CN1560245A - 一种酶解毒剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酶解毒剂及其制备方法与应用。该制备方法包括以下步骤：(1)白腐菌在氮限制型培养基中培养；(2)提取和纯化木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶；(3)高效酶解毒剂的制备。本发明能有效降解动物血液和脂肪组织内的这些持久性有机污染物，降解率超过60％。

Description

一种酶解毒剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种酶解毒剂，具体是一种阻断生物链中持久性有机污染物传递累积的酶解毒剂。本发明还涉及了该酶解毒剂的制备方法与应用。
背景技术
随着社会和经济的发展，来自制浆造纸工厂的纸浆含氯漂白过程，工业和生活废弃物的焚烧、石油化学工业以及氯化有机化学工业等产生的芳香性有机化合物如苯、苯酚、多环芳烃、氯代或氮代芳香化合物、带杂环类的苯系化合物、特别是二噁类(氯代二芳基二醚类)物质对生态环境平衡和人类键康的潜在威胁最为突出，已受到社会公众普遍的关注。上述芳香性污染物由于其毒性、致癌性、致畸性、致突变性和致多发性神经病变以及极端持久性，能在环境及生物链中高度累积，被称为持久性有机污染物(Persistent organic pollutants，POPs)。如何阻断它们在环境生物链中的传递与累积过程是一项迫切需要解决的问题。
由于生态环境中不同生物在生命活动中会接触多种类型的持久性有机污染物，这些物质均会通过食物链传递并在生物体内的脂肪性组织内累积，对持久性有机污染物在生物链中传递累积的阻断的难点是对POPs进行广谱性的而不是单种有机化合物的降解，只有广谱性降解POPs，才能有效完全阻断它们在生物链中的传递与累积。但到目前为止，国内外的研究集中于POPs在土壤、水体和大气中的转移及对生态环境的影响方面，尚未有广谐性降解生物链中POPs的专有技术。
自从1985年白腐菌能够降解芳香族环境污染物被报道以来，微生物学、环境生物化学和环境毒理学等学科的交叉研究表明，白腐菌能降解许多类型工业废水如焦化、印染、农药和制浆造纸等中的持久性有机污染物POPs，并在工业废水处理以及石油开采区、原油泄漏区或化工厂周围受污染位点的原位修复(In situbioremediation)方面拓开了广阔的应用前景。很多研究结果显示，白腐菌对持久性有机污染物POPs降解有非专一性现象，一种白腐菌可以降解数量众多的单基质或混合基质的芳香族环境污染物，而一种芳香族环境污染物也可以被多种白腐菌降解。白腐菌是通过分泌产生木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶降解这些持久性有机污染物POPs的。因此，开发基于白腐菌降解酶系统的阻断这些污染物在生物链中传递的技术是十分必要的。
发明内容
本发明的一个目的在于针对已有技术存在的缺点，提供一种酶解毒剂，通过分析并纯化出白腐菌降解持久性有机污染物POPs的酶系，将这些酶系和缓冲物混合，并加入到适当环境中，特别是作为饲料、肥料以及食物的添加剂组份，有效降解一些特别环境特别是进入鱼类、家畜家禽以及人体内的POPs，阻断它们在生物链中的传递和累积，从而进一步保护生态环境和人类健康。
本发明的另一个目的是提供该酶解毒剂的制备方法。
本发明还有一个目的是将酶解毒剂应用于阻断生物链中持久性有机污染物传递累积。
为达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
高效酶解毒剂的制备方法，依次包括以下步骤：
(1)、选择的白腐菌为具有降解木素能力的担子菌。担子菌从森林中筛选，经分离和选择性培养所获得。在氮限制型培养基中培养，其组成为：(C/N＜1)0.1～10g/LK2HPO4、0.1～10g/L KH2PO4、0.1～10g/L MgSO4、0.1～10g/LCaCl2、0.01～10g/LNaCl、0.1～10g/LFeSO4·7H2O2、0.01～1g/LZnSO4·7H2O2、0.01～1g/LCuSO4·5H2O2、0.01～1g/L MnSO4·H2O2、0.01～101～1g/L CoCl2、0.01～1g/L盐酸吡哆醇、1～10g/L葡萄糖和1～10g/L酒石酸铵。固体或液体培养基中于pH2～7、室温～39℃连续培养3～12天；
(2)、提取和纯化木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶
向培养基中加入离子水将菌丝打散后，四层纱布过滤，并经超滤浓缩1～10倍(膜截留Mr＝10000d)，浓缩液经0.1～0.3μm孔径滤膜过滤，滤液对蒸馏水透析。然后经快速蛋白液体层析仪连续梯度洗脱。0.01～1mol/L醋酸钠(pH6.0)连续梯度洗脱，流速0.5～1.0ml/min，检测400～409nm波段吸收值，并分别收集峰液部份，收集液即为过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶酶液的混合液。
可用下述方法测定酶活：
木素过氧化物酶活力的测定：以LiP在H2O2存在下氧化Azure B染料来表示LiP活力。反应条件为125mmol/L的酒石酸钠缓冲液(pH3.0)1mL，0.160mmol/L的Azure B溶液500uL，培养基滤出液500uL，30□下加入2mmol/L的H2O2溶液500uL启动反应，测反应最初3min内651nm处OD值减小速率，1个酶活力单位以每分钟每毫升的培养基滤出液降低0.1个OD值来表示。
锰过氧化物酶测定条件同上，但以香草醛丙酮为底物，测定反应液在336nm波段光吸收的变化。1个酶活力单位以每分钟每毫升的培养基滤出液降低0.1个OD值来表示。
漆酶活力的测定条件如下：3mL反应总体积中，含有0115mmol/L底物ABTS，0109mol/L NaAc2HAc缓冲液，pH4.5，适量的酶液，20℃条件下保温5min，测定A420值。酶活力单位定义为1min内产生1μmol产物所需的酶量。
(3)、含有木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶的高效酶解毒剂的制备。按1～20∶1～20∶1～20不同范围的将比例木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶进行混合；混合酶和其它生物调节因子黎芦醇及抗坏血酸按比例：1∶10～1000，W/W)制成解毒酶活性成份；将解毒活性成份和可食性材料如变性淀粉、改性纤维素、玉米粉、豆粕等进一步混合制成高效酶解毒酶制剂。混合酶和基质材料的混合比例为：1∶10～1000(W/W)；与基质材料混合后自然干燥后制备成的高效解毒酶制剂形式有：粉末、颗料状。
高效酶解毒剂饲喂给受持久性有机污染物污染的家畜家禽，能有效降解血液和脂肪组织内的这些持久性有机污染物，降解率超过60％。
混合后基质饲喂给不同种类的家畜家禽，饲喂期为3～360天，饲喂量按每天0.00001～0.01mg/kg体重比例加入。饲喂期结束后，对经持久性有机污染物污染的家畜家禽血液和脂肪组织中进行污染物浓度测定。持久性有机污染物种类有：二噁类物质；含氯取代呋喃类物质；多环芳烃类物质；含氯取代的单环及多环芳烃类物质；酚类及氯代酚类物质；杂原子如氮、磷等取代的芳烃类物质等。这里的持久性有机污染物浓度是指在不引起家畜家禽急性毒害时接触的持久性有机污染物浓度，范围为：0.00001～200mmol/L。
本发明与已有技术相比，具有如下有益效果：
本发明能广谱性和非专一性降解通过生物链进入动物体内的持久性有机污染物，降解效果好，有效阻断持久性有机污染物进一步通过生物链进入人体，保护人类键康。
具体实施方式
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的说明：
实施例1(对实验动物小鼠)
持久性有机污染物五氯酚按饲喂量0.0005mg/kg比例连续饲喂实验动物(小鼠)，饲喂期30d。白腐菌培养方案：0.9g/L K2HPO4、0.9g/L KH2PO4、0.2g/L MgSO4、0.2g/LCaCl2、0.05g/LNaCl、0.3g/LFeSO4·7H2O2、0.02g/LZnSO4·7H2O2、0.02g/LCuSO4·5H2O2、0.01g/L MnSO4·H2O2、0.01g/L CoCl2、0.05g/L盐酸吡哆醇、2g/L葡萄糖和2g/L酒石酸铵。pH3.5、29℃连续培养5天；然后将从上述培养基中制备的高效酶解毒剂按0.001mg/kg体重比例饲喂接触持久性有机污染物的小鼠，时间120d。分别于45d、90d和135d测定血液和脂肪组织内的POPs混合(1∶1)浓度(用气相色谱法测定)，取其平均值，用来描述这些污染物的降解情况如表1。
表1、实施例1中的酶解毒剂阻断持久性有机污染物传递累积的测试结果
              45d                 90d               135d
化合物        降解率％            降解率％          降解率％
五氯酚        4.62                57.80             73.61
对照          3.09                5.15              6.05
实施例2(对家庭饲养肉鸡)
持久性有机污染物二氯苯按饲喂量0.0001mg/kg比例连续饲喂实验动物肉鸡，饲喂期50d。白腐菌培养方案：0.3g/L K2HPO4、0.3g/L KH2PO4、0.2g/L MgSO4、0.2g/LCaCl2、0.005g/LNaCl、0.1g/LFeSO4·7H2O2、0.02g/LZnSO4·7H2O2、0.01g/LCuSO4·5H2O2、0.02g/L MnSO4·H2O2、0.02g/LCoCl2、0.03g/L盐酸吡哆醇、1.1g/L葡萄糖和1.3g/L酒石酸铵。pH4.5、33℃连续培养7天。然后将从上述培养基中制备的高效酶解毒剂按0.01mg/kg体重比例饲喂接触持久性有机污染物的肉鸡，时间150d。分别于45d、90d和135d测定血液和脂肪组织内的POPs混合(1∶1)浓度(用气相色谱法测定)，取其平均值，用来描述这些污染物的降解情况如表2。
表2、实施例2的酶解毒剂阻断持久性有机污染物传递累积的测试结果
            45d                 90d               135d
化合物      降解率％            降解率％          降解率％
五氯酚      5.32                58.88             77.89
对照        2.11                6.24              6.47
实施例3(对塘养鲢鱼)
持久性有机污染物八氯呋喃OCDF按饲喂量0.001mg/kg比例连续饲喂实验动物(鲢鱼)，饲喂期70d。白腐菌培养方案：2.0g/L K2HPO4、2.0g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4、0.2g/LCaCl2、0.06g/LNaCl、0.5g/LFeSO4·7H2O2、0.1g/LZnSO4·7H2O2、0.1g/LCuSO4·5H2O2、0.2g/L MnSO4·H2O2、0.3g/L CoCl2、0.1g/L盐酸吡哆醇、2.g/L葡萄糖和2.0g/L酒石酸铵。pH5.0、37℃连续培养7天；然后将从上述培养基中制备的高效酶解毒剂按0.01mg/kg体重比例饲喂接触持久性有机污染物(鲢鱼)，时间170d。分别于45d、90d和135d测定血液和脂肪组织内的POPs混合(1∶1)浓度(用气相色谱法测定)，取其平均值，用来描述这些污染物的降解情况如表3：
表3、实施例3的的酶解毒剂阻断持久性有机污染物传递累积的测试结果
            45d                 90d               135d
化合物      降解率％            降解率％          降解率％
五氯酚      5.23                58.91             81.78
对照        3.21                4.76              5.45
本发明与已有技术相比，具有如下有益效果：
本发明能广谱性和非专一性降解通过生物链进入动物体内的持久性有机污染物，降解效果好，有效阻断持久性有机污染物进一步通过生物链进入人体，保护人类键康。

Claims (3)

1、一种酶解毒剂的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：
(1)、白腐菌在氮限制型培养基中培养
培养基的组成为：0.1～10g/L K2HPO4、0.1～10g/L KH2PO4、0.1～10g/L MgSO4、0.1～10g/LCaCl2、0.01～10g/LNaCl、0.1～10g/LFeSO4·7H2O2、0.01～1g/LZnSO4·7H2O2、0.01～1g/LCuSO4·5H2O2、0.01～1g/L MnSO4·H2O2、0.01～101～1g/L/LCoCl2、0.01～1g/L盐酸吡哆醇、1～10g/L葡萄糖和1～10g/L酒石酸铵；
白腐菌在固体或液体培养基中于pH2～7，室温～39℃，连续培养3～12天；
(2)、提取和纯化木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶
向培养基中加入离子水将菌丝打散后，过滤，并经超滤浓缩1～10倍；浓缩液经0.1～0.3μm孔径滤膜过滤，滤液对蒸馏水透析，然后经快速蛋白液体层析仪连续梯度洗脱；
洗脱条件为在pH6.0，0.01～1mol/L醋酸钠下连续梯度洗脱，流速0.5～1.0ml/min；检测400～409nm波段吸收值，并分别收集峰液部份，收集液即为过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶酶液的混合液；
(3)、酶解毒剂的制备
按1～20∶1～20∶1～20的重量比例将木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶进行混合得到混合酶；混合酶和其它生物调节因子按1∶10～1000的重量比例制成解毒酶活性成份；将解毒活性成份和可食性材料以1∶10～1000的重量比例混合制成酶解毒酶制剂；
所述的白腐菌为具有降解木素能力的担子菌。
2、权利要求1所述的一种酶解毒剂的制备方法制备得到的酶解毒剂。
3、权利要求2所述酶解毒剂在阻断生物链中持久性有机污染物传递累积的应用。
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