 h；将烘干后的生物炭放置在通有流速为200 mL/min氮气流的管式炉中，以10 °C/min的升温速率升温至600 °C并保温2 h，去离子水清洗后用0.1M的HCl溶液进行中和，最后用去离子水清洗至中性并在60 °C烘箱内烘干，完成生物炭的预处理；NaOH溶液和HCl溶液体积用量以生物炭粉重量计为20 mL/g；购买的高岭土经风干、碾压、破碎后，过100目筛，得到高岭土粉末；将高岭土粉末添加至质量浓度为5%的NaOH溶液中，在室温环境下、转速为150 rpm磁力搅拌5 h，真空抽滤，滤饼用去离子水冲洗5～6次，在80 °C环境下进行干燥；将干燥后的高岭土添加至0.1M的HCl溶液，室温条件下150 rpm震荡5 h；真空抽滤，滤饼经去离子水冲洗至中性后，在80 °C环境下烘干备用；将预处理后的生物炭及高岭土按照体积比2:1的比例进行混合，混合均匀后得到复合载体。

所述第四步中，交联剂为戊二醛（Glutaraldehyde，CAS号为111-30-8）。

所述第四步中，交联剂体积分数为0.5%。

所述第五步中，室温为25～30 °C。

本实施例中，采用所述的制备方法制得的土壤修复制剂在土壤修复中的应用，是将土壤修复制剂（ZK-TX020）及其土壤修复配剂（ZK-TXP24）加入有机污染物及重金属污染的土壤中，调节土壤pH为3.5～5.0，土壤质量的含水量为15%～45%，在30～45 °C的温度条件下养护2～6天，土壤修复制剂（ZK-TX020）的添加量为50 mg/g土壤。

应用中，所述土壤修复配剂（ZK-TXP24）为2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS，CAS号为30931-67-0）、香草醛（vanillin，VAN，CAS号为121-33-5）和1-羟基苯并三唑（1-Hydroxybenzotriazole，HBT，CAS号为2592-95-2）中的一种或多种。

应用中，土壤修复配剂（ZK-TXP24）的添加量为1 mmol/g土壤。

应用中，土壤pH值用质量浓度10%氧化钙溶液或30%醋酸溶液进行调节，优选所述土壤pH为4.5，含水率为30%。

应用中，优选温度为40 °C。

应用中，所述有机污染及重金属污染的土壤中有机污染物为蒽（Anthracene，CAS号为120-12-7）、苯并[a]芘（Benzo[a]pyrene，CAS号为50-32-8）、毒死蜱（Chlorpyrifos，CAS号为2921-88-2）、异丙隆（Isoproturon，CAS号为34123-59-6）和戊唑醇（Tebuconazole，CAS号为107534-96-3）中的一种或多种。有机污染物为并不局限于以上所列举的几种。

应用中，污染的土壤中有机污染物污染浓度为20 mg/kg。

应用中，所述有机污染及重金属污染的土壤中重金属为砷（Arsenic，CAS号为7440-38-2）、镉（Cadmium，CAS号为7440-43-9）和铅（Lead，CAS号为7439-92-1）中的一种或多种。

应用中，污染的土壤中重金属污染浓度为150 mg/kg。

本发明实施例中污染的土壤（pH=6.89，容重为1.23 g/cm3）中，有机污染物的污染浓度为5 mg/kg，重金属污染浓度为150 mg/kg。

具体的实施例1。

土壤修复制剂（ZK-TX020）的制备过程中固定化时间的优化，步骤如下：

分别称取3.0g所述复合载体（生物炭：高岭土=2:1，v/v），且分别添加至1L所述漆酶溶液（称取500mg漆酶固体粉末，添加至200mLpH为4.5的柠檬酸盐缓冲液混匀溶解并旋涡分离后取上清液所得）中，手动搅拌均匀后，在温度为40°C，转速为150rpm的恒温振荡培养箱中进行固定反应分别持续1h、3h、5h、7h、9h，随后进行真空抽滤，滤饼经室温干燥后获得初级修复制剂。将此初级修复制剂添加至体积分数为0.5%的交联剂体系中进行交联反应，交联时间为3h，随即先后用去离子水和pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液进行充分冲洗，经真空抽滤并在室温干燥后获得所述土壤修复制剂ZK-TX020。分别得到质量为2.9g、3.1g、3.0g、3.3g、3.2g的土壤修复制剂（ZK-TX020）。

土壤修复制剂（ZK-TX020）的固定率是通过游离态漆酶总量被固定在复合型载体上的占比来表示（漆酶总量，即采用Bradford法测定体系中的蛋白质含量），即复合型载体上固定的漆酶总量与固定化操作前总游离态漆酶总量的比值，公式如下：

其中：A1为固定化操作前总游离态漆酶总量；

A2为固定化过程中抽滤和冲洗所得的游离态漆酶总量。

实验结果如图1所示，不同固定化时间制得的ZK-TX020的固定率分别为：58.4%、70.7%、78.3%、89.6%和83.4%。结果显示，当固定化时间控制在7h左右时制得的土壤修复制剂（ZK-TX020）的固定率最高，更适用于这种土壤修复制剂的制备方法。

具体的实施例2。

土壤修复制剂（ZK-TX020）制备过程中交联时间的优化，步骤如下：

分别称取3.0g所述复合载体（生物炭：高岭土=2:1，v/v），且分别添加至1L所述漆酶溶液（称取500mg漆酶固体粉末，添加至200mLpH为4.5的柠檬酸盐缓冲液混匀溶解并旋涡分离后取上清液所得）中，手动搅拌均匀后，在温度为40°C，转速为150rpm的恒温振荡培养箱中进行固定反应，固定化时间为7h，随后进行真空抽滤，滤饼经室温干燥后获得初级修复制剂。将此初级修复制剂添加至体积分数为0.5%的交联剂体系中进行交联反应，交联时间分别设定为为1h、2h、3h、4h、5h，随即先后用去离子水和pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液进行充分冲洗，经真空抽滤并在室温干燥后获得所述土壤修复制剂ZK-TX020。分别得到质量为3.0g、3.2g、3.1g、2.8g、3.0g的土壤修复制剂（ZK-TX020）。

采用实施例1的方法测定并计算出所制备出的土壤修复制剂（ZK-TX020）不同交联时间下的固定率，结果如图2所示，不同交联反应时间制得的土壤修复制剂（ZK-TX020）的固定率分别为：64.7%、72.1%、88.6%、80.7%和63.7%。结果显示当交联反应的时间为3h时制得的土壤修复制剂（ZK-TX020）的固定率最高，更适用于这种土壤修复制剂的制备方法。

具体的实施例3。

探究土壤修复制剂（ZK-TX020）的热稳定性变化，步骤如下：

称取3.0g所述复合载体（生物炭：高岭土=2:1，v/v），且分别添加至1L所述漆酶溶液（称取500mg漆酶固体粉末，添加至200mLpH为4.5的柠檬酸盐缓冲液混匀溶解并旋涡分离后取上清液所得）中，手动搅拌均匀后，在温度为40°C，转速为150rpm的恒温振荡培养箱中进行固定反应，固定化时间为7h，随后进行真空抽滤，滤饼经室温干燥后获得初级修复制剂。将此初级修复制剂添加至体积分数为0.5%的交联剂体系中进行交联反应，交联时间设定为为3h，随即先后用去离子水和pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液进行充分冲洗，经真空抽滤并在室温干燥后得到3.2g所述土壤修复制剂（ZK-TX020）。

将游离态漆酶和土壤修复制剂（ZK-TX020）共同放置在温度设为70°C的恒温水浴锅中，随后观察并测定分别在0h、0.25h、0.5h、0.75h、1h五个时间点下的相对活性。

游离态漆酶和土壤修复制剂（ZK-TX020）的热稳定性是通过在一定温度条件下，不同反应时间内相对活性来表示，即其他时间下各自表现的活性（UX）与0h表现的活性（U0）的比值，公式如下：

其中，漆酶活性的测定方法：底物ABTS在25°C的B&R缓冲液(pH=4.5)中用分光光度法测定漆酶活性，在420nm处测定吸光度。一个活性单位(U)被定义为每分钟能够氧化1mmolABTS的酶量。土壤修复制剂（ZK-TX020）活性测定方法同上所述。

结果如图3所示，对比变化趋势，在经过1h的培养实验后，游离态漆酶的相对活性下降至24.23%，而制得的土壤修复制剂ZK-TX020仅仅下降至69.88%，证明土壤修复制剂（ZK-TX020）具有良好的热稳定性。

具体的实施例4。

探究土壤修复制剂（ZK-TX020）的酸碱稳定性变化，步骤如下：

将游离态漆酶和土壤修复制剂（ZK-TX020）（实施例3方法制备）均培养在20mL、pH=6.5的柠檬酸盐缓冲溶液中，手动搅拌均匀后，每隔1h取样一次，即分别测定0h、0.5h、1h、1.5h、2h时的相对活性（同实施例3方法）。

结果如图4所示，对比变化趋势，在经过2h的培养实验后，游离态漆酶的相对活性下降至22.89%，而制得的土壤修复制剂（ZK-TX020）仅仅下降至76.56%，表明了土壤修复制剂（ZK-TX020）具有良好的酸碱稳定性。

具体的实施例5。

探究环境温度对土壤修复制剂（ZK-TX020）降解土壤中有机污染物的影响，步骤如下：

用质量浓度30%醋酸溶液和10%氧化钙溶液将有机污染物污染土壤的pH值调至4.5，作为试验土壤样品。

在4份干重均为10.0g的污染物污染的土壤样品中添加土壤修复制剂（ZK-TX020），随后添加土壤修复配剂（ZK-TXP24），其添加浓度为1mmol/kg土壤，混合均匀后保持土壤含水率均为30%，分别于温度为30°C、35°C、40°C和45°C的恒温培养箱中培养2天，测定土壤中五种有机污染物的含量并计算其降解率，结果如图5和表1所示。在30°C～45°C环境中，土壤修复制剂（ZK-TX020）对于试验土壤样品中的有机污染物均具有良好的修复效果，其中40°C的环境条件更适用于这种基于所述土壤修复制剂（ZK-TX020）降解污染土壤中有机污染物的土壤修复方法。

表1不同温度条件下五种有机污染物的降解率

具体的实施例6。

探究土壤pH对土壤修复制剂（ZK-TX020）降解土壤中有机污染物的影响，步骤如下：

用质量浓度30%醋酸溶液和10%氧化钙溶液将有机污染物污染土壤的pH值分别调节至3.5、4.0、4.5、5.0。用不同pH值的土壤作为试验土壤样品。

在4份干重均为10.0g的污染物污染的土壤样品中添加土壤修复制剂（ZK-TX020），随后添加土壤修复配剂（ZK-TXP24），其添加浓度为1mmol/kg土壤，混合均匀后，保持土壤含水率为30%，样品放置于温度为40°C的恒温培养箱中培养2天，测定土壤中五种有机污染物的含量并计算其降解率，结果如图6和表2所示。土壤pH为3.5～5.0的污染土壤中有机污染物可利用土壤修复制剂（ZK-TX020）进行修复，其对于试验土壤样品中的有机污染物均具有良好的修复效果，其中土壤pH为4.5的待修复土壤更适用于这种基于所述土壤修复制剂（ZK-TX020）降解污染土壤中有机污染物的土壤修复方法。

表2不同土壤pH条件下五种有机污染物的降解率

具体的实施例7。

探究土壤含水率对土壤修复制剂（ZK-TX020）降解土壤中有机污染物的影响，步骤如下：

用质量浓度30%醋酸溶液和10%氧化钙溶液将有机污染物污染土壤的pH值调至4.5，作为试验土壤样品。

在3份干重均为10.0g的污染物污染的土壤样品中添加土壤修复制剂（ZK-TX020），随后添加土壤修复配剂（ZK-TXP24），其添加浓度为1mmol/kg土壤，混合均匀后，分别保持土壤含水率分别为15%、30%和45%，样品放置于温度为40°C的恒温培养箱中培养2天，测定土壤中五种有机污染物的含量并计算其降解率，结果如图7和表3所示。保持在15%～45%之间的土壤含水率的污染土壤中有机污染物可利用土壤修复制剂（ZK-TX020）进行修复，其对于试验土壤样品中的有机污染物均具有良好的修复效果，其中含水率为30%的待修复土壤更适用于这种基于所述土壤修复制剂（ZK-TX020）降解污染土壤中有机污染物的土壤修复方法。

表3不同土壤含水率条件下五种有机污染物的降解率

具体的实施例8。

探究土壤修复制剂（ZK-TX020）对污染土壤中重金属的稳定化效果，步骤如下：

用质量浓度30%醋酸溶液和10%氧化钙溶液将有机污染物污染土壤的pH值调至4.5，作为试验土壤样品。

称取干重为2.0kg的试验土壤样品，并添加土壤修复制剂（ZK-TX020），添加修复制剂与污染土壤的质量比为5%，混合均匀，保持土壤含水率分别为30%，样品放置于温度为40°C的恒温培养箱中培养2～6天，采用《固体废物浸出毒性浸出方法硫酸硝酸法》（HJ/T299-2007）作为修复后土壤重金属污染物的浸出方法测定土壤中三种重金属的浸出浓度，结果如图8和表4所示。

经过6天的养护后，经检测污染土壤重金属砷的浸出浓度为0.02mg/L，重金属镉的浸出浓度为0.008mg/L，重金属铅的浸出浓度为0.032mg/L，均表现出显著性的降低，且满足修复要求。因此，本发明所述土壤修复制剂ZK-TX020对污染土壤中的重金属也具有良好的稳定化效果。

表4不同时间下三种重金属的浸出浓度

此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其零、部件的形状、所取名称等可以不同，本说明书中所描述的以上内容仅仅是对本发明结构所作的举例说明。凡依据本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效变化或者简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种土壤修复制剂的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：

第一步、将漆酶加入pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液中制成漆酶溶液；

第二步、加入复合载体，在温度为40 °C、转速为150 rpm的恒温振荡培养箱中反应1～9h；

第三步、进行真空抽滤、并获得滤饼，滤饼经室温干燥后获得初级修复制剂；

第四步、将初级修复制剂添加至交联剂体系中进行交联反应，交联时间为1～5 h；

第五步、用去离子水和pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液进行冲洗，再经真空抽滤、并在室温干燥后获得土壤修复制剂。

2.根据权利要求1所述的土壤修复制剂的制备方法，其特征在于：所述第一步中，漆酶为漆酶固体粉末，产自米曲霉菌种，漆酶酶活为1000 U/g；漆酶溶液配置方法为称取500mg漆酶固体粉末，添加至200 mL、pH为4.5的柠檬酸盐缓冲液混匀溶解并旋涡分离后取上清液所得。

3.根据权利要求1所述的土壤修复制剂的制备方法，其特征在于：所述第二步中，复合载体经预处理后所得，复合载体的添加量为300 mg/100 mL漆酶溶液；复合载体包括生物炭和高岭土；

生物炭是以毛竹为原料，首先经过5次去离子水冲洗以去除表面黏附物及灰尘，随后在通风处进行初步风干，将风干后的毛竹放置于80 °C烘箱中过夜干燥、粉碎，获得毛竹碎屑；将毛竹碎屑放置于坩埚中，盖上盖子，置于程序最终控温为600 °C的马弗炉中炭化6 h，经冷却至室温后取出，获得生物炭。

4.根据权利要求1所述的土壤修复制剂的制备方法，其特征在于：所述第四步中，交联剂为戊二醛，交联剂体积分数为0.5%。

5.根据权利要求1所述的土壤修复制剂的制备方法，其特征在于：所述第五步中，室温为25～30 °C。

6.根据权利要求3所述的土壤修复制剂的制备方法，其特征在于：所述复合载体按如下方法制备：

将生物炭研磨，过100目筛，得到生物炭粉；将生物炭粉加入质量浓度为5%的NaOH溶液中，在室温环境下、转速为150 rpm磁力搅拌2 h，真空抽滤，滤饼在80 °C环境下烘干24 h；将烘干后的生物炭放置在通有流速为200 mL/min氮气流的管式炉中，以10 °C/min的升温速率升温至600 °C并保温2 h，去离子水清洗后用0.1M的HCl溶液进行中和，最后用去离子水清洗至中性并在60 °C烘箱内烘干，完成生物炭的预处理；NaOH溶液和HCl溶液体积用量以生物炭粉重量计为20 mL/g；

高岭土经风干、碾压、破碎后，过100目筛，得到高岭土粉末；将高岭土粉末添加至质量浓度为5%的NaOH溶液中，在室温环境下、转速为150 rpm磁力搅拌5 h，真空抽滤，滤饼用去离子水冲洗5～6次，在80 °C环境下进行干燥；将干燥后的高岭土添加至0.1M的HCl溶液，室温条件下150 rpm震荡5 h；真空抽滤，滤饼经去离子水冲洗至中性后，在80 °C环境下烘干备用；

将预处理后的生物炭及高岭土按照体积比2:1的比例进行混合，混合均匀后得到复合载体。

7.一种采用权利要求1-6中任意一项权利要求所述的制备方法制得的土壤修复制剂在土壤修复中的应用，其特征在于：所述应用是将土壤修复制剂及其土壤修复配剂加入有机污染物及重金属污染的土壤中，调节土壤pH为3.5～5.0，土壤质量的含水量为15%～45%，在30～45 °C的温度条件下养护2～6天，土壤修复制剂的添加量为50 mg/g土壤。

8.根据权利要求7所述的土壤修复制剂在土壤修复中的应用，其特征在于：所述土壤修复配剂为2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸、香草醛和1-羟基苯并三唑中的一种或多种。

9.根据权利要求7所述的土壤修复制剂在土壤修复中的应用，其特征在于：土壤修复配剂的添加量为1 mmol/g土壤；土壤pH值用质量浓度10%氧化钙溶液或30%醋酸溶液进行调节，温度为40 °C。

10.根据权利要求7所述的土壤修复制剂在土壤修复中的应用，其特征在于：所述有机污染及重金属污染的土壤中有机污染物为蒽、苯并[a]芘、毒死蜱、异丙隆和戊唑醇中的一种或多种，污染的土壤中有机污染物污染浓度为20 mg/kg；

所述有机污染及重金属污染的土壤中重金属为砷、镉和铅中的一种或多种，污染的土壤中重金属污染浓度为150 mg/kg。

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