DE60211723T2

DE60211723T2 - Testplatte für hochdurchsatzscreening

Info

Publication number: DE60211723T2
Application number: DE60211723T
Authority: DE
Inventors: Keith Raleigh EVERETT
Original assignee: Biolex Inc
Current assignee: Biolex Therapeutics Inc
Priority date: 2001-05-30
Filing date: 2002-05-29
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2022-05-30
Also published as: CN100418632C; AU2002303881B2; IL158983A0; CN1537032A; EP1427528A2; ES2261669T3; DK1427528T3; US7326385B2; ATE327038T1; JP4471648B2; RU2003137840A; US20080096269A1; EP1427528B1; US20080098585A1; US20080096270A1; RU2296619C2; WO2002097029A3; MXPA03010831A; US20080102518A1; PT1427528E

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Vorrichtungen und Verfahren zum Fördern des Wachstums eines Gewebes in Versuchs- und Produktionsaufbauten, insbesondere auf die Verwendung von spezialisierten Platten zum Aufnehmen des Gewebes und des periodischen Durchlaufens eines Mediums, um das Gewebe biologisch zu erhalten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Hochdurchsatzscreening erfordert normalerweise paralleles Verarbeiten von Stapeln von Proben, typischerweise in Mehrfach-Well-Platten (multiple well plates, MWPs) mit 24, 48, 96 und 384 oder mehr Wells pro Platte. MWPs sind Standardgrößen, welche mit bestehenden Hochdurchsatzmaschinen, wie zum Beispiel mit robotergesteuerten Pipettierern verwendet werden können. Jede Pipettierstation eines robotergesteuerten Pipettierers sieht Pipettierköpfe mit einer Anordnung von Pipettenspitzen vor, welche mehrere Well gleichzeitig behandeln. Obwohl die gebräuchlichen Mehrfach-Well-Platten für das Screening von flüssigen Proben in wirksamer Weise verwendet werden, sind sie im Allgemeinen für ein Screening von Pflanzen und anderen Geweben unwirksam und die sekretorischen Produkte, welche mit diesen Geweben in Verbindung gebracht werden, erfordern oder bevorzugen komplexere Umgebungen, wie zum Beispiel feste Stützstrukturen.
Beispielsweise wurden Versuche unternommen, Pflanzen in MWPs durch Aussetzen der Pflanzen in einem flüssigen Medium innerhalb jeden Wells zu züchten. Dem Pflanzengewebe wird jedoch Sauerstoff vorenthalten, wenn es sich in der Flüssigkeit befindet, was das Pflanzengewebe gewissermaßen in einer anaeroben Umgebung „ertränkt". Andere Versuche wurden unternommen, welche Medien verwenden, die im Allgemeinen fester gestützt sind, und ein Substrat bereitstellen, auf welchem das Pflanzengewebe über der Flüssigkeit werden kann, wie zum Beispiel ein Gel oder eine Filterpapierscheibe. Obwohl diese Arten der Unterstützung ein Ertrinken der Pflanzen vermeiden, sind sie schwierig auszutauschen und wiederaufzufüllen, wenn die Nährstoffe oder die Medien erschöpft sind. Ferner wurden in flüssige Medien getauchte Papierbrücken als Gewebeunterstützungen verwendet und das flüssige Medium konnte etwas leichter aufgefrischt werden. Empirische Hinweise haben jedoch gezeigt, dass Papierbrücken in einem automatisierten System schwierig zu handhaben sind und im Allgemeinen unwirksam bei einem Fördern eines Pflanzengewebewachstums sind. Ohne mit einer speziellen Theorie verbunden zu sein, kann dies sein, weil das flüssige Medium die Papierbrücke nicht leicht durchdringt (d.h., die Papierbrücke ist nur ein bisschen hydrophil) und es dem darauf gestützten Gewebe an einer kontinuierlichen Versorgung mit dem Medium mangelt.
Eine gängige Methode, dem Pflanzengewebe ein frisches Medium zuzuführen, ist, das Pflanzengewebe zu einem Behälter, welcher frisches Medium enthält, zu bewegen. Ein Bewegen des Pflanzengewebes ist ein relativ langsamer und arbeitsintensiver Vorgang, da Mehrfachplatten für jeden Stapel von Pflanzengeweben aufgefüllt oder anderweitig vorbereitet werden müssen. Außerdem besteht eine Gefahr eines Verlusts oder einer Verunreinigung der Gewebeproben, wenn sie von den Wells entfernt werden.
Ein anderer Ansatz zum Absaugen und Entfernen eines verbrauchten Mediums und Gewebenebenprodukten ist, eine Probenplatte zu verwenden, welche mehrer Bohrungen aufweist, wobei jede Bohrung ein Loch oder einen Anschluss an dem Boden des Wells aufweist. Ein Filter ist an dem Boden eines jeden Wells angeordnet, um das Gewebe zu stützen. Verbrauchtes Medium kann von jedem Well durch den Anschluss unter Verwendung einer Vakuumverteileranordnung vakuumabgesaut werden. Ein Beispiel einer Vakuumverteileranordnung ist das von MILLIPORE of Bedford, Massachusetts, gefertigte MultiScreen Vakuum Manifold System. Die Probenplatte liegt auf einem Verteiler auf, welcher ein Vakuum liefert, welches das Medium durch die Filterscheiben aus den Well-Zellen und durch die Anschlüsse herauszieht, wo es in dem darunter liegenden Verteiler erfasst wird. Obwohl die Filterscheiben in der Probenplatte dem Medium ermöglichen aus der Platte herausgezogen zu werden, ist es für die Filterscheiben schwierig, genügend Medium zurückzuhalten, um eine Gewebeversorgung und ein Wachstum für einen beliebigen Zeitraum zu unterstützen. Da die Anschlüsse an dem Boden der Wells offen zu der Umgebungsluft sind, können die Anschlüsse dem Medium ermöglichen zu entweichen oder zu verdunsten und können ferner einen Pfad für eine mikrobielle Verschmutzung der Wells bereitstellen. Außerdem können die Wells der Probenplatte nicht einzeln geprobt werden, da der Vakuumverteiler das Medium von allen Wells auf einmal absaugt.
Das Gewebe von Tieren und andere Typen von Organismen kann auch feste Stützstrukturen erfordern oder bevorzugen, was die Verwendung von Mehrfach-Well-Platten- und Hochdurchsatzscreeningtechniken verhindert. Zum Beispiel kann das Wachstum von Knorpelzellen durch die Verwendung einer Kollagenfibrillenmatrix gefördert werden, welche eine Umgebung im lebenden Organismus (in vivo) simuliert. Ähnlich zu dem zuvor erörterten Pflanzengewebe brauchen die Knorpelzellen eine Versorgung mit frischem Me dium, welches in verschiedenen Intervallen wiederaufgefrischt wird, um zu überleben und/oder sich zu vermehren. Außerdem vermehren sich einige der Knorpelzellen innerhalb der Kollagenfibrillenmatrix und können nicht unabhängig von der Matrix bewegt werden. Ein Bewegen der Zellen zu einer neuen Platte mit einer frischen Versorgung des Mediums erfordert ein Bewegen der gesamten Kollagenmatrix, was ein relativ langsamer und ineffizienter Prozess ist, welcher das Gewebe einer Verunreinigung aussetzt.
Es wäre vorteilhaft eine Mehrfach-Well-Platte zu besitzen, welche die Verwendung von Hochdurchsatzscreeningverfahren für nicht flüssige Proben ermöglicht. Außerdem wäre es vorteilhaft eine Mehrfach-Well-Platte zu besitzen, welche die Verwendung von Hochdurchsatzscreeningverfahren für Gewebe, die feste Stützstrukturen erfordern oder bevorzugen, ermöglicht. Es wäre ferner vorteilhaft eine Mehrfach-Well-Platte zu besitzen, welche das Wachstum eines Gewebes, wie zum Beispiel ein Pflanzengewebe, fördert, ohne das Risiko des Ertränkens des Gewebes in einem flüssigen Medium aufzuwerfen oder zuzulassen, dass das Gewebe dehydriert oder verunreinigt wird. Es wäre auch vorteilhaft eine Mehrfach-Well-Platte zu besitzen, welche ermöglicht, ein Medium einfach aufzufrischen ohne das in den Wells enthaltene Gewebe übermäßig zu stören. Außerdem wäre es vorteilhaft die Möglichkeit zu haben, weniger als die gesamte Anzahl von Wells in der Platte zu prüfen ohne die nicht geprüften Wells zu stören.
EP 0483620 offenbart eine Mehrfach-Well-Platte, worin jedes Well einen ersten Abschnitt zum Aufnehmen eines Gewebes und einen zweiten Abschnitt, welcher ein Hinzufügen oder Entfernen einer Flüssigkeit ermöglicht, aufweist. Das Gewebe ist in einem getrennten Einsatz enthalten, welcher in dem ersten Abschnitt des Wells sitzt und die Störung des Gewebes während eines Hinzufügens oder Entfernens von Flüssigkeit verhindert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine Vorrichtung zum Unterstützen eines Gewebes auf einer porösen Fritte bereit, wobei das Gewebe und die Fritte in einem Medium feucht gehalten werden sollen, welches regelmäßig von einer von oben zu befüllenden Pipettiervorrichtung abgesaugt und aufgefrischt wird, wobei die Vorrichtung einen Körper mit einer oberen Oberfläche aufweist, wobei der Körper ein erstes Loch mit einer Oberkante des ersten Lochs, welche durch die obere Oberfläche des Körpers definiert ist, und mit einem Unterteil des ersten Lochs, welches innerhalb des Körpers und unterhalb der oberen Oberfläche des Körpers definiert ist, definiert, wobei das erste Loch ausgestaltet ist, das Gewe be aufzunehmen und das Medium, welches das Gewebe feucht hält, zu halten; wobei die Vorrichtung gekennzeichnet ist durch:
ein zweites Loch mit einer Oberkante des zweiten Lochs, welche durch die obere Oberfläche des Körpers definiert ist, und mit einem Unterteil des zweiten Lochs, welches innerhalb des Körpers und unterhalb der oberen Oberfläche des Körpers definiert ist, wobei das Unterteil des zweiten Lochs über eine Flüssigkeitsverbindung mit dem Unterteil des ersten Lochs derart verbunden ist, dass die Pipettiervorrichtung über die Oberkante des zweiten Lochs auf das erste Loch zugreifen kann, um das Medium durch Anwenden eines Unterdrucks abzusaugen und das Medium durch Einpumpen von frischem Medium aufzufrischen, ohne das Gewebe aus dem ersten Loch zu entfernen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer Platte zum Halten einer porösen Fritte, die ein Gewebe unterstützt, bereit, wobei die poröse Fritte und das Gewebe, welches in einem Medium, das regelmäßig von einer Pipettenvorrichtung abgesaugt und aufgefrischt wird, feucht gehalten werden, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: Bereitstellen eines Körpers mit einer oberen Oberfläche; Definieren eines ersten Lochs in dem Körper durch Durchbohren der Oberfläche des Körpers, um eine Oberkante des ersten Lochs auszubilden, und Bohren unterhalb der oberen Oberfläche und in den Körper, um ein Unterteil des ersten Lochs auszubilden; und Definieren eines zweiten Lochs in dem Körper durch Durchbohren der oberen Oberfläche des Körpers, um eine Oberkante des zweiten Lochs auszubilden, und Bohren unterhalb der oberen Oberfläche und in den Körper, um ein Unterteil des zweiten Lochs auszubilden; und
Verbinden des Unterteils des ersten Lochs mit dem Unterteil des zweiten Lochs durch Ausbilden eines Durchlasses in dem Körper und zwischen dem Unterteil des ersten Lochs und dem Unterteil des zweiten Lochs.
Die vorliegende Erfindung behandelt die obigen Bedürfnisse und erzielt weitere Vorteile durch Bereitstellen einer Mehrfach-Well-Platte (multiple well plate, MWP) und eines Verfahrens zum Medienaustausch, welches das Wachstum eines Pflanzengewebes und anderen Arten von Gewebe durch Steuern der Zuführung eines Mediums zu dem Gewebe und Ermöglichen des regelmäßigen Austausches (Entfernen und Hinzufügen) eines Mediums, ohne das Gewebe zu stören, fördert. Die MWP weist eine Anordnung von Wells auf, wobei jedes Well mit einem benachbarten Absaugloch gekoppelt ist, welches ermöglicht, dass ein Medium von den Wells unter Verwendung eines herkömmlichen automati sierten Pipettenkopfes abgesaugt wird. Die MWP und der Pipettenkopf stellen aufgrund der neuen Doppel-Well-Architektur einen praktisch vollständigen Austausch des verbrauchten Mediums bereit. Eine hydrophile, poröse Fritte, welche in jedem Well untergebracht ist, unterstützt das Gewebe und hält das Medium in seinem Zwischenraum, was eine Verbindung zwischen dem Gewebe und dem Medium ermöglicht, während ein anaerober Zustand vermieden wird. Das Medium wird in ausreichenden Mengen aufwärts transportiert, um Nährstoffe für das Gewebe bereitzustellen und eine Vermehrung des Gewebes zu fördern.
In einer Ausführungsform weist die Erfindung eine Platte zum Halten einer porösen Fritte, welche ein Gewebe unterstützt, auf. Die poröse Fritte wird in einem Medium getränkt, welches regelmäßig, zum Beispiel durch eine von oben zu befüllende Pipettiervorrichtung, abgesaugt und aufgefrischt werden kann. Die Platte umfasst einen Körper mit einer oberen Oberfläche, welche ein erstes Loch und ein zweites Loch definiert. Das erste Loch weist eine Oberkante des ersten Lochs, die durch die obere Oberfläche des Körpers definiert ist, und ein Unterteil des ersten Lochs auf, welches innerhalb des Körpers und unterhalb der oberen Oberfläche des Körpers definiert ist. Das erste Loch ist ausgestaltet, die poröse Fritte und das Gewebe aufzunehmen und das Medium zu halten, welches die poröse Fritte und das Gewebe feucht hält. Das zweite Loch weist eine Oberkante des zweiten Lochs, welche durch die obere Oberfläche des Körpers definiert ist, und ein Unterteil des zweiten Lochs auf, welches innerhalb des Körpers und unterhalb der oberen Oberfläche des Körpers definiert ist. Das Unterteil des zweiten Lochs ist derart in Flüssigkeitsverbindung mit dem Unterteil des ersten Lochs, dass die Pipettiervorrichtung auf die Oberkante des zweiten Lochs zugreifen kann, um das Medium durch Anwenden eines Unterdrucks abzusaugen. Die Pipettiervorrichtung frischt ferner das Medium durch Hinzufügen von frischem Medium direkt auf die Fritte in jedem Well auf.
In einem weiteren Aspekt definiert der Körper der Platte ferner einen Durchlass, welcher das Unterteil des ersten Lochs und das Unterteil des zweiten Lochs über eine Flüssigkeitsverbindung verbindet. Der Körper kann ferner einen Vorsprung aufweisen, welcher in das Unterteil des ersten Lochs hervorragt, um die Fritte oberhalb eines Vorrats von Flüssigkeit zu unterstützen. Der Körper kann ferner mehrere erste und zweite Löcher definieren, wobei jedes erste Loch in Flüssigkeitsverbindung mit einem entsprechenden der zweiten Löcher ist, um eine MWP auszubilden. In einem weiteren Aspekt definiert der Körper eine Anordnung von ersten und zweiten Löchern, zum Beispiel 12, 24, 48, 96, 384 oder 1536 erste und zweite Löcher, wobei jedes ersten Loch in Flüssigkeitsverbindung mit einem entsprechenden der zweiten Löcher ist. Die ersten und zweiten Löcher weisen vorzugsweise zylindrische Formen auf.
In noch einem andere Aspekt ist die obere Oberfläche des Körpers ausgestaltet, um eine darauf angeordnete Abdeckplatte aufzunehmen. Die Abdeckplatte ist vorzugsweise lichtdurchlässig und die Oberkante des ersten Lachs ist ausgestaltet, um auch Licht durchzulassen, wodurch ein Pflanzengewebewachstum gefördert wird.
In einer weiteren Ausführungsform weist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Platte zum Halten einer porösen Fritte, die ein Gewebe unterstützt, auf, wobei die poröse Fritte mit einem Medium getränkt ist. Das Medium wird regelmäßig von einer Pipettenvorrichtung abgesaugt und aufgefrischt, um ein Wachstum des Gewebes zu fördern. Das Verfahren weist ein Bereitstellen eines Körpers mit einer oberen Oberfläche und ein Definieren eines ersten und zweiten Lochs in dem Körper auf. Ein Definieren eines ersten Lochs in dem Körper weist ein Bohren durch die obere Oberfläche des Körpers, um eine Oberkante eines ersten Lochs auszubilden, und ein Bohren unterhalb der oberen Oberfläche auf, um ein Unterteil des ersten Lochs auszubilden. Das zweite Loch wird durch Bohren durch die obere Oberfläche des Körpers, um eine Oberkante des zweiten Lochs auszubilden, und ein Bohren unterhalb der oberen Oberfläche definiert, um ein Unterteil des zweiten Lochs auszubilden. Die Unterteile des ersten und zweiten Lochs sind durch Ausbilden eines Durchlasses in dem Körper und zwischen dem Unterteil des ersten Lochs und dem Unterteil des zweiten Lochs über eine Flüssigkeitsverbindung verbunden. Vorzugsweise ist der Durchlass durch Einführen einer Sägescheibe in das Unterteil des ersten Lochs und Bewegen der Säge seitlich bis zum Treffen auf das Bodenteil des zweiten Lochs ausgebildet.
In noch einer weiteren Ausführungsform weist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Verwenden einer MWP auf. Eine Fritte wird in jedes der mehreren ersten Löcher gelegt und Gewebe, vorzugsweise ein Wasserlinsen- oder anderes Pflanzengewebe, wird auf die Fritte gelegt. Ein Medium wird auf jedes der mehreren ersten Löcher ausgegeben. Eine Pipette wird in jedes der mehreren zweiten Löcher eingesetzt und verwendet, um das Medium aus den ersten Löchern abzusaugen. Das Medium wird durch Anwenden eines Saugdruckes auf die zweiten Löcher unter Verwendung der Pipette abgesaugt. Der Saugdruck zieht das Medium aus dem ersten Loch in das zweite Loch und in die Pipette, um so das Medium aus der Platte zu spülen. Frisches Medium kann wieder in die mehreren ersten Löcher nach einem Absaugen des Mediums durch die zweiten Löcher ausgegeben werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform weist die vorliegende Erfindung ein Frittenmaterial zum Unterstützen eines Gewebes auf, welches eine poröse Struktur, eine obere Oberfläche und eine untere Oberfläche aufweist. Die poröse Struktur weist hydrophile Eigenschaften und mehrere Zwischenräume auf. Die obere Oberfläche ist ausgestaltet, um das Gewebe zu stützen. Die untere Oberfläche ist in Flüssigkeitsverbindung mit einem Vorrat von flüssigem Medium. Die hydrophilen Eigenschaften der porösen Struktur transportieren die Flüssigkeit derart in ihre Zwischenräume, dass das gestützte Gewebe mit ausreichend flüssigem Medium von dem Vorrat versorgt wird, um ein Wachstum des Gewebes zu fördern.
Die vorliegende Erfindung weist mehrere Vorteile auf. Zum Beispiel müssen die Gewebeproben in den Wells nicht bewegt oder gestört werden, wenn das zugeführte Medium verbraucht ist, was eine Arbeitsbelastung herabsetzt und sterile und optimale Wachstumsbedingungen sicherstellt. Die Platten können mit herkömmlichen Pipettenköpfen zum Handhaben von Flüssigkeiten mit festen Spitzen oder individuell steuerbaren Spitzenvarianten verwendet werden, da die Absauglöcher von der oberen Oberfläche des Körpers, d.h. einer von oben zu befüllenden Anordnung, zugreifbar sind. Die Verwendung einer Roboterflüssigkeitshandhabungsvorrichtung mit der Platte fördert eine Well zu Well übereinstimmende Behandlung des Gewebes sowie das effiziente Entfernen und Ersetzen des Mediums. Der von oben zu befüllende Aspekt ermöglicht die Verwendung eines Standarddeckels für eine sterile Bedienung und beseitigt den Bedarf für eine getrennte Vakuumverteilerstation zum Herausziehen des Mediums. Das Fehlen eines Verteilers ermöglicht die unterschiedliche Behandlung eines jeden Wells und stellt Flexibilität bei der Flüssigkeitshandhabungsvorrichtungsausführung und -auswahl sowie bei experimentellen Ausführungen und Probenabfragefunktionen bereit. Die Flüssigkeitsköpfe können ausgestaltet werden, das Medium zu entfernen sowie neues Medium hinzuzufügen ohne Werkzeuge oder Pipettenspitzen zu ändern.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Nachdem somit die Erfindung in allgemeinen Worten beschrieben wurde, wird jetzt Bezug auf die beigefügten Zeichnungen genommen, welche nicht notwendigerweise maßstabsgerecht gezeichnet sind, und wobei
1 eine Draufsicht einer MWP zum Austauschen eines flüssigen Mediums einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist;
2 eine vergrößerte Querschnittsansicht eines einzelnen Wells und eines Absauglochs der MWP der 1 ist;
3 eine perspektivische Ansicht einer Spitzendichtung einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist;
4 eine perspektivische Ansicht eines Systems einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zum Auffrischen eines Mediums in der in 1 gezeigten MWP ist;
5 ein Flussdiagramm eines Verfahrens zum Auffrischen eines Mediums, welches in dem System der 4 verwendet wird, ist; und
6 eine Schnittansicht des Wells und des Absauglochs der 2 ist, welche in einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird jetzt im Folgenden unter Bezugnahme auf die bei gefügten Zeichnungen vollständiger beschrieben werden, in welchen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung gezeigt sind. Diese Erfindung kann jedoch in vielen verschiedenen Formen ausgeführt werden und sollte nicht als auf die hierin dargelegten Ausführungsformen begrenzt ausgelegt werden; vielmehr werden diese Ausführungsformen bereitgestellt, so dass diese Offenbarung genau und vollständig sein wird und den Umfang der Erfindung dem Fachmann vollständig übermitteln wird. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen durchwegs gleiche Elemente.
Eine Mehrfach-Well-Platte (multiple well plate, MWP) 10 der vorliegenden Erfindung weist einen Körper 12 mit einer oberen Oberfläche 14 auf. Der Körper 12 definiert eine Anordnung von ersten Löchern oder Wells 16 und eine Anordnung von zweiten Absauglöchern 22, wie in 1 gezeigt. Mehrere Kanäle 28 verbinden jeweils ein entsprechendes der Wells 16 mit einem benachbarten der Absauglöcher 22, wie in 2 gezeigt. In einer Ausführungsform ist in jedem der Wells 16 eine poröse, hydrophile Fritte 30 angeordnet, welche eine Gewebeprobe 32 über einem Vorrat von flüssigem Medium 36 stützt. Die porösen, hydrophilen Eigenschaften der Fritte 30 transportieren das Medium 36 nach oben, um das Medium der Gewebeprobe 32 zuzuführen. Ein Austauschen von altem, erschöpftem Medium 36 wird durch die Absauglöcher 22 ermöglicht, welche jeweils dimensioniert und ausgestaltet sind, um eine Pipettenspitze 34 aufzunehmen. Mehrere der Pipettenspitzen sind während eines Absaugens in die Absauglöcher 22 eingeführt und bringen einen Unterdruck auf. Der Unterdruck zieht das flüssige Medium 36 aus jedem der Wells 16 durch die Kanäle 28, durch das eine benachbarte der Absauglöcher 22 und in die Pipettenspitzen.
Die Gewebeprobe 32 ist vorzugsweise ein Pflanzengewebe, wie zum Beispiel Dikotyledon- und Monokotyledongewebe, wie zum Beispiel Gewebe von Mais (Zea mays), Brassica sp. (zum Beispiel B. napus, B. rapa, B. juncea), insbesondere die als Quellen von Samenöl verwendbaren Brassica-Spezien, Alfalfa (Medicago sativa), Reis (Oryza sativa), Roggen (Secale cereale), Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Hirse (zum Beispiel Perlhirse (Pennisetum glaucum), Rispenhirse (Panicum miliaceum), Kolbenhirse (Setaria italica), Fingerhirse (Eleusine coracana)), Sonnenblume (Helianthus annuus), Saflor (Carthamus tinctorius), Weizen (Triticum aestivum), Sojabohne (Glycine max), Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Erdnüsse (Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus), Maniok (Maniho esculenta), Kaffee (Coffea spp.), Kokusnuss (Cocos nucifera), Ananas (Ananas comosus), Zitrusbäume (Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camilla sinensis), Banane (Musa spp.), Avocado (Persea americana), Feige (Ficus casica), Guave (Psidium guajava), Mango (Mangifera indica), Olive (Olea europea), Papaya (Carica papaya), Kashew (Anacardium occidentale), Macadamia (Macadamia integrifolia), Mandel (Prunus amygdalus), Zuckerrüben (Beta vulgaris), Zuckerrohr (Saccharum spp.), Hafer, Gerste, Gemüse, Zierpflanzen und Koniferen. In einigen Ausführungsformen ist das Gewebe Kallus-Gewebe von Wasserlinsen oder Gymnospermen. Die vorliegende Erfindung kann insbesondere mit Pflanzengeweben, welche mit wenig Wasser gedeihen, wie zum Beispiel ein aus Gymnospermen abgeleitetes Gewebe, wirksam sein.
Der Körper 12 der MWP 10 ist vorzugsweise aus einem Polycarbonatblock hergestellt, welcher maschinell hergestellt werden kann und gegenüber Hitze widerstandfähig genug ist, um in einem Autoklav zur Wiederverwendung sterilisiert zu werden. Im Allgemeinen ermöglicht die Härte des Polycarbonats, dass er mit einer computergesteuerten Fräsmaschine (CNC) oder anderen automatischen Herstellungsverfahren in komplexe Präzisionsformen maschinell hergestellt wird. Der Körper kann auch aus anderen Materialien hergestellt werden, wie zum Beispiel einem Polystyrol, Polysulfon, andere synthetische Materialien, Metalle, Keramiken, Glas usw. Der Körper 12 hat eine rechteckige Form und eine Länge von 12,78 ± 0,03 cm (5,03 ± 0,01 Inch), eine Breite von 8,55 ± 0,03 cm (3,365 ± 0,01 Inch) und eine Höhe von 2,07 ± 0,03 cm (0,813 ± 0,01 Inch), eine mit den meisten üblichen Flüssigkeitshandhabungsmaschinen kompatible Form. Der Körper 12 weist weitere Merkmale auf, wie zum Beispiel eine Basis 13 und ein Paar von 45°-Abschrägungen 15 an gegenüberliegenden Ecken der Breite des Körpers. Die Basis 13 stellt einen Vorsprung bereit und kann als eine Griff- oder Befestigungsoberfläche in einer herkömmlichen Anlage dienen. Das Paar von Abschrägungen 15 kann als Referenzmarkierungen dienen, um die richtige Ausrichtung des Körpers sicherzustellen, besonders wenn es wichtig ist, den Ort eines jeden Wells im Auge zu behalten. Der Körper 12 weist ferner eine flache obere Oberfläche 14 auf, durch welche die Löcher 16 und 22 gebohrt sind. Es sollte erwähnt werden, dass, obwohl die Abmessung des Körpers vorzugsweise ausgestaltet ist, um kompatibel mit zuvor bestehenden Einrichtungen zu sein, die Abmessungen des Körpers wie gewünscht verändert werden können.
Die Anzahl, Abmessungen und Orte der Wells 16 sind auch zugeschnitten, um kompatibel mit zuvor existierenden Anlagen zu sein. Zum Beispiel weist die Platte vorzugsweise 24 Wells in einer Anordnung von 4 mal 6 oder 48 Wells in einer Anordnung von 6 mal 8 auf, um kompatibel mit den meisten Flüssigkeitshandhabungsvorrichtungen zu sein. Weitere Well-Dichten können verwendet werden, wie zum Beispiel 6 Wells oder 96 Wells, welche kompatibel mit herkömmlichen Vorrichtungen sind. Es können jedoch auch nicht standardisierte Well-Dichten verwendet werden, wie zum Beispiel ein einzelnes Well oder 1000 Wells. Im Allgemeinen wird die Anzahl der Wells durch derartige praktische Gegebenheiten begrenzt werden, wie die Größe des Körpers 12, der Typ des Gewebes, welches gezüchtet wird, die Kapazitäten der Anlagen, welche die Wells verwenden, und die Größe der Wells selbst.
Vorzugsweise weist jeder der Wells 16 eine normale zylindrische Form mit einem Durchmesser von 1,57 cm (0,62 Inch) und einer Tiefe von 1,52 ± 0,03 cm (0,60 ± 0,01 Inch) für die 24 Well-Platte auf. Der Durchmesser eines jeden Wells kann wie gewünscht verändert werden und basiert auf mehreren Faktoren, wie zum Beispiel die anfängliche Größe des in dem Well anzuordnenden Gewebes, die Wachstumsrate des Gewebes und die Zeitdauer, in der sich das Gewebe in dem Well ausbreiten soll bevor es entfernt wird. Ein Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen den Wells beträgt 1,93 cm (0,76 Inch) für die 24 Well-Platte, um sicherzustellen, dass die Anordnung und Bewegung einer normalen automatisierten Pipettenvorrichtung kompatibel ist. Die 24 Well-Platte, welche ein bevorzugtes Gleichgewicht von Gewebe 32 Volumen und Well-Dichte darstellt, wurde von den Erfindern befunden, speziell für die Gewebeausbreitung von Wasserlinsenkallus geeignet zu sein. Die Dichte der Zellenwells 16, welche für Wasserlinsen verwendet werden, beträgt vorzugsweise 96 Wells oder weniger aufgrund der Größe des Kallus und dem schnellen Zellenwachstum. Natürlich können andere Anordnungen für besser an Kundenwünsche angepasste Anlagen verwendet werden, falls gewünscht.
Die Absauglöcher 22 erstrecken sich durch die obere Oberfläche 14 des Körpers 12. Jedes der 24 Absauglöcher 22 ist vorzugsweise benachbart zu und in Flüssigkeitsverbindung mit einem entsprechenden der Wells 16 verbunden. Die paarweise Anordnung der Absauglöcher 22 und der Wells 16 ermöglicht ein Absaugen ohne Kreuzverunreinigung der Proben, wie sie zum Beispiel mit Verteiler-Well-Platten gemäß dem Stand der Technik auftreten. Außerdem ermöglicht die paarweise Anordnung, dass das Medium von einzelnen interessanten Wells 16 wahlweise abgesaugt und aufgefrischt werden kann. Einzelne Wells 16 können wahlweise von Hand oder von einer automatisierten Anlage, welche den Betrieb einer einzelnen Pipette unabhängig von anderen Pipetten in dem Kopf ermöglicht, behandelt werden. Wahlweises Behandeln von Wells wäre nützlich, wenn zum Beispiel das Gewebe in einem der Wells eine starke Äußerung als Antwort auf ein Mittel erzeugt, wie zum Beispiel erhöhtes Wachstum des Gewebes, erhöhtes Ausdrücken eines Polypeptids, erhöhte Widerstandsfähigkeit gegenüber einem ausgewählten Mittel, wie zum Beispiel einem Herbizid, oder Widerstand gegen ein Pflanzenpathogen. Weitere biochemische oder biophysikalische Reaktionen können mit der vorliegenden Erfindung in einzelnen Wells untersucht werden. Das Medium von diesem Well kann häufiger als von den anderen Wells abgesaugt und überprüft werden. Neben anderen Vorteilen stellt ein häufigeres Sammeln und Überprüfen des Mediums von diesem Well eine stärkere statistische Korrelation bereit. Wenn eine Verunreinigung weniger bedenklich ist, kann jedes der Absauglöcher 22 mit mehreren Wells 16 verbunden werden, um die Anzahl der Absaugschritte zu reduzieren.
Jedes der Absauglöcher 22 hat auch vorzugsweise eine zylindrische Form mit einer Tiefe von 1,68 ± 0,03 cm (0,66 ± 0,01 Inch) und einen Durchmesser von 0,424 cm (0,167 Inch), um geeignet zu sein, eine Pipettenspitze 34 von normaler Größe durch seinen oberen Rand 24 aufzunehmen. Größere oder kleinere Durchmesser und unterschiedlichen Mitte-zu-Mitte-Abständen können in Abhängigkeit von der Größe der darin einzusetzenden Pipettenspitze verwendet werden. Natürlich können die sonstigen Formen und sonstigen Abmessungen verändert werden, um zu einer kundenspezifischen Anordnung oder anderen Standardpipettenformen und -längen, die dem Fachmann bekannt sind, zu passen. Ferner sind zylindrische Absauglöcher 22 wünschenswert, da sie mit drehenden Bohrern leichter maschinell hergestellt werden können. Der Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen benachbarten Absauglöchern 22 ist vorzugsweise der gleiche wie der Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen den Wells 16, welcher in der dargestellten Ausführungsform mit 24 Wells 1,93 cm (0,76 Inch) beträgt. Die Platzierung der Absauglöcher durch die obere Oberfläche 14 des Körpers 12 und der gleiche Mitte-zu-Mitte-Abstand stellen sicher, dass die gleiche Pipettenkopfkonfiguration für ein Absaugen des Mediums 36 verwendet werden kann wie für das Verteilen des Mediums.
Jeder der Kanäle 28 verbindet ein entsprechendes Paar von Zellenwells 16 und Absauglöchern 22 über eine Flüssigkeitsverbindung, wie in 2 gezeigt. Jeder der Kanäle 28 weist vorzugsweise aufgrund des bevorzugten Herstellungsverfahrens, welches zum Erzeugen der Kanäle, wie nachfolgend beschrieben werden wird verwendet wird, eine näherungsweise elliptische Form auf. Jeder der Kanäle ist unterhalb einem Unterteil von einem der Wells 16 und der Absauglöchern 22 ebenfalls aufgrund des bevorzugten Herstellungsverfahrens angeordnet. Viele Arten von Formen können für den Kanal 28 verwendet werden, da die Druckverteilung des durch die Pipette 34 angewendeten Vakuums über das Zellenwell, welches abgesaugt wird, immer gleich verteilt sein wird. Jeder der Kanäle 28 arbeitet zusammen mit dem entsprechenden einen der Wells 16 und der Löcher 22 als ein Vorratsbehälter für überschüssiges Medium 36, welches nicht in die Fritte 30 transportiert wurde. Zusätzlich zum Bereistellen eines Vakuums zum Absaugen können die Kanäle 28 und Absauglöcher 22 auch verwendet werden, um Medium 36 zuzuführen. Ein Zuführen eines Mediums durch die Kanäle 28 und Absauglöcher 22 zu den Wells 16 kann nützlich sein, wenn zum Beispiel der Kallus des Pflanzengewebes 32 dicht genug ist, um verhältnismäßig undurchlässig für ein Medium zu sein, welches durch die Oberkante des Wells 16 verabreicht wird. Vorzugsweise ist die Breite eines jeden der Kanäle 28 kleiner als der Durchmesser des entsprechenden Wells 16, um einen Vorsprung 29 an dem Boden des Wells zum Stützen der Fritte 30 über dem Medium 36 auszubilden.
Jede Fritte 30 ist vorzugsweise aus einem gesinterten Polyethylenmaterial hergestellt, welches porös und hydrophil ist, um das Anziehen und Zurückhalten des Mediums innerhalb seiner Zwischenräume zu fördern. Die hydrophile Eigenschaft des Frittenmaterials kann permanent oder zeitweise in Abhängigkeit von dem Verfahren, von welchem es verwendet wird, oder ob das Material inhärent hydrophil ist, sein. Alternative Materialien mit porösen Strukturen können verwendet werden und ein oberflächenaktiver Stoff kann auf Materialien verwendet werden, welche von Natur aus nicht hydrophil sind, um sie hydrophil zu machen. Das Material wird durch Sintern hergestellt und überträgt Lösungen durch Kapillarwirkung und kann als eine sterile Grenzschicht aufgrund seiner gewundenen Pfadeigenschaften arbeiten. Die Fritten werden vorzugsweise in Scheibenformen, welche näherungsweise kongruent mit den Wells 16 sind, aus einer porösen 0,635 cm (¼ Inch) dicken Polyethylenschicht mit einer mittleren Porengröße von 90 bis 130 μm geschnitten oder gestanzt, wie sie als Porex von Porous Products of Fairburn, Georgia und auch als Teile Nr. Y2-PEH-250/90 von Small Parts Inc., Miami Lakes, FL bekannt ist. Derartige Fritten können näherungsweise 550 μl eines Mediums aufnehmen und das Gewebe für einige Tage versorgen.
Die Kongruenz der Form zwischen der Fritte 30 und ihrem einen entsprechenden der Wells 16 stellt eine Passung mit einem minimalen Auslaufen des Mediums 36 um die Fritte sicher und stellt auch sicher, dass die Fritte fest auf dem Vorsprung 29 oberhalb des meisten des Mediums aufliegt. Unterschiedliche Dicken der Fritte können verwendet werden, wobei dickere Fritten im Allgemeinen mehr Material aufnehmen und weniger häufig mit neuem Medium aufgefrischt werden müssen. Eine Fritte mit größeren Durchmesser kann für Wells 16 mit größerem Durchmesser verwendet werden, kann aber einen Verteiler unterhalb als eine zusätzliche Stütze erfordern, um die Fritte 30 mit dem großen Durchmesser vor einem Zusammenfallen unter dem angewendeten Vakuumdruck zu bewahren. Zum Beispiel kann eine Fritte 30 mit einem großen Durchmesser durch ein Sieb, welches auf der Rückseite des Frittenmaterials angeordnet wird, wenn das Frittenmaterial hergestellt wird, unterstützt werden. Trotz des möglichen Bedarfs an einem unterstützenden Verteiler sind die Fritten typischerweise erheblich stabiler als vergleichbar dimensio nierte Membran- oder Papierträger, welche nicht einmal gemäßigte Vakuumdrücke, welche von der Pipettenspitze während des Absaugens angewendet werden, aushalten. Das Frittenmaterial der vorliegenden Erfindung sollte vorzugsweise geeignet sein, Drücken von näherungsweise 76 cm (30 Inch) Hg (Quecksilbersäule) auszuhalten. In noch einer weiteren Ausführungsform kann das Gewebe 32 auf einer Schicht des Frittenmaterials gezüchtet werden und dann in einzelne Fritten zum Platzieren in den Wells 16 geschnitten oder gestanzt werden.
Die MWP 10 wird vorzugsweise aus einem Block von Polycarbonatmaterial von näherungsweise den gleichen rechteckigen Abmessungen wie der Körper 12 hergestellt. Ein Herstellen der Platte aus einem einzelnen Block eines Materials sichert gegen Undichtigkeiten zwischen Wells, was eine Kreuzverunreinigung der Proben zur Folge haben könnte. Die Wells 16 und die Absauglöcher 22 werden vorzugsweise durch Verwendung einer CNC oder einer anderen automatisierten Bohrmaschine mit Bohrern von ähnlichen Abmessungen wie die gewünschten Lochabmessungen ausgebildet. Falls erforderlich schneidet die Bohrmaschine auch genug Polycarbonat weg, um die Basis 13, den Einsatz oberhalb der Basis und die Abschrägungen 15 auszubilden und entfernt genug Material, um weitere Oberflächen, wie zum Beispiel die obere Oberfläche 14, abzuflachen. Der Kanal 28 wird vorzugsweise unter Verwendung eines sich drehenden Sägeblatts 80 auf der gleichen Fräsmaschine ausgebildet. Das sich drehende Sägeblatt weist einen Schneiddurchmesser von etwas weniger als dem Well 16 auf und wird in eins von den Wells eingesetzt bis es eine Tiefe gleich der Dicke des sich drehenden Sägeblatts 80 weggeschnitten hat, wie in 6 gezeigt. Das sich drehende Sägeblatte wird dann in die Richtung des einen benachbarten der Absauglöcher 22 vorwärts bewegt, bis es genug in das Absaugloch einschneidet, um den Kanal 28 mit ausreichender Größe auszubilden, um eine Flüssigkeitsverbindung zwischen dem Well und dem Absaugloch wie in 2 gezeigt zu ermöglichen. Das Sägeblatte 80 wird dann zurück in die Mitte des Wells bewegt und aus dem Well herausgezogen. Der unterdimensionierte Durchmesser des Sägeblatts bildet den Vorsprung 29 aus, auf welchem die Fritte 30 gehalten wird.
Wie in 2 und 3 gezeigt, kann die vorliegende Erfindung ferner eine Dichtung 35 aufweisen, welche die Pipettenspitze 34 umfasst und um die Oberkante 24 von einem der Ansauglöcher 22 angeordnet ist, wenn die Spitze darin eingesetzt ist. Die Dichtung 35 weist einen Elastomerring 50 auf, welcher unter einem festen Rand 51 liegt. Der feste Rand ist vorzugsweise aus einem steifen Material, wie zum Beispiel aus einer Stahlhülse, hergestellt und weist optional eine Einstellschraube 52 auf, welche sich durch seine Seite erstreckt. Festziehen der Einstellschraube spannt den Rand um die Pipettenspitze 34, was dem festen Rand 51 ermöglicht, eine Aufwärtswanderung des Elastomerrings 50 zu verhindern, wenn dieser gegen die Oberkante 24 des Absauglochs gedrückt wird. Das Ende des Elastomerrings 50, welches in Berührung mit der Oberkante 24 des Absauglochs ist, kann eine kegelstumpfartige Form mit einem bevorzugten Winkel von näherungsweise 70° aufweisen, um ferner ein Ausbilden einer vakuumdichten Abdichtung zu unterstützen. Die Dichtung 35 hat ferner vorzugsweise einen Durchmesser von näherungsweise 0,3 Inch und ist 0,5 Inch lang, um an eine Standardpipettenspitze zu passen. Zum Beispiel eine TECAN-Pipettenspitze Nr. 71-7005 mit einer PTFE (TEFLON)-Beschichtung, einem Innenspitzendurchmesser von 0,5 mm, einem Außenspitzendurchmesser von 1,1 mm, einem Innenkörperdurchmesser von 1,5 mm und einem Außenkörperdurchmesser von 2,0 mm.
Der Elastomerring 50 kann ferner ausgestaltet sein, um auf einen beliebigen Typ von Pipettenspitzen zu passen, indem seine Öffnung 53 auf näherungsweise 90% des weitesten Außendurchmessers der Pipettenspitze dimensioniert wird, was der Dichtung ermöglicht, sich um die Spitze zu pressen, während sie sich auf ihre normale Form entspannt, wenn sie von dem Absaugloch entfernt wird. Umgekehrt weist der feste Rand 51 eine Öffnung auf, welche 10% in Bezug auf den Außenseitendurchmesser der Pipettenspitze 34 überdimensioniert ist, was ihm ermöglicht, die Pipettenspitze einfach aufzunehmen. Die Öffnung des Rands wird verkleinert, wenn die Einstellschraube 52 angezogen wird, um den Rand um die Pipettenspitze 34 zu sichern. In einer alternativen Ausführungsform kann die Dichtung 35 integriert mit der Pipettenspitze 34 ausgestaltet sein. In noch einer weiteren Ausführungsform kann ein weiches Dichtungsmaterial um die Oberkante 24 der Absauglöcher verwendet werden, um eine Spitze ohne die Dichtung 35 abdichtend aufzunehmen.
Die MWP 10 wird verwendet, um Gewebewachstum und Ausbreitung durch Liefern von Nährstoffen in einer sterilen Umgebung zu fördern. Das Verfahren zur Verwendung der MWP weist entweder ein manuelles Befüllen der Platte oder ein Verwenden eines Zellensortierers, welcher modifiziert wurde, um Gewebeproben zu sortieren, wie zum Beispiel derartige, welche zum Sortieren von Taufliegen verwendet werden, auf. Im Allgemeinen verwendet diese Anlage ein Vakuum, um die Proben aufzunehmen. Der nicht modifizierte Zellensortierer kann verwendet werden, wenn die Gewebeproben klein genug sind. Die MWP 10 ist vorzugsweise mit einer transparent Polystyrolabdeckung oder einem transparenten Polystyroldeckel abgedeckt, um eine Übertragung von Licht zu dem Gewebe zu ermöglichen.
Sobald das Gewebe 32 in den Wells 16 der Platte ist, wird die Platte für einen Zugriff durch eine Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung, welche Mehrfachpipettenspitzen aufweist, die mit einem Medium und einer Vakuumversorgung verbunden sind, gestapelt. Die Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung greift die Platte und entfernt den Deckel in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise. Die Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung fährt jede Pipettenspitze 34 in ein entsprechendes der Absauglöcher 22 aus, bis die Dichtung 35 gegen die Oberkante 24 des Absauglochs und den Anteil der oberen Oberfläche 14 dort herum anstößt. Die Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung gibt Medium durch die Spitzen in die Absauglöcher 22, durch die Kanäle 28 und in die Wells 16 ab. Auf diese Art und Weise hat das Gewebe 32 in jedem der Wells 16 Zugriff zu einer Zulieferung des Mediums durch die Fritte 30. Der Deckel wird wieder auf der Platte 10 angeordnet und die Platte wird in einem Kulturraum mit einer Beleuchtung zum Fördern des Wachstums (in diesem Fall von Pflanzengeweben) platziert.
Nachdem das Gewebe wesentliche Nährstoffe in dem Medium 36 verringert hat oder das Medium aus anderen Gründen ausgetauscht werden muss, wird die Platte 10 zurück auf die Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung geladen. Der Deckel wird von der Platte entfernt. Die Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung fährt jede Pipettenspitze 34 in ein entsprechendes der Absauglöcher 22 heraus, bis die Dichtung 35 gegen die Oberkante 24 des Absauglochs und den Abschnitt der oberen Oberfläche 14 dort herum anstößt. Die Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung wendet ein Vakuum oder einen Saugdruck durch die Pipettenspitzen an, welches/welcher das Medium aus den Zellwells 16 durch die Kanäle 28 in die Ansauglöcher 22 und in die Pipettenspitzen saugt, um ein Absaugen auszuführen. Das Medium wird sooft wie benötigt durch Wiederholen des obigen Verfahrens zyklisch ausgetauscht.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein automatisierter Pipettierkopf (oder eine Roboterflüssigkeitshandhabungsvorrichtung) 60 verwendet, um einzelne oder mehrere Wells ausgewählt zu behandeln, wie zum Beispiel die GENESIS-Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung (TECAN, AG der Schweiz), wie in 4 gezeigt.
Der Roboter ist mit einem Sechswegeventil zum Umschalten zwischen unterschiedlichen Medien-, Reagenz- und Ethanolversorgungen ausgerüstet. Der Roboter weist acht Pipettierspitzen 61 an seinem Flüssigkeitshandhabungsarm 62 auf. Vier der Spitzen sind ausgestaltet, um Medium zu mehreren der Mehrfach-Well-Platten 63, welche auf seinem Boden 64 gelagert sind, zu liefern. Die vier übrigen Spitzen sind jeweils in eine Spitzendichtung eingepasst, welche den vier übrigen Spitzen ermöglicht, die Wells 16 durch ihre entsprechenden Absauglöcher 22 abzusaugen.
Vorzugsweise wird die Roboterflüssigkeitshandhabungsvorrichtung 60 durch Verwendung eines Softwareprogramms zum Steuern des Ausfahrens ihrer Pipettenspitzen 61 in einer derartigen Art und Weise betrieben, um eine Kreuzverunreinigung zwischen den Wells 16 zu minimieren. Eine Verunreinigung der vier medienzuführenden Spitzen wird während der Mediumzuführung durch Schweben der Medienzuführungsspitzen über den Wells, ohne die Platten zu berühren, vermieden. Eine Verunreinigung der Absaugspitzen wird durch Spülen jeder Spitze mit einer antimikrobiellen Ethanolflüssigkeit zwischen den Absaugzyklen vermieden. Das Äußere der Spitzen und Dichtungen wird in einer Oberflächenwaschstation 65 auf dem Boden gewaschen, welche auch mit Ethanolflüssigkeit gefüllt ist. Das Ethanol wird von einer Spritzenpumpe und/oder einer Hochgeschwindigkeits-(Schnellwasch-)Membranpumpe von einem Vorratsbehälter, welcher durch das Sechswegeventil zugreifbar ist, gepumpt.
Ein Programmieren des Roboters 60, um die richtigen Löcher anzusteuern erfordert, dem Roboter die Stelle von sowohl den Absauglöchern 22 als auch den Wells 16 beizubringen. Auf diese Art und Weise wird der Roboter betrieben, als ob die Platte 10 zweimal so viele Wells aufweisen würde, da die Absauglöcher 22 entsprechend der Wells einer Platte mit der doppelten Dichte angeordnet sind. Die Tatsache, dass die Absauglöcher einen kleineren Durchmesser als die Wells 16 aufweisen, hat keine Auswirkungen, da der Roboter die Mitte der Absauglöcher 22 sucht. Zum Beispiel wird der Roboter zum Ansteuern einer 24 Well-Platte so programmiert, als ob sie 48 Wells hätte, wobei jedes Well einen Durchmesser gleich dem der von den Absauglöchern aufweist. Besonders die Programmierung der Well-Mitten (oder ihrer Stellen in Bezug auf die Absauglöcher) kann wegen des viel kleineren Durchmessers der Pipettenspitzen 61 bezogen auf die Wells beträchtlich daneben sein.
5 stellt ein Beispiel dar, wie der Roboter 60 programmiert werden kann, um die Wells 16 und die Absauglöcher 22 der Platte 10 zu behandeln. Zuerst werden die vier Mediumzuführungsspitzen über den Wells 105–108 angeordnet und, ohne die Platte 10 zu berühren, Medium in die Wells in Schritt 125 abgegeben. Die Mediumzuführungsspitzen werden dann der Reihe nach nach oben positioniert und geben Medium in die Wells 113–116 und 121–124 in den Schritten 126 bzw. 127 ab. Die vier Absaugspitzen werden dann in die Absauglöcher (welche der Roboter als „Wells" erkennt) 101–104 eingeführt, und saugen das verbrauchte Medium von den Wells 105–108 in Schritt 128 ab. Nach dem Absaugen werden die Absaugspitzen innen gespült und außen mit Ethanol an der Waschstation 65 im Schritt 129 gereinigt. Absaugen und Reinigen werden abwechselnd für Löcher 109–112 in den Schritten 130 und 131 und wieder für Absauglöcher 117–120 in den Schritten 132 und 133 durchgeführt. Es sollte erwähnt werden, dass der Vorgang in Abhängigkeit von der Anzahl der Pipettierspitzen und der Anzahl der Wells erweitert oder reduziert werden kann. Zusätzlich wird das Verfahren vorzugsweise innerhalb einer HEPA-gefilterten Umgebung durchgeführt, wie zum Beispiel einer unter Druck stehenden und gefilterten Haube, um das Auftreten einer Verunreinigung zu minimieren.
Der Roboter 60 kann ferner in Verbindung mit einer hochdichten Unterbringung oder einem Gestell zum Halten und Zuführen von Licht zu den Geweben in hunderten von Platten verwendet werden, wie in der demselben Anmelder gehörenden US-Patentanmeldung 10/080,918 mit dem Titel „LED Array for Illuminating Cell Well Plates and Automated Rack Systems for Handling the Same" beschrieben ist, welche durch Bezugnahme hierin mit aufgenommen wird. Das automatisierte Gestellsystem verwendet seinen eigenen Roboter, um die Platten handzuhaben und dem Roboter des vorliegenden Systems vorzulegen.
In noch einer weiteren Ausführungsform kann die Well-Platte und das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine feste Phasenextraktion durchzuführen. Jedes Well der Well-Platte enthält eine Matrix, welche zwischen einem Paar von Fritten, welche eine Säule ausbilden, eingeschlossen ist. Verschiedene Verbindungen (zum Beispiel Liganden oder Antikörper) werden durch die Säule gedrückt und werden innerhalb der Matrix gefangen. Nach einer Festephasen-Extraktion kann ein Mittel durch die Säule gedrückt werden, um die feste Phase aufzubrechen. Eine Hochdurchsatzverteilung und Rückgewinnung der Verbindung, Mittel usw. kann von einem automatisierten Pipet tierkopf unter Verwendung der Wells und ihrer entsprechenden Absauglöcher gehandhabt werden.
Die vorliegende Erfindung weist verschiedene Vorteil auf. Zum Beispiel müssen die Gewebeproben 32 in den Wells 16 nicht bewegt oder gestört werden, was die Arbeitsbelastung reduziert und sterile und optimale Wachstumsbedingungen sicherstellt. Die Platten 10 können mit herkömmlichen flüssigkeitshandhabenden Pipettenköpfen verwendet werden, da die Absauglöcher 22 von der oberen Oberfläche des Körpers zugreifbar sind, d.h., eine von oben zu befüllende Anordnung. Die Verwendung von Roboterflüssigkeitshandhabungsvorrichtungen mit der Platte fördert eine Well zu Well übereinstimmende Behandlung der Gewebe sowie das wirksame Entfernen und Ersetzen des Mediums 36. Der von oben zu beladende Aspekt ermöglicht die Verwendung eines Standarddeckels für eine sterile Bedienung und beseitigt die Notwendigkeit für eine getrennte Vakuumverteilerstation zum Heraussaugen des Mediums. Das Fehlen von einem Verteiler ermöglicht die unterschiedliche Behandlung von jedem Well und bietet Flexibilität bei der Gestaltung und Auswahl der Flüssigkeitshandhabungsvorrichtung. Der Flüssigkeitskopf kann ausgestaltet sein, das Medium zu entfernen sowie neues Medium hinzuzufügen ohne Werkzeuge oder Pipettenspitzen auszutauschen.
Einige der hierin offenbarten Figuren enthalten Blockdiagramme, Flussdiagramme und Kontrollflussdarstellungen von Verfahren, Systemen und Programmprodukten gemäß der Erfindung. Es ist klar, dass jeder Block oder Schritt des Blockdiagramms, Flussdiagramms und der Kontrollflussdarstellung und Kombinationen von Blöcken in dem Blockdiagramm, Flussdiagramm und der Kontrollflussdarstellung von Computerprogrammbefehlen ausgeführt werden können. Diese Computerprogrammbefehle können in einen Computer oder eine andere programmierbare Vorrichtung geladen werden, so dass die Befehle, welche auf dem Computer oder einer anderen programmierbaren Vorrichtung ausgeführt werden, Mittel zum Realisieren der Funktionen, welche in dem Blockdiagramm, dem Flussdiagramm oder dem Kontrollflussblock (den Kontrollflussblöcken) oder -schritt (-schritten) spezifiziert sind, erzeugen. Diese Computerprogrammbefehle können auch in einem computerlesbaren Speicher gespeichert werden, welche einen Computer oder eine andere programmierbare Vorrichtung steuern können, um in einer speziellen Art und Weise zu arbeiten, so dass die in dem computerlesbaren Speicher gespeicherten Befehle einen Beitrag zu herstellungseinschließenden Befehlsmitteln, welche die Funktion ausführen, die in dem Blockdiagramm, Flussdiagramm oder dem Kontrollflussblock oder -schritt (den Kontrollflussblöcken oder -schritten) spezifiziert sind, herstellen. Die Computerprogrammbefehle können ferner auf einen Computer oder eine andere programmierbare Vorrichtung geladen werden, um eine Abfolge von Betriebsschritten zu bewirken, die auf dem Computer oder einer anderen programmierbaren Vorrichtung ausgeführt werden sollen, um ein computerrealisiertes Verfahren derart herzustellen, dass die Befehle, welche auf dem Computer oder einer anderen programmierbaren Vorrichtung ausgeführt werden, Schritte zum Realisieren der Funktionen bereitstellen, die in dem Blockdiagramm, dem Flussdiagramm, dem Kontrollflussblock oder -schritt (den Kontrollflussblöcken oder -schritten) spezifiziert sind.
Dementsprechend unterstützen Blöcke oder Schritte des Blockdiagramms, Flussdiagramms oder der Kontrollflussdarstellung Kombinationen von Mitteln zum Ausführen der spezifizierten Funktionen, Kombinationen von Schritten zum Ausführen der spezifizierten Funktionen und Programmbefehlsmitteln zum Ausführen der spezifizierten Funktionen. Es ist ferner klar, dass jeder Block oder Schritt des Blockdiagramms, Flussdiagramms oder der Kontrollflussdarstellung und Kombinationen von Blöcken oder Schritten in dem Blockdiagramm, Flussdiagramm oder der Kontrollflussdarstellung von einem hardwarebasierten Spezialcomputersystem ausgeführt werden kann, welches die spezifizierten Funktionen oder Schritte oder Kombinationen von Spezialhardware und Computerbefehlen ausführt.
Viele Anderungen und andere Ausführungsformen der Erfindung werden einem Fachmann, den diese Erfindung betrifft, einfallen, welche den Nutzen der in den vorhergehenden Beschreibungen und zugeordneten Zeichnungen dargestellten Lehren aufweisen. Daher ist es selbstverständlich, dass die Erfindung nicht auf die speziellen offenbarten Ausführungsformen beschränkt ist, und dass Änderungen und weitere Ausführungsformen von dem Umfang der beigefügten Ansprüche mit umfasst sein sollen. Zum Beispiel kann in einer weiteren Ausführungsform die Well-Platte und das Verfahren auch verwendet werden, um Bakterien zu züchten. Obwohl hier spezifische Begriffe verwendet werden, werden sie nur in einem allgemeinen und beschreibenden Sinn benutzt und nicht zum Zweck der Beschränkung.

Claims

Vorrichtung, um ein Gewebe (32) auf einer porösen Fritte (30) zu unterstützen, wobei das Gewebe (32) und die poröse Fritte (30) in einem Medium (36) feuchtgehalten werden sollen, welches regelmäßig von einer von oben zu befüllenden Pipetiervorrichtung abgesaugt und aufgefrischt wird, wobei die Vorrichtung einen Körper (12) mit einer oberen Oberfläche (14) umfasst, wobei der Körper (12) ein erstes Loch (16) mit einer Oberkante des ersten Lochs, die durch die obere Oberfläche (14) des Körpers (12) definiert ist, und mit einem Unterteil des ersten Lochs, das innerhalb des Körpers (12) und unterhalb der oberen Oberfläche (14) des Körpers definiert ist, definiert, wobei das erste Loch (16) ausgestaltet ist, das Gewebe (32) aufzunehmen und das Medium (36), welches das Gewebe (32) feucht hält, zu halten, wobei die Vorrichtung gekennzeichnet ist durch ein zweites Loch (22) mit einer Oberkante des zweiten Lochs, die durch die obere Oberfläche (14) des Körpers (12) definiert ist, und mit einem Unterteil des zweiten Lochs, der innerhalb des Körpers (12) und unterhalb der oberen Oberfläche (14) des Körpers (12) definiert ist, wobei der Unterteil des zweiten Lochs über Flüssigkeitsverbindung mit dem Unterteil des ersten Lochs derart verbunden ist, dass die Pipettiervorrichtung über die Oberkante des zweiten Lochs auf das erste Loch (16) zugreifen kann, um das Medium (36) durch Anwenden eines Unterdrucks abzusaugen und das Medium (36) durch Einpumpen von frischem Medium (36), ohne das Gewebe (32) aus dem ersten Loch (16) zu entfernen, aufzufrischen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung eine Platte (10) umfasst, die mehrere erste Löcher (16) und mehrere zugehörige zweite Löcher (22) umfasst.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Vorrichtung ferner eine poröse Fritte (30) umfasst, die ausgestaltet ist in der Lage zu sein das Gewebe (32) oberhalb des Unterteils des ersten Lochs zu tragen und das Gewebe (32) in dem Medium (36) feucht zu halten.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei der Körper (12) ferner einen Vorsprung (29) aufweist, der in den Unterteil des ersten Lochs hineinragt und ausgestaltet ist, die poröse Fritte (30) darauf zu unterstützen.
Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die obere Oberfläche (14) des Körpers (12) ausgestaltet ist, eine darauf angeordnete Abdeckplatte aufzunehmen.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei die Abdeckplatte lichtdurchlässig ist und wobei die Oberkante des ersten Lochs ausgestaltet ist, Licht zum Gewebe (32), welches sich im ersten Loch (16) befindet, durchzulassen, indem sie ein Verhältnis Höhe zu Durchmesser von weniger als 2 zu 1 aufweist, so dass Wachstum des Gewebes (32) gefördert wird.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das zweite Loch (22) einen Durchmesser aufweist, der mit bereits bestehenden Pipettenspitzen verträglich ist.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Körper (12) aus einem einzigen Stück Material gebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die poröse Fritte (30) aus gesintertem Polyethylen-Material gefertigt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 9, wobei die Fritte (30) hydrophil ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, 9 oder 10, wobei die Fritte (30) ungefähr 0,635 cm (0,25 inch) dick ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, 9, 10 oder 11, wobei die Fritte (30) eine Porengröße von ungefähr 90 bis ungefähr 130 Mikrometer aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, die ferner einen Kanal (28) umfasst, der in dem Körper (12) ausgebildet ist und eine Flüssigkeitsverbindung zwischen dem Unterteil des ersten Lochs und dem Unterteil des zweiten Lochs zur Verfügung bereitstellt, so dass eine Pipetiervorrichtung mit vielen Köpfen gleichzeitig auf das zweite Loch (22) zugreifen kann, um das Medium (36) durch Anwenden eines Unterdrucks abzusaugen, und das Medium (36) durch Einpumpen von frischem Medium durch das erste Loch (16), ohne das Gewebe (32) zu entfernen, auffrischen kann.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei der Körper (12) ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass er aus flüssigkeitsundurchlässigem Material gebildet ist.
Vorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die obere Oberfläche (14) und die untere Oberfläche des Körpers im Wesentlichen eben sind.
Vorrichtung zum automatisierten Hochdurchsatz-Screening von Gewebe (32), wobei die Vorrichtung zumindest eine Medium-Versorgungsspitze, die über Flüssigkeitsverbindung mit einer Mediumversorgung verbunden ist; und mindestens eine Ansaugspitze, die über Flüssigkeitsverbindung mit einer Unterdruck-Versorgung verbunden ist, umfasst; wobei die Vorrichtung ferner umfasst: eine Dichtung (35), welche die Ansaugspitze umgibt, eine Roboter-Schwenkvorrichtung (60), welche geeignet ist, die Spitzen (61) in einem Bewegungsbereich gelenkig zu bewegen; und zumindest eine Vorrichtung nach einem der voranstehenden Ansprüche, die innerhalb des Bewegungsbereichs der Spitzen (61), die durch die Roboter-Schwenkvorrichtung (60) gelenkig bewegt werden, positioniert ist, wobei das erste Loch (16) ausgestaltet ist, das Gewebe (32) und das Medium (36), welches durch die Medium-Versorgungsspitze bereit gestellt wird, aufzunehmen und das Medium (36) derart zu tragen, dass das Gewebe (32) feuchtgehalten wird, und wobei das zweite Loch ausgestaltet ist die Ansaugspitze derart aufzunehmen, dass die Dichtung (35), welche die Ansaugspitze umgibt, gegen die obere Oberfläche (14), welche die obere Kante umgibt, stößt, und gegen Anwendung des Unterdrucks abdichtet, um das Medium (36) aus dem ersten Loch (16) durch die Ansaugspitze abzusaugen.
Vorrichtung nach Anspruch 16, wobei die Dichtung (35) der Spitze einen Durchlass definiert, wodurch die Dichtung (35) die Ansaugspitze umgeben kann.
Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei der Durchlass einen Durchmesser von höchstens 90% eines maximalen Durchmessers der Ansaugspitze aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei die Dichtung (35) der Spitze ein kegelstumpfförmiges Ende mit dem sich dadurch axial erstreckenden Durchlass aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei das kegelstumpfförmige Ende einen Winkel von 70 Grad aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 20, die ferner einen Bund (51) umfasst, der um die Spitze herum, zur Dichtung (35) der Spitze benachbart, befestigt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 21, wobei der Bund (51) eine Stahlbuchse mit einer Öffnung, die durch diese hindurchführt, aufweist, welches in der Größe ausgelegt ist die Spitze aufzunehmen.
Vorrichtung nach Anspruch 21 oder 22, wobei der Bund (51) ferner eine Justierschraube (52) aufweist, die ausgestaltet ist, die Spitze einzufassen, indem die Spitze in eine Passung mit Reibung eingeschnürt wird.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 23, wobei die Dichtung (35) aus einem Silikonmaterial gefertigt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 24, wobei die Ansaugspitze in Flüssigkeitsverbindung mit einer antimikrobielle Flüssigkeitsversorgung steht.
Vorrichtung nach Anspruch 25, die ferner eine Pumpe umfasst, welche geeignet ist, die antimikrobielle Flüssigkeit durch die Ansaugspitze zu pumpen.
Vorrichtung nach Anspruch 25 oder 26, wobei die antimikrobielle Flüssigkeit Ethanol beinhaltet.
Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 15, wobei das Verfahren die Stufen umfasst: Bereitstellen eines Körpers (12) mit einer oberen Oberfläche (14); Definieren eines ersten Lochs (16) in dem Körper (12), indem durch die obere Oberfläche (14) des Körpers (12) hindurch gebohrt wird, um eine Oberkante des ersten Lochs auszubilden, und indem unterhalb der oberen Oberfläche (14) und in den Körper (12) hinein gebohrt wird, um einen Unterteil des ersten Lochs auszubilden; und Definieren eines zweiten Lochs (22) in dem Körper (12), indem durch die obere Oberfläche (14) des Körpers (12) gebohrt wird, um eine Oberkante des zweiten Lochs auszubilden und indem unterhalb der oberen Oberfläche (14) und in den Körper (12) hinein gebohrt wird, um einen Unterteil des zweiten Lochs auszubilden; und Verbinden des Unterteils des ersten Lochs mit dem Unterteil des zweiten Lochs, indem ein Durchlass (28) in dem Körper (12) und zwischen dem Unterteil des ersten Lochs und dem Unterteil des zweiten Lochs ausgebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Ausbilden des Durchlasses (28) ein Einführen einer Säge (80) in den Unterteil des ersten Lochs und ein Bewegen der Säge in lateraler Richtung, bis sie auf den Unterteil des zweiten Lochs stößt, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, wobei das Bereitstellen des Körpers (12) das Bereitstellen des Körpers (12), der aus einem einzigen Materialstück besteht, umfasst.
Verfahren zur Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Stufen: Legen einer Fritte (30) in das erste Loch (16); Platzieren eines Gewebes (32) in dem ersten Loch (16) und auf der Fritte (30); Zugabe eines Mediums (36) in das erste Loch (16); Einführen einer Pipette in das zweite Loch (22) und Absaugen des Mediums (36) aus dem ersten Loch (16) durch Anwenden eines Saugdrucks auf das zweite Loch (22) durch Benutzung der Pipette, wobei der Saugdruck das Medium (36) vom ersten Loch (16) in das zweite Loch (22) und in die Pipette zieht, um so das Medium (36) aus der Vorrichtung zu spülen.
Verfahren nach Anspruch 31, welches ferner, nachdem das Medium (36) aus dem ersten Loch (16) abgesaugt wurde, die erneute Zugabe des Mediums (36) in das erste Loch (16) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, welches den Vorgang des Entfernens des Deckels von der Vorrichtung, bevor die Fritte (30) eingelegt wird, und das Wiederaufsetzen des Deckels nach dem Absaugen des Mediums (36), umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, wobei die Zugabe des Mediums in das erste Loch (16) die Zugabe des Mediums (36) in das zugehörige zweite Loch (22) mit der Pipette umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 34, wobei der Körper (12) ferner einen Kanal (28), der das erste Loch (16) mit dem zugehörigen zweiten Loch (22) über eine Flüssigkeitsverbindung verbindet, definiert und wobei das Absaugen das Medium (36) durch den Kanal (28) zieht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 35, wobei das Gewebe (32) ein Pflanzengewebe umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 36, wobei das Gewebe (32) ein Wasserlinsengewebe ist.
Verfahren zur Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, um ein Gewebe für Wachstum auf einer Fritte (30) zu unterstützen, gekennzeichnet durch die Vorgänge: Bereitstellen der Fritte (30) in dem ersten Loch (16) oberhalb einer Nährstoffversorgung; Ableiten der Nährstoffe durch eine poröse, hydrophile Struktur der Fritte (30); und Zuführen der Nährstoffe durch eine obere Oberfläche der Fritte (30) zu dem Gewebe, so dass das Gewebe kontinuierlich mit Nährstoffen versorgt wird und das Wachstum des Gewebes gefördert wird.
Verfahren nach Anspruch 38, ferner gekennzeichnet durch Speichern von bis zu 550 μl an Nährstoffen in der Fritte, bevor die Nährstoffe zugeführt werden.
Verfahren zum Austauschen eines flüssigen Mediums (36) in einer mit mehreren Kavitäten versehenen Platte, welches eine Vorrichtung nach Anspruch 2 umfasst, wobei das Verfahren umfasst: Positionieren einer Vielzahl von Spender-Pipettenspitzen jeweils über einem der Vielzahl der ersten Löcher (16) der mit einer Vielzahl von Kavitäten versehenen Platte; Abgabe des Mediums (36) aus jeder der Spender-Pipettenspitzen in das entsprechende erste Loch (16), über dem die Spender-Pipettenspitze positioniert ist; wiederholtes Positionieren und Abgabe aus den Spender-Pipettenspitzen, bis alle der ersten Löcher (16) der mit einer Vielzahl von Kavitäten versehenen Platte gefüllt sind; Einführen einer Vielzahl von Ansaug-Pipettenspitzen jeweils in ein entsprechendes der Vielzahl der zweiten Löcher (22); Absaugen des Mediums (36), indem jede der Ansaug-Pipettenspitzen zum Ansaugen des Mediums (36) aus dem entsprechenden zweiten Loch (22), in welchem die Ansaug-Pipettenspitze positioniert ist, benutzt wird; Waschen der Ansaug-Pipettenspitzen in einer Waschstation; und wiederholtes Einführen, Absaugen und Waschen, bis das Medium (36) aus allen der ersten Löcher (16) der Platte mit der Vielzahl an Kavitäten geleert ist.
Computerprogramm, welches, wenn es auf einem Computer ausgeführt wird, geeignet ist, eine Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens nach Anspruch 40 zu steuern.
Lesbares Computerspeichermedium, auf welchem ein Computerprogramm nach Anspruch 41 gespeichert ist.