MXPA03010831A - Placa y metodo para clasificacion de alto rendimiento. - Google Patents

Abstract

Se proporciona una placa de depositos multiples y metodo para el intercambio de medio, incluyendo un cuerpo que define una pluralidad de depositos de celulas conectado cada uno a traves de una canal a una pluralidad de agujeros de aspiracion. Los depositos de celulas contienen un frit poroso, hidrofilico que esta suspendido en una escalon arriba de un deposito de medio fluido y que soporta una muestra de tejido. Las propiedades del frit dirigen hacia arriba el medio de fluidos para abastecer a la muestra del tejido con nutrientes para su crecimiento y proliferacion. Se aspira el medio antiguo de los depositos a traves de un aparato de manejo de liquidos que inserta una punta de pipeta en los agujeros de aspiracion. La punta de pipeta aplica una presion de succion que extrae el medio fuera del deposito de la celula, a traves del canal, en un agujero de aspiracion y fuera a traves de la punta de la pipeta. Se dispersa medio nuevo a traves de la punta de la pipeta y directamente en el deposito de la celula.

Description

PLACA Y MÉTODO PARA CLASIFICACIÓN DE ALTO RENDIMIENTO Campo del Invento La presente invención se refiere a aparatos y métodos para promover el crecimiento de tejido en escenarios experimentales y de producción, más particularmente se refiere al uso de placas especializadas para alojar el tejido y al ciclado de medios para sostener en forma biológica el tej ido .

Antecedentes del Invento La clasificación de alto rendimiento normalmente requiere el procesamiento paralelo de lotes de muestras, normalmente en placa de depósitos múltiples (MWPs) de 24, 48, 96 y 384 ó más depósitos por placa. Las MWPs tienen tamaños estándar que se pueden utilizar con la maquinaria de alto rendimiento ya existente, tal como con pipeteadores controlados por robots . Cada estación de pipetización de un pipeteador controlado por robots, emplea cabezas de pipetización que tienen una formación de puntas de pipetas que se dirigen a múltiples depósitos en forma simultanea. Aunque se utilizan en forma efectiva para la clasificación de muestras liquidas, las placas de depósitos múltiples normales generalmente no son efectivas para clasificar tejidos de plantas y otros tejidos, y los productos de segregación asociados con estos tejidos, que requieren, o prefieren ambientes más complejos, tales como estructuras de soporte sólido. Por ejemplo, se han realizado intentos para crecer plantas en MWPs suspendiendo las plantas en un medio liquido dentro de cada depósito. Sin embargo, se priva de oxigeno el tejido de la planta cuando se asienta en el liquido, "anegando" en forma efectiva el tejido de la planta en un ambiente anaeróbico. Se han realizado otros intentos utilizando medios que generalmente son más sólidos y proporcionan un substrato en el cual el tejido de la planta puede ser soportado arriba del fluido, tal como un gel o un disco de papel filtro. Aunque estos tipos de soportes evitan la anegación de las plantas, son difíciles de intercambiar y rellenar cuando se han eliminado los nutrientes o el medio. También se han utilizado puentes de papel mojados en el medio líquido en la forma de soporte del tejido, y el medio liquido se rellena en una forma un poco más fácil. Sin embargo, la evidencia empírica ha mostrado que los puentes de papel son difíciles de manejar en un sistema automático y generalmente no son efectivos para promover el crecimiento de tejidos de plantas. Sin limitarse a alguna teoría en particular, esto se puede deber a que el medio líquido no penetra fácilmente en un puente de papel (es decir, el puente de papel es hidrofílico hasta cierto punto) y el tejido soportado en el mismo carece de un suministro continuo del medio.

Un método común para suministrar medio fresco al tejido de las plantas, es mover el tejido de la planta a un contenedor que mantiene un medio fresco. El movimiento del tejido de la planta es un proceso relativamente lento y de trabajo intenso, ya que se deben rellenar múltiples placas y preparar de otra manera para cada lote de tejido de la planta. Además, existe la amenaza de una pérdida o contaminación de las muestras de tejido cuando se eliminan de los depósitos. Otro método para aspirar y eliminar el medio gastado y los subproductos del tejido, es utilizar una placa de ensayo que tenga una pluralidad de depósitos, teniendo cada depósito un agujero o puerta en la base del mismo. Se coloca un filtro en la parte del fondo de cada depósito para soportar el tejido. El medio gastado puede ser recolectado de cada depósito al vacio a través de la puerta, utilizando un ensamble de múltiple de vacio. Un ejemplo de un ensamble de múltiple de vacio es el sistema de Múltiple de Vacio MultiScreen fabricado por MILLIPORE de Bedford, Massachussets. La placa de ensayo descansa en un múltiple que suministra un vacio que extrae el medio a través de los .discos del filtro, fuera de los depósitos de la célula y a través de las puertas, en donde es capturado en la parte de abajo del múltiple. Aunque los discos del filtro en la placa de ensayo permiten que el medio sea extraído fuera de la placa, es difícil que los discos y el filtro retengan suficiente medio para soportar el mantenimiento y crecimiento del tejido durante largo tiempo. Debido a que las puertas en la parte del fondo de los depósitos están abiertas al aire ambiental, las puertas pueden permitir que el medio se filtre o evapore y también pueden proporcionar una . trayectoria de contaminación microbiana de los depósitos. Además, los depósitos de la placa de ensayo no pueden ser muestreados en forma individual debido · a que el múltiple de vacio recolecta el medio de todos los depósitos a la vez . El tejido de animales, y otros tipos de organismos también pueden requerir, o preferir, estructuras de soporte sólido que inhiben el uso de placas de depósitos múltiples y técnicas de clasificación de alto rendimiento. Por ejemplo, se puede promover el crecimiento de células de cartílago a través del uso de una matriz de fibrilla de colágeno que simula un ambiente in vivo. Similar al tejido de planta descrito anteriormente, las células de cartílago necesitan un suministro de medio fresco que se rellena en varios intervalos para sobrevivir y/o proliferar. Además, parte de las células de cartílago proliferan dentro de la matriz de fibrilla de colágeno y no pueden moverse en forma independiente de la matriz . Al mover las células a una nueva placa con un suministro fresco de medios, se requiere el movimiento de toda la matriz de colágeno el cual es un proceso relativamente lento e ineficiente que expone el tejido a la contaminación. Podría ser conveniente tener una placa de depósitos múltiples que permita el uso de métodos de clasificación de alto rendimiento para muestras no liquidas. Además, podría ser conveniente tener una placa de depósitos múltiples que permite el uso de métodos de clasificación de alto rendimiento para tejidos que requieren, o prefieren, estructuras de soporte sólido. Podría ser conveniente además tener una placa de depósitos múltiples que promueva el crecimiento de tejidos, tal como el tejido de una planta, sin tener el riego de anegar el tejido en el medio líquido o permitir que el tejido se deshidrate o se contamine. También podría ser conveniente tener una placa de depósitos múltiples que permita que el medio se rellene fácilmente, sin una perturbación indebida del tejido contenido en los depósitos. Además, podría ser conveniente tener la capacidad de muestrear menos del número total de depósitos en la placa sin perturbar los depósitos no muestreados.

Sumario del Invento La presente invención se dirige a las necesidades anteriores y logra otras ventajas al proporcionar una placa de depósitos múltiples (MWP) y un método para intercambiar el medio que promueve el crecimiento de tejidos de plantas y otros tipos de tejido, controlando el suministro de medio al tejido y permitiendo el intercambio regular ( eliminación y adición ) del medio sin perturbar el tejido. La MWP incluye una formación de depósitos, estando acoplado cada depósito con un agujero de aspiración adyacente que permite que el medio sea aspirado de los depósitos utilizando una cabeza de pipeta automatizada convencional. La MWP y la cabeza de la pipeta proporcionan un intercambio virtualmente completo del medio gastado debido a la arquitectura novedosa de doble depósito. Un vidrio hidrofilico y poroso (frit) alojado dentro de cada depósito, soporta el tejido y mantiene el medio en sus intersticios, permitiendo el contacto entre el tejido y el medio en tanto que evita una condición anaeróbica. El medio es dirigido hacia arriba en cantidades suficientes para proporcionar nutrientes al tejido y promover la proliferación del mismo. En una modalidad, la presente invención incluye una placa para mantener un frit poroso que soporta un tejido. El frit poroso está saturado en un medio que puede ser aspirado y rellenado de manera regular, por ejemplo, mediante un aparato de pipeta de carga superior. La placa comprende un cuerpo con una superficie superior que define un primer agujero y un segundo agujero. El primer agujero tiene un borde superior del primer agujero definido por la superficie superior del cuerpo y una parte del fondo del primer agujero definida dentro del cuerpo y debajo de la superficie superior del cuerpo. El primer agujero está configurado para recibir el frit poroso y el tejido, y para mantener al medio bañando el frit poroso y al tejido. El segundo agujero tiene un borde superior del segundo agujero definido por la superficie superior del cuerpo y una parte del fondo del segundo agujero definida dentro del cuerpo y debajo de la superficie superior del cuerpo. La parte del fondo del segundo agujero está en comunicación de fluidos con la primera parte del fondo del agujero, de modo que el aparato de la pipeta puede accesar el segundo borde superior del agujero para aspirar el medio aplicando vacio. El aparato de pipeta también rellena el medio agregando medio fresco directamente sobre el frit en cada depósito. En otro aspecto, el cuerpo de la placa define además un pasaje que conecta una primera parte del fondo del agujero y la segunda parte del fondo del agujero en comunicación de fluidos. El cuerpo puede incluir además un escalón que sobresale en la primera parte del fondo del agujero para soportar el 'frit arriba de un depósito de fluidos. El cuerpo también puede definir una pluralidad del primero y segundo agujeros, con cada primer agujero en comunicación de fluidos con uno respectivo de los segundos agujeros para formar un MWP . En otro aspecto, el cuerpo define una formación de primeros y segundos agujeros, por ejemplo 12, 24, 48, 96, 384 ó 1536 primeros y segundos agujeros, en donde cada primer agujero está en comunicación de fluidos con uno respectivo de los segundos agujeros. El primer y segundo agujeros tienen preferentemente formas cilindricas . Aún en otro aspecto, la superficie superior del cuerpo está configurada para recibir una placa de cobertura colocada en la misma.

Preferentemente, la placa de cobertura es transparente para la transmisión de luz y el borde superior del primer agujero está configurado para permitir la transmisión de luz, promoviendo de este modo el crecimiento de tejido de la- planta. En otra modalidad, la presente invención incluye un método para elaborar una placa para mantener un frit poroso que soporta un tejido,- en donde el frit poroso está saturado en un medio. El medio se aspira y se rellena en forma regular mediante un aparato de pipeta para promover la proliferación del tejido. El método incluye abastecer a un cuerpo con una superficie superior y definir un primer y segundo agujeros en el cuerpo. El definir un primer agujero en el cuerpo, incluye perforar a través de la superficie superior del cuerpo para formar un borde superior del primer agujero y perforar debajo . de la superficie superior para formar una parte del fondo del primer agujero. El segundo agujero se define perforando a través de la superficie superior del cuerpo para formar un borde superior del segundo agujero y perforar debajo de la superficie superior para formar una parte del fondo del segundo agujero. Las partes del fondo del primero y segundo agujeros están conectadas en comunicación de fluidos formando un pasaje en el cuerpo y entre la parte del fondo del primer agujero y la parte del fondo del segundo agujero.

Preferentemente, el pasaje se forma insertando un disco con sierras en la parte del fondo del primer agujero y moviendo la sierra en forma lateral hasta que se encuentra con la parte del fondo del segundo agujero. Aún en otra modalidad, la presente invención incluye un método para utilizar una MWP . Se coloca un frit en cada pluralidad de primeros agujeros y tejido, colocando preferentemente en el frit una lenteja de agua u otro tejido de planta. Se suministra un medio en cada pluralidad de primeros agujeros. Se inserta una pipeta en cada pluralidad de segundos agujeros y se utiliza para aspirar el medio de los primeros agujeros. El medio es aspirado aplicando una presión de succión a los segundos agujeros utilizando la pipeta. La presión de succión extrae el medio del primer agujero, en el segundo agujero y en la pipeta para lavar el medio de la placa. El medio fresco puede ser suministrado nuevamente en la pluralidad de primeros agujeros después de aspirar el medio de los segundos agujeros. Aún en otra modalidad, la presente invención incluye un material frit para soportar un tejido que tiene una estructura porosa, una superficie superior y una superficie de fondo. La estructura porosa tiene propiedades hidrofílicas y una pluralidad de intersticios . La superficie superior está configurada para soportar el tejido. La superficie del fondo está en comunicación de fluidos con un depósito del medio fluido. Las propiedades hidrofílicas de la estructura porosa, dirigen el fluido en sus intersticios, de modo que el tejido soportado es abastecido con suficiente medio líquido del recipiente para promover el crecimiento del tejido. La presente invención tiene varias ventajas. Por ejemplo, las muestras del tejido en los depósitos no tienen que ser movidas o perturbadas cuando se gasta el medio proporcionado, se corta en la carga y se aseguran condiciones de crecimiento estériles y óptimas. Las placas pueden ser utilizadas con cabezas de pipeta de manejo líquido convencionales de la punta fija o versiones de punta controlada en forma individual debido a que los agujeros de aspiración son accesibles desde la superficie superior del cuerpo, es decir, un ajuste de carga superior. El uso de recipientes para líquidos robotizados con la placa, promueve una consistencia de depósito en depósito en el tratamiento del tejido, asi como una eficiente remoción y reemplazo del medio. El aspecto de carga superior permite el uso de una tapa estándar para el control de esterilidad y elimina la necesidad de una estación de múltiple de vacio por separado para extraer el medio. La carencia de un múltiple permite el tratamiento diferencial de cada depósito y proporciona flexibilidad en el diseño y selección del recipiente para líquidos, así como un modelo experimental y funciones de interrogación de muestra. La cabeza de líquido puede estar configurada para eliminar el medio así como agregar nuevos medios sin cambiar el herramentaje o las puntas de la pipeta.

Breve Descripción de las Figuras Habiendo descrito de este modo la invención en términos generales, a continuación se hará referencia a las figuras que la acompañan, las cuales no están trazadas necesariamente a escala, y en donde : La figura 1, es una vista en planta de una MWP para el intercambio del medio líquido de una primera modalidad de la presente invención; La figura 2, es una vista de sección transversal alargada de un solo depósito y un agujero de aspiración de MWP de la figura 1; La figura 3, es una vista en perspectiva de un sello de la punta de otra modalidad de la presente invención ; La figura 4, es una vista en perspectiva de un sistema para rellenar medio en la MWP mostrada en la figura 1 de otra modalidad de la presente invención; La figura 5, es un diagrama de flujo de un método para rellenar medio utilizando el sistema de la figura 4; y La figura 6, es una vista seccionada del depósito y agujero de aspiración de la figura 2, estando maquinada en otra modalidad de la presente invenció .

Descripción Detallada del Invento La presente invención se describirá a continuación de manera más completa, haciendo referencia a las figuras que la acompañan en las cuales se muestran las modalidades preferidas de la presente invención. Sin embargo, la presente invención puede presentarse en muchas diferentes formas y no debe ser construida como limitada a las modalidades aquí establecidas; más bien, las modalidades se proporcionan para que está descripción sea profunda y completa y transmita completamente el alcance de la presente invención a los expertos en la técnica. Los números similares se refieren a elementos similares a lo largo de la descripción. Una placa de depósitos múltiples (MWP) 10 de la presente invención, incluye un cuerpo 12 que tiene una superficie superior 14. El cuerpo 12 define una formación de primeros agujeros o depósitos 16 y una formación de segundos agujeros de aspiración 22, tal como se muestra en la figura 1. Una pluralidad de canales 28 conectan cada uno, uno de los depósitos respectivos 16 a uno de los agujeros de aspiración adyacente 22, tal como se muestra en la figura 2. En una modalidad, un frit hidrofilico 30 poroso se encuentra colocado en cada uno de los depósitos 16, en donde el frit soporta una muestra del tejido 32 sobre un recipiente de medio liquido 36. Las propiedades porosas, hidrofilicas del frit 30 conducen el medio 36 hacia arriba, para suministrar el medio a la muestra de tejido 32. Se facilita el intercambio del medio eliminado anterior 36 mediante los agujeros de aspiración 22, los cuales están diseñados y configurados cada uno para recibir una punta de pipeta 34. Durante la aspiración, se insertan varias de las puntas de la pipeta en los agujeros de aspiración 22 y aplican una presión de vacio. La presión de vacio extrae el medio fluido 36 fuera de cada uno de los depósitos 16, a través de los canales 28, a través de uno.de los agujeros de aspiración adyacente 22 y dentro de las puntas de las pipetas . La muestra de tejido 32 es preferentemente un tejido de planta, tal como un tejido dicotiledóneo o monocotiledóneo , tal como un tejido de maíz (Zea mays) , sp Brassica (por ejemplo, B.napus, B. Rapa , B. Júncea) , particularmente aquellas especies Brassica útiles como fuentes de aceite de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz {Oryza sativa) , centeno [Sécale cereale) , sorgo {Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum) , mijo proso (Panicum miliaceum) , mijo cola de zorro (Setarica italiza) , mijo de dedo (Eleusine coracana) ) , girasol (Heliantlus annuus) , cártamo (Carthamus tínctorius) , trigo {Triticum aestivium) , frijol soya (Glycine max) , tabaco (Nicotiana tabacum) , papa (Solanium tuberosum) , cacahuate (Arachis hypogaea) , algodón (Gossypium barbadenser Gossypium hirsutum) , papa dulce {Ipo oea batatus) , cassava {Manihot esculenta) , café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera) , piña [Ananas comosus) , árboles cítricos {Citrus spp.), cocoa (Theobroma cacao) , te (Camellia sinensis) , plátano (Musa spp) , aguacate (Persea americana) , higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava) , mango (Mangifera indica) , oliva (Olea europaea) , papaya (Carica papaya) , anacardo (Anacardiu occidentale) , macadamia (Macadamia integrifolia) , almendra (Prunus amygdalus) , granos de azúcar (Beta bulgaris) , caña de azúcar ( Saccharun spp) , avena, cebada, vegetales, ornamentales y coniferas. En algunas modalidades, el tejido es tejido calloso procedente de lenteja de agua o gimnospermas . La presente invención puede ser particularmente efectiva con tejidos de planta que sobreviven con el mínimo de fluidos, tal como un tejido derivado de gimnospermas. El cuerpo 12 de la MWP 10, está construido preferentemente de un bloque de policarbonato que puede ser maquinado y lo suficientemente resistente al calor para ser esterilizado en un autoclave para reutilizarse . Generalmente, la dureza del policarbonato permite que sea maquinado mediante una máquina de molido controlada por computadora (CNC) , u otro proceso de maquinación automática, en formas de precisión completas. El cuerpo también podría ser construido de otros materiales, tales como poliestireno, polisulfono, otros materiales sintéticos, metales, cerámicas, vidrio, etc. El cuerpo 12 tiene forma rectangular, y tiene 12.776+_0.0254 cm. de longitud, 8.5 71+0.0254 cm. de ancho y 2.060 + 0.0254 cm. de altura, una configuración compatible con la mayor parte de las máquinas convencionales para manejo de líquidos . El cuerpo 12 incluye otras características tales como una base 13 y un par de chaflanes de 45° 15 en las esquinas opuestas del . ancho del cuerpo. La base 13 proporciona un escalón y puede servir como una superficie de sujeción o montaje en equipo convencional . El par de chaflanes 15 puede servir como marcas de referencia para asegurar la orientación adecuada del cuerpo, especialmente cuando es importante mantener el seguimiento de la ubicación de cada depósito. El cuerpo 12 también tiene una superficie superior, plana 14, a través de la cual se preparan los agujeros 16 y 22. Se debe observar, que aunque el tamaño del cuerpo está configurado preferentemente para ser compatible con el equipo ya existente, las dimensiones del cuerpo pueden variar según se deseé . El número, dimensiones y ubicaciones de los depósitos 16, también se diseñan a la medida para ser compatibles con el equipo ya existente. Por ejemplo, la placa tiene preferentemente 24 depósitos en una formación de 4 por 6, ó 48 depósitos en una formación de 6 por 8 para ser compatibles con la mayoría de los aparatos de manejo de líquidos. Se podrían utilizar otras densidades de depósitos, tales como 6 depósitos ó 96 depósitos que sean compatibles con los aparatos convencionales. Sin embargo, también se podrían utilizar densidades de depósitos no estándar, tales como un solo depósito ó 1000 depósitos. Generalmente, el número de depósitos estará limitado por la práctica, de acuerdo con el tamaño del cuerpo 12, el tipo de tejido que esté creciendo, las capacidades del equipo que esté utilizando los depósitos y los tamaños de los propios depósitos . Preferentemente, cada uno de los depósitos 16 tiene una forma cilindrica estándar con un diámetro de 1.5748 cm. y una profundidad de 1.524 + 0.0254 cm. para la placa de 24 depósitos. El diámetro de cada depósito puede variar según se desea, y se basa en diversos factores, tal como el tamaño inicial del tejido que será colocado en el depósito, el rango de depósito del tejido y la longitud del tiempo en la que el tejido será propagado en el depósito antes de la eliminación. Una distancia centro a centro entre los depósitos es de 1.9364 cm. para que la placa de depósito asegure que es compatible el ajuste y movimiento de las aparatos de pipeta automáticos y estándar. La placa de depósito 24 ha sido determinada por los inventores como particularmente adecuada para la propagación de tejido de callo de lenteja de agua, presentando un balance preferido de volumen y densidad del tejido 32 de los depósitos. La densidad de los depósitos celulares 16 utilizada para la lenteja de agua, es preferentemente de 96 depósitos o menos debido al tamaño del callo y rápido crecimiento celular. Por supuesto, también se pueden utilizar otros ajustes para un equipo más hecho a la medida. Los agujeros de aspiración 22 se extienden a través de la superficie superior 14d el cuerpo 12. Cada uno de los 24 agujeros de aspiración 22 está preferentemente adyacente a, y conectando en comunicación de fluidos con, uno de los depósitos 16 respectivos. El ajuste equitativo de los agujeros de aspiración y los depósitos 16, permite la aspiración sin la contaminación cruzada de las muestras, tal como ocurre con las placas de depósito de múltiple de la técnica anterior. Además, el ajuste equitativo permite que el medio de los depósitos individuales 16 de interés, sea aspirado y rellenado en forma selectiva. Los depósitos individuales 16 podrían dirigirse selectivamente en forma manual o mediante equipo automático que permita la operación de una sola pipeta en forma independiente a las otras pipetas que se encuentran en la cabeza. El dirigir en forma selectiva los depósitos podría ser útil, por ejemplo si el tejido en uno de los depósitos estuvo generando una fuerte respuesta de expresión a un agente, tal como un crecimiento incrementado al tejido, una expresión incrementada en un polipéptido, una resistencia agregada a un agente selectivo tal como herbicida, o una resistencia a un patógeno de plantas. Con la presente invención, también se podrían ensayar otras respuestas bioquímicas o biofísicas en depósitos individuales. El medio de este depósito podría ser aspirado y probado de manera más frecuente que otros depósitos. Entre otras ventajas, la recolección y elaboración de pruebas más frecuentes del medio de dicho depósito, podrían proporcionar una correlación estadística más fuerte. Si la contaminación es un aspecto menos importante, cada uno de los agujeros de aspiración 22 podría ser emparejado con varios depósitos 16 para cortar en el número de iteraciones de aspiración. Cada uno de los agujeros de aspiración 22 también tienen preferentemente una forma cilindrica con una profundidad de 1.6764 + 0.0254 cm. y un diámetro de 0.4241 cm. para ser posible recibir una punta de pipeta de tamaño estándar 34 a través de su borde superior 24. Se podrían utilizar diámetros más pequeños o más grandes y diferentes distancias centro a centro, dependiendo del tamaño de la punta de la pipeta que será insertada. Por supuesto, las otras formas y dimensiones podrían variarse para adaptarse a un ajuste hecho a la medida, u otras formas y longitudes de pipetas estándar que son conocidas para los expertos en la técnica. Los agujeros de aspiración cilindricos 22 también son preferibles ya que son más fáciles de maquinar con puntos de perforación de rotación. Las distancias centro a centro entre los agujeros de aspiración adyacentes 22, es preferente la misma que la distancia centro a centro entre los depósitos 16, la cual es de 1.9304 cm. en la modalidad ilustrada de 24 depósitos. La colocación de los agujeros de aspiración a través de la superficie superior 14 del cuerpo 12 y la misma distancia centro a centro asegura que se puede utilizar la misma configuración de la cabeza de la pipeta para la aspiración del medio 36 como para la dispersión del medio. Tal como se muestra en la figura 2, cada uno de los canales 28 se conecta a un par de depósitos de células 36 y agujeros de aspiración 22 respectivos en comunicación de fluidos. Tal como se describió anteriormente, cada uno de los canales 28 tiene preferentemente una forma rigurosamente elíptica debido al método de fabricación preferido utilizado para crear el canal. Cada uno de los canales está colocado debajo de la parte de fondo de uno de los depósitos 16 y los agujeros de aspiración 22, también debido al método de fabricación preferido. También se podrían utilizar muchos tipos de formas para los canales 28 ya que la distribución de presión del vacío aplicado a la pipeta, se distribuirá de manera uniforme a través de todo el depósito de células que está siendo aspirado. Cada uno de los canales 28, actúa junto con sus depósitos 16 y agujeros 22 respectivos, como un recipiente para el medio en exceso 36 que no ha sido dirigido en el frit 30. Además de suministrar un vacío para aspiración, los canales 28 y los agujeros de aspiración 22 también pueden utilizarse para suministrar el medio 36. Podría ser útil suministrar el medio a través de los canales 28 y los agujeros de aspiración 22 a los depósitos 16, si por ejemplo el callo del tejido de la planta 32 fuera lo suficientemente denso para ser relativamente impermeable al medio suministrado a través del borde superior de los depósitos 16. Preferentemente, el ancho de cada uno de los canales 28 es menor al diámetro de uno de sus depósitos 16 respectivos para formar un escalón 29 en la parte del fondo del depósito para soportar el frit 30 arriba del medio 36. Cada frit 30 está construido preferentemente de un material de polietileno sinterizado que es poroso e hidrofilico para promover la atracción y retención del medio dentro de sus intersticios. La hidrofilicidad del material de frit puede ser permanente o temporal dependiendo de los procesos mediante los cuales se ha aplicado, o de si el material es inherentemente hidrofilico. Se pueden utilizar materiales alternativos con estructuras porosas y se puede aplicar un tensioactivo a materiales no hidrofilicos por naturaleza, para hacerlo hidrofilico El material se produce sintetizando y dirigiendo las soluciones mediante acción capilar y pueden actuar como una barrera estéril debido a sus propiedades de trayectoria tortuosa. Los frits son cortados o pinchados preferentemente en formas de disco rigurosamente congruentes con los depósitos 16 a partir de una hoja de polietileno porosa con un espesor de 0.635 cm. con un tamaño adecuado promedio de 90 a 130 micrometros conocidos como Porex de Porous Products of Fairburn, Georgia, y también disponibles con el número de parte Y2-PEH-250/90 en Small Parts Inc. , Miami Lakes, Fl . Dicho frit puede sujetar aproximadamente 550 µ? de medios y aumentar el tejido durante el número de días. La congruencia de forma entre el frit 30 y uno de sus depósitos 16 respectivo asegura un ajuste con una mínima filtración del medio 36 alrededor del frit y también asegura que el frit descanse firmemente en el escalón 29, arriba de la mayor parte del medio. Se pueden utilizar diferentes espesores del frit 30, en donde los frits más gruesos mantienen generalmente más material y necesitan ser renovados más frecuentemente con un nuevo medio. Se podría utilizar un frit con un diámetro mayor para depósitos 16 con diámetros mayores, aunque se puede requerir un múltiple debajo para que un soporte adicional evite que el frit 30 con diámetro grande se colapse debajo de la presión de vacío aplicada. Por ejemplo, un frit con diámetro grande 30 podría ser soportado por una pantalla colocada en la parte posterior del material de frit cuando se fabrica el mismo. A pesar de la posible necesidad de un múltiple de soporte, los frits normalmente son mucho más fuertes que los soportes de membrana o de papel diseñados en forma similar que no pueden soportar presiones de vacio incluso moderadas aplicadas a la punta de la pipeta durante la aspiración. Preferentemente, el material del frit de la presente invención debe tener la capacidad de soportar presiones de aproximadamente 76.2 cm. ) de Hg . Aún en otra modalidad, el tejido 32 podría ser crecido en un hoja del material del frit, y posteriormente ser cortado o pinchado en frits individuales para la colocación en los depósitos 16. La MWP 10 está construida pref rentemente a partir de un bloque de material de policarbonato con dimensiones rectangulares rigurosamente iguales a la del cuerpo 12. El construir la placa de un solo bloque de material, asegura que se evite la filtración entre depósitos lo cual podría dar como resultado la contaminación cruzada de la muestras. Los depósitos 16 y los agujeros de aspiración 22 se forman preferentemente utilizando un CNC, u otra máquina de perforación automatizada, con puntos de perforación - de dimensiones similares para las dimensiones del agujero deseado. Si es necesario, la máquina de perforación también puede cortar suficiente policarbonato para formar la base 13, el inserto arriba de la base, los chaflanes 15 y remover suficiente material para aplanar y emparejar superficies, tales como la superficie superior 14. El canal 28 se forma preferentemente utilizando una cuchilla dentada de rotación 80 en la misma máquina de molido. La cuchilla dentada de rotación tiene un diámetro de corte ligeramente menor al de los depósitos 16 y se inserta en uno de los depósitos hasta que se corta a una profundidad igual al espesor de la cuchilla dentada de rotación 80, tal como se muestra en la figura 6. Posteriormente la cuchilla dentada de rotación avanza en la dirección de uno de los agujeros de aspiración adyacentes 22 hasta que se corta lo suficiente en el agujero de aspiración para formar el canal 28 con un suficiente tamaño para hacer posible la comunicación de fluidos entre el depósito y el agujero de aspiración, tal como se muestra en la figura 2. La cuchilla dentada 80 se mueve posteriormente de regreso al centro del depósito y se retracta fuera del mismo. El diámetro subdimensionado de la cuchilla dentada forma el escalón 20 en el cual se soporta el frit Tal como se muestra en las figuras 2 y 3, la presente invención también puede incluir un sello 35 que abarca la punta de la pipeta 34 y se coloca alrededor del borde superior 24 de uno de los agujeros de aspiración 22, cuando la punta se inserta en la misma. El sello 35 incluye un anillo elastomérico 50 subyacente a un collar rígido 51. El collar rígido está construido preferentemente de un material rígido, tal como de un casquillo de acero e incluye opcionalmente un tornillo de ajuste 62 que se extiende a lo largo de su parte lateral. El apretar el tornillo de ajuste aprieta el collar alrededor de la punta de la pipeta 34 permitiendo que el collar rígido 51 evite la migración ascendente del anillo elastomérico 50 conforme se presiona contra el borde superior 24 del agujero de aspiración. El extremo del anillo elastomérico 50 que hace contacto con el borde superior 24 del agujero de aspiración, puede tener una forma frustocónica con un ángulo preferido de aproximadamente 70° para facilitar en forma adicional las formación de un sello hermético de vacío. Además, el sello 35 tiene preferentemente un diámetro de 0.762 cm. y una longitud de 1.27 cm. para que ajuste a una punta de pipeta estándar. Por ejemplo, la punta de pipeta No. 71-700S de TECAN con un recubrimiento de PTFE (TEFLON) , un diámetro de punta interna de 0.5 mm, un diámetro de punta externa de 1.1 mm, un diámetro de cuerpo interno de 1.5 mm y un diámetro de cuerpo externo de 2.0 mm. El anillo elastomérico 50 también puede estar configurado para ajustar con cualquier tipo de punta de pipeta diseñando su apertura 53 para que sea de aproximadamente 90 % del diámetro externo más ancho de la punta de la pipeta, permitiendo que el sello se comprima alrededor de la punta en tanto que se afloja a su forma normal cuando se elimina del agujero de aspiración. De manera inversa, el collar rígido 51 tiene un apertura que está sobredimensionada al 10% con respecto al diámetro externo de la punta de la pipeta 34, permitiendo que éste reciba fácilmente la punta de la pipeta. La apertura del collar se disminuye cuando el tornillo de ajuste 52 se aprieta para asegurar el collar alrededor de la punta de la pipeta 34. En una modalidad alternativa, el sello 35 también podría estar moldeado de manera integral con la punta de la pipeta 34. En aún otra modalidad, se podría utilizar un material de sellado alrededor del borde superior 24 de los agujeros de aspiración, para recibir en forma de sello una punta sin el sello 35. La MWP10 se utiliza para promover el crecimiento y la propagación de tejido suministrando nutrientes en un ambiente estéril. El método para utilizar la M P incluye cargar la placa, ya sea en forma manual, o utilizando un clasificador celular modificado para clasificar muestras de tejido, tal como los que se utilizan para clasificar moscas de frutas. Generalmente, este tipo utiliza un vacio para levantar las muestras . Se podría utilizar el clasificador de células no modificadas si las muestras del tejido fueran lo suficientemente pequeñas. La MWP 10 está cubierta preferentemente por una cubierta o tapa transparente de poliestireno que permite la transmisión de luz al tejido. Una vez que el tejido 32 está en los depósitos 16 de la placa, la placa se afila para el acceso mediante un recipiente de líquidos que incluyen múltiples puntas de pipetas conectadas al medio y suministro de vacío. El recipiente de líquidos sujeta la placa y remueve la tapa en una forma conocida para los expertos en la técnica. El aparato de manejo de líquidos se extiende a cada punta de pipeta 34 en uno de los agujeros de aspiración respectivos 22 hasta que el sello 35 se apoya contra el borde superior 24, el agujero de aspiración y la parte de la superficie superior 14. El aparato de manejo de líquidos suministra medio a través de las puntas, en los agujeros de aspiración 22, a través de los canales 28 y en los depósitos 16. En esta forma, el tejido 32 en cada uno de los depósitos 16 tiene acceso a un suministro de medio a través del frit 30. La tapa se reemplaza en la placa 10 y la placa se coloca en un habitación de cultivo con iluminación que promueve el crecimiento ( en el caso de tejidos de plantas ) . Una vez que el tejido disminuye los nutrientes esenciales en un medio 36, o el medio necesita ser cambiado de otra manera, la placa 10 se carga nuevamente en el aparato de manejo de líquidos. La tapa se elimina de la placa. El aparato de manejo de líquidos se extiende a cada punta de la pipeta 34 en uno de los agujeros de aspiración respectivos 22, hasta que el sello 35 se apoya contra el borde superior 24 del agujero de aspiración y la parte de la superficie superior 14. El aparato de manejo de líquidos, aplica vacio o una presión de succión a través de las puntas de la pipeta, la cual extrae el medio de los depósitos de células 16, a través de los canales 28, dentro de los agujeros de aspiración 22 y dentro de las puntas de pipeta para completar la aspiración. El medio es ciclado en forma tan frecuente como se necesite repitiendo los procesos anteriores. En otra modalidad, se utiliza una cabeza de pipetizacion automática (o recipiente de líquidos de robots) 60 para dirigir en forma selectiva un solo depósito o múltiples depósitos, tal como el recipiente de líquidos GENESIS (TECAN, AG de Suiza) mostrado en la figura 4. El robot es actualizado con una válvula de seis vías para la comunicación entre diferentes medios, reactivos y suministros de etanol . El robot incluye ocho puntas de pipetizacion 61 en su brazo de manejo de líquidos 62. Están configuradas cuatro de las puntas para suministrar medio a una pluralidad de placas de depósitos múltiples 63 soportadas en su plataforma 64. Las cuatro puntas restantes permanecen ajustadas cada una con un sello de la punta que permite que las cuatro puntas restantes aspiren los depósitos 16 a través de sus agujeros de aspiración respectivos 22. Preferentemente, el recipiente para líquidos de robot 60 se opera utilizando un programa de software que controla el despliegue de sus puntas de pipetización 61, de tal forma que se minimiza la contaminación cruzada entre los depósitos 16. Durante el suministro de medio se evita la contaminación de las cuatro puntas de suministro de medio suspendiendo las puntas de suministro de medio sobre los depósitos sin hacer contacto con las placas . Se evita la contaminación de las puntas de aspiración, lavando cada punta con un liquido de etanol antimicrobiano entre ciclos de aspiración. El exterior de las puntas y sellos se lava en una estación de lavado con una parte onda sobre la plataforma 65, la cual se llena con liquido de etanol. El etanol es bombeado a través de una bomba de jeringa y/ o una bomba de diafragma de alta velocidad (lavado rápido) desde un depósito accesible a través de la válvula de seis vías . La programación del robot 60 para accesar a los agujeros correctos requiere enseñar al robot la ubicación tanto de los agujeros de aspiración 22 como de los depósitos 16. En esta forma, el robot opera como si la placa 10 tuviera como mucho el doble de depósitos debido a que los agujeros de aspiración 22 están colocados para corresponder con los depósitos de una placa que tiene el doble de densidad. El hecho de que los agujeros de aspiración tengan un diámetro menor al de los depósitos 16, no tiene consecuencia debido a que el robot busca el centro de los agujeros de aspiración 22. Por ejemplo, el robot está programado para accesar una placa de 24 depósitos como si tuviera 48 depósitos, teniendo cada depósito un diámetro igual al de los agujeros de aspiración. En forma notable, puede ser considerable la programación de los depósitos fuera de centro ( o sus ubicaciones con respecto a los agujeros de aspiración ) debido al diámetro mucho más pequeño de las puntas de las pipetas 61 con respecto a los depósitos. La figura 5, ilustra un ejemplo de cómo el robot 60 puede ser programado para dirigir los depósitos 16 y los agujeros de aspiración 22 de la placa 10. Primero, las cuatro puntas de suministro de medios están colocadas arriba de los depósitos del 105 al 108, y sin hacer contacto con la placa 10, abastecen medio en los depósitos en el paso 125. Posteriormente las puntas de suministro de medio son colocadas de manera secuencial arriba, y suministran medio dentro de los depósitos del 113 al 116 y del 121 al 124 en los pasos 126 y 127, respectivamente. Las cuatro puntas de aspiración son insertadas posteriormente en los agujeros de aspiración (los cuales reconoce el robot como "depósitos") del 101 al 104, aspirando el medio gastado de los depósitos del 105 al 108, en el paso 128. Después de la aspiración, las puntas de aspiración se lavan internamente y se limpian externamente con etanol en la estación de lavado 65, en el paso 129. La aspiración y limpieza se alternan de los agujeros 109 al 112, en los pasosl30 a 131, y nuevamente para los agujeros de aspiración del 117 al 120 en los pasos 132 y 133. Se debe observar que el proceso puede expanderse o reducirse dependiendo del número de puntas de pipetización y el número de depósitos. Además, para minimizar el surgimiento de contaminación, el proceso se lleva a cabo preferentemente dentro de un ambiente filtrado con HEPA, tal como dentro de un gancho presurizado o filtrado.

El robot 60 también se puede utilizar junto con una rejilla o soporte de alta densidad, para mantener y suministrar luz al tejido en cientos de las placas, tal como se describe en la solicitud de Patente Norteamericana de Propiedad Común Serie No. 10/080,918 titulada "Formación de LED para Iluminar Placas de Depósitos de Células y Sistema de Rejillas Automático para Manejar los Mismos", la cual está incorporada a la presente invención como referencia. El sistema de rejilla automático utiliza su propio robot para manipular y presentar las placas al robot del sistema de la presente invención. En aún otra modalidad la placa de depósitos y el método de la presente invención se pueden utilizar para llevar a cabo una extracción de fase sólida. Cada depósito de la placa de depósitos contiene una matriz atrapada entre de un par de frits que forman una columna. Se empujan varios compuestos (tales como, ligantes, o anticuerpos) a través de la columna y se atrapan dentro de la matriz. Después de la extracción de fase sólida, se puede empujar un agente a través de la columna para romper la fase sólida. La distribución de alto rendimiento y la recuperación del compuesto, agentes, etcétera podría ser manejada por una cabeza de pipetización automática utilizando los depósitos y su respectivos agujeros de aspiración. La presente invención tiene varias ventajas. Por ejemplo, las muestras de tejido 32 en los depósitos 16 no tienen que ser movidas o perturbadas, cortando en la carga de trabajo, asegurando condiciones de crecimiento estériles y óptimas. Las placas 10 pueden utilizarse con cabezas de pipeta de manejo de líquidos convencionales, debido a que los agujeros de aspiración 22 son accesibles desde la superficie superior del cuerpo, es decir, un ajuste de carga superior. El uso de recipientes de líquidos de robot con la placa, promueve una consistencia de depósito a depósito en el tratamiento del tejido, así como una eficiente eliminación y reemplazo del medio 36. El aspecto de carga superior permite el uso de una tapa estándar para controlar la esterilidad y elimina la necesidad de una estación de múltiple de vacío por separado para extraer el medio. La falta de un múltiple permite el tratamiento diferencial de cada depósito y proporciona flexibilidad en el diseño y selección del recipiente de líquidos. La cabeza de líquidos puede estar configurada para eliminar el medio así como para agregar medio nuevo sin cambio de herramentaje o puntas de pipetas. Algunas de las figuras descritas en la presente invención contienen diagramas de bloque, gráficas de flujo e ilustraciones de flujo de control de métodos, sistemas y productos de programas de acuerdo con la presente invención. Quedará entendido que cada bloque o paso del diagrama de bloque, gráfica de flujo o ilustración de flujo de control y las combinaciones de bloques en el diagrama de bloque, gráfica de flujo e ilustración de flujo de control pueden ser implementadas mediante instrucciones de programas de computación. Estás instrucciones de programas de computación pueden ser cargadas en una computadora u otro aparato programable para producir una máquina, de tal modo que las instrucciones que se ejecutan en la computadora u otro aparato programable creen medios para incrementar las funciones especificadas en el diagrama de bloque, gráfica de flujo o bloque (s) de flujo de control o paso (s) . Estás instrucciones de programas de computadora también pueden ser almacenadas en una memoria legible en computadora que puede dirigir una computadora u otro aparato programable para funcionar en una forma en particular, de modo que las instrucciones almacenadas en la memoria legible en computadora produzcan un articulo de fabricación que incluya medios de instrucción que implementen la función especificada en el diagrama de bloque, gráfica de flujo o bloque (s) de flujo de control o paso (s) . Las instrucciones de programa de computadora también pueden ser cargadas en una computadora u otro aparato programable para originar que se lleven a cabo una serie de pasos de operación en la computadora u otro aparato programable para producir un proceso incrementado por computadora, de modo que las instrucciones que se ejecutan en la computadora u otro aparato programable proporcionen pasos para incrementar las funciones especificadas en el diagrama de bloque, gráfica de flujo o bloque (s) de flujo de control o paso (s) .

Por consiguiente, los bloques o pasos de diagrama de bloque, gráfica de flujo o ilustración de flujo de control soportan combinaciones de medios para llevar a cabo las funciones especificadas, combinaciones de pasos para llevar a cabo las funciones especificadas y medios de instrucción del programa para llevar a cabo las funciones especificadas. También quedará entendido que cada bloque o paso del diagrama de bloque, gráfica de flujo o ilustración del flujo de control y combinaciones de bloques o pasos en el diagrama de bloque, gráfica de flujo o ilustración del flujo de control pueden ser implementados a través de sistemas de computadora a base de un hardware con propósitos especiales que lleva a cabo las funciones o pasos especificados, o combinaciones de instrucciones por computadora y hardware con propósitos especiales. Muchas modificaciones de otras modalidades de la presente invención vendrán a la mente de un experto en la técnica a la cual pertenece la presente invención, teniendo el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones anteriores y en los dibujos asociados. Por consiguiente, quedará entendido que la presente invención no se limitará a las modalidades especificas descritas y que se pretenden incluir modificaciones y otras modalidades dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, en otra modalidad, la placa de depósito y el método también podrían utilizarse para crecer bacterias. Aunque se emplean términos específicos en la presente invención, se utilizan únicamente en un sentido genérico y descriptivo y no para propósito de limitación.

Claims (42)

1. Novedad de la Invención Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad de la invención y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:
2. R E I V I N D I C A C I O N E S 1.- Una placa para mantener un frit poroso que soporta un tejido el cual será bañado en un medio que es aspirado y renovado en forma regular por un aparato de pipeta de carga superior, en donde la placa comprende : un cuerpo que tiene una superficie superior, en donde el cuerpo define: un primer agujero que tiene un borde superior del primer agujero definido por la superficie superior del cuerpo, y una parte del fondo del primer agujero definida dentro del cuerpo y debajo de la superficie superior del cuerpo, estando configurado el primer agujero para recibir el frit poroso y el tejido y mantener el medio bañando el frit poroso y el tejido; un escalón que sobresale en la parte del fondo del primer agujero, y configurado para soportar el frit en el mismo; un segundo agujero que tiene un borde superior del segundo agujero definido por la superficie superior del cuerpo y una parte del fondo del segundo agujero definida dentro del cuerpo y debajo de la superficie superior del cuerpo, estando conectada la parte del fondo del segundo agujero en comunicación de fluidos con la primera parte del fondo del primer agujero, de modo que el aparato de pipeta pueda accesar el primer agujero a través del borde superior del segundo agujero para aspirar el medio a través de la aplicación de vacio y renovar el medio bombeando el medio fresco sin la eliminación del tejido y el frit poroso de la placa. 2. - Una placa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la superficie superior del cuerpo está configurada para recibir una placa de cubierta colocada en la misma .
3. 3. - Una placa de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque comprende además una placa de cubierta que es transparente para la transmisión de luz y en donde el borde superior del primer agujero está configurado para permitir la transmisión de luz al tejido contenido en el primer agujero, teniendo una proporción de altura a diámetro menor que 2 a 1, de modo que se promueve el crecimiento del tejido.
4. 4. - Una placa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el segundo agujero tiene un diámetro que es compatible con las puntas de pipeta ya existentes .
5. 5. - Una placa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el cuerpo se forma a partir de una sola pieza de material.
6. 6. - Una placa para mantener un frit poroso que soporta un tejido el cual será bañado en un medio que es aspirado y renovado en forma regular a través de un aparato de pipeta de carga superior, en donde la placa comprende: un cuerpo que está siendo formado a partir de una sola pieza de material y que tiene una superficie superior, en donde el cuerpo define: un primer agujero que tiene un borde superior del primer agujero definido por la superficie superior del cuerpo y una parte del fondo del primer agujero definida dentro del cuerpo y debajo de la superficie superior del mismo, estando configurado el primer agujero para recibir el frit poroso y el tejido y para mantener el medio bañando el frit poroso y el tejido; un segundo agujero que tiene un borde superior del segundo agujero definido por la superficie superior del cuerpo y una parte del fondo del segundo agujero definida dentro del cuerpo y debajo de la superficie superior del mismo, estando conectada la parte del fondo del segundo agujero en comunicación de fluidos con la parte del fondo del primer agujero, de modo que el aparato de pipeta pueda accesar el primer agujero a través del borde superior del segundo agujero para aspirar el medio a través de la aplicación de vacio y renovar el medio bombeando el medio fresco sin la eliminación del tejido y el frit poroso de la placa.
7. 7. - Una placa de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la superficie superior del cuerpo está configurada para recibir una placa de cubierta colocada en la misma .
8. 8. - Una placa de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende además una placa de cubierta que es transparente para la transmisión de luz y en donde el borde superior del primer agujero está configurado para permitir la transmisión de luz al tejido contenido en el primer agujero teniendo una proporción de altura a diámetro menor que 2 a 1, de modo que se promueve el crecimiento del tejido.
9. 9. - Una placa de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el segundo agujero tiene un diámetro que es compatible con las puntas de pipeta ya existentes .
10. 10. - Un ensamble para soportar un tejido que será bañado en un medio que se aspira y renueva en forma regular a través de un aparato de pipeta de carga superior, en donde el ensamble comprende: un frit poroso; un cuerpo que está siendo formado a partir de una sola pieza de material y que tiene una superficie superior, en donde el cuerpo define: un primer agujero que tiene un borde superior del primer agujero definido por la superficie superior del cuerpo y una parte del fondo del primer agujero definida dentro del cuerpo y debajo de la superficie superior del cuerpo, estando configurado el primer agujero para recibir el frit poroso y el tejido y mantener el medio bañando el frit poroso y el tejido; un segundo agujero que tiene un borde superior del segundo agujero definido por la superficie superior del cuerpo y una parte del fondo del segundo agujero definida dentro del cuerpo y debajo de la superficie superior del mismo, estando la parte del fondo del segundo agujero conectada en comunicación de fluidos con la parte del fondo del primer agujero, de modo que el aparato de pipeta pueda accesar el primer agujero a través del borde superior del segundo agujero para aspirar el medio a través de la aplicación de vacio y renovación del medio bombeando el medio fresco sin la eliminación del tejido y el frit poroso de la placa.
11. 11. - Un ensamble de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el frit poroso está construido de un material de polietileno sinterizado.
12. 12. - Un ensamble de conformidad con , la reivindicación 11, caracterizado porque el frit es hidrofilico .
13. 13. - Un ensamble de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el frit tiene aproximadamente 0.635 era. de espesor.
14. 14. - Un ensamble de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el frit tiene un tamaño de poro de 90 a 130 micrometros.
15. 15. - Un ensamble de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el cuerpo comprende además un escalón que sobresale en la parte del fondo del primer agujero y que está configurado para soportar el frit en el mismo.
16. 16. - Un aparato para la clasificación automática de alto rendimiento de tejido, caracterizado porque el aparato comprende: al menos una punta de suministro de medio conectada en comunicación de fluidos con el suministro de medio; al menos una punta de aspiración conectada en comunicación de fluidos con un suministro de presión de vacío; un sello que abarca la punta de aspiración; un manipulador de robot con la capacidad de articular las puntas a través del rango de movimiento; y al menos una placa colocada dentro del rango de movimiento de las puntas articuladas por el manipulador de robot, que incluye un cuerpo que tiene una superficie superior, en donde el cuerpo define : un primer agujero que tiene un borde superior del primer agujero definido por la superficie superior del cuerpo y una parte del fondo del primer agujero definida dentro del cuerpo y debajo de la superficie del mismo, estando configurado el primer agujero para recibir el tejido y el medio suministrado a través de la punta de suministro del medio y para mantener el medio bañando el tej ido; un segundo agujero que tiene un borde superior del segundo agujero definido por la superficie superior del cuerpo y una parte del fondo del segundo agujero definida dentro del cuerpo y debajo de la superficie superior del cuerpo, estando la parte del fondo del segundo agujero conectada en comunicación de fluidos con la parte del fondo del primer agujero, estando configurado el segundo agujero para recibir la punta de aspiración de modo que el sello abarque la punta de aspiración que se apoya en la superficie superior que rodea el borde superior y que se sella contra la aplicación de presión de vacio para aspirar el medio del primer agujero a través de la punta de aspiración.
17. 17.- Un aparato de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el sello de la punta define un pasaje a través del mismo que permite que el sello rodee la punta de aspiración .
18. 18. - Un aparato de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el paso tiene un diámetro de casi 90 % de un diámetro máximo de la punta de aspiración.
19. 19. - Un aparato de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el sello de la punta tiene un extremo en forma frustocónica con el pasaje extendiéndose en forma axial a través del mismo.
20. 20. - Un aparato de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el extremo con forma frustocónica tiene un ángulo de 70°·.
21. 21. - Un aparato de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende además un collar asegurado alrededor de la punta adyacente al sello de la punta.
22. 22. - Un aparato de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el collar incluye un casquillo de acero con una abertura a través del mismo diseñada para recibir la punta.
23. 23. - Un aparato de conformidad con la reivindicación 21, en donde el collar incluye además un grupo de tornillos configurados para atrapar la punta apoyando la misma en un ajuste de fricción .
24. 24. - Un aparato de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el sello está construido con un material de silicona.
25. 25. - Un aparato de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la punta de aspiración está conectada en forma adicional en comunicación de fluidos a un suministro de liquido antimicrobiano .
26. 26.- Un aparato de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque comprende una bomba con la capacidad de bombear el líquido antimicrobiano a través de la punta de aspiración.
27. 27. - Un aparato de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el líquido antimicrobiano incluye etanol .
28. 28. - Un método para elaborar una placa para mantener un frit poroso que soporta un tejido, el frit poroso y el tejido bañados en un medio que es aspirado y renovado en forma regular mediante un aparato de pipeta, en donde el método comprende: proporcionar un cuerpo con una superficie superior; definir un primer agujero en el cuerpo para perforar a través de la superficie superior del mismo para formar un borde superior del primer agujero y perforar debajo de la superficie superior y en el cuerpo para formar una parte del fondo del primer agujero; definir un segundo agujero en el cuerpo, perforando a través de la superficie superior del mismo para formar un borde superior del segundo agujero y perforar debajo de la superficie superior y dentro del cuerpo para formar una parte del fondo del segundo agujero; y conectar la parte del fondo del primer agujero a la parte del fondo del segundo agujero formando un pasaje en el cuerpo y entre la parte del fondo del primer agujero y la parte del fondo del segundo agujero.
29. 29. - Un método para elaborar la placa de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la formación del pasaje incluye insertar una sierra en la parte del fondo del primer agujero y mover la sierra en forma lateral hasta que encuentre la parte del fondo del segundo agujero.
30. 30. - Un método para elaborar la placa de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el cuerpo está definido a partir de una sola pieza de material.
31. 31.- Un método para utilizar una placa de depósitos múltiples que tiene un cuerpo con una superficie superior, definiendo el cuerpo una pluralidad de primeros agujeros y una pluralidad de segundos agujeros, teniendo cada agujero un borde superior definido por la superficie superior y cada uno de los primeros agujeros estando conectado en comunicación de fluidos con uno de los segundos agujeros respectivos, en donde el método comprende: colocar un frit en cada pluralidad de primeros aguj eros ; colocar un tejido en cada pluralidad de primeros agujeros y en el frit; abastecer un medio en cada pluralidad de primeros agujeros; insertar una pipeta en cada pluralidad de los segundos agujeros; y aspirar el medio de los primeros agujeros aplicando una presión de succión a los segundos agujeros utilizando la pipeta, extrayendo la presión de succión en medio del primer agujero, en el segundo agujero y en la pipeta para lavar el medio de la placa de depósitos múltiples .
32. 32. - Un método para utilizar una placa de depósitos múltiples de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque comprende además abastecer nuevamente el medio en cada pluralidad de primeros agujeros después de aspirar en medio de los primeros agujeros.
33. 33. - Un método para utilizar una placa de depósitos múltiples de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque comprende además eliminar la tapa de la placa de depósitos múltiples antes de colocar el frit y colocar nuevamente la tapa después de aspirar el medio.
34. 34. - Un método para utilizar una placa de depósitos múltiples de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el abastecimiento de un medio en cada pluralidad de primeros agujeros incluye abastecer el medio en uno de los segundos agujeros respectivos utilizando la pipeta.
35. 35. - Un método para utilizar una placa de depósitos múltiples de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el cuerpo define además un canal que conecta cada uno de los primeros agujeros con cada uno de los segundos agujeros respectivos en comunicación de fluidos y porque la aspiración extrae el medio a través del canal .
36. 36. - ün método para utilizar una placa de depósitos múltiples de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el tejido incluye un tejido de planta.
37. 37. - Un método para utilizar una placa de depósitos múltiples de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el tejido es un tejido de planta acuática.
38. 38. - Un método para utilizar un material de frit para soportar un tejido para su crecimiento, caracterizado porque el método comprende: suspender el material de frit arriba de un suministro de nutrientes; dirigir los nutrientes a través de una estructura porosa, idrofilica del material de frit; y suministrar los nutrientes a través de una superficie superior del frit al tejido, de modo que el tejido sea suministrado en forma continua con nutrientes y se promueva el crecimiento del tej ido .
39. 39. - Un método de conformidad con la reivindicación 38 , caracterizado porque comprende además almacenar hasta 550 µ? de nutrientes en el frit antes de suministrar los mismos.
40. 40. - Un método para intercambiar un medio fluido en una placa de depósitos múltiples que define una pluralidad de depósitos, conectado cada uno en comunicación de fluidos con una pluralidad de agujeros de aspiración adyacente, caracterizado porque el método comprende : colocar una pluralidad de puntas de pipeta de abastecimiento, cada una sobre una pluralidad de depósitos respectivos de la placa de depósitos múltiples ; abastecer medio fuera de cada una de las puntas de pipeta de abastecimiento y en el depósito respectivo sobre el cual se coloca la punta de la pipeta de abastecimiento; repetir la colocación y el abastecimiento fuera de las puntas de la pipeta de abastecimiento hasta que se llenen todos los depósitos de la placa de depósitos múltiples; insertar una pluralidad de puntas de pipetas de aspiración, cada una en una pluralidad respectiva de agujeros de aspiración; aspirar el medio utilizando cada una de las puntas de las pipetas de aspiración para succionar el medio fuera del agujero de aspiración respectivo en el cual se coloca la punta de aspiración ; lavar las puntas de la pipeta de aspiración en una estación de lavado; y repetir la inserción, aspiración y lavado hasta que todos los depósitos de la placa de depósitos múltiples se vacien del medio.
41. 41.- Un producto de programa de computadora para controlar el intercambio del medio fluido en una placa de depósitos múltiples que define una pluralidad de depósitos, conectada cada una en comunicación de fluidos con una pluralidad adyacente de agujeros de aspiración, comprendiendo el producto de programa de computadora un medio de almacenamiento legible en computadora que contiene partes de códigos del programa legible en computadora almacenadas en el mismo, caracterizado porque las partes del código del programa legible en computadora comprenden: una primera parte de código ejecutable para colocar una pluralidad de puntas de pipeta de abastecimiento, cada una sobre una pluralidad respectiva de depósitos de la placa de depósitos múl iples ; una segunda parte de código ejecutable para abastecer medio fuera de cada una de las puntas de la pipeta de abastecimiento y en los depósitos respectivos sobre los cuales se coloca la punta de la pipeta de abastecimiento; una tercera parte de código ejecutable para repetir la colocación y el abastecimiento de medio fuera de las puntas de la pipeta de abastecimiento hasta que se llenen todos los depósitos de la placa de depósitos múltiples; una cuarta parte de código ejecutable para insertar una pluralidad de puntas de la pipeta de aspiración, cada una en una pluralidad de agujeros de aspiración respectivos; una quinta parte de código ejecutable para aspirar medio utilizando cada una de las puntas de la pipeta de aspiración para succionar el medio fuera del agujero de aspiración respectivo en el cual se coloca la punta de aspiración; una sexta parte de código ejecutable para lavar las puntas de la pipeta de aspiración en una estación de lavado; y una séptima parte de código ejecutable para repetir la inserción, aspiración y lavado hasta que todos los depósitos de la placa de depósitos múltiples sean vaciados del medio.
42. 42.- Un placa de depósitos múltiples para mantener un frit poroso que soporta un tejido el cual será bañado en un medio que es aspirado y renovado en forma regular a través de un aparato de pipeta de cabezas múltiples de carga superior, caracterizado porque la pluralidad de depósitos múltiples comprende: un cuerpo formado de un material impermeable al liquido que tiene superficies superiores e inferiores sustancialmente planas; una pluralidad de depósitos formada en el cuerpo y colocada en una rejilla de columnas y filas separadas de manera uniforme, teniendo cada depósito un extremo superior abierto en la superficie superior de cuerpo y una parte del fondo definida dentro del cuerpo y debajo de la superficie superior del mismo, y estando configurado cada depósito para recibir y soportar el frit poroso y el tejido y para mantener el medio bañando el frit poroso y el tejido; un agujero aspirado formado en el cuerpo adyacente a cada uno de los depósitos, estando ajustados los agujeros del aspirador en una rejilla de columnas y filas separadas de manera uniforme, y teniendo cada uno un extremo superior abierto en la superficie superior del cuerpo y una parte del fondo definida dentro del cuerpo y debajo de la superficie superior del mismo; y un canal formado en el cuerpo que proporciona comunicación de fluidos entre la parte del fondo de cada depósito y la parte del fondo del agujero aspirador adyacente respectivo, de modo que el aparato de pipeta de cabezas múltiples pueda accesar en forma simultanea los agujeros del aspirador respectivos para aspirar el medio a través de la aplicación de vacio y renovar el medio bombeando medio fresco sin la eliminación del tejido y el frit poroso de la placa de depósitos múltiples. R E S U E N Se proporciona una placa de depósitos múltiples y método para el intercambio de medio, incluyendo un cuerpo que define una pluralidad de depósitos de células conectado cada uno a través de una canal a una pluralidad de agujeros de aspiración. Los depósitos de células contienen un frit poroso, hidrofílico que está suspendido en una escalón arriba de un depósito de medio fluido y que soporta una muestra de tejido. Las propiedades del frit dirigen hacia arriba el medio de fluidos para abastecer a la muestra del tejido con nutrientes para su crecimiento y proliferación. Se aspira el medio antiguo de los depósitos a través de un aparato de manejo de líquidos que inserta una punta de pipeta en los agujeros de aspiración. La punta de pipeta aplica una presión de succión que extrae el medio fuera del depósito de la célula, a través del canal, en un agujero de aspiración y fuera a través de la punta de la pipeta. Se dispersa medio nuevo a través de la punta de la pipeta y directamente en el depósito de la célula.