DE60208397T2

DE60208397T2 - Valproinsäure zur Behandlung von Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Kopf-Hals-Krebs, kleinzelligem Lungenkarzinom und Blutzellenkrebs in Kombination mit Bestrahlung

Info

Publication number: DE60208397T2
Application number: DE60208397T
Authority: DE
Inventors: Bernd Groner; Thorsten Heinzel; Bernd Hentsch; Stephan Winfried WELS; A. Peter HERRLICH; Saverio Minucci; Giuseppe Pier PELICCI; Martin GÖTTLICHER
Original assignee: Topotarget Germany AG
Current assignee: Topotarget Germany AG
Priority date: 2001-09-18
Filing date: 2002-09-17
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2022-09-18
Also published as: WO2003024442A3; EP1602371A3; CA2460713A1; CY1105552T1; DK1427403T3; ES2252519T3; DE60208397D1; JP2005512961A; EP1602371A2; WO2003024442A2; EP1529527A2; EP1427403B1; AU2002338716B2; EP1529527A3; EP1427403A2; ATE314063T1; EP1293205A1; EP1427403B8; US20050038113A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des Wirkstoffs Valproinsäure und von pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon für eine sensibilisierende Behandlung von Humankrebs in Kombination mit etablierten therapeutischen Prinzipien. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung solcher Verbindungen zur Behandlung von Tumormetastasen und minimaler Resterkrankung. Die Erfindung schließt die Herstellung eines klinisch verwendeten Arzneimittels zur Behandlung von Krebs bei Menschen ein.
Die lokale Umstrukturierung von Chromatin und die dynamischen Veränderungen bei der nucleosomalen Verpackung von DNA sind Schlüsselstufen bei der Regulierung der Genexpression und beeinflussen demzufolge die richtige Zellfunktion, Differenzierung und Proliferation. Einer der wichtigsten Mechanismen, der die Aktivität von Zielgenen bestimmt, ist die posttranslationale Modifikation der N-terminalen Schwänze von Kernhistonen bzw. Nucleohistonen durch Acetylierung und nachfolgende Veränderungen der Chromatinstruktur (Davie, 1998, Curr Opin Genet Dev 8, 173–8; Kouzarides, 1999, Curr Opin Genet Dev 9, 40–8; Strahl und Allis, 2000, Nature 403, 41–4). Die Acetylierung von Lysinresten, hauptsächlich in den Histonen H3 und H4 wird durch Enzyme mit Histonacetyltransferase-(HAT)-aktivität vermittelt. Umgekehrt werden Acetylgruppen von ε-N-Acetyllysin durch Histondesacetylasen (HDACs) entfernt. Sowohl HAT- als auch HDAC-Aktivitäten können sich zu Zielgenen in Komplexen mit sequenzspezifischen Transkriptionsfaktoren und deren Cofaktoren zusammensetzen. Nucleare Rezeptoren der Steroid/Retinoidrezeptorsuperfamilie, wie Retinsäurerezeptor oder Schilddrüsenhormonrezeptor sind prototypische Beispiele für die Transkriptionsfaktoren, die HAT- und HDAC-assoziierte Cofaktoren rekrutieren, abhängig von ihrem Aktivierungszustand durch einen geeigneten Liganden. Ohne Ligand Wechselwirken diese Nuclearrezeptoren mit Corepressoren, z.B. N-CoR und SMRT. Die Corepressoren bilden große Proteinkomplexe, die Histondesacetylasen enthalten und hemmen dadurch die Transkription (Pazin und Kadonaga, 1997; Cell 89, 325–8). Bei der Ligandenbindung dissoziiert der Corepressorkomplex und wird durch Coaktivatorproteine ersetzt, z.B. SRC-1 und CBP, die in Multiproteinkomplexen existieren, die Histonacetyltransferaseaktivität beherbergen. Die durch Liganden induzierte Umschaltung von nuclearen Rezeptoren von Repression auf Aktivierung gibt somit den Austausch von Corepressor- und Coaktivatorkomplexen mit antagonistischen enzymatischen Aktivitäten wieder (Glass und Rosenfeld, 2000, Genes Dev 14, 121–41). Es wurde gezeigt, dass verblüffenderweise viele andere Transkriptionsfaktoren, wie Mad-1, BCL-6 und ETO 4 (Pazin und Kadonaga, 1997, Cell 89, 325–8; Huynh und Bardwell, 1998, Oncogene 17, 2473–84; J. Wang et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 10860–5) HDAC-abhängige Transkriptionsrepressorkomplexe zusammenfügen, was darauf hindeutet, dass dies ein üblicher Mechanismus der Genregulierung ist.
Säugetierhistondesacetylasen können in drei Unterklassen aufgeteilt werden (Cress und Seto, 2000, J Cell Physiol 184, 1–16; Gray und Ekstrom 2001, Exp Cell Res 262, 75–83). Enzyme der Klasse I sind Homologe des Hefe-RPD3-Proteins und schließen die Säugetierenzyme HDAC1, HDAC2, HDAC3 und HDAC8 mit Molekularmassen im Bereich von 42 bis 55 kDa ein. Die Histondesacetylasen HDAC4, HDAC5, HDAC6 und HDAC7 der Klasse II sind größere Proteine (etwa 120 bis 130 kDa), die mit dem Hefe-HDA1-Protein in Beziehung stehen. Kürzlich wurde eine dritte Klasse von Histondesacetylasen mit Homologie zu dem Hefe-SIR2-Protein und verschiedenen möglichen Säugetiermitgliedern identifiziert (Imai et al., 2000, Nature 403, 795–800). Derzeit ist immer noch unklar, in welchem Ausmaß diese HDACs isoenzymspezifische oder redundante Funktionen aus üben. Weitere Untersuchungen, einschließlich von Gendeletionsanalysen sind daher erforderlich, um die biologische Rolle jedes dieser Enzyme aufzuklären.
Histondesacetylasen binden an viele verschiedene Proteine und existieren gewöhnlich in großen Komplexen innerhalb der Zelle. Viele der assoziierten Proteine scheinen entweder an der Ausrichtung der HDACs zu ihren Substraten oder zu transkriptionalen Repressoren beteiligt zu sein. Z.B. werden die Rb-assoziierten Proteine RbAP46 und RbAP48 gewöhnlich als integrale Teile des HDAC-Enzymkomplexes angesehen, der für die Erkennung von nucleosomalen Substraten verantwortlich ist (Taunton et al., 1996, Science 272, 408–11; Verreault et al., 1996, Cell 87, 95–104). Die Corepressoren N-CoR, SMRT und Sin3 sind andererseits verbrückende Faktoren, die für die Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren für HDACs erforderlich sind (Pazin und Kadonaga, 1997, Cell 88, 737–40). Histondesacetylasen sind auch Komponenten der Nucleosomumstrukturierung und des Desacetylase-(NuRD)-komplexes, der auch RbAP46 und RbAP48, Mi-2 und MTA2 enthält (Y. Zhang et al., 1999, Genes Dev 13, 1924–35). Aufgrund der großen Anzahl von HDAC-Isoenzymen und wechselwirkenden Proteinen ist anzunehmen, dass die Komplexzusammensetzung die Substratspezifität und Ziel-HDACs sogar für Nichthistonproteine modulieren könnte.
Eine nicht angemessene Repression von Genen, die für die Zelldifferenzierung erforderlich sind, wurde mit verschiedenen Formen von Krebs in Beziehung gebracht und insbesondere mit akuter Leukämie. Bei Patienten mit akuter promyelozytischer Leukämie (APL) beinhalten RAR-Fusionsproteine, die durch chromosomale Translokationen entstehen, entweder das promyelozytische Leukämieprotein (PML) oder das promyelozytische Zinkfingerprotein (PLZF) (de The, 1996, Faseb J 10, 955–60). Beide Fusionsproteine können mit Komponenten des Corepressorkomplexes wechselwirken. Die Zugabe hoher Dosen von all-trans-Retinsäure verdrängt jedoch den Corepressorkomplex nur von PLM-RAR, aber nicht von PLZF-RAR (Grignani et al., 1998, Nature 391, 815–8; Guidez et al., 1998, Blood 91, 2634–42; He et al., 1998, Nat Genet 18, 126–35; Lin et al., 1998, Nature 391, 811–4). Diese Erkenntnisse liefern eine Erklärung, warum bei PML-RAR-APL-Patienten mit Retinsäurebehandlung gewöhnlich eine vollständige Remission erzielt wird, wohingegen PLZF-RAR-APL-Patienten sehr schlecht auf diese Therapie ansprechen. Die Hypothese, dass eine durch Corepressor vermittelte aberrante Repression die Ursache für die Pathogenese bei APL sein könnte, wird durch die Erkenntnis gestützt, dass Inhibitoren der Co-repressor-assoziierten HDAC-Aktivität den Differenzierungsblock in Zellen, die das PLZF-RAR-Fusionsprotein enthalten, überwinden können.
Bei einer häufigen Form der akuten myeloischen Leukämie (AML) führt die Translokation t(8;21) zu dem AMLI/ETO-Fusionsprotein, bei dem die Transaktivierungsdomäne des Transkriptionsfaktors AML1 durch fast das gesamte ETO-Protein ersetzt ist. Es wurde berichtet, dass der Translokationspartner ETO mit N-CoR, SMRT, mSin3 und HDACs eine Wechselwirkung eingeht (Lutterbach et al., 1998, Mol Cell Biol 18, 7176–84; Gelmetti et al., 1998, Mol Cell Biol 18, 7185–91; Wang et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95, 10860–5; Hildebrand et al., 2001, J Biol Chem 276, 9889–95). Somit rekrutiert das Fusionsprotein Corepressorkomplexe, die HDAC-Aktivität enthalten, statt Coaktivatoren. In letzter Zeit erschienene Berichte zeigen, dass das onkogene Potenzial und die Transkriptionsrepressoraktivität des Translokationsproduktes AML1/ETO eine Oligomerisierung erfordert (Minucci et al., 2000, Mol Cell 5, 811–20). Bei Nicht-Hodgkins-Lymphoma führen Translokationen und Punktmutationen häufig zu einer Überexpression des BCL-6-Onkogenprodukts, von dem impliziert wird, dass es an der Kontrolle der B-Zellproliferierung beteiligt ist. Da BCL-6 ein Transkriptionsfaktor ist, von dem gezeigt wurde, dass er mit den Corepressoren N-CoR und SMRT interagiert, könnte eine aberrante Repression, wie bei akuter Leukämie, auch an der Pathogenese von Nicht-Hodgkins-Lymphomen beteiligt sein (Huynh und Bardwell, 1998, Oncogene 17, 2473–84).
Mutationen bei einem Nuclearhormonrezeptor wurden auch als verursachendes Prinzip mit dem Syndrom der Resistenz gegen Schilddrüsenhormon (RTH} in Verbindung gebracht, einer endokrinen humangenetischen Krankheit, die durch eine Unterbrechung sowohl der Regulation durch negatives Feedback als auch die positive Regulation durch T₃ gekennzeichnet ist. Diverse dominante negative Mutationen in dem Schilddrüsenhormonrezeptor β-(TRβ)-Gen, die eine konstitutive Bindung von Corepressoren und assoziierten HDACs verursachen, sind die molekulare Basis für RTH (Yoh et al., 1997, Mol Endocrinol 11, 470–80; Yoh und Privalsky, 2000, Mol Cell Endocrinol 159, 109–24).
Da die Pathogenese von akuter Leukämie und Nicht-Hodgkins-Lymphomen mit der aberranten Repression von Genen assoziiert ist, die für die Zelldifferenzierung erforderlich sind, ist es plausibel, dass dieser Mechanismus auch für viele weitere Arten von Krebs, einschließlich solider Tumoren, verantwortlich sein könnte. Derzeit ist die molekulare Basis vieler Neoplasien immer noch großteils unerforscht. Aufgrund der Verbindung zwischen transkriptionaler Repression und Rekrutierung von Histondesacetylasen kann erwartet werden, dass Inhibitoren dieser enzymatischen Aktivität die Repression umkehren und eine Reexpression der die Differenzierung induzierenden Gene induzieren könnten. Daher sind HDAC-Inhibitoren potenziell viel versprechende Wirkstoffkandidaten für die Differenzierungstherapie von Krebs und die Behandlung bestimmter endokriner Krankheiten.
Der klinische Nutzen der HDAC-Hemmung und ihre Implikationen für eine Redifferenzierungstherapie werden derzeit an verschiedenen Stellen untersucht. Ein PML-RAR-Patient, der viele Rückfälle nach Behandlung mit Retinsäure und Chemotherapie hatte, wurde mit dem HDAC-Inhibitor Phenylbutyrat behandelt, was zu einer vollständigen Remission der Leukämie führte (Warrell et al., 1998, J Natl Cancer Inst 90, 1621–4). Das Ergebnis dieser Anfangsstudie deutet darauf hin, dass hohe Dosen von HDAC-Inhibitoren nicht permanent aufrechterhalten werden müssen, um eine klinische Antwort zu erreichen. Phase-II-Studien bei Krebspatienten dienen als Beweis des Prinzips der Wirksamkeit von HDAC-Inhibitoren bei der Therapie.
Kürzlich wurde gefunden, dass der antiepileptische Wirkstoff Valproinsäure (VPA, 2-Propylpentansäure) als Inhibitor von Histondesacetylasen dient (PCT/EP01/07704; Phiel et al., 2001, J Biol Chem, im Druck). Diese Aktivität kann durch geeignete Modifikationen des VPA-Moleküls von der bisher therapeutisch genutzten antiepileptischen Aktivität getrennt werden (PCT/EP01/07704).
Valproinsäure hat vielfältige biologische Aktivitäten, die von verschiedenen molekularen Wirkungsmechanismen abhängen:

– VPA ist ein antiepileptischer Wirkstoff.
– VPA ist teratogen. Wenn es als antiepileptischer Wirkstoff während der Schwangerschaft verwendet wird, kann VPA bei wenigen Prozent der geborenen Kinder Geburtsfehler induzieren (Defekte beim Verschluss des Neuralrohrs und andere Missbildungen). Bei Mäusen ist VPA bei der Mehrzahl der Mäuseembryos teratogen, wenn es richtig dosiert wird.
– VPA aktiviert einen nuclearen Hormonrezeptor (PPARδ). Verschiedene zusätzliche Transkriptionsfaktoren werden auch dereprimiert, aber einige Faktoren werden nicht signifikant dereprimiert (Glucocorticoidrezeptor, PPARα).
– VPA verursacht gelegentlich Hepatotoxizität, was von schlecht metabolisierten Estern mit Coenzym A abhängen kann.

Die Verwendung von VPA-Derivaten 1ieß es zu, zu bestimmen, dass verschiedene Aktivitäten durch verschiedene molekulare Wirkungsmechanismen vermittelt werden. Teratogenizität und antiepileptische Aktivität folgen verschiedenen Wirkungsarten, da Verbindungen isoliert werden konnten, die entweder bevorzugt teratogen oder bevorzugt antiepileptisch sind (Nau et al., 1991, Pharmacol. Toxicol. 69, 310–321). Es wurde gefunden, dass die Aktivierung von PPARδ strikt mit der Teratogenizität korreliert (Lampen et al., 1999, Toxicol. Appl. Pharmacol. 160, 238–249), was darauf hindeutet, dass sowohl die PPARδ-Aktivierung als auch die Teratogenizität die gleiche molekulare Aktivität von VPA erfordern. Auch die Differenzierung von F9-Zellen korreliert strikt mit der PPARδ-Aktivierung und Teratogenizität, wie von Lampen et al., 1999, vorgeschlagen und durch die Analyse von Differenzierungsmarkern dokumentiert wurde (Werling et al., 2001, Mol. Pharmacol. 59, 1269–1276). Es wurde gezeigt, dass die PPARδ-Aktivierung durch die HDAC-hemmende Aktivität von VPA und seinen Derivaten verursacht wird (PCT/EP01/07704). Weiterhin wurde gezeigt, dass der etablierte HDAC-Inhibitor TSA PPARδ aktiviert und die gleiche Art von F9-Zelldifferenzierung induziert, wie VPA. Aus diesen Ergebnissen wurde geschlossen, dass nicht nur die Aktivierung von PPARδ, sondern auch die Induktion der F9-Zelldifferenzierung und Teratogenizität von VPA oder VPA-Derivaten höchstwahrscheinlich durch HDAC-Hemmung verursacht wird.
Antiepileptische und sedierende Aktivitäten folgen unterschiedlichen Strukturaktivitätsbeziehungen und hängen daher offensichtlich von einer primären VPA-Aktivität, die von der HDAC-Hemmung verschieden ist, ab. Der Mechanismus der Hepatotoxizität wird kaum verstanden und es ist unbekannt, ob er mit der Bildung des VPA-CoA-Esters assoziiert ist. Die HDAC-Hemmung scheint jedoch keine CoA-Esterbildung zu erfordern.
Heutzutage sind Tumortherapien bekannt, die aus der kombinatorischen Behandlung von Patienten mit mehr als einem therapeutischen Antitumorreagenz bestehen. Beispiele sind die kombinierte Verwendung von Bestrahlungsbehandlung zusammen mit chemotherapeutischen und/oder cytotoxischen Reagenzien und in letzter Zeit die Kombination einer Bestrahlungsbehandlung mit immunologischen Therapien, wie die Verwendung von tumorzellspezifischen therapeutischen Antikörpern. Die Möglichkeit, einzelne Behandlungen miteinander zu kombinieren, um solche Kombinationen aufzufinden, die wirksamer sind als die einzelnen Ansätze alleine, erfordern jedoch umfassende präklinische und klinische Tests. Es ist nicht möglich vorherzusagen, welche Kombinationen eine additive oder sogar synergistische Wirkung zeigen. Außer dem Ziel, die therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen, ist ein weiterer Zweck die potenzielle Senkung der Dosierung der einzelnen Komponenten in den resultierenden Kombinationen, um unerwünschte oder schädliche Nebenwirkungen, die durch höhere Dosen der einzelnen Komponenten verursacht werden.
Die vorliegende Erfindung hat das Ziel, ein Arzneimittel bereitzustellen, das zur Behandlung von Krebs bei Menschen nützlich ist.
Hierzu wurde nun überraschenderweise gefunden, dass VPA unerwartete nützliche Wirkungen hat, wenn es für die Behandlung von potenziell vielen verschiedenen Arten von Krebs bei Menschen in Kombination mit einer Vielzahl anderer Antitumortherapien, die einzeln auf erstaunlich unterschiedlichen Wirkungsarten basieren, verwendet wird. Somit ist die potenzielle therapeutische Verwendung von VPA als eine Komponente von vielen Antitumorwirkstoffkombinationen nicht beschränkt auf Kombinationen mit Wirkstoffen mit speziellen molekularen Mechanismen. Dies macht in der Tat VPA zu einem Wirkstoff, der mit der Mehrzahl bestehender Antitumor- ansätze kombiniert werden kann. Die genaue Wirkungsart, die von VPA angewendet wird, wird nicht vollständig verstanden, aber sein die Differenzierung induzierendes Potenzial kann die Basis sein, um Tumorzellen für die Aktivität eines weiten Bereichs an Antitumorwirkstoffen zu sensibilisieren. Es wird erwartet, dass dieses erstaunlich breite Potenzial von VPA auf seiner Aktivität als Inhibitor spezifischer Gruppen von Enzymen mit HDAC-Aktivität basiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von VPA und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs bei Menschen in Kombination mit einer Strahlenbehandlung, wobei der Humankrebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Kopf-Hals-Krebs, kleinzelligem Lungenkarzinom und Krebs bei Blutzellen. Die Antitumoraktivität solcher kombinatorischer Behandlungen im Vergleich zur Verwendung von jeder Komponente allein kann daher erhöht werden und, falls erwünscht, können die Dosen der einzelnen Komponenten solcher kombinatorischer Behandlungen gesenkt werden, um unerwünschte Nebenwirkungen, die mit einzelnen Wirkstoffen verbunden sind, zu senken.
Der Ausdruck "kombinatorische Behandlung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Behandlung eines Einzelnen mit mindestens zwei verschiedenen therapeutischen Mitteln. Erfindungsgemäß wird der/die Einzelne mit Valproinsäure oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon behandelt, was das erste therapeutische Mittel bildet. Das zweite therapeutische Mittel ist eine Strahlentherapie. Eine kombinatorische Behandlung kann ein drittes oder sogar ein weiteres therapeutisches Mittel beinhalten. Gemäß der Erfindung können Valproinsäure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon und das zweite und gegebenenfalls weitere therapeutische Mittel gleichzeitig verabreicht werden oder VPA oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon können vor oder nach dem zweiten therapeutischen Mittel verabreicht werden. Die Verabreichung von VPA oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon vor dem zweiten therapeutischen Mittel oder die gleichzeitige Verabreichung sind bevorzugt. Die Verabreichung (simultan oder zu verschiedenen Zeitpunkten) kann systemisch oder topisch je nach Indikation erfolgen. VPA oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon kann an einen Krebspatienten vor oder nach Strahlentherapie verabreicht werden, um die Wirkungen des Krebses zu behandeln oder zu bessern. Wenn das erste und zweite therapeutische Mittel zu verschiedener Zeit angewendet werden, ist der Zeitraum zwischen zwei Behandlungen kürzer als 10 Tage.
Die Ausdrücke "kombinatorische Behandlung", "Kombinationstherapie" und "kombinierte Behandlung" werden hier austauschbar verwendet.
Erfindungsgemäß können auch pharmazeutisch annehmbare Salze von Valproinsäure für die kombinatorische Therapie von Krebs verwendet werden.
Valproinsäure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon wird zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet, um menschliche Krebszellen für die Behandlungswirksamkeit in Kombinationstherapie mit klinisch etablierten therapeutischen Antikrebsmitteln zu sensibilisieren. Krebszellen werden bei Kontakt mit einem sensibilisierenden Mittel sensibilisiert, wenn eine geringere Dosis eines gegebenen Antikrebsmittels erforderlich ist, um eine bestimmte Antikrebswirkung zu erzielen im Vergleich zu Krebszellen, die nicht mit dem sensibilisierenden Mittel in Kontakt gekommen sind. Antikrebswirkungen können die Reduktion der Tumormasse, Hemmung der Proliferation und/oder Cytotoxizität sein. Methoden, um Antitumorwirkungen zu bestimmen, sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.
Erfindungsgemäß wird VPA oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon für eine kombinatorische Behandlung von Krebs bei Menschen oder zur Herstellung eines Arzneimittels für eine kombinatorische Behandlung von Krebs bei Menschen verwendet. Die kombinatorische Behandlung kann eine bekannte Antitumortherapie beinhalten.
Für solche Krebsarten, die sich als solide Tumoren manifestieren, ist der effizienteste Behandlungsweg die chirurgische Entfernung der Tumormasse. Für frühe Stadien von Tumoren, die vollständig reseziert werden können, wird die Wirkstofftherapie selten verwendet. In späteren Stadien ist der Tumor jedoch gewöhnlich zu einer solchen Größe gewachsen und/oder hat sich über den Körper in einem solchen Ausmaß verbreitet, dass die Resektion keine geeignete Behandlungsoption mehr ist. In diesen Fällen wird die Wirkstofftherapie entweder verwendet, um die Größe des Tumors vor der Resektion zu vermindern oder um im Körper nach der Tumonesektion zurückbleibende Krebszellen zu eliminieren (minimale Resterkrankung).
Heutzutage gibt es verschiedene Klassen von Antikrebswirkstofftherapien einschließlich chemotherapeutischer und cytotoxischer Reagenzien, die Differenzierung induzierender Reagenzien (z.B. Retinsäure, Vitamin D, Cytokine), Hormontherapie, immunologische Ansätze, und, seit kurzem, die Entwicklung von antiangiogenen Ansätzen.
Valproinsäure und pharmazeutisch annehmbare Salze davon haben eine HDAC-hemmende Aktivität und verursachen häufig und unerwarteterweise eine synergistische therapeutische Wirkung bei kombinatorischer Therapie mit einer oder mehreren Antikrebsbehandlungen, deren Zielmechanismen erstaunlich unterschiedlich voneinander sind.
Valproinsäure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon können gewöhnlich Humankrebszellen sensibilisieren. Valproinsäure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon werden daher hier auch als sensibilisierendes Mittel bezeichnet. Demzufolge kann die Dosierung des zweiten therapeutischen Mittels in einer Kombinationstherapie signifikant reduziert werden, um einen Antitumoreffekt zu erreichen, wenn es in Kombination mit dem sensibilisierenden Mittel verwendet wird. Die Dosierung des zweiten therapeutischen Mittels kann bevorzugt um mindestens 25% reduziert werden im Vergleich zu der Dosierung, die gewöhnlich in einer klinischen Antikrebstherapie verabreicht wird. Bevorzugter kann die Dosierung um mindestens 50% reduziert werden. Die "Dosierung, die gewöhnlich bei einer klinischen Antikrebstherapie verabreicht wird" wird hier definiert als die Menge an Antikrebsmittel pro sm (m²) oder kg Körpergewicht (BW) des Patienten pro Tag (in Bezug auf Literaturstellen und Dosierungsdetails siehe auch S. Seeber und J. Schütte, Therapiekonzepte Onkologie, Springer-Verlag, 2. Auflage 1998, ISBN 3-540-58586-9).
Üblicherweise verwendete Antikrebsmittel und tägliche Dosierungen, die gewöhnlich verabreicht werden, schließen ein:
Bestrahlung 20 bis 60 Gy
Die täglichen Dosierungen der Bestrahlung können signifikant reduziert werden in einer kombinatorischen Behandlung mit dem sensibilisierenden Mittel im Vergleich zu den üblichen Dosierungen, wenn sie alleine oder mit anderen therapeutischen Prinzipien verabreicht werden. Die folgenden täglichen Dosierungen können in der kombinatorischen Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden:
Bestrahlung 10 bis 45 Gy
Valproinsäure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon können nützlich sein, um die Histondesacetylasen HDAC 1 bis 3 und 8 (Klasse I), HDAC 4 bis 7 (Klasse II) vom Säugetier (zur Verwendung von Zelllinien in in-vitro-Assays und Tiermodellsystemen) und insbesondere von Menschen (in vivo und in vitro) zu hemmen ebenso wie die kürzlich aufgefundene neue Klasse von Histondesacetylasen mit Homologie zu dem Hefe-SIR2-Protein einschließlich verschiedener möglicher Säugetiermitglieder (Imai et al., 2000, Nature 403, 795–800) und für die Verwendung bei der Krebsbehandlung in Kombination mit anderen Krebstherapien. In einer Ausführungsform hemmt Valproinsäure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon nur eine Untergruppe von HDACs.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Valproinsäure oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon zur Herstellung eines Arzneimittels für die kombinatorische Behandlung einer Krankheit, bei der die Induktion einer Hyperacetylierung von Histonen eine nützliche Wirkung hat, z.B. zur Differenzierung und/oder Apoptose von Tumorzellen eines Patienten führt und dadurch eine klinische Verbesserung des Zustandes des Patienten verursacht. Beispiele für solche Krankheiten sind östrogenrezeptorabhängiger und -unabhängiger Brustkrebs, Kolonkrebs, Kopf-Hals-Krebs, kleinzelliges Lungenkarzinom. Die kombinatorische Behandlung der vorliegenden Erfindung ist besonders nützlich zur Behandlung von minimaler Resttumorerkrankung oder Tumormetastasen.
Die Verbindungen und Salze können als pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden (z.B. Pulver, Körnchen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Injektionen, Lösungen, Schäume, Klistiere und dgl.), die mindestens eine solche Verbindung allein oder in Mischung mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Hilfsstoffen und/oder Verdünnungsmitteln enthalten. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können gemäß einer üblichen Methode formulier werden. Spezifische Dosierungsanteile für jeden speziellen Patienten werden angewendet abhängig von einer Vielzahl von Faktoren einschließlich der Aktivität der spezifisch angewendeten Verbindungen, dem Alter, Körpergewicht, allgemeinen Gesundheitszustand, Geschlecht, Nahrungszustand, der Verabreichungszeit, dem Verabreichungsweg, der Ausscheidungsrate, der Wirkstoffkombination und dem Schweregrad der jeweiligen Krankheit, der diese Therapie dienen soll. Das sensibilisierende Mittel wird bevorzugt in einer geeigneten Menge verabreicht, z.B. ausgewählt aus dem Bereich von 10 mg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag oral oder intravenös. Die Dosishöhen sind nicht spezifisch beschränkt, solange Serumpegel von 0,05 mM bis 3 mM, bevorzugt 0,4 mM bis 1,2 mM erreicht werden.
Allgemein liefert die vorliegende Erfindung neue Möglichkeiten, um verschiedene Krebskrankheiten zu behandeln. Der Anmelder hat gefunden, dass die HDAC-hemmende und die Zelldifferenzierung induzierende Aktivität von VPA und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon erfolgreich in Kombination mit wohl etablierten und klinisch verwendeten therapeutischen Wirkstoffen zur Behandlung von Tumorzellen verschiedenen Ursprungs verwendet werden kann. So wird angenommen, dass eine auf VPA und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon basierende kombinatorische Behandlung einen besseren therapeutischen Erfolg bei menschlichen Tumorpatienten erzeugt als die entsprechenden therapeutischen Wirkstoffe, wenn sie allein verwendet werden. Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, kombinatorische therapeutische Ansätze zu schaffen unter Ver wendung von VPA und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon zur Behandlung von Krebs. Solche kombinatorischen Behandlungen könnten zu einer Senkung der therapeutischen Dosen z.B. von chemotherapeutischen Reagenzien, die erforderlich sind, führen und könnten somit die derzeit beobachteten teilweise sehr ernsten Nebenwirkungen von häufig verwendeten Therapien einschränken.
Aspekte der vorliegenden Erfindung sind die Kombination von VPA oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon mit einer Strahlentherapie (z.B. Röntgenstrahlen oder Gammastrahlen).
Nach der Tumortherapie bleiben oft restliche Tumorzellen im Körper des Patienten. Dieser Zustand ist bekannt als minimale Resterkrankung. Diese Tumorzellen können zu sekundären Tumoren führen, sogar Jahre nachdem der erste Tumor entfernt worden ist. Daher ist eine Hauptaufgabe einer erfolgreichen Tumortherapie die Ausrottung solcher restlichen Tumorzellen.
Somit ist ein weiterer Aspekt der Erfindung die Verwendung von VPA und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon zur Hemmung der Tumormetastasenbildung und der Auslöschung der minimalen Resterkrankung.
Es wurde die Wirkung von Bestrahlung in Kombination mit VPA auf menschliche Tumorzellen verschiedenen Ursprungs getestet. Überraschenderweise wurde regelmäßig gefunden, dass die Kombination von VPA mit Bestrahlung eine synergistische Antitumorwirkung hat im Vergleich zu den Wirkungen, die mit VPA alleine oder Bestrahlung alleine zu sehen sind. Diese häufig beobachteten Verbesserungen waren unerwartet.
Die wahrscheinlichste Basis für diesen therapeutischen Erfolg von VPA ist seine Aktivität als neuer Inhibitor von Enzymen mit HDAC-Aktivität. Da jedoch z.B. TSA diese synergistischen Aktivitäten nicht in dem gleichen Ausmaß aufweist, wie VPA, scheint es, dass die fein eingestellte mechanistische Zielfindung, die durch VPA erreicht wird, der von anderen HDAC-Inhibitoren überlegen ist.
Zusätzlich kann VPA zur Hemmung der Tumormetastasenbildung angewendet werden und daher zur Behandlung der minimalen Resterkrankung. Dies wurde erfolgreich getestet, indem in-vivo-Modelle von Nieren- und Brustkarzinoma getestet wurden.
1 zeigt die Wirkung von VPA auf den Differenzierungsblock von hämatopoetischen Progenitorzellen in vitro: VPA wirkt zusammen mit Cytokinen in der Wiederherstellung des differenzierenden Potenzials von PML-RAR exprimierenden Zellen (Referenzbeispiel) und muss daher als sensibilisierend und synergistisch wirkendes Reagenz für eine die Differenzierung induzierende Aktivität von Cytokinen angesehen werden.
2 zeigt, dass VPA PML-RAR exprimierende Zellen für die Röntgenstrahlbehandlung in vitro sensibilisiert (Beispiel 1) und synergistische therapeutische Aktivitäten in dieser Kombination verursacht.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Referenzbeispiel
Synergistische Wirkung von VPA auf den Differenzierungsblock von hämatopoetischen Progenitorzellen in vitro: VPA wirkt mit Cytokinen zusammen bei der Wiederherstellung des differenzierenden Potenzials von PML-RAR exprimierenden Zellen. VPA muss daher als sensibilisierendes Reagenz für die differenzierungsinduzierende Aktivität von Cytokinen angesehen werden (1).
Da akute promyelozytische Leukämiezellen dafür bekannt sind, dass sie auf eine Behandlung mit HDAC-Inhibitoren ansprechen, wurde die Wirkung von VPA auf den Differenzierungsblock von hämatopoetischen Vorläuferzellen durch PML-RAR getestet. Hämatopoetische Progenitoren von der Maus (lin–) wurden mit einem retroviralen Vektor, der PLM-RAR codierte, und GFP als Marker transduziert. Transduzierte Zellen wurden mit einem Cocktail, der verschiedene Cytokine enthielt (IL3, IL6, SCF, G-CSF und GM-CSF), in Gegenwart oder Abwesenheit von VPA stimuliert, um zu differenzieren. Die Myeloiddifferenzierung wurde bewertet durch Analyse der Gegenwart des Differenzierungsmarkers Mac-1.
Ergebnisse
Die VPA-Behandlung beeinflusste die Differenzierung von Kontrollzellen nicht, wohingegen die Expression von PML-RAR einen starken Differenzierungsblock verursachte (1), der nicht überwunden werden konnte, wenn die beschriebenen Cytokine als einzige Behandlung verwendet wurden. VPA (1 mM, auf den rechten Platten, mit PML-RAR bezeichnet) kehrte fast vollständig den Differenzierungsblock um, der durch PML-RAR erzeugt wurde (1). Somit reetabliert und sensibilisiert VPA in Abwesenheit von RA die Zellen für einen Zustand, der für die Differenzierung permissiv ist, wird dann durch Cytokine induziert, wahrscheinlich durch Hemmung der Wirkung des HDAC-Komplexes, der rekrutiert wird, um Gene durch PLM-RAR anzusteuern. Diese Aktivität von VPA muss als synergistische Aktivität angesehen werden, da die Behandlung mit Cytokinen alleine nicht zu einer signifikanten Freisetzung des Differenzierungsblocks in diesen PLM-RAR-Zellen, wie oben erwähnt, führt.
Methoden:
Hämatopoetische Progenitorzellen von der Maus wurden aus Knochenmark von 129 Mäusen auf Basis der Abwesenheit von Abstammungsdifferenzierungsmarkern (lin–) isoliert. Lin–-Zellen wurden 48 Stunden in Gegenwart von IL-3 (20 ng/ml), IL-6 (20 ng/ml), SCF (100 ng/ml) gezüchtet und dann an mit Nichtgewebe-Kulturbehandelte Platten, die mit Retronectin beschichtet waren (Takara-Shuzo) gebunden. Die Zellen wurden dann transduziert durch Inkubation mit dem Überstand aus Phoenix-ecotropen Verpackungszellen (ergänzt mit frischem Serum und IL-3, IL-6 und SCF wie oben), vorübergehend mit dem retroviralen Kontrollvektor PINCO oder PINCO-PML-RAR transfiziert. Nach 60 Stunden wurden GFP+-Zellen mit FACS sortiert und in Methylcelluloseplatten, die wie oben ergänzt waren, plus G-CSF (60 ng/ml) und GM-CSF (20 ng/ml), ausgesät. Wo es angegeben ist, wurde Natriumvalproat (VPA, von links nach rechts 0,2 oder 1 mM) in das Differenzierungsmedium zugegeben. Nach 8 bis 10 Tagen wurden die Zellen auf die Gegenwart des Myeloiddifferenzierungsmarkers Mac-1 mit FACS analysiert. VPA verursachte keine signifikanten Veränderungen in der Anzahl der Mac-1⁺-Zellen, noch in der Anzahl von Kolonien in Kontrollzellen bis zu Konzentrationen von 1 mM. Bei höheren Kon zentrationen (> 3 mM) wurde eine Reduktion der Anzahl von Kolonien beobachtet, höchstwahrscheinlich aufgrund der Induktion des Zelltods (Daten nicht gezeigt). Als Kontrolle ergab die Analyse von mit VPA behandelten Zellen mit einem Erythroiddifferenzierungsmarker (Ter-119) nicht die Gegenwart von positiven Zellen (Daten nicht gezeigt). Nicht infizierte Zellen und Zellen, die mit dem Kontroll-PINCO-Vektor infiziert waren, verhielten sich identisch (Daten nicht gezeigt).
Für 1 wurden Lin–-Zellen mit den angegebenen Vektoren (Kontrolle: PINCO, leerer Vektor, der GFP alleine codiert) transduziert und GFP+-Zellen wurden mit FACS sortiert. GFP+-Zellen wurden dann in Differenzierungsmedium plattiert in Gegenwart oder Abwesenheit von VPA (von links nach rechts 0,2 und 1 mM). Die Differenzierung wurde nach 8 bis 10 Tagen durch Analyse des Myeloiddifferenzierungsmarkers Mac-1 untersucht.
Beispiel 1
VPA sensibilisiert PML-RAR exprimierende Zellen für Röntgenbehandlung in vitro und verursacht einen synergistischen therapeutischen Effekt (2).
Ergebnisse
Bei Röntgenbehandlung (2 Gray) zeigen hämatopoetische Progenitorzellen eine starke Abnahme des Überlebenspotenzials und unterliegen einer Apoptose. Halbfeste Kulturbedingungen (auf Methylcellulose basierende Medien) führen zu einer fast vollständigen Abwesenheit von Kolonien (abgeleitet von Kolonie bildenden Zellen, CFCs) in mit Röntgenstrahlen behandelten Kulturen von Wildtypzellen, was zeigt, dass undifferenzierte Zellen für diese Behandlung sehr empfindlich sind (2). Erstaunlicherweise verursachte PML-RAR-Expression eine starke Reduktion der Röntgenempfindlichkeit von Zielzellen mit einer Überlebensrate von >50% (2). Unter den gleichen Bedingungen senkte VPA (1 mM) die Empfindlichkeit von Wildtypzellen etwas. VPA führte jedoch zu einer Resensibilisierung von PML-RAR exprimierenden Zellen mit einem vollständigen und eindeutig synergistischen Verschwinden von Kolonien bei mit VPA behandelten Zellen (2). Es scheint daher, dass VPA mit Röntgenstrahlen kombiniert werden kann, um die Empfindlichkeit von Zellen, die (z.B. durch Expression eines onkogenen Fusionsproteins) für die Röntgenbehandlung allein resistent geworden sind, wiederherzustellen, und dass dies synergistische therapeutische Erfolgsraten erzeugen kann.
Methoden
Lin–-Zellen wurden transduziert, wie für 1 beschrieben (siehe auch Methoden im Referenzbeispiel bezüglich Details) und mit FACS sortiert. 12 Stunden nach dem Sortieren wurden die Zellen mit PBS gewaschen und dann 8 bis 12 Stunden in Medium mit Cytokinen inkubiert [Daten gezeigt in 2 unter Verwendung von IL-3 (20 ng/ml), IL-6 (20 ng/ml), SCF (100 ng/ml), G-CSF (60 ng/ml), GM-CSF (20 ng/ml)] oder ohne Cytokine (Daten nicht gezeigt). Am Ende der Inkubation wurden die Zellen einer Röntgenquelle (2 Gy Gesamtbestrahlung) ausgesetzt und weitere 12 bis 16 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit von VPA inkubiert. Schließlich wurden Zellen in Methylcellulose enthaltendem Medium (StemCell Technologies) in Gegenwart von Cytokinen (IL3, IL6, SCF, G- und GM-CSF) 8 bis 10 Tage lang plattiert.
Für 2 wurden nicht infizierte Zellen ("Kontrolle"), oder Zellen, die GFP alleine exprimierten ("leerer Vektor"), oder Zellen, die GFP und PML-RAR exprimierten ("PML-RAR") verwendet. 8 Tage nach dem Plattieren in Methylcellulose wurde die Gesamtzahl der Kolonien gemessen. Mit VPA behandelte Zellen (1 mM) wurden VPA auch vor der Röntgenbehandlung ausgesetzt.

Claims

Verwendung von Valproinsäure oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs beim Menschen in Kombination mit einer Strahlenbehandlung, wobei der Krebs ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Kopfund Halskrebs, kleinzelligem Lungenkarzinom und Blutzellenkrebs.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Kombinationsbehandlung weiterhin eine Antitumortherapie einschließt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der Behandlung mit die Differenzierung induzierenden Wirkstoffen, der Behandlung mit chemotherapeutischen Wirkstoffen, der Behandlung mit cytotoxischen Wirkstoffen, Hormontherapie, Immuntherapie, antiangiogener Therapie und/oder Gentherapie.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei Valproinsäure ein Inhibitor von Enzymen mit HDAC-Aktivität ist und einen additiven oder synergistischen therapeutischen Effekt bewirkt.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Enzym mit Histondeacetylaseaktivität eine Histondeacetylase vom Säugetier, bevorzugt vom Menschen ist.
Verwendung nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, wobei die Humanhistondeacetylase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus HDACs 1 bis 8 und Mitgliedern der SIR2-Proteinfamilie.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, wobei die Valproinsäure spezifisch nur eine Untergruppe von HDACs hemmt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Valproinsäure zur Induktion der Differenzierung von Zellen verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Valproinsäure zur Induktion der Differenzierung von transformierten Zellen verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei Valproinsäure zur Induktion der Apoptose von transformierten Zellen verwendet wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Induktion der Hyperacetylierung von Histonen oder von anderen Proteinen, die funktionell durch Acetylierung reguliert werden, eine vorteilhafte Wirkung auf die Behandlung von Krebs bei Menschen hat.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 1A, wobei Valproinsäure oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon als erstes therapeutisches Mittel zu verabreichen ist und die Strahlentherapie als zweites therapeutisches Mittel zu verabreichen ist, dadurch gekennzeichnet, dass die tägliche Dosis der Strahlentherapie signifikant reduziert ist im Vergleich zu der täglichen Dosis der Strahlentherapie, wenn diese allein angewandt wird.