CN103691736B - 一种降解土壤pah污染物的修复复合酶制剂及用其修复土壤的方法 - Google Patents

一种降解土壤pah污染物的修复复合酶制剂及用其修复土壤的方法 Download PDF

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本发明公开一种降解土壤PAH污染物的修复复合酶制剂及用其修复土壤的方法。该复合酶制剂由下述方法制得：漆酶粗制品酶液50～60%（V/V），锰过氧化物酶粗制品酶液20～30%（V/V），木素过氧化物酶粗制品酶液10～20%（V/V）及可溶性淀粉5～10%（W/V）搅拌混合均匀，喷雾干燥，控制成品含水量为3～6%，无菌封装，即得。本发明具有处理简单，见效周期短，效果显著的特点，通过三种酶的协同作用可高效降解土壤中的PAH污染物，经检测，其对土壤PAH污染物的降解率高达70～80%，可实现污染土壤的高效脱毒及修复。

Description

一种降解土壤PAH污染物的修复复合酶制剂及用其修复土壤的方法
技术领域
本发明属于土壤修复领域，具体涉及一种可降解土壤PAH污染物的复合酶制剂及用其修复土壤的方法。
背景技术
土壤是组成环境的四大要素，在自然生态系统中具有不可替代的作用。醉着工业化、城市化和农业高度集约化的发展，工业三废、农用化肥、农药、重金属/化学品造成的污染越来越严重，导致土壤质量每况愈下，严重影响了生态安全和人体健康。土壤污染物主要有无机污染物和有机污染物，无机污染物包括重金属污染和放射性元素污染等，有机污染物包括有机农药污染、除草剂污染、多环芳烃污染（PAH）污染、人工合成染料污染、石油污染、PCB污染等。
针对上述土壤污染的处理措施一般有：工程措施修复、物理化学修复、化学修复和生物修复。前三种修复存在成本高或易造成二次污染等缺点。化学修复是利用生物技术治理污染土壤的一种新技术，利用生物技术处理受污染土壤及降解吸附有毒污染物的方式日益受到人们的重视，成为污染土壤修复研究的热点。
多环芳烃（PAH）是煤、石油、木材、烟草、有机高分子化合物等有机物不完全燃烧时产生的挥发性碳氢化合物，通过大气沉降而富集到土壤，是重要的环境和食品污染物。迄今已发现有200多种PAH，其中有相当部分具有致癌性，如苯并芘，苯并蒽等。局部的PAH污染主要归咎于人类的工业活动：废弃的老加油站、使用杂酚油和蒽油的木材防腐工厂、具有高浓度PAH的石油部分蒸馏物。最近几十年来。由于PAH在人类和微生物中的生物转化过程中会形成致癌物质，因此它们引起的环境污染受到越来越多的重视。
目前有两类微生物可被用于PAH的氧化和矿化——土壤细菌和白腐真菌，土壤细菌只能降解低分子量的PAH，而白腐真菌能氧化更稠的PAH，达6个芳环和水溶性的PAH，并降低毒性，白腐真菌对PAH降解的初始反应被认为是其细胞外木质素降解酶木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶共同作用的结果。 现有生物修复处理受PAH污染的土壤一般是直接接种培养白腐真菌，使其分泌胞外木质素降解酶、锰过氧化物酶和漆酶以降解这类污染物，但该方法中真菌培养易受外环境条件影响，往往生长不良，见效周期短，效果不佳。
发明内容
针对现有土壤PAH污染物降解技术存在的缺陷，本申请人经过研究改进，提供了一种降解土壤PAH污染物的修复复合酶制剂，该修复复合酶制剂由下述方法制得：将漆酶粗制品酶液50～60%（V/V），锰过氧化物酶粗制品酶液20～30%（V/V），木素过氧化物酶粗制品酶液10～20%（V/V）及可溶性淀粉5～10%（W/V）搅拌混合均匀，喷雾干燥，控制成品含水量为3～6%，无菌封装，即得；所述漆酶粗制品酶液酶活≥10万U/L，所述锰过氧化物酶粗制品酶液酶活≥10万U/L，所述木素过氧化物酶粗制品酶液酶活≥3000U/L，所述可溶性淀粉为AR级。
其进一步的技术方案为：
所述漆酶粗制品酶液由保藏编号为CCTCC NO：M2010235的密孔菌属菌株Pycnoporus sp.SYBC-L3通过液体搅拌发酵制得。
所述锰过氧化物酶粗制品酶液和木素过氧化物酶粗制品酶液由保藏编号为CGMCC NO：5.0776的黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium通过液体搅拌发酵制得。
所述搅拌混合在封闭式恒温搅拌器内进行，搅拌速度50～100rpm，搅拌时间45～60min，温度25～30℃。
所述喷雾干燥通过喷雾干燥器实现，参数设定为进口温度160～180℃，出口温度60～70℃，雾化器频率40～50Hz，料液泵频率5～6Hz。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述修复复合酶制剂修复土壤的方法：.将所述修复复合酶制剂按质量体积比1：100～200的比例溶解于pH4.0的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液，搅拌均匀，再喷洒于污染PAH的土壤上使其渗透至污染底层，即可实现土壤的高效脱毒和修复。
其进一步的技术方案为：
所述柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液为现用现配。
本发明具有如下有益技术效果：
本发明精选一株高产漆酶的密孔菌属菌株Pycnoporus sp.SYBC-L3以及一株高产锰过氧化物酶和木素过氧化物酶的黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium，通过液体搅拌发酵提取获得漆酶、锰过氧化物酶和木素过氧化物酶的粗制品酶液。其中，木素过氧化物酶（LiP），锰过氧化物酶（MnP）是一类过氧化物酶，能催化非酚类芳香族化合物（包括芳烃类污染物）的降解；漆酶是一类多酚氧化酶，对许多非酚类物质如蒽，苯并芘，多环芳烃等具有高度的进攻性，能高效氧化降解这类污染物。本发明将上述三种粗制品酶液按特定比例复配制成复合酶制剂并直接用于受PAH污染的土壤修复，具有处理简单，见效周期短，效果显著的特点，通过三种酶的协同作用可高效降解土壤中的多环芳烃（PAH）污染物，经检测，其对土壤PAH污染物的降解率高达70～80%，可实现污染土壤的高效脱毒及修复。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明的具体实施方式。
以下实施例1～实施例3所用粗制品酶液制备方法如下：
漆酶粗制品酶液：取购自CCTCC的密孔菌属菌株Pycnoporus sp.SYBC-L3（保藏编号：CCTCC NO：M2010235）经斜面培养，菌种活化，一级种子培养，二级种子培养（种子培养基（w/v）：葡萄糖5%，酵母膏1%，蛋白胨0.5%）及发酵罐搅拌发酵（发酵培养基(g/L)：麦芽糖12，豆粕6，CuSO4·5H200.4，KH2PO41，Na2HPO40.2，MgSO4·7H2O0.5，MnSO4·H2O0.034），发酵液真空抽滤，滤液经超滤浓缩得浓缩漆酶粗制品酶液，漆酶酶活经DMP法检测酶活达10万U/L以上。
锰过氧化物酶粗制品酶液：取购自CGMCC的黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium（保藏编号：CGMCC NO：5.0776）经斜面培养，菌种活化，一级种子培养，二级种子培养（种子培养基（w/v）：葡萄糖5%，酵母膏1%，蛋白胨0.5%）及发酵罐搅拌发酵（发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，酒石酸铵10，KH2PO42，MgSO4·7H2O0.5，MnSO4·H2O1，CaCl2·2H2O0.1，微量元素溶液(g/L)：（NaCl2，FeSO4·7H2O0.2，CoCl20.2，ZnSO4·7H200.2，CuSO4·5H200.2，KAl(SO4)2·12H2O0.02，H3BO30.02，Na2MoO4·2H2O0.04）7ml，Tween-800.5），发酵液真空抽滤，滤液经超滤浓缩得浓缩锰过氧化物酶 粗制品酶液，锰过氧化物酶酶活经氧化Mn2+法检测酶活达10万U/L以上。
木素过氧化物酶粗制品酶液：取购自CGMCC的黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium（保藏编号：CGMCC NO：5.0776）经斜面培养，菌种活化，一级种子培养，二级种子培养（种子培养基（w/v）：葡萄糖5%，酵母膏1%，蛋白胨0.5%）及发酵罐搅拌发酵（发酵培养基(g/L)：葡萄糖12，酒石酸铵0.3，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O0.7，黎芦醇0.5，VB10.001，微量元素溶液（g/L）：（MnSO4·H2O0.5，NaCl1，FeSO4·7H2O0.1，CoCl20.2，CaCl2·2H2O1.5，ZnSO4·7H200.1，CuSO4·5H200.1，KAl(SO4)2·12H2O0.01，H3BO30.01，Na2MoO4·2H2O0.01）70ml，Tween-801），发酵液真空抽滤，滤液经超滤浓缩得浓缩木素过氧化物酶粗制品酶液，木素过氧化物酶酶活经氧化藜芦醇法检测酶活达3000U/L以上。
所采用可溶性淀粉为国药集团化学试剂有限公司产品（AR级）。
以下实施例所用各仪器设备均为本领域常规设备。
实施例1修复复合酶制剂1
制备：
（1）液化溶解：称取漆酶粗制品酶液60%（V/V），锰过氧化物酶粗制品酶液30%（V/V），木素过氧化物酶粗制品酶液10%（V/V）及可溶性淀粉5%（W/V），并加入封闭式恒温搅拌器内，搅拌速度100rpm，搅拌时间60min，温度30℃，直至固形物完全溶解为止。
（2）喷雾干燥：将步骤（1）所得复合酶液通过喷雾干燥器喷雾干燥，主要参数设定为：进口温度180℃，出口温度65℃，雾化器频率50Hz，料液泵频率5.5Hz，控制干燥后酶粉成品含水量为3%。
（3）无菌封装：将步骤（2）所制干燥酶粉送入自动无菌包装机内进行无菌封装，即得。
应用：
（1）先各配制0.1mol/L的柠檬酸溶液及0.1mol/L的磷酸二氢钠溶液，再将柠檬酸溶液倒入磷酸二氢钠溶液中，同时测pH值，直至pH值为4.0为止，现用现配。
（2）将上述复合酶制剂成品以1:100（W/V）的比例加入柠檬酸-磷酸二氢 钠缓冲液中溶解搅拌均匀，直至酶粉完全溶解为止。
（3）将上述溶解的复合酶液喷洒于受PAH污染的土壤上直至污染底层，但不能渗透出复合酶液。一周后取样检测，测得受污染将土壤中PAH含量降解率达80%（参照ISO18287-2006PAH多环芳烃检测方法）。
实施例2修复复合酶制剂2
制备：
（1）液化溶解：称取漆酶粗制品酶液55%（V/V），锰过氧化物酶粗制品酶液30%（V/V），木素过氧化物酶粗制品酶液15%（V/V）及可溶性淀粉10%（W/V），并加入封闭式恒温搅拌器内，搅拌速度100rpm，搅拌时间45min，温度25℃，直至固形物完全溶解为止。
（2）喷雾干燥：将步骤（1）所得复合酶液通过喷雾干燥器喷雾干燥，主要参数设定为：进口温度170℃，出口温度60℃，雾化器频率40Hz，料液泵频率5Hz，控制干燥后酶粉成品含水量为4%。
（3）无菌封装：将步骤（2）所制干燥酶粉送入自动无菌包装机内进行无菌封装，即得。
应用：
（1）先各配制0.1mol/L的柠檬酸溶液及0.1mol/L的磷酸二氢钠溶液，再将柠檬酸溶液倒入磷酸二氢钠溶液中，同时测pH值，直至pH值为4.0为止；
（2）将上述复合酶制剂成品以1:150（W/V）的比例加入柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液中溶解搅拌均匀，直至酶粉完全溶解为止。
（3）将上述溶解的复合酶液喷洒于受PAH污染的土壤上直至污染底层，但不能渗透出复合酶液。一周后取样检测，测得受污染将土壤中PAH含量降解率达75%（参照ISO18287-2006PAH多环芳烃检测方法）。
实施例3修复复合酶制剂3
制备：
（1）液化溶解：称取漆酶粗制品酶液55%（V/V），锰过氧化物酶粗制品酶液25%（V/V），木素过氧化物酶粗制品酶液20%（V/V）及可溶性淀粉10%（W/V），并加入封闭式恒温搅拌器内，搅拌速度80rpm，搅拌时间55min，温度25℃，直至固形物完全溶解为止。
（2）喷雾干燥：将步骤（1）所得复合酶液通过喷雾干燥器喷雾干燥，主要参数设定为：进口温度160℃，出口温度70℃，雾化器频率45Hz，料液泵频率6Hz，控制干燥后酶粉成品含水量为5%。
（3）无菌封装：将步骤（2）所制干燥酶粉送入自动无菌包装机内进行无菌封装，即得。
应用：
（1）先各配制0.1mol/L的柠檬酸溶液及0.1mol/L的磷酸二氢钠溶液，再将柠檬酸溶液倒入磷酸二氢钠溶液中，同时测pH值，直至pH值为4.0为止；
（2）将上述复合酶制剂成品以1:200（W/V）的比例加入柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液中溶解搅拌均匀，直至酶粉完全溶解为止。
（3）将上述溶解的复合酶液喷洒于受PAH污染的土壤上直至污染底层，但不能渗透出复合酶液。一周后取样检测，测得受污染将土壤中PAH含量降解率达72%（参照ISO18287-2006PAH多环芳烃检测方法）。
综上所述，将本发明修复复合酶制剂直接应用于PAH污染土壤，PAH降解率高达70～80%，能实现污染土壤的高效脱毒及修复，处理方法简单，见效周期短，效果显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种降解土壤PAH污染物的修复复合酶制剂，其特征在于由下述方法制得：将漆酶粗制品酶液50～60％(V/V)，锰过氧化物酶粗制品酶液20～30％(V/V)，木素过氧化物酶粗制品酶液10～20％(V/V)及可溶性淀粉5～10％(W/V)搅拌混合均匀，喷雾干燥，控制成品含水量为3～6％，无菌封装，即得；所述漆酶粗制品酶液酶活≥10万U/L，所述锰过氧化物酶粗制品酶液酶活≥10万U/L，所述木素过氧化物酶粗制品酶液酶活≥3000U/L，所述可溶性淀粉为AR级。
2.根据权利要求1所述降解土壤PAH污染物的修复复合酶制剂，其特征在于：所述漆酶粗制品酶液由保藏编号为CCTCC NO：M2010235的密孔菌属菌株Pycnoporus sp.SYBC-L3通过液体搅拌发酵制得。
3.根据权利要求1所述降解土壤PAH污染物的修复复合酶制剂，其特征在于：所述锰过氧化物酶粗制品酶液和木素过氧化物酶粗制品酶液由保藏编号为CGMCC NO：5.0776的黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium通过液体搅拌发酵制得。
4.根据权利要求1所述降解土壤PAH污染物的修复复合酶制剂，其特征在在于：所述搅拌混合在封闭式恒温搅拌器内进行，搅拌速度50～100rpm，搅拌时间45～60min，温度25～30℃。
5.根据权利要求1所述降解土壤PAH污染物的修复复合酶制剂，其特征在在于：所述喷雾干燥通过喷雾干燥器实现，参数设定为进口温度160～180℃，出口温度60～70℃，雾化器频率40～50Hz料液泵频率5～6Hz。
6.一种利用权利要求1～3任一项所述修复复合酶制剂修复土壤的方法，其特征在于：将所述修复复合酶制剂按质量体积比1：100～200的比例溶解于pH4.0的柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液，搅拌均匀，再喷洒于污染PAH的土壤上使其渗透至污染底层，即可实现土壤脱毒。
7.根据权利要求6所述修复土壤的方法，其特征在于：所述柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液为现用现配。
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