DE60214846T2

DE60214846T2 - Verwendung von mGLuR5 antagonists zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von empfindlichen X Syndrome, Autismus und geistiger Zurückgebliebenheit

Info

Publication number: DE60214846T2
Application number: DE60214846T
Authority: DE
Inventors: F. Mark Bristol BEAR; M. Kimberly Dallax HUBER; Stephen.T. Atlanta WARREN
Original assignee: Emory University; Brown University Research Foundation Inc
Current assignee: Emory University; Brown University Research Foundation Inc
Priority date: 2001-04-02
Filing date: 2002-04-02
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2022-04-03
Also published as: US20030100539A1; US6890931B2; ATE339968T1; EP1392363A2; DE60214846D1; CA2442478A1; AU2002307049A1; CA2442478C; WO2002078745A3; WO2002078745A2; JP2005500260A; ES2272754T3; EP1392363B1

Description

Hintergrund der Erfindung
In dem zentralen Nervensystem von Säugetieren (ZNS) wird die Übertragung von Nervenimpulsen durch das Zusammenwirken zwischen einem durch ein sendendes Neuron freigesetzten Neurotransmitter und einem Oberflächenrezeptor auf einem empfangenden Neuron gesteuert, wodurch das empfangende Neuron angeregt wird. L-Glutamat, der verbreiteste Neurotransmitter im ZNS, vermittelt den hauptsächlichen exzitatorischen (Anregungs-) Weg in Säugetieren, und wird als eine exzitatorische Aminosäure (EAA) bezeichnet. Die auf Glutamat reagierenden Rezeptoren werden als exzitatorische Aminosäure-Rezeptoren (EAA-Rezeptoren) bezeichnet. Siehe Watkins & Evans, Annual Reviews in Pharmacology and Toxicology, 21:165 (1981); Monaghan, Bridges und Cotman, Annual Reviews in Pharmacology and Toxicology, 29:365 (1989); Watkins, Krogsgaard-Larsen und Honore, Transactions in Pharmaceutical Science, 11:25 (1990).
Exzitatorische Aminosäure-Rezeptoren werden in zwei generelle Typen eingeteilt. Rezeptoren, die direkt mit dem Öffnen von Kationenkanälen in der Zellmembran der Neuronen gekoppelt sind, werden als "ionotrop" bezeichnet. Dieser Rezeptortyp ist in mindestens drei Klassen unterteilt, die durch die depolarisierende Wirkung der selektiven Agonisten N-Methyl-D-aspartat (NMDA), α-Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-propionsäure (AMPA) und Kaininsäure (kainic acid) (KA) definiert sind. Es wurden fünf Kainat-Rezeptoren identifiziert, wobei sie entweder als Kainat-Rezeptoren mit hoher Affinität (KA1 und KA2) oder mit geringer Affinität (GluR5, GluR6 und GluR7) eingeteilt sind. (Bleakman et al., Molecular Pharmacology, 1996, Vol. 49, Nr. 4, Seiten 581-585).
Der zweite generelle Rezeptortyp ist das G-Protein oder der sekundäre Botenstoff gekoppelte "metabotrope" exzitatorische Aminosäure-Rezeptor. Dieser zweite Typ stellt eine sehr heterogene Familie von Glutamatrezeptoren dar, die mit vielen sekundären Botenstoff-Systemen gekoppelt sind. Basierend auf ihrer Aminosäuresequenz-Homologie, Agonisten-Pharmakologie und einem Koppeln an Weitergabemechanismen werden die 8 gegenwärtig bekannten mGluR-Untertypen in drei Gruppen eingeteilt. Es wurde gezeigt, dass Gruppe I- Rezeptoren bzw. Rezeptoren der Gruppe I (mGluR1 und mGluR5) an eine Stimulierung der Phospholipase C gekoppelt sind, was zu einer Hydrolyse von Phosphoinositid und einer Erhöhung des intrazellulären Ca²⁺-Spiegels führt, und in einigen Expressionsystemen zu einer Modulation von Ionenkanälen, wie K⁺-Kanälen, Ca⁺⁺-Kanälen, nicht-selektiven Kationenkanälen oder NIVIDA-Rezeptoren. Gruppe II-Rezeptoren (mGluR2 und mGluR3) und Gruppe III-Rezeptoren (mGluRs 4, 6, 7 und 8) sind mit einer Adenylylcyclase negativ gekoppelt, wobei gezeigt wurde, dass sie mit einer Inhibierung der cAMP-Bildung gekoppelt sind, wenn sie in Säugetierzellen heterolog exprimiert werden, und mit G-Protein aktivierten, nach innen gleichgerichteten Kaliumkanälen, in Xenopus-Oozyten und in unipolaren "Brush-Zellen". Neben mGluR6, der hauptsächlich lediglich in der Retina exprimiert wird, sind die mGluRs empfunden weitgehend über das zentrale Nervensystem exprimiert zu sein.
Beide Rezeptortypen scheinen nicht nur eine normale synaptische Weiterleitung entlang exzitatorischer Wege zu vermitteln, sondern ebenfalls an der Modifizierung synaptischer Verbindungen während der Entwicklung und über das gesamte Leben beteiligt zu sein. Schoepp, Bockaert und Sladeczek, Trends in Pharmacological Science, 11:508 (1990); McDonald und Johnson, Brain Research Review, 15:41 (1990).
Die übermäßige oder unangemessene Stimulierung exzitatorischer Aminosäure-Rezeptoren führt zur Schädigung neuronaler Zellen oder zum Verlust durch einen als Exzitotoxizität bekannten Mechanismus. Es wurde vorgeschlagen, dass dieser Prozess bei einer Vielzahl von Bedingungen eine neuronale Degeneration vermittelt. Agonisten und Antagonisten dieser Rezeptoren können für eine Behandlung akuter und chronischer neurodegenerativer Zustände nützlich sein.
Die WO 01/10846 betrifft 1,4-Benzodiazepin-Verbindungen und Derivate. Das Dokument offenbart, dass mehrere dieser Verbindungen als Modulatoren von metabotropen Glutamatrezeptoren wirken und als solche zur Behandlung von Krankheiten des zentralen Nervensystems nützlich sind, die das metabotrope Glutamatrezeptor-System betreffen.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines Gruppe I mGluR-Antagonisten zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von mindestens eines Zustands bereit, der ausgewählt ist unter Fragiles-X-Syndrom, Autismus und geistiger Retardation (Zurückgebliebenheit), wie in den anliegenden Ansprüchen definiert ist.
Ein Verabreichen zusammen mit anderen therapeutischen Agenzien (beispielsweise gleichzeitig oder zu verschiedenen Zeiten) an den Patienten (Mensch oder ein anderes Tier) in einer Menge eines mGluR-Antagonisten, die ausreicht, die Störung zu behandeln, kann durchgeführt werden. Die Zusammensetzung kann zur oralen Verabreichung oder zur transdermalen Verabreichung bestimmt sein.
In einem anderen Aspekt der Erfindung ist der mGluR-Antagonist ein mGluR5-Antagonist.
In einem anderen Aspekt der Erfindung ist der mGluR-Antagonist wie in den Ansprüchen definiert.
Es kann ein Kit, der einen oder mehrere mGluR-Antagonisten umfasst, in Form zur einzelnen, oralen Dosierung oder als ein transdermales Pflaster/Patch in einer Menge bereitgestellt werden, die zur Behandlung neurologischer Störungen in einem Patienten ausreichend ist, welche ausgewählt sind unter Fragiles-X-, Down's-Syndrom und andere Formen geistiger Retardation, Autismus und Schizophrenie, und in Verbindung mit Instruktionen (geschrieben und/oder als Bild), welche die Verwendung des Kits zur Behandlung neurologischer Störungen, und optional Warnungen vor möglichen Nebenwirkungen und Arzneimittel-Arzneimittel- oder Arzneimittel-Nahrungsmittel-Wechselwirkungen, beschreiben.
Ein Verfahren zum Durchführen eines pharmazeutischen Handelns/Plans kann umfassen

a. Herstellen eines einen oder mehrere mGluR-Antagonisten umfassenden Kits, die in Form zur einzelnen oralen Dosierung oder als ein transdermales Pflaster/Patch in einer Menge bereitgestellt sind, die zur Behandlung neurologischer Störungen in einem Patienten ausreichend sind, die ausgewählt sind unter Fragiles-X-, Down's-Syndrom und anderen Formen geistiger Retardation, Autismus und Schizophrenie, und in Verbindung mit Instruktionen (geschrieben und/oder als Bild), welche die Verwendung des Kits zur Behandlung neurologischer Störungen beschreiben, und optional Warnungen vor möglichen Nebenwirkungen und Arzneimittel-Arzneimittel- oder Arzneimittel-Nahrungsmittel-Wechselwirkungen; und
b. Vermarkten der Vorteile einer Verwendung des Kits zum Behandeln neurologischer Störungen für Patienten an Anbieter für Gesundheitspflege.

Ein Verfahren zum Durchführen eines pharmazeutischen Handelns/Plans kann umfassen

a. Bereitstellen eines Verteilernetzwerks zum Verkaufen eines einen oder mehrere mGluR5-Antagonisten umfassenden Kits, die in Form zur einzelnen oralen Dosierung oder als ein transdermales Pflaster/Patch in einer Menge bereitgestellt sind, die zur Behandlung neurologischer Störungen in einem Patienten ausreichend sind, die ausgewählt sind unter Fragiles-X-, Down's-Syndrom und andere Formen geistiger Retardation, Autismus und Schizophrenie, und in Verbindung mit Instruktionen (geschrieben und/oder als Bild), welche die Verwendung des Kits zur Behandlung neurologischer Störungen beschreiben, und optional Warnungen vor möglichen Nebenwirkungen und Arzneimittel-Arzneimittel- oder Arzneimittel-Nahrungsmittel-Wechselwirkungen; und
b. Bereitstellen von Instruktionsmaterial für Patienten oder Mediziner zur Verwendung des Kits zum Behandeln neurologischer Störungen von Patienten.

Ein anderes Verfahren zum Durchführen eines pharmazeutischen Handelns/Plans kann umfassen

a. Bestimmen einer geeigneten Dosis eines mGluR-Antagonisten zum Behandeln neurologischer Störungen in einer Klasse von Patienten;
b. Erstellen eines therapeutischen Profils einer oder mehrerer Formulierungen des in Schritt (a) bezeichneten mGluR5-Antagonisten zur Wirksamkeit und Toxizität in Tieren; und
c. Bereitstellen eines Verteilernetzwerks zum Verkaufen der in Schritt (b) bezeichneten Formulierungen, die ein annehmbares therapeutisches Profil aufweisen.

Ein anderes Verfahren umfasst einen zusätzlichen Schritt eines Bereitstellens einer Verkäufergruppe zum Vermarkten des pharmazeutischen Erzeugnisses an Anbieter für Gesundheitspflege.
Ein anderes Verfahren zum Durchführen eines pharmazeutischen Handelns/Plans kann umfassen

a. Bestimmen einer geeigneten Dosis eines mGluR-Antagonisten zum Behandeln neurologischer Störungen in einer Klasse von Patienten; und
b. Lizenzieren der Rechte zur Weiterentwicklung und zum Verkauf des mGlu5-Antagonisten zum Behandeln der neurologischen Störung an eine dritte Partei.

Ein Verfahren zum Herstellen eines pharmazeutischen Erzeugnisses umfasst, Kombinieren eines mGluR-Antagonisten und eines pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträgers in einer Zusammensetzung zur gleichzeitigen Verabreichung des Arzneimittels.
Ein Verfahren zum Durchführen eines pharmazeutischen Handelns umfasst, Herstellen eines pharmazeutischen Erzeugnisses von einem mGluR-Antagonisten (oder eines Pro-Pharmakon oder Metaboliten davon) oder eines Kits, der eine getrennte Formulierung von jedem umfasst, und Vermarkten der Vorteile einer Verwendung des pharmazeutischen Erzeugnisses oder Kits in der Behandlung von Down's-Syndrom, Fragiles-X-Syndrom und andere Formen geistiger Retardation, Autismus und Schizophrenie an Anbieter von Gesundheitspflege.
Ein anderes Verfahren zum Durchführen eines pharmazeutischen Handelns/Plans umfasst, Bereitstellen eines Verteilernetzwerks zum Verkaufen der kombinatorischen pharmazeutischen Erzeugnisse und Kits, sowie Bereitstellen von Instruktionsmaterial an Patienten oder Mediziner zur Verwendung eines derartigen pharmazeutischen Erzeugnisses zum Behandeln von Down's-Syndrom, Fragiles-X-Syndrom und anderer Formen geistiger Retardation, Autismus und Schizophrenie.
Ein anderes Verfahren zum Durchführen eines pharmazeutischen Handelns/Plans umfasst, Bestimmen einer geeigneten Formulierung und Dosis eines mGluR-Antagonisten. In bestimmten Ausführungsformen umfasst das Verfahren ferner einen zusätzlichen Schritt eines Bereitstellens einer Verkäufergruppe zum Vermarkten des pharmazeutischen Erzeugnisses an Anbieter von Gesundheitspflege.
Ein anderes Verfahren zum Durchführen eines pharmazeutischen Handelns/Plans umfasst, Bestimmen einer geeigneten Formulierung und Dosis bzw. Dosierung eines mGluR-Antagonisten, sowie Lizenzieren der Rechte zur Weiterentwicklung und zum Verkauf der Formulierung an eine dritte Partei. In einem anderen Aspekt leidet die Klasse der Patienten an neurologischen Störungen.
Das Verfahren kann umfassen, dass dem Patienten eine wirksame Menge des mGluR-Antagonisten oder Kombinationen davon verabreicht wird. In einer anderen Ausführungsform wird der mGluR-Antagonist in einer Dosis verabreicht, die von ungefähr 10 bis ungefähr 1000 mg/kg Körpergewicht/Tag reicht. In einer Ausführungsform wird der mGluR-Antagonist in einer Dosis verabreicht, die von ungefähr 50 bis ungefähr 800 mg/kg Körpergewicht/Tag reicht. In einer Ausführungsform wird der mGluR-Antagonist in einer Dosis verabreicht, die von ungefähr 250 bis ungefähr 500 mg/kg Körpergewicht/Tag reicht. In bestimmten Ausführungsformen weist der mGluR-Antagonist eine ED₅₀ von 1 μM, 100 nm, 10 nm oder weniger auf. In einer Ausführungsform beträgt der TI 10, 100 oder mehr. Die ED₅₀ für Gruppe I-Rezeptor-Antagonismus kann mindestens zehnmal geringer sein als die ED₅₀ für jeden des Gruppe II- oder Gruppe III-Rezeptor-Antagonismus, beispielsweise mGluR2, mGluR3, mGluR4, mGluR6, mGluR7 und mGluR8.
Ausführliche Beschreibung der Figuren
1: Eigenschaften von (RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG)-induzierter Langzeit-Depression (LTD)
A: Dosisabhängigkeit der Auswirkungen einer DHPG-Verabreichung (5 min; gekennzeichnet durch den nach unten gerichteten Pfeil) auf Steigungswerte des Feldpotentials (10 µM DHPG; n = 5; 50 µM DHPG; n = 11; 100 µM DHPG; n = 4). Einfügung: Schema einer Anordnung von stimulierenden (S) und extrazellulären, aufzeichnenden (R) Elektroden in einer isolierten CA1 Scheibe des Hippocampus. Repräsentatives Feldpotential (2-min Mittel) von einer Scheibe, die mit 50 µM DHPG behandelt wurde, und zu den durch die Zahlen auf dem Graphen gekennzeichneten Zeiten aufgenommen wurde. Eichung: 0,5 mV, 5 msec.
B: DHPG-LTD ist stimulationsunabhängig. Einfügung: Anordnung von stimulierenden Elektroden (S 1 und S2), die 2 unabhängige Zuführungen abwechselnd stimuliert. Stimulierung auf einem Weg (OFF-Weg; o) wurde unmittelbar vor einer DHPG-Applikation abgeschaltet und 30 min nach Auswaschen des DHPG wieder aufgenommen, während die andere (ON-Weg; •) Zuführung mit der Basislinienfrequenz (0,067 Hz) während der Dauer des Experiments stimuliert wurde. Sowohl im An- als auch im Aus-Weg (n = 4) wurde ein ähnliches Ausmaß einer Depression beobachtet.
C: DHPG-LTD kann gesättigt werden. Zwei Applikationen von DHPG sind ausreichend, um LTD zu sättigen. Eine dritte DHPG-Applikation induziert keine weitere Depression (n = 8).
D: DHPG-Applikation (50 µM; 5 min) induziert eine anhaltende Depression von Steigungswerten eines durchschnittlichen exzitatorischen postsynaptischen Potentials (EPSP) (n = 6). Repräsentative EPSP-Wellenformen (2-min Mittel), die bei einem Experiment zu den durch die Zahlen auf dem Graphen gekennzeichneten Zeiten genommen wurden. Eichung: 5 mV, 10 msec.
E: DHPG-Applikation (50 µM; 5 min) verringern exzitatorische postsynaptische Strom (EPSC)-Amplituden. Zellen wurden mit Spannung bei –70 mV eingespannt. Ein Aufzeichnungsmodus wurde, wie durch den Balken gekennzeichnet ist, während und 5 Minuten nach DHPG-Applikation von der Spannungsklemme zur Strom (I)-Klemme geschalten. Repräsentative EPSCs (2-Minuten Mittel), die bei einem Experiment zu den durch die Zahlen auf dem Graphen gekennzeichneten Zeiten genommen wurden. Eichung: 125 pA, 25 msec.
2: DHPG-LTD, jedoch nicht N-Methyl-D-aspartat-Rezeptor (NMDAR)-abhängige LTD, benötigen mGluR5
A: DHPG-LTD ist NMDAR unabhängig. Vorinkubation der Scheiben in D-2-Amino-5-Phosphonopentansäure (AP5; 50 µM; •; n = 5) beeinflusst nicht das Ausmaß von DHPG-LTD, verglichen mit verschachtelten Kontrollscheiben (o; n = 4).
B: DHPG-LTD benötigt mGluR5. DHPG-Applikation auf Scheiben homozygoter mGluR5-knockout-Mäusen (–/–; o; n = 8) induziert keine LTD. Eine intermediäre LTD wird in Heterozygoten (+/–;
n = 6) beobachtet, verglichen mit Scheiben von Wildtyp-Mäusen (wt; •; n = 9).
C: Niederfrequente synaptische Stimulierung (LFS)-induzierte LTD benötigt kein mGluR5. LFS induziert ein ähnliches Ausmaß von LTD sowohl in homozygoten Knockout-Mäusen (–/–; o; n = 6) als auch verglichen mit Wildtyp-Mäusen (wt; •; n = 6).
3: DHPG-LTD ist eingeschlossen durch mGluR-abhängige LTD induziert mit PP-LFS, jedoch nicht NMDAR-abhängige LT.
A: Es wurden wiederholte Episoden von LFS verabreicht, um NMDAR-abhängige LTD zu sättigen. Anschließend wurde DHPG (nach unten gerichteter Pfeil) auf die Scheibe verabreicht.
B: Wieder normalisierte FP-Steigungswerte für die vor-DHPG-Basislinie (n = 8).
C: Es wurden wiederholte Episoden von LFS verabreicht, um mGluR-abhängige LTD zu sättigen. Anschließend wurde DHPG (nach unten gerichteter Pfeil) auf die Scheibe verabreicht. Das gesamte Experiment wurde in 50 µM D-AP5 durchgeführt, um eine Induktion der NMDAR-abhängiger LTD zu verhindern.
D: Wieder normalisierte FP-Steigungswerte für die vor-DHPG-Basislinie (n = 5).
4: mGluR-Stimulierung induziert Endozytose von GluR1-Punkten bzw. puncta
(a) Repräsentative Bilder eines Kontroll-Neurons und eines Neurons 15 Minuten nach mGluR-Stimulierung markiert mittels "Acid Strip"-Immunocytochemie für internalisiertes GluR1. Maßstabsbalken 10 µm. (b) Eine Quantifizierung zeigt eine 2,5-fache Zunahme in der Dichte an internalisierten Punkten bereits nach 15 Minuten, die für mindestens 60 Minuten bleibt. (c) mGluR-stimulierte Endozytose von GluR1 wird durch einen Gruppe I-mGluR-Antagonisten, LY344545, blockiert. (d) Inhibierung der Proteinsynthese durch Cycloheximid-Behandlung (60 µM) verringert eine mGluR-stimulierte Endozytose.
5: mGluR-Stimulierung induziert Verlust von AMPARs auf der synaptischen Oberfläche
(a,b) Repräsentative Bilder eines Kontrollneurons, das mit einem gegen den synaptischen Marker Synapsin I (a) gerichteten Antikörper und einen Antikörper gegen den N-Terminus von GluR2 (b) gefärbt ist. Maßstabsbalken 10 µm. (c, d) Stärker vergrößerte Bilder der gleichen Zelle wie in (a) zeigen die Co-Lokalisation von Synapsin (c) und GluR2 (d). Maßstabsbalken 5 µm. (e, f) Ein ähnliches Ausmaß einer Co-Lokalisation wurde mit Antikörpern gegen Synaptophysin (e) und den N-Terminus von GluR1 (f) beobachtet. (g, h) Nach einer Stunde DHPG wurde keine Veränderung in der Synapsin-Punktdichte nachgewiesen (g), jedoch gab es eine große Abnahme in der Anzahl von synaptischen GluR2-Punkten (h). Maßstabsbalken 10 µm. (i) Eine Quantifizierung zeigte, dass 80,6 ± 9,0% der Synapsin-Punkte zusammen mit GluR2 auf Kontrollneuronen lokalisiert waren. Jedoch wiesen eine Stunde nach DHPG lediglich 40,8 ± 11% der Synapsen eine Oberflächenfärbung für GluR2 auf. (j, k) GluR1-positive Synapsen sind durch eine DHPG-Behandlung verringert und die stabile Expression dieses Wechsels ist durch Cycloheximid inhibiert. Lediglich 29,3 ± 5,4% Synaptophysin-positiver Synapsen exprimieren GluR1-Punkte 15 Minuten nach DHPG, verglichen mit 72,5 ± 4,7% in Kontrollkulturen. Diese Wirkung von DHPG wurde durch Cycloheximid nicht beeinflusst (j). Im Gegenteil inhibierte Cycloheximid signifikant den Verlust von GluR1, erfasst 60 Minuten nach DHPG (k).
6: mGluR-Stimulierung induziert einen Verlust von Oberflächen-GluR1.
(a) Repräsentative Blots zeigen die Beispiele eines gesamten und biotinylierten Oberflächen-GluR1 einer Kontroll-Kultur (Linien 1 und 2) und 60 Minuten nach einer DHPG-Behandlung (Linien 3 und 4). (b) Densitometrische Quantifizierung zeigt, dass 60 Minuten nach DHPG die Spiegel an Oberflächen-GluR1 auf 56,8 ± 4,0% der Kontroll-Level verringert waren.
7: DHPG-induzierte synaptische Depression ist von einer Verringerung in AMPAR-vermittelter mEPSC-Frequenz begleitet
(a) Repräsentative mEPSC-Aufzeichnungen einer Zelle vor und eine Stunde nach DHPG-Applikation. (b) Kumulative Wahrscheinlichkeitshistogramme für ein Zwischenereignis-Intervall und eine Amplitude für die in (a) dargestellte Zelle vor DHPG und in einer 45 Minuten nach DHPG-Applikation beginnenden Periode. (c) Gruppen-gemittelte mEPSC-Amplitude und Zwischenereignis-Intervall vor, 15 Minuten und 1 Stunde nach DHPG-Applikation.
8: mGluR-Stimulierung induziert einen Verlust von NMDARs der synaptischen Oberfläche
(a, b) repräsentative Bilder eines Kontrollneurons, das mit einem gegen den synaptischen Marker Synapsin I (a) gerichteten Antikörper und einen Antikörper gegen den N-Terminus von NR1 (b) gefärbt ist. Maßstabsbalken 10 µm. (c, d) Stärker vergrößerte Bilder der gleichen Zelle wie in (a) zeigen die Co-Lokalisation von Synapsin (c) und NR1 (d). Maßstabsbalken 5 µm. (e, f) Nach einer Stunde DHPG wurde keine Veränderung in der Synapsin-Punktdichte nachgewiesen (e), jedoch gab es eine große Abnahme in der Anzahl synaptischer NR1-Punkte (f). Maßstabsbalken 10 µm. (g) Eine Quantifizierung zeigte, dass DHPG den Prozentsatz an für NR1 positive Synapsen 60 Minuten nach Behandlungsbeginn verringert, und dass diese Wirkung durch Cycloheximid inhibiert wurde. (h) Repräsentative Blots zeigen Beispiele eines gesamten und biotinylierten Oberfläche-NR1 in Kontrolle (Linien 1 und 2) und 60 Minuten nach Behandlung mit DHPG (Linien 3 und 4; Reprobe des Blots in 3a). (i) Sechzig Minuten nach DHPG-Behandlung waren die Oberflächen-NR1-Spiegel auf 32,3 ± 8,2% der Kontroll-Spiegel verringert. Cycloheximid verringerte den Verlust an Oberflächen-NMDARs auf 79,1 ± 14,5% der Kontroll-Spiegel.
9: DHPG-Applikation vermindert synaptisch hervorgerufene NMDAR-vermittelte EPSCs und NMDA-hervorgerufene Ströme
(a) DHPG-induzierte Depression synaptisch hervorgerufener NMDAR EPSCs. (b) Zwei-Minuten-Mittel NMDA-hervorgerufener Stromamplituden vor und nach Applikation von 100 µM DHPG. (c) Zwei-Minuten-Mittel NMDA-hervorgerufener Ströme einer Kontrolle. In (a) und (b) zeigen die Pfeile den Beginn einer 5-minütigen DHPG-Applikation an. R_S, Vorwiderstand (series resistance).
Beste(r) Modus/Modi zum Durchführen der Erfindung
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
I. Überblick
Erst kürzlich wurden Anzeichen aufgefunden, dass FMR-Protein (FMRP) in einer Aktivitäts-abhängigen, lokalen synaptischen Proteinsynthese involviert ist. Der hauptsächliche exzitatorische Neurotransmitter Glutamat stimuliert, über Gruppe I metabotrope Glutamat-Rezeptoren (mGluRs), eine Proteinsynthese in Dendriten. Die Gruppe I-mGluRs sind eine Untergruppe der G-Protein-gekoppelten mGluR-Familie und sind aus zwei Untertypen, mGluR1 und mGluR5, zusammengesetzt. Nachfolgende Arbeiten zeigten, dass in Dendriten FMR1 mRNA vorkommt, und dass FMRP als Antwort auf eine mGluR-Aktivierung von Synaptoneurosomen synthetisiert wird (Weiler et al., 1997). Da FMRP selbst mRNA-Translation regulieren kann, kann die Synthese von FMRP in Synapsen als Antwort auf eine mGluR-Aktivierung einen Mechanismus darstellen, durch den neuronale Aktivität eine Synthese anderer für die synaptische Plastizität und Entwicklung wichtige Proteine regulieren und steuern kann.
Obwohl bekannt war, dass mGluR-Aktivierung die Proteinsynthese stimulieren kann, und insbesondere die von FMRP, war die funktionelle Rolle dieses Mechanismus bis vor kurzem nicht bekannt. Mehrere Studien haben gezeigt, dass eine Aktivierung von Gruppe I-mGluRs mit entweder einer synaptischen Stimulierung oder dem selektiven Agonisten R,S-Dihydroxyphenylglycin (DHPG) eine Langzeit-Depression (LTD) (long-term depression) synaptischer Antworten im Bereich CA1 des Hippocampus von Ratten induziert (Fitzjohn et al., 1999; Kemp und Bashir, 1999; Huber et al., 2000). LTD ist abhängig von mGluR5 und benötigt am dringendsten die schnelle und dendritische Synthese neuer Proteine (Huber et al., 2000). Dieser LTD-Mechanismus stellt Hinweise über die Funktion von Glutamat- oder Aktivitäts-induzierender-Stimulation lokaler dendritischer Proteinsynthese bereit.
Es wurde vorgeschlagen, dass ein LTD-ähnlicher Mechanismus für eine Entfernung oder Aufastung (pruning) ungeeigneter Synapsen verantwortlich sein kann, die während frühen Perioden einer postnatalen Entwicklung gebildet werden (Colman et al., 1997; Bear und Rittenhaus, 1999). Jüngste Anzeichen unterstützen diese Hypothese. Eine Behandlung hippocampaler, neuronaler Kulturen mit dem Gruppe I-Agonisten, DHPG, führen zu einer Langzeit-Abnahme in der Oberflächen-Expression von AMPA-Subtyp-Glutamat-Rezeptoren (AMPAR), wobei die Rezeptoren für die synaptische Übertragung bei exzitatorischen Synapsen verantwortlich sind. Wie LTD, ist die Langzeit-Abnahme in der AMPAR-Oberflächenexpression abhängig von einer Proteinsynthese (Synder et al., 2000). Vorläufige Daten zeigen ebenfalls eine gleichzeitige Verringerung in der Anzahl an präsynaptischen Enden nach einer DHPG-Behandlung. Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass eine Aktivierung von mGluR5 zu Abnahmen in der synaptischen Stärke führt, wobei dies höchst wahrscheinlich durch eine Verringerung oder Entfernung der Anzahl an exzitatorischen Synapsen vermittelt ist. Dieser synaptische Entfernungsprozess kann zur Bildung geeigneter synaptischer Verbindungen während der Entwicklung sowie in der Speicherung von Erinnerungen bei Erwachsenen beitragen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass FMRP in dem LTD-Mechanismus eine wesentliche Rolle spielt. Wie nachstehend ausführlich erläutert, wurde die Rolle von FMRP in LTD durch Verwendung eines FMR1-Knockout-Mäuse-Modells für Fragiles-X-Syndrom aufgefunden. In Kürze, es werden hippocampale Gehirnscheiben von entweder Knockout- oder Wildtyp-Jungtieren (littermates) hergestellt. LTD wurde entweder durch DHPG-Applikation oder ein synaptisches Stimulierungsprotokol induziert, das als gepaarte Puls-Niederfrequenz-Stimulierung (paired-pulse low frequency stimulation) (PP-LFS) bezeichnet wird. Überraschenderweise wurde eine signifikante Erhöhung von LTD in den Knockout-Mäusen beobachtet, sowohl in den DHPG- als auch in den PP-LFS behandelten Scheiben. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass FMRP normalerweise als ein Inhibitor der mGluR-abhängigen Proteinsynthese fungieren kann und es in der Abwesenheit von FMRP zu einer nicht regulierten Synthese von Proteinen kommt, die für LTD benötigt werden. Eine Folge dieser Ergebnisse ist, dass ein Überschuss an LTD oder ein Synapsenentfernungsmechanismus in FMR1-knockout-Mäusen oder Patienten mit Fragilem-X-Syndrom den normalen synaptischen Entwicklungsprozess stören kann und zu Abnormalitäten in der dendritischen Dornfortsatz- bzw. Stachelstruktur und letztendlich zu kognitiven Mängeln führt. Alternativ oder zusätzlich kann die Erhöhung eines LTD-ähnlichen Mechanismus bei Erwachsenen zu der nicht wirksamen Speicherung von Information in dem Gehirn führen, was ebenfalls zu geistiger Retardation beitragen kann.
Das Auffunden eines mit geistiger Retardation assoziierten neuronalen Mechanismus liefert Therapien, um die synaptischen Abnormalitäten bzw. Anomalien und kognitive Mängel, die mit Fragilem-X-Syndrom, Down's-Syndrom und anderen Formen geistiger Retardation, Autismus, Schizophrenie und anderen, die Herunterregulierung von FMRP-Spiegeln oder Expression einbeziehenden Störungen assoziiert sind, zu verhindern oder rückgängig zu machen. So kann die Behandlung beispielsweise die Verabreichung eines Antagonisten eines Gruppe I-mGluRs, wie mGluR5, während der frühen postnatalen Entwicklung sein, um die abnormal erhöhte LTD abzumildern und das Gleichgewicht der synaptischen Bildung und Entfernung wieder herzustellen. Weiterhin kann eine Behandlung von Erwachsenen mit Antagonisten von Gruppe I-mGluRs, wie mGluR5, Lernschwierigkeiten verringern angesichts des Anzeichens, dass Neuronen ihre Fähigkeit Dendriten zu bilden beibehalten und eine Oberflächenexpression von Rezeptoren für einige Zeit modulieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Antagonisten von Gruppe I-mGluRs, wie mGluR5, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fragilem-X-Syndrom und anderer Formen geistiger Retardation sowie Autismus. Ein mGluR-Antagonist ist eine Substanz, welche die Wirkung eines Liganden (Agonist) verringert oder beseitigt, der ein mGluR aktiviert. Somit kann der Antagonist beispielsweise ein chemischer Antagonist, ein pharmakokinetischer Antagonist, ein Antagonist durch Rezeptorblockierung, ein nicht kompetitiver Antagonist oder ein physiologischer Antagonist sein.
Antagonisten können auf der Ebene der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen wirken, wie bei kompetitiv oder nicht kompetitiv (beispielsweise allosterisch) inhibierender Ligandenbindung. In anderen Ausführungsformen kann der Antagonist dem Rezeptor nachgelagert wirken, wie bei inhibierender Rezeptor-Inaktivierung mit einem G-Protein. Eine "pharmakokinetischer Antagonist" verringert wirksam die Konzentration des aktiven Arzneimittels an seiner Wirkstelle, beispielsweise durch Erhöhen der Rate des metabolischen Abbaus des aktiven Liganden. Antagonismus durch Rezeptor-Blockierung schließt zwei wichtige Mechanismen ein: 1) reversibler kompetitiver Antagonismus und 2) irreversibler oder Nichtgleichgewichts-kompetitiver Antagonismus. Reversibler kompetitiver Antagonismus tritt auf, wenn die Dissoziationsrate des Antagonistenmoleküls von dem Rezeptor hoch genug ist, so dass durch Zugabe des Liganden die an die Rezeptoren bindenden Antagonistenmoleküle wirksam durch den Liganden ersetzt werden. Irreversibler oder Nichtgleichgewichts- kompetitiver Antagonismus tritt auf, wenn der Antagonist sehr langsam oder überhaupt nicht von dem Rezeptor dissoziiert, was dazu führt, dass es bei einer Applizierung des Liganden zu keiner Änderung in der Antagonisten-Belegung kommt. Somit ist der Antagonismus unüberwindbar. Wie hier verwendet ist ein "kompetitiver Antagonist" ein Molekül, das direkt an den Rezeptor oder Liganden in einer Art und Weise bindet, die sterisch mit der Wechselwirkung des Liganden mit dem Rezeptor eingreift.
Nicht-kompetitiver Antagonismus beschreibt eine Situation, bei der der Antagonist nicht direkt mit einem an den Rezeptor bindenden Liganden konkurriert, jedoch anstelle einen Punkt in dem Signalübertragungsweg nach einer Rezeptoraktiveirung durch den Liganden blockiert. Physiologischer Antagonismus beschreibt im weitesten Sinne die Wechselwirkung zweier Substanzen, deren gegenseitige Wirkungen im Körper dazu neigen, sich gegenseitig aufzuheben. Ein Antagonist kann ebenfalls eine Substanz sein, die eine Expression von funktionellem mGluR verringert oder beseitigt. Somit kann ein Antagonist beispielsweise eine Substanz sein, welche verringert oder beseitigt: 1) die Expression des mGluR5 kodierenden Gens, 2) die Translation von mGluR5 RNA, 3) die post-translationale Modifikation des mGluR5-Proteins oder 4) die Insertion von GluR5 in die Zellmembran.
II. Definitionen
Eine "wirksame Menge" betrifft die Menge einer einen mGluR-Antagonisten umfassenden Verbindung bzw. Zusammenstellung, die nach Verabreichung in einmaliger oder mehrmaliger Dosierung an einen Patienten in einer Behandlung des Patienten wirksam ist, der unter den genannten Störungen leidet.
Der Begriff "ED₅₀" bezeichnet die Dosis eines Arzneimittels, welche 50% seiner maximalen Antwort oder Wirkung erzeugt.
Der Begriff "IC₅₀" bezeichnet die Konzentration eines Arzneimittels, welche eine Aktivität oder Eigenschaft um 50% inhibiert, beispielsweise durch Verringerung der Häufigkeit eines Zustands, wie Zelltod, durch 50%, indem ein Binden eines Kompetitor-Peptides an ein Protein um 50% verringert wird oder indem die Höhe an Aktivität um 50% verringert wird.
Der Begriff "LD₅₀" bezeichnet die Dosis eines Arzneimittels, welche in 50% der Probanden letal ist.
Ein "Patient" oder "Proband", der durch das beanspruchte Verfahren behandelt wird, kann entweder einen Menschen oder ein nicht-menschliches Tier meinen.
"Zusammensetzung" zeigt eine Kombination mehrerer Substanzen in einem aggregierten Gemisch an.
Der Begriff "Pro-Pharmakon (prodrug)" soll Verbindungen umfassen, die unter physiologischen Bedingungen in die erfindungsgemäßen therapeutisch aktiven Agenzien umgewandelt werden. Eine gebräuchliches Verfahren zum Herstellen eines Pro-Pharmakons ist es ausgewählte Reste, wie Ester, einzubeziehen, die unter physiologischen Bedingungen hydrolysiert werden, um das gewünschte Molekül zu enthüllen. In anderen Ausführungsformen wird das Pro-Pharmakon durch eine enzymatische Aktivität des Wirtstiers umgewandelt.
Der Begriff "Metaboliten" betrifft aktive Derivate, die nach Einführung einer Verbindung in ein biologisches Milieu, wie einem Patienten, gebildet werden
Ein "Agonist" ist ein Molekül, das einen bestimmten Rezeptor-Typ aktiviert. So wirken beispielsweise Glutamatmoleküle als Agonisten, wenn sie EM-Rezeptoren anregen. Im Gegensatz dazu ist ein "Antagonist" ein Molekül, welches die durch einen Agonisten auf einem Rezeptor angeregten Wirkungen verhindert oder vermindert. Der Begriff "therapeutische Kennzahl" betrifft den therapeutischen Kennzahl (TI) eines Arzneimittels, welcher als LD₅₀/D₅₀ definiert ist.
"Transdermales Pflaster/Patch" bezeichnet ein System, das in der Lage ist ein Arzneimittel an einen Patienten über die Haut oder eine beliebige geeignete äußere Oberfläche, welche Schleimhäute wie solche, die sich im Mund befinden, umfasst, bereitzustellen bzw. zu liefern. Derartige Bereitstellungssysteme umfassen im Allgemeinen eine flexible Trägerschicht bzw. Unterlage, ein Haftmittel und eine Arzneimittel-enthaltende Matrix, wobei die Trägerschicht das Haftmittel und die Matrix schützt, und wobei das Haftmittel das Ganze auf der Haut des Patienten hält. Bei Kontakt mit der Haut liefert die Arzneimittel-enthaltende Matrix das Arzneimittel an die Haut, wobei das Arzneimittel durch die Haut in das Patientensystem gelangen kann.
Der Begriff "statistisch signifikant", wie hier verwendet bedeutet, dass es mit einem bestimmten Wahrscheinlichkeitsgrad unwahrscheinlich ist, dass die erhaltenen Ergebnisse von zufälliger Fluktuationen sind. Die zwei am häufigsten festgelegten Wahrscheinlichkeitsgrade sind 0,05 (p = 0,05) und 0,01 (p = 0,01). Die Wahrscheinlichkeitsgrade von gleich 0,05 bzw. 0,01 bedeuten, dass die Wahrscheinlichkeit eines Fehlers 5 aus 100 bzw. 1 aus 100 beträgt.
Der Begriff "Anbieter für Gesundheitspflege" betrifft Individuen oder Organisationen, die Gesundheitspflege-Service für eine Person, Gemeinschaft etc. bereitstellen. Beispiele für "Anbieter für Gesundheitspflege" umfassen Ärzte, Krankenhäuser, dauerhafte Betreuungsgemeinschaften, fachmännische Pflegeeinrichtungen, subakute Betreuungseinrichtungen, Kliniken, Kliniken mit mehreren Fachgebieten, frei stehende ambulante Zentren, Agenturen für häusliche Versorgung und HMO's.
Der Begriff "Verteilernetzwerk" betrifft Individuen oder Organisationen, die zusammengeschlossen sind und Güter einem Indivduum, Organisation oder einem Ort an mehrere andere Individuen, Organisationen oder Orte übermitteln.
Der Begriff "Vertriebsgruppe" betrifft eine Organisation von Individuen, die mit dem Verkauf eines bestimmten Produkts assoziiert sind.
Der Begriff "Lizenzieren" betrifft die Erteilung einer Befugnis durch den Patentinhaber und den Eigentümer von Wissen auf einen Anderen, wobei der Letztere ermächtigt wird, die patentierte Zusammensetzung herzustellen oder das Verfahren oder das Wissen zu verwenden.
III. Beispielhafte Verbindungen
A. Beispielhafte mGluR-Antagonisten
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Gruppe I-Antagonisten, vorzugsweise mGluR5-Antagonisten.
Beispielhafte mGluR5-Antagonisten umfassen, ohne Beschränkung, 2-Methyl-6-(phenylethinyl)-pyridin (MPEP), (E)-6-Methyl-2-styryl-pyridin (SIB 1893), LY293558, 2-Methyl-6-[(1E)-2-phenylethinyl]-pyridin, 6-Methyl-2-(phenylazo)-3-pyridinol, (RS)-α-Methyl-4-carboxyphenylglycin (MCPG), 3S,4aR,6S,8aRS-6-((((1H-tetrazol-5-yl)methyl)oxy)methyl)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydroisochinolin-3-carbonsäure, 3S,4aR,6S,8aR-6-((((1H-tetrazol-5-yl)methyl)oxy)methyl)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydroisochinolin-3-carbonsäure, 3SR,4aRS,6SR,8aRS-6-(((4-Carboxy)phenyl)methyl)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydroisochinolin-3-carbonsäure und 3S,4aR,6S,8aR-6-(((4-Carboxy)-phenyl)methyl)-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8a-decahydroisochinolin-3-carbonsäure, und deren pharmazeutisch annehmbaren Salze, Analoge und Derivate davon.
Antagonisten von mGluR5 sind ebenfalls beschrieben in WO 01/66113, WO 01/32632, WO 01/14390, WO 01/08705, WC 01/05963, WO 01/02367, WO 01/02342, WO 01/02340, WO 00/20001, WO 00/73283, WO 00/69816, WO 00/63166, WO 00/26199, WO 00/26198, EP-A-0807621, WO 99/54280, WO 99/44639, WO 99/26927, WO 99/08678, WO 99/02497, WO 98/45270, WO 98/34907, WO 97/48399, WO 97/48400, WO 97/48409, WO 98/53812, WO 96/15100, WO 95/25110, WO 98/06724, WO 96/15099 WO 97/05109, WO 97/05137, US 6,218,385 , US 5,672,592 , US 5,795,877 , US 5,863,536 , US 5,880,112 , US 5,902,817 , patentierten US-Anmeldung Nr. 08/825,997, 08/833,628, 08/842,360 und 08/899,319, wobei alle diese hiermit unter Bezugnahme mitaufgenommen sind.
Verschiedene Klassen von mGluR5-Antagonisten sind beispielsweise in der WO 01/08705 (Seiten 3-7), WO 99/44639 (Seiten 3-11) und WO 98/34907 (Seiten 3-20) beschrieben.
Andere Klassen von mGluR1-Antagonisten, antisense-Oligonukleotide sind in der WO 01/05963 beschrieben. Antisense-Oligonukleotide für mGluR5 können, wenn gewünscht, in analoger Weise hergestellt und verwendet werden, um mGluR5 selektiv entgegenzuwirken.
Eine andere Klasse von mGluR5-Antagonisten ist in WO 01/02367 und WO 98/45270 beschrieben. Derartige Verbindungen besitzen im Allgemeinen die Formel:
wobei R bedeutet: H oder ein hydrolysierbarer Kohlenwasserstoffrest, wie ein Alkyl-, Heteroalkyl-, Alkenyl- oder Aralkyl-Rest.
In bestimmten derartiger Ausführungsformen weist das Isochinolinsystem auf die folgende stereochemische Anordnung auf
(wobei, wie dem Fachmann bekannt, ein dunkler Punkt auf einem Kohlenstoff einen Wasserstoff anzeigt, der aus der Seite hinausweist, und ein Paar Striche einen Wasserstoff anzeigen, der sich hinter die Ebene der Seite erstreckt), das Enantiomer davon oder ein racemisches Gemisch der beiden.
Eine andere Klasse von in der WO 01/66113 beschriebenen Antagonisten weisen die folgende Formel auf:
wobei
R1 bezeichnet: Wasserstoff, Niederalkyl, Hydroxy-Niederalkyl, Niederalkyl-amino, Piperidino, Carboxy, verestertes Carboxy, amidiertes Carboxy, nicht-substituiertes oder Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Halo- und/oder Trifluormethyl-substituiertes N-Niederalkyl-N-phenylcarbamoyl, Niederalkoxy Halo-Niederalkyl oder Halo-Niederalkoxy;
R2 bezeichnet: Wasserstoff, Niederalkyl, Carboxy, verestertes Carboxy, amidiertes Carboxy, Hydroxy-Niederalkyl, Hydroxy, Niederalkoxy oder Niederalkanoyloxy, 4-(4-Fluorbenzoyl-piperidin-1-yl-carbony, 4-t.-butyloxycarbonyl-piperazin-1-yl Carboxy, 4-(4-Azido-2-hydroxybenzoyl)-piperazin-1-yl-carboxy oder 4-(4-Azido-2-hydroxy-3-iodo-benzoyl)-piperazin-1-yl-carboxy;
R3 bezeichnet: Wasserstoff, Niederalkyl, Carboxy, Niederalkoxy-carbonyl, Niederalkyl Carbamoyl, Hydroxy-Niederalkyl, di-Niederalkyl-aminomethyl, Morpholinocarbonyl oder 4- (4-Fluorbenzoyl)-piperadin-1-yl-carboxy;
R4 bezeichnet Wasserstoff, Niederalkyl, Hydroxy, Hydroxy-Niederalkyl, Amino-Niederalkyl, Niederalkylamino-Niederalkyl, di-Niederalkylamino-Niederalkyl, nichtsubstituiertes oder Hydroxy-substituiertes Niederalkylenamino-Niederalkyl, Niederalkoxy, Niederalkanoyloxy, Amino-Niederalkoxy Niederalkylamino-Niederalkoxy di-Niederalkylamino-Niederalkoxy Phthalimid-Niederalkoxy nicht-substituiertes oder Hydroxy- oder 2-Oxo-imidazolidin-1-yl-substituiertes Niederalkylenamino-Niederalkoxy, Carboxy, verestertes oder amidiertes Carboxy, Carboxy-Niederalkoxy oder verestertes Carboxy-Niederalkoxy; und
X bezeichnet eine wahlweise Halo-substituierte Niederalkylen- oder Alkinyl-Gruppe, die über ein benachbartes gesättigtes Kohlenstoffatom gebunden ist, oder eine Azo-Gruppe (-N=N-), und
R5 bezeichnet: an aromatische oder hetero-aromatische Gruppe, welche nicht-substituiert oder substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten ausgewählt unter Niederalkyl, Halo, Halo-Niederalkyl, Halo-Niederalkoxy Niederalkenyl, Niederalkinyl, nicht-substituiertes oder Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Halo- und/oder Trifluormethyl-substituiertes Phenyl, nicht-substituiertes oder Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Halo und/oder Trifluormethyl-substituiertes Phenyl-Niederalkinyl, Hydroxy, Hydroxy-Niederalkyl, Niederalkanoyloxy-Niederalkyl, Niederalkoxy Niederalkenyloxy, Niederalkylenedioxy, Niederalkanoyloxy, Amino-, Niederalkylamino-, Niederalkanoylamino- oder N-Niederalkyl-N-Niederalkanoylamino-Niederalkoxy, nicht-substituiertes oder Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Halo- und/oder Trifluormethyl substituiertes Phenoxy, nicht-substituiertes oder Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Halo- und/oder Trifluormethyl-substituiertes Phenyl-Niederalkoxy Acyl, Carboxy, verestertes Carboxy, amidiertes Carboxy, Cyano, Carboxy-Niederalkylamino, verestertes Carboxy-Niederalkylamino, amidiertes Carboxy-Niederalkylamino, Phosphono-Niederalkylamino-verestertes Phosphono-Niederalkylamino, Nitro, Amino, Niederalkylamino, di-Niederalkylamino-acylamino, N-Acyl-N-Niederalkylamino, Phenylamino, Phenyl-Niederalkylamino, Cycloalkyl-Niederalkylamino oder Heteroaryl-Niederalkylamino, welche jeweils sein können: nicht-substituiertes oder Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Halo- und/oder Trifluormethyl-substituert; deren N-Oxide und deren pharmazeutisch verträgliche Salze.
In bestimmten Ausführungsformen, wie in der WO 01/66113 und WO 00/20001 offenbart, weisen diese Verbindungen die folgende Formel auf
worin:
R1 ist: Wasserstoff, (C_1-4)Alkyl, (C_1-4)Alkoxy, Cyano, Ethinyl oder di(C_1-4)Alkylamino,
R2 ist: Wasserstoff, Hydroxy, Carboxy, (C_1-4)Alkoxycarbonyl, di(C_1-4)Alkylaminomethyl, 4-(4-Fluorbenzoyl)-piperidin-1-yl-carboxy, 4-t-Butyloxycarbonyl-piperazin-1-yl-carboxy, 4-(4-Azido-2-hydroxybenzoyl)-piperazin-1-yl-carboxy, oder (4-Azido-2-hydroxy-3-iod-benzoyl)-piperazin-1-yl-carboxy,
R3 ist: Wasserstoff, (C_1-4)Alkyl, Carboxy, (C_1-4)Alkoxycarbonyl, (C_1-4)Alkylcarbamoyl, Hydroxy-(C_1-4)alkyl, Di(C_1-4)alkylaminomethyl, Morpholinocarbonyl oder 4-(4-Fluorbenzoyl)-piperazin-1-yl-Carboxy,
R4 ist: Wasserstoff, Hydroxy, Carboxy, (C_2-5)Alkanoyloxy, (C_1-4)Alkoxycarbonyl, Amino(C_1-4)alkoxy, Di(C_1-4)alkylamino(C_1-4)alkoxy, Di(C_1-4)alkylamino-(C_1-4)Alkyl oder Hydroxy-(C_1-4)alkyl, und
R5 ist eine Gruppe der Formel:
worin
Ra und Rb unabhängig sind: Wasserstoff, Halogen, Nitro, Cyano, (C_1-4)Alkyl, (C_1-4) Alkoxy, Trifluormethyl, Trifluormethoxy oder (C_2-5)Alkinyl, und
Re ist Wasserstoff, Fluor, Chlor, Brom, Hydroxy(C_1-4)Alkyl, (C_2-5)Alkanoyloxy, (C_1-4)Alkoxy, oder Cyano, und
Rd ist Wasserstoff, Halogen oder (C_1-4)Alkyl; in freier Form oder in der Form pharmazeutisch verträglicher Salze.
In bestimmten Ausführungsformen, wie in der WO 01/66113 offenbart, weisen mGluR5 Antagonisten die Strukturen der folgenden Formel auf:
worin:
R6 ist Wasserstoff, Hydroxy, oder C_1-6-Alkoxy;
R7 ist Wasserstoff, Carboxy, Tetrazolyl, -SO2H, -SO3H, -OSO3H, -CONHOH, oder P(OH)OR', -PO(OH)OR', -OP(OH)OR' oder -OPO(OH)OR', worin R' ist, Wasserstoff, C_1-6-Alkyl, C_2-6-Alkenyl, oder Aryl, C_1-6-Aryl;
R8 ist Wasserstoff, Hydroxy oder C_1-4-Alkoxy; und
R9 ist Fluor, Trifluormethyl, Nitro, C_1-6-alkyl, C_3-7-cycloalkyl, C_2-6-akenyl, C_2-6-alkinyl, C_1-6-Alkylthio, HeteroAryl, wahlweise substituiertes Aryl, wahlweise substituiertes Aryl C_1-6-Alkyl, wahlweise substituiertes Aryl C_2-6-Alkenyl, wahlweise substituiertes Aryl C_2-6-Alkynyl, wahlweise substituiertes Aryloxy, wahlweise substituiertes C_1-6-Alkoxy, wahlweise substituiertes Arylthio, wahlweise substituiertes Aryl C_1-6-Allylthio, -CONR''R''', -NR''R''', -OCONR''R''' oder -SONR''R''', worin R'' und R''' jeweils sind, Wasserstoff, C_1-6-Alkyl oder Aryl C_1-6-Alkyl, oder R'' und R''' bilden zusammen einen C_3-7-Alkylenering; oder ein Salz oder Ester davon.
Noch eine andere klasse an mGluR5 Antagonisten ist in der WO 00/63166 beschrieben.
Diese Verbindungen weisen die folgende Formel auf:
worin
R10 bezeichnet: Wasserstoff oder Niederalkyl;
R11 bezeichnet jeweils unabhängig: Wasserstoff, Niederalkyl, Niederalkoxy, Halogen oder trifluormethyl;
X bezeichnet O, S, oder zwei Wasserstoffatome, welche keine Brücke bilden;
A1/A2 bezeichnen unabhängig voneinander: Phenyl oder einen 6-gliedrigen Heterocyklus mit 1 oder 2 Stickstoffatome;
B ist eine Gruppe der Formel:
worin
R12 bezeichnet: Niederalkyl, Niederalkenyl, Niederalkinyl, Benzyl, Niederalkyl Cycloalkyl, Niederalkyl-Cyano, Niederalkyl-Pyridinyl, Niederalkyl-Niederalkoxyphenyl, Niederalkyl-phenyl (wahlweise substituiert mit Niederalkoxy), Phenyl (wahlweise substituiert mit Niederalkoxy), Niederalkyl-thienyl, Cycloalkyl, Niederalkyl-trifluormethyl, oder Niederalkyl-morpholinyl;
Y bezeichnet -O-, -S- oder einen Bindung;
Z bezeichnet -O- oder -S-; oder
B ist eine 5-gliedrige heterocyclische Gruppe der Formel:
worin
R13 und R14 unabhängig bezeichnen: Wasserstoff, Niederalkyl, Niederalkoxy Cyclohexyl, Niederalkyl-cyclohexyl oder Trifluormethyl, mit der massgabe, dass mindestens einer von R13 oder R14 Wasserstoff ist;
Sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze.
Eine weitere Klasse an mGluR1 Antagonisten ist in der WO 01/32632 beschrieben.
Diese Verbindungen weisen die folgende Formel auf:
Worin
X1 bezeichnet: O oder NH;
L bezeichnet: eine Bindung oder eine (C_1-6)-Alkylenkette wahlweise unterbrochen mit O, S, SO, SO oder NH und wahlweise substituiertes an einem Alkylene-Kohlenstoffatom mit Fluor, Hydroxy, (C_1-4)Alkoxy oder Oxo;
R1 bezeichnet ein nicht-substituierte oder substituierte carbocyclische oder heterocyclische Gruppe;
R2 bezeichnet ein Wasserstoffatom, ein Halogenatom, eine Carboxygruppe, eine Cyanogruppe, ein SCH2CN, oder eine Gruppe der Formel X2-R5 worin X2 bezeichnet: eine Bindung, O, S, SO, SO2 oder NH und R5 bezeichnet: (C_1-8)Alkyl, (C_3-10)Cycloalkyl, Halo(C_1-6)alkyl, Hydroxy-(C_1-6)alkyl, diHydroxy(C_1-4), Alkyl, (C_1-4)Alkoxy-(C_1-4)alkyl, (C_1-4)Alkanoyl(C_1-4)alkyl, (C_1-4)Alkanoyloxy(C_1-4)alkyl, Carboxy(C_1-4)alkyl, (C_1-4)Alkylaminocarbonyl(C_1-4)alkyl, (C_1-4)Alkanoylamino, (C_1-4)Alkanoylamino(C_1-4)alkyl, (C_1-4)Alkanoylamino[(C_1-4)alkyl)]₂, (C_1-4)Alkylthio(C_1-4)Alkyl, (C_1-4)Alkylsulfinyl(C_1-4)alkyl, (C_1-4)Alkylsulfonyl(C_1-4)alkyl, (C_1-4)Alkylsulfonylamino(C_1-4)alkyl, (C_1-4)Alkylamino-sulfonyl(C_1-4)alkyl, di(C_1-4)Alkylaminophosphonyl(C_1-4)alkyl, Phenyl oder Phenyl(C_1-4)alkyl worin jede Phenylgruppe nicht-substituiert oder substituiert ist mit einem oder zwei Substituenten unabhängig ausgewählt unter einem Halogenatom, (C_1-4)Alkyl und (C_1-4)Alkoxy; und
R3 und R4 jeweils unabhängig bezeichnen: (C_1-4)Alkyl oder zusammen mit dem Kohlenstoffatom, an das sie gebunden sind, einen nicht-substituierten oder substituierten carbocyclischen oder heterocyclischn Ring bilden; oder
ein pharmazeutsch verträgliches Salz davon.
Eine weitere Klasse an mGluR5 Antagonisten ist in der WO 01/14390 beschrieben.
Diese Verbindungen weisen die folgende Formel auf:
worin,
entweder J und K zusammengenommen werden mit einem oder mehreren zusätzlichen Atomen, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: C, O, S, und N in chemisch vernünftigen Substitutionsmustern zur Bildung eines 3-7 gliedrigen, gesättigten oder ungesättigten heterocyclischen oder carbocyclischen Rings, und L ist -CH, oder
J, K, und L zusammengenommen werden mit einem oder mehreren zusätzlichen Atomen, die unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: C, O, S, und N in chemisch vernünftigen Substitutionsmustern zur Bildung einer 4-8 gliedrigen, gesättigten oder ungesättigten, mono-, bi-, oder tricyclischen, hetero- oder carbocyclischen Ringstruktur;
Z ist: eine Metal-chelierende Gruppe;
R1 und R2 unabhängig sind: Wasserstoff, C₁-C₉-Alkyl, C₂-C₉-Alkenyl, C₃-C₉-Cycloalkyl, C₅-C₇-Cycloalkenyl, oder Ar, worin jeder von Alkyl, Alkenyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, oder Ar unabhängig ist: nicht-substituiert oder substituiert mit einem oder mehreren Substituenten; und
Ar ist ein carbocyclischer oder heterocyclischer Rest, der nicht-substituiert oder substituiert ist mit einem oder mehreren Substituenten;
oder ein pharmazeutisch verträgliches Equivalent davon.
Noch eine andere Klasse von mGluR5 Antagonisten ist in der US-P-6,218,385 beschrieben. Diese Verbindungen weisen die folgende Formel auf:
R1 bezeichnet Wasserstoff, Hydroxy, Niederalkyl, Sauerstoff, Halogen, oder
-OR, -O(C₃-C₆)cycloalkyl, -O(CHR)_n-(C₃-C₆)cycloalkyl, -O(CHR)_nCN, -O(CHR)nCF3, -O(CHR)(CHR)nNR2, -O(CHR)(CHR)nOR, -O(CHR)n-Niederalkenyl, -OCF3, -OCF2-R, -OCF2-Niederalkenyl, -OCHRF, -OCHF-Niederalkenyl, -OCF2CRF2, -OCF2Br, -O(CHR)nCF2Br, -O(CHR)n-phenyl, worin die Phenylgruppe wahlweise unabhängig voneinander substituiert sein kann mit ein bis drei Niederalkyl, Niederalkoxy, Halogen, Nitro oder Cyano-Gruppen,
-O(CHR)(CHR)n-Morpholino, -O(CHR)(CHR)n-Pyrrolidino, -O(CHR)(CHR)n Piperidino, -O(CHR)(CHR)nImidazolo, -O(CHR)(CHR)n-Triazolo, -O(CHR)n-Pyridino, -O(CHR)(CHR)n-OSi-Niederalkyl, -O(CHR)(CHR)nOS(O)2-Niederalkyl, -(CH2)n CH=CF2, -O(CHR)n-2,2-Dimethyl-[1,3]dioxolane, -O(CHR)n-CHOR-CH2-OR, -O(CHR)n-CHOR-(CHR)n-CH2-OR oder
-SR oder -S(CHR)nCOOR, oder -NR2, -N(R)(CHR)(CHR)nOR, -N(R)(CHR)n CF3, -N(R)(CHR)(CHR)nMorpholino, -N(R)(CHR)(CHR)n-Imidazolo, -N(R)(CHR) (CHR)nPyrrolidino, -N(R)(CHR)(CHR)nPyrrolidin-2-on, -N(R)(CHR)(CHR)n Piperidino, -N(R)(CHR)(CHR)n-Triazolo, -N(R)(CHR)n-Pyridino, oder
R1 und R4 sind verbunden zu den Gruppen -(CH2)_3-5-, -(CH2)₂-N=, -CH=N-N=-, -CH=CH-N=, -NH-CH=CH- oder -NR-CH2-CH2- und bilden zusammen mit jedem N- oder C-Atom, an das sie gebunden sind, einen weitren Ring;
n is 1-6;
R bezeichnet Wasserstoff, Niederalkyl oder Niederalkenyl, unabhängig voneinander, wenn mehr als ein R vorhanden ist;
R2 bezeichnet Nitro oder Cyano;
R3 bezeichnet Wasserstoff, Niederalkyl, =O, -S, -SR, -S(O)₂-Niederalkyl, -(C₃-C₆)Cycloalkyl oder Piperazino, wahlweise substituiert mit Niederalkyl, oder
-CONR2, -(CHR)nCONR2, -(CHR)nOR, -(CH2)n-CF3, -CF3, -(CHR)nOC-(O)CF3, -(CHR)n COOR, -(CHR)n SC₆H₅, worin die Phenylgruppe wahlweise unabhängig voneinander substituiert sein kann mit einem bis drei von Niederalkyl, Niederalkoxy, Halogen, Nitro oder Cyangruppen,
-(CHR)n-1,3-dioxo-1,3-dihydro-isoindol, -(CHR)n-tetrahydro-pyran-2-yloxy oder -n-S-Niederalkyl, oder
-NR2, -NRCO-Niederalkyl, -NRCHO, -N(R)(CHR)nCN, -N(R)-(CHR)nCF3, -N(R)(CHR)(CHR)n-OR, -N(R)C(O)(CHR)n-O-Niederalkyl, -NR(CHR)n-Niederalkyl, -NR(CHR)(CHR)n-OR, -N(R)(CHR)(CHR)n-O-phenyl, worin die Phenylgruppe wahlwiese unabhängig voneinander substituiert sein kann mit einem bis drei von Niederalkyl, Niederalkoxy, Halogen, Nitro oder Cyanogruppen,
-N(R)(CHR)n-Niederalkenyl, -N(R)(CHR)(CHR)n-O-(CHR)nOR, -N(R)(CHR)n-C(O)-O-Niederalkyl, -N(R)(CHR)nC(O)NR-Niederalkyl, -N(R)(CH2)n-2,2-dimethyl-[1,3]-dioxolan, -N(R)(CHR)(CHR)n-Morpholino, -N(R)(CHR)nPyridino, -N(R)(CHR)(CHR)n-Piperidino, N(R)(CHR)(CHR)n-Pyrrolidino, -N(R)(CHR)(CHR)n-O-Pyridino, -N(R)(CHR)(CHR)n-Imidazolo, -N(R)(CHR)n-CR2-(CHR)n-OR, -N(R)(CHR)n-CR2-OR, -N(R)(CHR)n-CHOR-CH2OR, -N(R)(CHR)n-CHOR-(CHR)n-CH2OR, oder -OR, -O(CHR)nCF3, -OCF3, -O(CHR)(CHR)n-O-Phenyl, worin die Phenylgruppe wahlweise unabhängig voneinander substituiert sein kann mit einem bis drei von Niederalkyl, Niederalkoxy Halogen, Nitro oder Cyan-Gruppen,
-O(CHR)(CHR)n-O-Niederalkyl, -O(CHR)n-Pyridino oder
-O(CHR)(CHR)n-Morpholino; oder
R3 und R4 verbunden sind zu den Gruppen -(CH2)_3-5-, -(CH2)₂-N=, CH=N-N=-, -CH=CH-N=, -NH-CH=CH- oder NR-CH2-CH2- und zusammen mit einem der N- oder C-Atome, an die sie angebracht sind, einen weiteren Ring ausbilden; und
R4 bezeichnet: Wasserstoff, Niederalkyl, Niederalkenyl oder Nitro, oder
-OR, -OCF3, -OCF2-R, -OCF2-Niederalkenyl, -OCHRF, -OCHF-Niederalkenyl, -O(CHR)nCF3, oder -(CHR)nCHRF, -(CHR)nCF2 R, -(CH₂)nCF3, -(C₃-C₆)cycloalkyl, -(CHR)n(C₃-C₆)cycloalkyl, -(CHR)nCN, -(CHR)n-phenyl, worin die Phenylgruppe wahlweise unabhängig voneinander substituiert sein kann mit einem bis drei von Niederalkyl, Niederalkoxy Halogen, Nitro oder Cyan-Gruppen,
-(CHR)(CHR)nOR, -(CHR)nCHORCH2OR; -(CHR)(CHR)nNR2, -(CHR)nCOOR, -(CHR)(CHR)nOSi-Niederalkyl, -(CHR)(CHR)n-OS(O)₂Niederalkyl, -(CH2)n-CH=CF2, -CF3, -CF2-R, -CF2-Niederalkenyl, -CHRF, -CHF-Niederalkenyl, -(CHR)n-2,2-dimethyl-[1,3]dioxolane, -(CH2)n-2-Oxo-azepan-1-yl, -(CHR)(CHR)n-; orpholino, -(CHR)n-Pyridino, -(CHR)(CHR)n-Imidazolo, -(CHR)(CHR)n-Triazolo, -(CHR)(CHR)n Pyrrolidino, wahlweise substituiert mit -(CH2)nOH, -(CHR)(CHR)n-3-Hydroxy-pyrrolidin oder
-(CHR)(CHR)n-piperidino, oder -NR2, -N(R)(CHR)n-pyridino, -N(R)C(O)O-Niederalkyl, -N(CH2CF3)C(O)O-Niederalkyl, -N[C(O)O-Niederalkyl]₂, -NR-NR-C(O) O-Niederalkyl oder -N(R)(CHR)nCF3, -NRCF3, -NRCF2-R, -NRCF2-Niederalkenyl, -NRCHRF, -NRCHP-Niederalkenyl; oder nicht vorhanden ist, wenn X ist -N= oder =N-;
R5, R6 bezeichnen: Wasserstoff, Niederalkyl, Niederalkoxy, Amino, Nitro, -SO2NH2 oder Halogen; oder
R5 und R6 verbunden sind zu der Gruppe -O-CH2-O- und zusammen dem C-Atom, an das sie gebunden sind, einen weiteren 5-gliedrigen Ring bilden;
R7, R8 bezeichnen: Wasserstoff, Niederalkyl, Niederalkoxy Amino, Nitro oder Halogen;
R9, R10 bezeichnen: Wasserstoff oder Niederalkyl;
R11, R12 bezeichnen: Wasserstoff, Niederalkyl, Hydroxy, Niederalkoxy Niederalkoxycarbonyloxy oder Niederalkanoyloxy;
R13, R14 bezeichnen: Wasserstoff, Tritium oder Niederalkyl;
R15, R16 bezeichnen Wasserstoff, Tritium, Niederalkyl, Hydroxy, Niederalkoxy oder zusammen eine Oxo-Gruppe sind; oder
X bezeichnet -N=, =N-,- -N<, >C= oder =C<;
Y bezeichnet -N=, =N-, -NH-, -CH= oder =CH-; und
Die gestrichelte Linie kann eine Bindung sein, wenn R1, R3 oder R4 darstellen, ein bivalentes Atom, sowie die pharmazeutisch verträglichen Salze jeder Verbindung der vorstehenden Formel und die racemischen Gemische und wahlweise aktive Formen jeder Verbindung der vorstehenden Formel.
Noch eine weitere Klasse von mGluR5 Antagonisten sind in der WO 01/02342 und der WO 01/02340 beschrieben. Diese Verbindungen weisen jeweils die folgende Formel auf:
Stereoisomere davon, oder pharmazeutisch verträgliche Salze oder Hydrate davon, worin
R1 und R2 ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend:

1) H; oder
2) einer sauren Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carboxy, Phosphono, Phosphino, Sulfono, Sulfino, Borono, Tetrazol, Isoxazol, -(CH2)n-Carboxy, -(CH2)n-phosphono, -(CH2)n-phosphino, -(CH2)n-sulfonono-(CH2)n-sulfino, (CH2)n-borono, -(CH2)n-Tetrazol, and -(CH2)n-Isoxazol, worin n = 1,2,3,4,5, oder 6; or X ist eine saure Gruppe ausgewählt aus der Gruppe umfassend, Carboxy, Phosphono, Phosphino, Sulfono, Sulfino, Borono, Tetrazol, Isoxazol; Y ist eine basische Gruppe ausgewählt aus der Gruppe umfassend 1° amino, 2° amino, 3° amino, quaternäre Ammoniumsalze, aliphatische 1° amino, aliphatische 2° amino, aliphatische 3° amino, aliphatische quaternäre Ammoniumsalze, aromatische 1° amino, aromatische 2° amino, aromatische 3° amino, aromatische quaternäre Ammoniumsalze, Imidazol, Guanidino, Boronoamino, Allyl, Harnstoff, Thioharnstoff; m is 0, 1; R3, R4, R5, R6 sind unabhängig H, Nitro, Amino, Halogen, Tritium, Trifluormethyl, Trifluoracetyl, Sulfo, Carboxy, Carbamoyl, Sulfamoyl oder verträgliche Esters davon; oder ein Salz davon mit einer pharmazeutisch verträglichen Säure oder Base.

Weitere Klassen von mGluR5 Antagonisten sind in der WO 00/73283 and der WO 99/26927 beschrieben. Diese Verbindungen weisen die folgende Formel auf: R-[Linker]-Ar; worin
R ist, eine wahlweise substituierte geradkettige oder verzweigte Alkyl, Arylalkyl, Cycloalkyl, oder Alkylcycloalkyl-Gruppe vorzugsweise mit 5-12 Kohlenstoffatomen;
Ar ist eine wahlweise substituierte, aromatische, heteroaromatische, Arylalkyl oder Heteroaralkyl-Gruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen und bis zu 4 Heteroatomen, und [linker] ist, -(CH2)-, worin n ist 2-6, und worin bis zu 4 CH2 Gruppen unabhängig substituiert sein können mit Gruppen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₃-Alkyl, CHOH, CO, O, S, SO, SO2, N, NH, und NO. Zwei Heteroatome in dem [linker] können nicht benachbart sein ausser wenn diese Atome beide N sind (wie in -N=N-of-NH-NH-) oder N und S sind, wie in einem Sulfonamide. Two benachbarte CH2 Gruppen im [linker] können auch durch einen substituierte oder nicht-substituierte Alkene- oder Alkin-Gruppe ersetzt sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze der Verbindungen werden bereit gestellt.
Eine weitere Klasse von mGluR5 Antagonisten sind in der WO 00/69816 beschrieben.
Diese Verbindungen weisen die folgende Formel auf:
worin,
n ist 0, 1 oder 2;
X ist O, S, NH, oder NOH;
R1 und R2 sind jeweils unabhängig H, CN, COOR, CONHR, C₁-C₆-Alkyl, Tetrazol, oder
R1 und R2 stellen zusammen dar, "=O";
R ist H oder C₁-C₆-Alkyl;
R3 ist C₁-C₆-Alkyl, C₂-C₆-Alkenyl, C₃-C₆-Cycloalkyl, -CH2-OH, -CH2-O-alkyl, -COOH;
Ar ist eine nicht-substituierte oder substituierte aromatische oder hetero-aromatische Gruppe;
Z bezeichnet ein Gruppe der Formel:
worin,
R4 and R5 jeweils unabhängig sind, H, Halogen, C₁-C₆-Alkoxy, -OAr, C₁-C₆-Alkyl, CF3, COOR, CONHR, -CON, -OH, -COR, -S-(C₁-C₆-alkyl), -SO2(C₁-C₆-alkyl);
A ist CH2, O, NH, NR, S, SO, SO2, CH2-CH2, CH2-O, CHOR, C(O); worin R wie vorstehend definiert ist;
B ist CHR, CR2, C₁-C₆-Alkyl, C(O), -CHOH, -CH2-O, -CH=CH, CH2-C(O), CH2-S, CH2-S(O), CH2-SO2; -CHCO2R; or-CH-NR2, worin R wie vorstehend definiert ist;
Het ist ein Heterocyclus, wie Furan, Thiophen, oder Pyridin;
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon.
Noch eine weitere Klasse an mGluR1 Antagonisten ist in der WO 00/26199 und der WO 00/26198 beschrieben. Diese Verbindungen weisen die folgende Formel auf:
worin
R1, R2 und R3 unabhängig sind, Wasserstoff, (C₁-C₆)Alkyl, (C₂-C₆)Alkenyl, (C₃-C₁₀)Cycloalkyl, nicht-substituiertes oder substituiertes Aryl, nicht-substituiertes oder substituiertes Aryl(C₁-C₆)Alkyl, nicht-substituiertes oder substituiertes Aryl(C₂-C₆)Alkenyl, Halo, Carboxy, (C₁-C₆)Alkoxycarbonyl oder -(CH2), n-OH, worin m is 1,2 oder 3;
= bezeichnet eine Einzel- oder Doppelbindung;
X und Y sind jeweils unabhängig Wasserstoff, oder X und Y sind zusammen eine Brücke der Formel -(CH2)n-, worin n ist 1 oder 2;
A1 und A2 sind jeweils unabhängig ein nicht-substituiertes oder substituiertes Aryl;
Z ist -CO-, -SO2- oder -CH2-; mit der massgabe, dass wenn Z ist -CO-, A1 ist nicht 3,4,5-Trimethoxyphenyl;
oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz oder Ester davon.
Eine weitere Klasse von mGluR5 Antagonisten ist in der WO 99/54280 beschrieben.
Diese Verbindungen weisen die folgende Formel auf:
worin,
R1 sein kann, eine saure Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carboxy, Phosphono, Phosphino, Sulfono, Sulfino, Borono, Tetrazol, Isoxazol, -CH2-Carboxy, -CHPhosphono, -CH2-Phosphino, -CH2-Sulfono, -CH2-Sulfino, -CH2-Borono, -CH2-Tetrazol, -CH2-Isoxazol und höheren Homologen davon,
R2 kann sein, eine basische Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1° amino, 2° amino, 3° amino, quaternären Ammoniumsalzen, aliphatischen 1° amino, aliphatischen 2° amino, aliphatischen 3° amino, aliphatischen quaternären Ammoniumsalzen, aromatischen 1° amino, aromatischen 2° amino, aromatischen 3° amino, aromatischen quaternären Ammoniumsalzen, Imidazol, Guanidino, Boronoamino, Allyl, Harnstoff, Thioharnstoff;
R3 kann sein, H, aliphatisch, aromatisch oder heterocyclisch;
R4 kann sein eine saure Gruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carboxy, Phosphono, Phosphino, Sulfono, Sulfino, Borono, Tetrazol, Isoxazol; Stereoisomeren davon; und pharmazeutisch verträglichen Salze davon.
Noch eine weitere Klasse von mGluR5 Antagonisten ist in der WO 99/08678 beschrieben. Diese Verbindungen weisen die folgende Formel auf:
Worin
R bezeichnet, Halogen oder Niederalkyl;
n bezeichnet 0-3;
R1 bezeichnet Niederalkyl; Cycloalkyl; Benzyl wahlweise substituiert mit Hydroxy, Halogen, Niederalkoxy oder Niederalkyl; Benzoyl, wahlweise substituiert mit Amino, Niederalkylamino oder di-Niederalkylamino; Acetyl oder Cycloalkyl-carbonyl; und
bezeichnet einen aromatischen 5-gliedrigen Rest, der über ein N-Atom gebunden ist und der weiter 1-3 N-Atome enthält, zusätzlich zu dem Verbindungs N-Atom, sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze.
Bevorzugte Antagonisten sind jene, die eine Reduzierung der Aktivierung durch den Liganden von mindestens 10%, und mehr herbeiführen, vorzugsweise mindestens 20%, mindestens 30%, mindestens 40%, mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80%, mindestens 90%, mindestens 95%, oder sogar mindestens 99% bei einer Konzentration des Antagonisten von beispielsweise 1 μg/mL, 10 µg/mL, 100 µg/ml, 500 µg/ml, 1 mg/ml, 10 mg/ml, oder 100 mg/ml. Der Prozentsatz des Antagonisten bezeichnet die prozentuale Abnahme der Aktivität von mGluR, beispielsweise mGluR5, in einem Vergleichs-Assay in Anwesenheit und Abwesenheit des Antagonisten. Jede Kombination der vorstehend aufgeführten prozentualen Antagonismus und Konzentration des Antagonisten kann dazu verwendet werden einen erfindungsgemäßen Antagonisten zu definieren, wobei größerer Antagonismus und geringere Konzentrationen bevorzugt sind.
Ein Antagonist zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann ein relativ nicht spezifischer Antagonist sein, der ein Antagonist von mGluR im allgemeinen ist. Ein Antagonist wirkt jedoch vorzugsweise selektiv gegen mGluRs der Gruppe I. Ein in der Erfindung eingesetzter Antagonist ist mehr bevorzugt ein selektiver Antagonist von mGluR5. Ein selektiver Antagonist von mGluR5 ist ein Antagonist, der gegen mGluR5 antagonistisch wirkt, gegen andere mGluRs jedoch nur schwach oder im Wesentlichen überhaupt nicht, oder gegen andere mGluRs mindestens mit einer EC₅₀ von mindestens 10 oder sogar 100 oder 1000 mal größer als die EC₅₀, bei der gegen mGluR5 antagonistisch wirkt. Die am meisten bevorzugten Antagonisten sind solche, die gegen mGluR5 bei niedrigen Konzentrationen selektiv antagonistisch wirken, beispielsweise jene, die bei einer Konzentration von 100 µg/ml oder weniger einen Grad an Antagonismus von 50% oder mehr bewirken.
Die in der Erfindung nützlichen Verbindungen, insbesondere Banken von Varianten mit verschiedenen repräsentativen Klassen von Substituenten, sind für eine Kombinationschemie und andere parallel verlaufende Synthese-Schemata geeignet (siehe beispielsweise PCT WO 94/08051). Das Ergebnis ist, dass große Banken verwandter Verbindungen, beispielsweise eine variierte Bank mit möglichen mGluR-Antagonisten, schnell in Hochdurchsatz-Assays durchmustert werden können, um mögliche Leader-Verbindungen zu identifizieren, sowie um die Spezifität, die Toxizität und/oder das cytotoxisch-kinetische Profil der Leader-Verbindung zu verbessern.
Einfach zur Erläuterung, eine Kombinations-Bank (combinatorial library) für die Zwecke der erfindungsgemäßen Verwendung ist ein Gemisch von Verbindungen, das zusammen für eine bestimmte Eigenschaft durchmustert werden kann. Die Herstellung vieler verwandter Verbindungen in einer einzigen Reaktion reduziert und vereinfacht die Anzahl an Durchmusterungsprozesse, die durchgeführt werden müssen, nachhaltig. Eine Durchmusterung nach geeigneten körperlichen Eigenschaften kann gemäß herkömmlicher Verfahren erfolgen.
Die Diversität in der Bank (library) kann an einer Vielzahl von Stellen erfolgen. So können beispielsweise die in den kombinatorischen Reaktionen verwendete Substrat-Arylgruppen hinsichtlich der Kern-Arylgruppe verschieden sine, beispielsweise eine Variation hinsichtlich der Ring-Struktur und/oder kann hinsichtlich anderer Substituenten variiert sein.
Im Stand der Technik sind mehrere Techniken verfügbar, um kombinatorische Banken organischer Moleküle herzustellen, wie die betreffenden Antagonisten. Siehe beispielsweise Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14:83; the Affymax U. S. Patents 5,359,115 und 5,362,899: das Ellman U. S. Patent 5,288,514: die Still et al. PCT Veröffentlichung WO 94/08051; Chen et al. (1994) JACS 116:2661: Kerr et al. (1993) JACS 115:252; PCT Veröffentlichungen WO 92/10092, WO 93/09668 and WO 91/07087; und die Lerner et al. PCT-Veröffentlichung WO 93/20242). Eine Vielzahl von Banken mit Diversomeren der betreffenden Antagonisten in der Grössenordnung von 100 bis 1.000.000 oder mehr können daher hergestellt und auf eine bestimmte Aktivität oder Eigenschaft durchmustert werden.
Eine Sammlung bzw. Bibliothek von Kandidaten Antagonist Diversomeren kann unter Einsatz eines Schemas synthetisiert werden, das an die Techniken angepasst ist, welche in der PCT Veröffentlichung WO 94/08051 von Still et al. beschrieben sind, beispielsweise ein Vernetzen an ein Polymerkügelchen durch eine hydrolysierbare oder photolysierbare Gruppe, die beispielsweise auf einer der Positionen der Kandidaten Antagonisten oder einem Substituenten einer synthetischen Zwischenverbindung lokalisiert ist. Die Sammlung wird gemäß der Technik nach Still et al. auf einem Satz Kügelchen synthetisiert, wobei jedes Kügelchen einen Satz Marker umfasst, der das bestimmte Diversomer auf dem Kügelchen identifiziert. Die Diversomere können von dem Kügelchen beispielsweise durch Hydrolyse freigesetzt und auf Aktivität getestet werden.
A) Direkte Charakterisierung
Im Gebiet der kombinatorischen Chemie ist ein wachsender Trend die Empfindlichkeit von Techniken wie Massenspektrometrie (MS) auszunutzen, die beispielsweise eingesetzt werden können, um sub-femtomolare Mengen einer Verbindung zu charakterisieren und direkt den chemischen Aufbau einer Verbindung zu bestimmen, die aus einer kombinatorischen Sammlung ausgewählt ist. Ist die Sammlung beispielsweise auf einer unlöslichen Trägermatrix bereitgestellt, können von dem Träger zunächst diskrete Populationen einer Verbindung freigesetzt und durch MS charakterisiert werden. In anderen Ausführungsformen können als Teil der MS-Probenherstellungstechnik, solche MS-Techniken wie MALDI verwendet werden, um eine Verbindung von der Matrix freizusetzen, insbesondere, wenn ursprünglich eine labile Bindung verwendet wird, um die Verbindung an die Matrix zu binden. So kann beispielsweise ein aus einer Sammlung ausgewähltes Kügelchen in einem MALDI-Schritt bestrahlt werden, um das Diversomer von der Matrix freizu setzen und das Diversomer für die MS-Analyse zu ionisieren.
B) Multipin-Synthese
Sammlungen können das Multipin-Sammlungsformat annehmen. In Kürze, Geysen und Mitarbeiter (Geysen et al. (1984) PNAS 81:3998-4002) haben ein Verfahren zum Erzeugen von Verbindungssammlungen durch parallele Synthese auf mit Polyacrylsäure geriebenen Polyethylen-Pins eingeführt, die in dem Mikrotiterplatten-Format angeordnet sind. Die Geysen-Technik kann verwendet werden, um unter Verwendung des Multipin-Verfahrens Tausende von Verbindungen pro Woche zu synthetisieren und zu überprüfen, wobei die gebundenen Verbindungen in vielen Assays wieder verwendet werden können. An die Pins können ebenfalls geeignete Linkerreste angefügt werden, so dass die Verbindungen nach Synthese von den Trägern abgespalten werden können, um die Reinheit zu beurteilen und für weitere Auswertungen (vergleiche Bray et al. (1990) Tetrahedron Lett 31:5811-5814; Valerio et al. (1991) Anal Biochem 197:168-177; Bray et al. (1991) Tetrahedron Lett 32:6163-6166).
C) Teile-Kopple-Rekombiniere
Auf einem Satz an Kügelchen kann durch Verwendung der Strategie von Teile-Kopple-Rekombiniere eine vielfältige Sammlung an Verbindungen bereitgestellt werden (siehe beispielsweise Houghten; PNAS; 82 (1985); 5131-5135; und US-Patente 4,613,211; 5,440,016; 5,480,971). In Kürze, wie der Name beinhaltet, werden bei jedem Syntheseschritt, an dem eine Degeneration in die Sammlung eingeführt wird, die Kügelchen in getrennte Gruppen geteilt, die der Anzahl an verschiedenen Substituenten entspricht, die an einer bestimmten Position in die Sammlung eingefügt werden soll, die verschiedenen Substituenten koppeln in getrennten Reaktionen, und die Kügelchen werden für den nächsten Schritt wieder in einem Pool vereinigt.
Die Teile-Kopple-Rekombiniere-Strategie kann unter Verwendung eines analogen Ansatzes zum sogenannten "Teebeutel"-Verfahren durchgeführt werden, das zuerst von Houghten entwickelt wurde, bei dem eine Verbindungssynthese auf Harz erfolgt, das in porösen Polypropylenbeuteln eingeschlossen ist (Houghten et al.; PNAS; 82 (1986); 5131-5135). Es werden Substituenten an die Verbindungstragenden Harze durch Platzieren der Beutel in geeigneten Reaktionslösungen gekoppelt, während alle gemeinsamen Schritte, wie ein Waschen des Harzes und ein Entfernen eines Schutzes gemeinsam in einem Reaktions gefäß durchgeführt werden. Am Ende der Synthese enthält jeder Beutel eine einzelne Verbindung.
D) Kombinatorische Sammlungen durch Lichtgesteuerte, räumlich adressierbare parallele chemische Synthese
Ein Schema einer kombinatorischen Synthese bei der die Identität einer Verbindung durch ihre Orte auf einem Synthesesubstrat gegeben ist, wird als räumlich adressierbare Synthese bezeichnet. Der kombinatorische Prozess kann durch Steuern der Zugabe eines chemischen Reagenz auf bestimmte Orte auf einem festen Träger durchgeführt werden (Dower et al.; Annu Rep Med Chem; 26 (1991); 271-280; Fodor, S.P.A.; Science; 251 (1991) 767; Pirrung et al. (1992); U.S.-Patent Nr. 5,143,854; Jacobs et al.; Trends Biotechnol; 12 (1994); 19-26). Die räumliche Auflösung einer Photolithographie ermöglicht eine Verkleinerung. Diese Technik kann durch die Verwendung von schützenden/entschützenden Reaktionen mit photolabilen Schutzgruppen durchgeführt werden.
Die Schlüsselpunkte dieser Technologie sind in Gallop et al.; J Med Chem; 37 (1994); 1233-1251 dargestellt. Es wird eine Synthesesubstrat zum Koppeln durch die kovalente Anfügung eines photolabilen Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC)-geschützten Aminolinkers oder anderen photolabilen Linkers hergestellt. Licht wird verwendet, um einen bestimmten Bereich des Syntheseträgers zum Koppeln zu aktivieren. Entfernen der photolabilen Schutzgruppen durch Licht (entschützen) führt zu einer Aktivierung eines bestimmten Gebiets. Nach Aktivierung wird ein erster Satz an Aminosäureanalogen, wobei jedes eine photolabile Schutzgruppe am N-Terminus trägt, der gesamten Oberfläche ausgesetzt. Ein Koppeln erfolgt lediglich in Bereichen, die in dem vorhergehenden Schritt durch Licht angesprochen wurden. Die Reaktion wird gestoppt, die Platte gewaschen, und das Substrat wird wiederum durch eine zweite Maske beleuchtet, wobei ein anderer Bereich zur Reaktion mit einem zweiten geschützten Baublock aktiviert wird. Das Muster an Masken und die Abfolge an Reaktanden definiert die Produkte und ihre Orte. Da dieser Prozess Photolithographie-Techniken verwendet, ist die Anzahl an Verbindungen, die synthetisiert werden können, lediglich durch die Anzahl an Synthesestellen, die mit einer geeigneten Auflösung angesprochen werden können, begrenzt. Die Position jeder Verbindung ist genau bekannt; deshalb können ihre Wechselwirkungen mit anderen Molekülen direkt beurteilt werden.
In einer lichtgesteuerten chemischen Synthese hängen die Produkte von den Mustern einer Beleuchtung und von der Reihenfolge einer Zugabe von Reaktanden ab. Durch Variieren der lithographischen Muster können gleichzeitig viele verschiedene Sätze von Testverbindungen synthetisiert werden; wobei diese Eigenheit zur Erzeugung von vielen verschiedenen Maskierungsstrategien führt.
E) Kodierte kombinatorische Sammlungen
Dieses Verfahren nutzt eine Verbindungssammlung, die mit einem kodierten Markierungssystem bereitgestellt ist. Eine kürzliche Verbesserung in der Identifizierung von aktiven Verbindungen aus kombinatorischen Sammlungen nutzt chemische Indizierungssysteme, die Markierungen bzw. Identifizierungen verwenden, welche die Reaktionsschritte, denen ein bestimmtes Kügelchen unterworfen worden ist, und durch Rückschluss die Struktur, die es trägt, einzigartig kodiert. Vom Konzept her ahmt dieser Ansatz Phagen-Display-Sammlungen nach, bei denen eine Aktivität von exprimierten Peptiden herrührt, wobei die Struktur des aktiven Peptids jedoch von der entsprechenden genomischen DNA-Sequenz abgeleitet ist. Das erste Kodieren synthetischer kombinatorischer Sammlungen nutzt DNA als den Code. Es wurde eine Vielzahl anderer Formen eines Kodierens, umfassend ein Kodieren mit sequenzierbaren Bio-Oligomeren (beispielsweise Oligonukleotiden und Peptiden) sowie binäres Kodieren mit zusätzlichen nicht sequenzierbaren Markierungen berichtet.
1) Markieren mit sequenzierbaren Bio-Oligomeren
Das Prinzip Oligonukleotide zum Kodieren kombinatorischer synthetischer Sammlungen zu verwenden wurde 1992 beschrieben (Brenner et al.; PNAS; 89 (1992); 5381-5383), wobei ein Beispiel einer derartigen Sammlung im folgenden Jahr erschienen ist (Needles et al.; PNAS; 90 (1993); 10700-10704). Es wurde eine kombinatorische Sammlung von nominell 7⁷ (= 823.543) Peptiden, die aus allen Kombinationen von Arg, Gln, Phe, Lys, Val, D-Val und Thr (Drei-Buchstaben-Aminosäurecode) zusammengesetzt ist, wobei jedes durch ein spezifisches Dinukleotid (TA, TC, CT, AT, TT, CA bzw. AC) kodiert wurde, durch eine Serie von abwechselnden Runden aus Peptid- und Oligonukleotidsynthese auf einem festen Träger hergestellt. In dieser Arbeit wurde die Amen-Verbindende Funktionalität auf dem Kügelchen speziell in Richtung Peptid- oder Oligonukleotidsynthese differenziert durch gleichzeitiges Vorinkubieren der Kügelchen mit Reagenzien, die geschützte OH-Gruppen für eine Oligonukleotidsynthese und geschützte NH₂-Gruppen für eine Peptid synthese erzeugen (hier in einem Verhältnis von 1:20). Am Ende umfassen die Markierungen jeweils 69-mere, wobei 14 Einheiten von diesen im Code getragen sind. Die Kügelchengebundene Sammlung wurde mit einem Fluoreszenz-markierten Antikörper inkubiert, und es wurden gebundenen Antikörper enthaltende Kügelchen, welche stark fluoreszierten durch Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren (FACS) geerntet. Die DNA-Markierungen wurden durch PCR vervielfältigt und sequenziert, und es wurden die vorhergesagten Peptide synthetisiert. Gemäß derartiger Techniken können Verbindungssammlungen zur Verwendung in dem beanspruchten Verfahren erlangt werden, bei denen die Oligonukleotidsequenz der Markierung die sequenziellen kombinatorischen Reaktionen identifiziert, denen ein bestimmtes Kügelchen unterzogen wurde, und damit die Identität der Verbindung auf dem Kügelchen bereitstellt.
Die Verwendung von Oligonukleotidmarkierungen erlaubt eine höchst empfindliche Markierungsanalyse. Trotzdem benötigt das Verfahren eine sorgfältige Wahl von orthogonalen Sätzen von Schutzgruppen, welche für eine abwechselnde Co-Synthese der Markierung und des Sammlungsmitglieds benötigt werden. Weiterhin kann die chemische Labilität der Markierung, insbesondere die Phosphat- und Zuckeranomeren Verbindungen, die Wahl von Reagenzien und Bedingungen beschränken, die für die Synthese von Nicht-Oligonukleotid-Sammlungen genutzt werden können. In bevorzugten Ausführungsformen nutzten die Sammlungen Linker, welche ein selektives Entfernen des Testverbindungssammlungsmitglieds für einen Assay ermöglichen.
Es wurden auch Peptide als markierende Moleküle für kombinatorische Sammlungen genutzt. Zwei beispielhafte Ansätze sind im Stand der Technik beschrieben, wobei beide von ihnen verzweigte Linker auf einer festen Phase nutzt, an der kodierende und Ligandenstränge abwechselnd ausgearbeitet werden. In dem ersten Ansatz (Kerr et al. (1993) JACS 115:2529-2531) wird eine Orthogonalität in der Synthese dadurch erreicht, dass für den kodierenden Strang ein Säure-labiler Schutz und für den Verbindungsstrang ein Basen-labiler Schutz genutzt wird.
In einem alternativen Ansatz (Nikolaiev et al.; Pept Res; 6 (1993); 161-170) werden verzweigte Linker derart genutzt, dass sowohl die kodierende Einheit als auch die Testverbindung an dieselbe funktionelle Gruppe auf dem Harz angefügt werden können. In einer Ausführungsform kann ein spaltbarer Linker zwischen dem Verzweigungspunkt und dem Kügelchen platziert werden, so dass ein Spalten ein Molekül freisetzt, dass sowohl Code als auch die Verbindung enthält (Ptek et al.; Tetrahedron Lett; 32 (1991); 3891-3894). In einer anderen Ausführungsform kann der spaltbare Linker derart platziert sein, dass die Testverbindung selektiv von dem Kügelchen getrennt werden kann und den Code zurücklässt. Dieses letzte Konstrukt ist besonders nützlich, weil es ein Untersuchen der Testverbindung ohne mögliche Wechselwirkung mit den codierenden Gruppen ermöglicht. Beispiele einer unabhängigen Spaltung und Sequenzierung von Mitgliedern einer Peptidsammlung haben im Stand der Technik bestätigt, dass die Markierungen die Peptidstruktur genau vorhersagen können.
2) Nicht sequenzierbare Markierung: Binäres Kodieren
Eine alternative Form zum Kodieren der Sammlung von Testverbindungen nutzt einen Satz an nicht sequenzierbaren, elektrophoren Markierungsmolekülen, die als binärer Code verwendet werden (Ohlmeyer et al.; PNAS; 90 (1993); 10922-10926). Beispielhafte Markierungen sind haloaromatische Alkylether, die als ihre Trimethylsilyl-Ether in weniger als femtomolaren Mengen durch Gaschromatographie mit Elektroneneinfang (ECGC) nachgewiesen werden können. Variationen in der Länge der Alkylketten sowie der Natur und Position der aromatischen Halogenid-Substituenten ermöglicht die Synthese von mindestens 40 derartiger Markierungen, die im Prinzip 2⁴⁰ (beispielsweise bis zu 10¹²) verschiedene Moleküle kodieren können. In dem Originalbericht (Ohlmeyer et al., vorstehend aufgeführt) werden die Markierungen an ungefähr 1% der verfügbaren Amingruppen einer Peptidsammlung über einen durch Licht spaltbaren o-Nitrobenzyl-Linker gebunden. Dieser Ansatz ist bequem, wenn kombinatorische Sammlungen von Peptid-ähnlichen oder anderen Amin-enthaltenden Molekülen hergestellt werden. Jedoch wurde ein vielseitigeres System entwickelt, welches ein Kodieren von im Wesentlichen jeder Sammlung ermöglicht. Hier wird die Verbindung an den festen Träger über den durch Licht spaltbaren Linker angefügt und die Markierung wird durch einen Catecholether-Linker über eine Carbeninsertion in die Matrix der Kügelchen angefügt (Nestler et al.; J Org Chem; 59 (1994); 4723-4724). Diese orthogonale Anfügungsstrategie ermöglicht die selektive Entfernung eines Sammlungsmitglieds zur Untersuchung in Lösung und nachfolgender Entkodierung durch ECGC nach oxidativer Entfernung der Markierungssätze.
Obwohl im Stand der Technik mehrere Amid-verbundene Sammlungen ein binäres Kodieren mit den an die Amingruppen angefügten elektrophoren Markierungen nutzen, liefert ein direktes Anfügen dieser Markierungen an die Matrix der Kügelchen eine weit größere Vielseitigkeit in den Strukturen, die in kodierten kombinatorischen Sammlungen hergestellt werden kann. Auf diese Weise angefügte Markierungen und ihre Linker sind nahezu so unreaktiv wie die Matrix der Kügelchen selbst. Es wurden zwei binär kodierte kombinatorische Sammlungen berichtet, bei denen die elektrophoren Markierungen direkt an die feste Phase angefügt sind (Ohlmeyer et al.; PNAS; 92 (1995); 6027-6031) und stellen eine Anleitung zum Erzeugen der beanspruchten Verbindungssammlung bereit. Beide Sammlungen wurden konstruiert indem eine orthogonale Anfügungsstrategie verwendet wurde, bei der das Sammlungsmitglied durch einen Licht- bzw. photolabilen Linker mit dem festen Träger verbunden wurde und die Markierungen durch einen Linker angefügt wurden, der lediglich durch eine heftige Oxidation gespalten werden kann. Da die Mitglieder der Sammlung wiederkehrend teilweise von dem festen Träger photoeluiert werden können, können Mitglieder der Sammlung in mehreren Untersuchungen genutzt werden. Eine sukzessive Photoelution ermöglicht ebenfalls eine schrittweise bzw. iterative Überprüfungsstrategie mit sehr hohem Durchsatz: Erstens sind mehrere Kügelchen in 96-Well-Mikrotiterplatten platziert; Zweitens werden Verbindungen teilweise gelöst und auf Assayplatten überführt; Drittens identifiziert ein Metall-bindener Assay die aktiven Wells bzw. Bohrungen; Viertens werden die entsprechenden Kügelchen in neuen Mikrotiterplatten wieder einzeln untersucht; Fünftens werden einzelne aktive Verbindungen identifiziert, und Sechstens werden die Strukturen entschlüsselt.
B. Beispielhafte mGluR5-Antagonisten-Untersuchungen
Verfahren zum Identifizieren von mGluR-Antagonisten sind im Stand der Technik bekannt. Derartige Verfahren umfassen im Wesentlichen Bestimmen, ob ein Testagens ein mGluR5-Antagonist ist und Bestimmen, ob der so identifizierte Antagonist in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Fragilem-X-Syndrom und/oder Autismus verwendet werden kann.
Ein Beispiel für eine Untersuchung bzw. Analyse zum Bestimmen der Aktivität einer Testverbindung als ein Antagonist von mGluR5 umfasst ein Exprimieren von mGluR5 in CHO-Zellen, die mit cDNAs transformiert wurden, welche das mGluR5-Rezeptorprotein kodieren (Dagget et al.; Neuropharmacology; 34 (1995); 871). Der mGluR5 wird dann durch die Zugabe von Quisqualat und/oder Glutamat aktiviert und kann beispielsweise beurteilt werden durch die Erfassung von: 1) Hydrolyse von Phosphoinositol (Litschig et al.; Mol. Pharmacol.; 55 (1999); 453); 2) Akkumulation von [3H] Cytidinphosphat-Diacylglycerin (Cavanni et al.; Neuropharmacology 38 (1999); A10); oder Fluoreszenznachweis von Calciumeinfluss in Zellen (Kawabata et al.; Nature; 383 (1996); 89-1; Nakahara et al.; J. Neurochemistry; 69 (1997); 1467). Die Untersuchung kann sowohl in der Gegenwart als auch in der Abwesenheit eines Testprodukts durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob die Testverbindung der Aktivität des Testprodukts entgegenwirken kann. Diese Untersuchung ist für eine Überprüfung mit hohen Durchsatz zugänglich.
GluR5-Rezeptor-Antagonisten können ebenfalls durch Bindungsstudien radioaktiv markierter Liganden an dem klonierten und exprimierten menschlichen GluR5-Rezeptor identifiziert werden (Korczak et al.; Recept. Channels; 3 (1994); 41-49), durch Gesamtzell-Klemmspannungs-elektrophysiologische Aufzeichnungen der funktionellen Aktivität an dem menschlichen GluR5-Rezeptor (Korczak et al.; Recept. Channels; 3 (1994); 41-49) und durch Gesamtzell-Klemmspannungs-elektrophysiologische Aufzeichnungen von Strömen in fein isolierten Dorsalwurzel-Ganglionneuronen der Ratte (Bleakman et al.; Mol. Pharmacol.; 49 (1996); 581-585).
Es können geeignete Kontrollexperimente durchgeführt werden. So kann beispielsweise ein vermeintlicher Antagonist von mGluR5 mit mGluR1 getestet werden, um die Spezifität des vermeintlichen Antagonisten zu testen, oder andere, mit mGluRs nicht verwandte Rezeptoren, um die Möglichkeit abzuziehen bzw. verringern, dass es ein allgemeiner Antagonist für Zellmembran-Rezeptoren ist.
Geeignete Testprodukte zum Identifizieren eines mGluR5-Antaggonisten umfassen kombinatorische Sammlungen, definierte chemische Identitäten, Peptide und Peptidnachahmer, Oligonukleotide und natürliche Produktsammlungen. Die Testprodukte können in einer anfänglichen Überprüfung von beispielsweise zehn Produkten pro Reaktion verwendet werden, und wobei die Produkte von Chargen, die einen Antagonismus zeigen, einzeln getestet werden. Weiterhin können Antikörperprodukte (beispielsweise monoklonale und polyklonale Antikörper, Einzelkettenantikörper, chimere Körper und CDR-veredelte bzw. transplantierte (CDR-grafted) Antikörper verwendet werden.
C. Pharmazeutische Herstellungen der mGluR5-Antagonisten
Die vorliegende Erfindung stellt in einem anderen Aspekt Verwendung eines mGluR5-Antagonsiten in der Herstellung pharmazeutischer Erzeugnisse bereit. Die mGluR5-Antagonisten können in geeigneter Weise zur Verabreichung mit einem biologisch annehmbaren, nicht-fiebererzeugenden und/oder sterilem Medium, wie Wasser, gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, Polyol (beispielsweise Glycerin, Propylen, Glykol, flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen) oder geeignete Gemische davon formuliert werden. Die optimale Konzentration des/der aktiven Bestandteils/Bestandteile in dem gewählten Medium kann empirisch, gemäß einem Arzneichemiker wohl bekannter Verfahren, bestimmt werden. Wie hier verwendet, umfasst "biologisch annehmbares Medium" beliebige und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien und dergleichen, die für den gewünschten Verabreichungsweg des pharmazeutischen Erzeugnisses geeignet sein können. Die Verwendung derartiger Medien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik bekannt. Ausgenommen insofern, dass ein beliebiges herkömmliches Medium oder Agens mit der Aktivität des mGluR5-Antagonisten unverträglich ist, dessen Verwendung in dem erfindungsgemäßen pharmazeutischen Erzeugnis in Erwägung gezogen ist. Geeignete Vehikel und ihre Formulierung einschließlich anderer Proteine sind beispielsweise in dem Buch Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA, 1985) beschrieben. Diese Vehikel umfassen injizierbare "Depot-Formulierungen".
Pharmazeutische Formulierungen können ebenfalls Zusammensetzungen für die Veterinärmedizin umfassen, beispielsweise pharmazeutische Erzeugnisse des mGluR5-Antagonisten, der für Verwendungen in der Veterinärmedizin, beispielsweise für die Behandlung von Nutztieren und Haustieren, beispielsweise Hunde, geeignet ist.
Methoden zum Einführen können ebenfalls durch wiederfüllbare oder biologisch abbaubare Einrichtungen bereitgestellt werden. In den letzten Jahren wurden verschiedene polymere Einrichtungen mit langsamer Freisetzung für die gesteuerte Abgabe von Arzneimitteln entwickelt und getestet. Es kann eine Vielfalt an biokompatiblen Polymeren (Hydrogele umfassend) verwendet werden, um ein Implantat für die Langzeit-Freisetzung eines mGluR5-Antagonisten an einer bestimmten Zielstelle verwendet werden.
Die pharmazeutischen Erzeugnisse können oral, parenteral, topisch oder rektal verabreicht werden. Sie werden natürlich durch Formen verabreicht, die für den gewünschten Verabreichungsweg geeignet sind. Sie können beispielsweise in Tabletten- oder Kapselform, durch Injektion, Inhalation, als Augenlotion, Salbe, Zäpfchen, Pflaster mit gesteuerter Freisetzung etc. verabreicht werden, Verabreichung durch Injektion, Infusion oder Inhalation, topisch durch Lotion oder Salbe, und rektal durch Zäpfchen. Orale und topische Verabreichungen sind bevorzugt.
Die Ausdrücke "parenterale Verabreichung" und "parenteral verabreicht" bedeutet, wie hier verwendet, Arten einer Verabreichung anders als enterale und topische Verabreichung, für gewöhnlich durch Injektion, und umfasst, ohne Beschränkung, intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle, intrathecale, intrakapsuläre, intraorbitale, intrakardiale, intradermale, intraperitoneale, transtracheale, subkutane, subcuticuläre, intraarticuläre, subkapsuläre, subarachnoidale, intraspinale und intrasternale Injektion und Infusion.
Der Ausdrücke "systemische Verabreichung", "systemisch verabreicht", "periphere Verabreichung" und "peripher verabreicht", wie hierin verwendet, betreffen die Verabreichung einer Verbindung, eines Arzneimittels oder anderen Materials anders als direkt in das zentrale Nervensystem, so dass sie/es in das System des Patienten aufgenommen wird und daher Metabolismus und anderen ähnlichen Vorgängen, beispielsweise bei subkutaner Verabreichung, unterzogen wird.
Diese Verbindungen können Menschen und anderen Tieren für eine Therapie durch irgendeinen geeigneten Verabreichungsweg, einschließlich oral, nasal, wie beispielsweise durch ein Spray, rektal, intravaginal, parenteral, intracisternal und topisch, wie durch Pulver, Salben oder Tropfen, einschließlich buccal und sublingual, verabreicht werden.
Ungeachtet des ausgewählten Verabreichungswegs sind die Verbindungen, die in einer geeigneten hydrierten Form eingesetzt werden können, und/oder die pharmazeutischen Zusammensetzungen in pharmazeutische verträgliche Dosierungsformen derart wie nachstehend beschrieben oder durch andere herkömmliche dem Fachmann bekannte Verfahren formuliert.
Effektive Dosierniveaus der wirksamen Bestandteile in den pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung können verändert werden, um so eine Menge des wirksamen Bestandteils, die für ein Erreichen der erwünschten therapeutischen Antwort für einen bestimmten Patienten wirksam ist, Zusammensetzung und Art der Verabreichung zu erhalten ohne für den Patienten toxisch zu sein.
Das ausgewählte Dosierniveau wird von einer Vielzahl von Faktoren einschließlich der Wirksamkeit der angewendeten bestimmten Verbindung der vorliegenden Erfindung oder dem Ester, Salz oder Amid davon, dem Weg der Verabreichung, dem Zeitpunkt der Verabreichung, der Ausscheidungsrate der angewendeten bestimmten Verbindung, der Dauer der Behandlung, anderen Arzneimitteln, Verbindungen und/oder Materialien, welche in Verbindung mit den angewandten bestimmten Wiederaufnahme Inhibitoren eingesetzt wurden, dem Alter, Geschlecht, Gewicht, Zustand, allgemeiner Gesundheit und vorheriger medizinischer Historie des behandelten Patienten und ähnlichen Faktoren abhängen, die im medizinischen Fachgebiet wohl bekannt sind.
Ein Arzt oder Tierarzt mit gewöhnlicher Fachkenntnis kann die wirksame Menge der benötigten pharmazeutischen Verbindung einfach bestimmen und festsetzen. Der Arzt oder Tierarzt kann beispielsweise mit Dosen der erfindungsgemäßen Verbindungen in den pharmazeutischen Zusammensetzungen angewendet bei Niveaus unterhalb des benötigten anfangen, um die erwünschte therapeutische Wirkung zu erzielen und die Dosis schrittweise erhöhen bis die erwünschte Wirkung erreicht wird.
Im Allgemeinen wird eine geeignete tägliche Dosis einer Verbindung der Erfindung jene Menge der Verbindung sein, die die niedrigste wirksame Dosis ist, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen. Eine derartige wirksame Dosis wird im Allgemeinen von den Faktoren abhängen, die vorstehend beschrieben wurden. Im Allgemeinen werden intravenöse, intrazerebroventikulare und subkutane Dosen der erfindungsgemäßen Verbindungen für einen Patienten von ungefähr 0,0001 bis ungefähr 100 mg pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag reichen.
Die wirksame tägliche Dosis der aktiven Verbindung kann, falls erwünscht, als zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr Unterdosen verabreicht werden, die getrennt an geeigneten Intervallen über den Tag und wahlweise in einheitliche Dosierform verabreicht werden.
Dem Ausdruck "Behandlung" ist ebenso ein Umfassen von Prophylaxe, Therapie und Heilung zugedacht.
Der diese Behandlung empfangende Patient ist irgendein bedürftiges Tier, einschließlich Primaten, insbesondere Menschen, und andere Säuger, wie beispielsweise Pferde, Rinder, Schweine und Schafe und Geflügel und Tiere bzw. Haustiere im Allgemeinen.
Die Verbindung kann als solche oder in Beimischungen mit pharmazeutisch verträg lichen Trägern und kann ebenso in Verbindung mit anderen antimikrobiellen Agenzien, wie beispielsweise Penicillinen, Cephalosporinen, Aminoglycosiden und Glycopeptiden, verabreicht werden. Eine verbindende Therapie umfasst daher aufeinander folgende, gleichzeitige und getrennte Verabreichung der aktiven Verbindung auf einem Weg, dass die therapeutischen Wirkungen der zuerst verabreichten nicht vollständig verschwunden ist wenn die nachfolgende verabreicht wird.
Während es für eine Verbindung möglich ist alleine verabreicht zu werden, wird die Verbindung vorzugsweise als eine pharmazeutische Formulierung (Zusammensetzung) verabreicht. Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann für Verabreichung in irgendeinem bequemen Weg für einen Einsatz in Human- oder Veterinärmedizin formuliert sein.
Daher stellt eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Verwendung von einer oder mehr der vorstehend beschriebenen Verbindungen bei der Herstellung einer pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung bereit, die zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern (Additive) und/oder Verdünnungsmittel formuliert ist. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können, wie nachstehend ausführlich beschrieben, speziell für eine Verabreichung in fester oder flüssiger Form formuliert sein, einschließlich jeder die an das nachstehende angepasst sind: (1) orale Verabreichung, beispielsweise Drench (wässrige oder nicht-wässrige Lösungen oder Suspensionen), Tabletten, Bolus, Pulver, Granalien und Pasten für eine Anwendung auf der Zunge; (2) parenterale Verabreichung, beispielsweise durch subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion, wie beispielsweise eine sterile Lösung oder Suspension; (3) topische Anwendung, beispielsweise als eine Creme, Salbe oder Spray, das auf die Haut angewendet wird; oder (4) intravaginal oder intrarektal, beispielsweise als Pessar, Creme oder Schaum. In bestimmten Ausführungsformen können die betroffenen Verbindungen allerdings einfach in sterilem Wasser gelöst oder suspendiert werden.
Der Ausdruck "pharmazeutisch verträglicher Träger", wie hierin verwendet" bedeutet ein pharmazeutisch verträgliches Material, Zusammensetzung oder Vehikel, wie beispielsweise verkapselndes Material, welche in ein Tragen oder Transportieren der betroffenen Regulatoren von einem Organ oder Körperabschnitt in ein anderes Organ oder Körperabschnitt einbezogen sind. Jeder Träger muss "verträglich" im Sinne einer Kompatibilität mit den anderen Bestandteilen der Formulierung sein und den Patienten nicht verletzen. Einige Beispiele von Materialien, die als pharmazeutisch verträgliche Träger dienen können, umfassen (1) Zucker, wie beispielsweise Lactose, Glukose, und Sucrose; (2) Stärken, wie beispielsweise Weizenstärke und Kartoffelstärke; (3) Zellulose und seine Derivate, wie beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Ethylcellulose und Celluloseacetat; (4) pulverförmiges Tragacant; (5) Malz; (6) Gelatine; (7) Talk; (8) Excipienten, wie beispielsweise Kakaobutter und Suppositoriumwachse; (9) Öle, wie beispielsweise Erdnussöl, Baumwollsamenöl, Safranöl, Sesamöl, Olivenöl, Weizenöl und Sojabohnenöl; (10) Glycole, wie beispielsweise Propylenglycol; (11) Polyols, wie beispielsweise Glycerin, Sorbitol, Mannitol und Polyethylenglycol; (12) Esters wie beispielsweise Ethyloleat und Ethyllaurat; (13) Agar; (14) puffernde Agenzien, wie beispielsweise Magnesiumhydroxid und Aluminumhydroxid; (15) Algininsäure; (16) pyrogen-freies Wasser; (17) isotonische Salzlösung; (18) Ringer's Lösung; (19) Ethylalkohol; (20) Phosphatepufferlösungen; und (21) andere nicht-toxische, kompatible Substanzen, die in pharmazeutischen Formulierungen eingesetzt werden.
Wie vorstehend ausgeführt, können gewisse mGluR5 Antagonisten eine grundlegende funktionelle Gruppe enthalten, wie beispielsweise Amino oder Alkylamino, und sind daher befähigt pharmazeutisch verträgliche Salze mit pharmazeutisch verträglichen Säuren zu bilden. Der Ausdruck "pharmazeutisch verträgliche Salze" betrifft in dieser Hinsicht die relativ nicht-toxischen, anorganischen und organischen saure Additionssalze von Verbindungen der vorliegenden Erfindung. Diese Salze können während der schlussendlichen Isolierung und Reinigung der erfindungsgemäßen Verbindungen in situ hergestellt werden oder durch getrenntes zur Reaktion bringen einer gereinigten, erfindungsgemäßen Verbindung in ihrer freien Basenform mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure und Isolieren des solcherart gebildeten Salzes. Maßgebliche Salze umfassen das Hydrobromid, Hydrochlorid, Sulfat, Bisulfat, Phosphat, Nitrat, Acetat, Valerat, Oleat, Palmitat, Stearat, Laurat, Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat, Naphthylat, Mesylat, Glucoheptonat, Lactobionat, und Laurylsulfonatsalze und ähnliche. (Siehe beispielsweise Berge et al. "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci.; 66 (1977); 1-19).
Die pharmazeutisch verträglichen Salze der betroffenen Verbindungen umfassen die herkömmlichen nicht-toxischen Salze oder quaternäre Ammoniumsalze der Verbindungen, beispielsweise aus nicht-toxischen organischen oder anorganischen Säuren. Derartige herkömmliche nicht-toxische Salze umfassen jene die von anorganischen Salzen abgeleitet sind, wie beispielsweise Hydrochlorid, Hydrobromid, Schwefel-, Sulfamat, Phosphor-, Stickstoff-, und ähnliche; und die Salze die aus organischen Säuren hergestellt sind, wie beispielsweise Acetat, Propionat, Succinat, Glycolat, Stearat, Lactat, Malat, Tartrat, Citrat, Ascorbat, Palmitat, Maleat, Hdroxymaleat, Phenyllactat (Phenylacetic), Glutamat, Benzoat, Salicylat, Sulfanat, 2-Acetoxybenzoat, Fumarat, Toluolsulfonat, Methanesulfonat, Ethandisulfonat, Oxalat, Isothionat und ähnliche.
In anderen Fällen können die erfindungsgemäßen Verbindungen ein oder mehrere saure funktionelle Gruppen enthalten, so dass sie mit pharmazeutisch annehmbaren Basen pharmazeutisch annehmbare Salze bilden können. Der Begriff "pharmazeutisch annehmbare Salze" betrifft in diesen Fällen Additionssalze der erfindungsgemäßen Verbindungen mit relativ nicht-toxischen, anorganischen und organischen Basen. Diese Salze können gleichermassen in situ während der letztendlichen Isolierung und Aufreinigung der Verbindungen hergestellt werden, oder durch separates Umsetzen der gereinigten Verbindung in deren freien Säureform mit einer geeigneten Base, wie dem Hydroxid, Carbonat oder Bicarbonat eines pharmazeutisch annehmbare Metallkations, mit Ammonium, oder mit einem pharmazeutisch annehmbaren primären, sekundären oder tertiären Amin. Repräsentative Alkali- oder Erdalkali-Salze beinhalten die Lithium, Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium und Aluminiumsalze und dergleichen. Repräsentative organische Amine, die zur Bildung von Basen-Additiossalzen nützlich sind umfassen Ethylamin, Diethylamin, Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Piperazin und dergleichen (siehe beispielsweise Berge et al, supra).
Benetzungsmittel, Emulgatoren und Schmiermittel, wie Natriumlaurylsulfat und Magnesiumstearat, sowie Färbemittel, Freisetzungsmittel, Beschichtungsmittel, Süsstoffe, Aroma und Duftstoffe, Konservierungsmittel und Antioxidantien können in den Zusammensetzungen ebenfalls enthalten sein.
Beispiele für pharmazeutisch annehmbar Antioxidantien umfassen: (1) wasserlösliche Antioxidantien, wie Ascorbinsäure, Cysteinhydrochlorid, Natriumbisulfat, Natriummetabisulfat, Natriumsulfit und dergleichen; (2) öllösliche Antioxidantien, wie Ascorbylpalmitat, butyliertes Hydroxyanisol (BHA), butyliertes Hydroxytoluol (BHT), Lecithin, Propylgallat, α-Tocopherol und dergleichen; und (3) Metall-chelierende Mittel, wie Zitronensäure, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sorbitol, Weinsäure, Phosphorsäure und dergleichen.
Formulierungen umfassen solche, die geeignet sind für orale, nasale, örtliche (einschließlich bukal und sublingual), rektale, vaginale und/oder paranterale Verabreichungen. Die Formulierungen können zweckmäßigerweise in Einheitsdosisform dargeboten werden und können gemäß jedem in der Pharmazie bekannten Verfahren hergestellt werden. Die Menge an aktivem Inhaltsstoff, die mit einem Trägermaterial unter Herstellung und einer Einheitsdosisform kombiniert werden kann, variiert in Abhängigkeit von der behandelten Person, und dem bestimmten Verabreichungsweg. Die Menge an aktivem Inhaltsstoff, die mit einem Trägermaterial unter Herstellung einer Einheitsdosisform kombiniert werden kann, wird im Allgemeinen die menge der Verbindung sein, die einen therapeutischen Effekt bewirkt. Im Allgemeinen wird diese Menge bezogen auf 100% von 1% bis 99% aktiver Inhaltsstoff reichen, vorzugsweise von 5% bis 70%, am meisten bevorzugt von 10% bis 30%.
Verfahren zur Herstellung dieser Formulierungen und Zusammensetzungen beinhalten den Schritt, eine erfindungsgemäße Verbindung mit dem Träger und wahlweise einem oder mehreren Hilfs-Inhaltsstoffen zusammen zu bringen. Im Allgemeinen werden die Formulierungen hergestellt, in dem eine erfindungsgemäße Verbindung mit flüssigen Trägern einheitlich und innig zusammengebracht wird, oder mit fein verteilten festen Trägern oder beidem und anschließend, wenn erforderlich, das Produkt in eine Form gebracht wird.
Zur oralen Verabreichung geeignete Formulierungen können in Form von Kapseln, Kapseln aus Stärkemasse, Pillen, Tabletten, Bonbons (unter Verwendung einer Geschmacksbasis gewöhnlich Zucker und Akazien oder Tragakant), Pulvern, Granulaten oder als eine Lösung oder eine Suspension in einer wässrigen oder nicht wässrigen Lösung, oder als eine flüssige Öl in Wasser oder Wasser in Öl Emulsion oder als ein Elixier oder Sirup oder als Pastillen (unter Verwendung einer inerten Basis, wie Gelatine und Glycerin, oder Saccharose und Akazien) oder als Mundwasser und dergleichen vorliegen, wobei jede eine bestimmte menge der erfindungsgemäßen Verbindung als aktiver Inhaltsstoff enthält. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann darüber hinaus als ein Bolus, Elektuarium oder als Paste verabreicht werden.
In festen Dosierungsformen zur oralen Verabreichung (Kapseln, Tabletten, Pillen, Dragees, Pulver, Granulaten und dergleichen) wird der aktive Inhaltsstoff mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern vermischt, wie Natriumcitrat oder Di-calciumsulfat und/oder jedem der folgenden: (1) Füllstoffen oder Streckstoffen, wie Stärken, Lactose, Saccharose, Glucose, Mannitol und/oder Kieselsäure; (2) Bindemittel, wie beispielsweise carboxymethylcellulose, Alginate, Gelatine, Polyvenyl-Pyrrolidone, Saccharose und/oder Akazia; (3) Befeuchtungsmittel, wie Glycerin; (4) Desintegriermittel, wie Agar-Agar, Calciumcarbonat, Kartoffel- oder Tapioca-Stärke, Alginsäure, bestimmte Silicate und Natriumcarbonat; (5) Lösungsverzögerungsmittel, wie Parafin; (6) Absorptionsbeschleunigungsmittel, wie quaternare Amoniumverbindungen; (7) Benetzungsmitteln, wie beispielsweise Cetylalkohol und Glycerinmonosterat; (8) Absorptionsmitteln, wie Kaolin und Bentonit Lehmerde; (9) Benetzungsmitteln, wie Talg, Calciumstearat, Magnesiumstearat, festen Polyetyhlenglycole, Natriumlaurylsulfat, und Gemischen davon; (10) Färbemitteln. In Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen weiter Puffermittel enthalten. Feste Zusammensetzungen eines vergleichbaren Typs können auch als Füllstoffe in weichen und harten Harz gefüllten Gelatine Kapseln unter Verwendung von Excepienten wie Lactose oder Milchzuckern, sowie als hoch molekulargewichtige Polyethylenglycole und dergleichen eingesetzt werden.
Eine Tablette kann durch Kompression oder Gießen wahlweise mit einem oder mehreren Hilfs-Stoffen hergestellt werden. Gepresste Tabletten können unter Verwendung von Bindemitteln (beispielsweise Gelatine oder Hydroxypopyl-Methylcellose), Benetzungsmitteln, inerten Verdünnungsmitteln, Präservativen, Desintegriermitteln (beispielsweise Natriumstärkeglyculat oder vernetzter Natriumcarboxymethylcellulose), Oberflächen aktiven oder Dispergiermitteln hergestellt werden. Gegossenen Tabletten können durch gießen eines Gemisches der gepulverten Verbindung, welche mit einem inerten, flüssigen verdünnungsmittel befeuchtet wurden gegossen werden.
Die Tabletten und andere feste Dosierungsformen der pharmazeutischen Zusammensetzungen, wie Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können wahlweise angeritzt oder mit Beschichtungen und Umhüllungen hergestellt werden, wie enterische Beschichtungen und andere im Stand der pharmazeutischen Formulierung wohl bekannten Beschichtungen. Sie können darüber hinaus formuliert werden, um eine langsame oder gesteuerte Freisetzung des darin enthaltenen aktiven Inhaltsstoffes bereitzustellen, wobei beispielsweise Hydroxypropylmethylcellulose in unterschiedlichen Anteilen eingesetzt wird, um das gewünschte Freisetzungsprofil bereitzustellen, andere Polymermatritzen, Liposomen und/oder Mikrokügelchen. Sie können beispielsweise durch Filtration durch einen Bakterien zurückhaltenden Filter sterilisiert werden, oder durch einbringen sterilisierender Mittel in Form von sterilen festen Zusammensetzunge, welche in sterilem Wasser aufgelöst werden können, oder durch ein anderes steriles indizierbares Medium unmittelbar vor Verwendung. Diese Zusammensetzungen können darüber hinaus wahlweise deckende Mittel enthalten, und können aus einer Zusammensetzung bestehen, so dass sie den/die aktiven Inhaltsstoff(e) nur oder vorzugsweise in einem bestimmten Bereich des Gastrointestinalen Traktes wahlweise in einer verzögernden Art und Weise, freisetzen. Beispiele für aufnehmende Zusammensetzungen, welche verwendet werden können, umfassen Polymere Substanzen und Wachse. Der aktive Inhaltsstoff kann darüber hinaus in einer Mikro-verkapselten Form vorliegen, wenn geeignet mit einem oder mehreren der vorstehend aufgeführten Excepienten.
Flüssige Dosierungsformen zu oralen Verabreichung der Verbindungen umfassen, pharmazeutisch annehmbare Emulsionen, Mikroemulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere. Zusätzlich zu dem aktiven Inhaltsstoff können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünnungsmittel enthalten, welche im Stand der Technik gewöhnlich zum Einsatz kommen, wie beispielsweise Wasser oder andere Lösungsmittel Solubilisierungsmittel und Emulgatoren, wie Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglycol, 1,3-butylenglycol, Öle (insbesondere Baumwoll-, Erdnuss-, Getreide-, Keim-, Oliven-, Rizinuss- und Sesamöle), Glycerin, Tetrahydrofurylalkohol, Polyethylen Glycole und Fettsäurester von Sorbitol und Gemische davon.
Neben inerten Verdünnungsmitteln können die oralen Zusammensetzungen weiter Hilfsstoffe, wie Benetzungsmittel, emulgierende und suspendierende Mittel, Süßstoffe, Geschmacksstoffe, Färbemittel, Duftstoffe und Konservierungsmittel enthalten.
Suspensionen können neben den aktiven Verbindungen suspendierende Mittel wie beispielsweise ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbitol und Sorbitolester, Mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydoxyd, Bentonit, Agar-Agar und Tragakant und Gemische davon enthalten.
Formulierungen der pharmazeutischen Zusammensetzungen für rektale oder vaginale Verabreichungen können als Suppositorium verabreicht werden, welches durch vermischen einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Verbindungen mit einem oder mehreren geeigneten, nicht störenden Excepienten oder Trägern hergestellt werden kann, welche beispielsweise umfassen Kakaobutter, Polyethylenglycol, ein Suppositorium, ein Wachs oder ein Salicylat, welches bei Raumtemperatur fest ist, jedoch bei Körpertemperatur flüssig und daher in dem Rektum oder der Vaginalhöhle schmilzt und den aktiven Wiederaufnahme-Inhibitor freisetzt.
Formulierungen, welche zur vaginalen Verabreichung geeignet sind umfassen weiter Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Spray-Formulierungen, welche im Stand der Technik Träger zweckmäßigerweise enthalten.
Dosierungsformen für die topische oder transdermale Verabreichung einer erfindungsgemäßen Verbindung umfassen Pulver, Sprays, Salben, Pasten, Cremes, Lotionen, Gele, Lösungen, Pflaster und Inhaliermittel. Die aktive Verbindung kann unter sterilen Bedingungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und irgendeinem Konservierungsmittel, Puffer oder Treibmittel, welche erforderlich sein können gemischt werden.
Die Salben, Pasten, Cremen und Gele können neben der aktiven Verbindung Excepienten enthalten, wie tierische und pflanzliche-Fette, Öle, Wachse, Parafine, Stärke, Tragakant, Cellulose Derivate, Polyethylenglycole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxyd oder Gemische davon.
Pulver und Sprays können neben einer Verbindung Excepienten enthalten, wie Lactose, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxyd, Calciumsilicate und Polyamidpulver oder Gemische dieser Substanzen. Sprays können darüber hinaus gewöhnliche Treibmittel enthalten, wie Chlofluor, Kohlenwasserstoffe und flüchtige, nicht substituierte Kohlenwasserstoffe, wie Butan und Propan.
Transdermale Pflaster weisen den zusätzlichen Vorteil auf, eine gesteuerte Abgabe einer erfindungsgemäßen Verbindung in dem Körper bereitzustellen. Derartige Dosisformen können durch lösen oder dispergieren des Wiederaufnahme-Inhibitors in einem geeigneten Medium hergestellt werden.
Absorption-Verstärkungsmittel können darüber hinaus verwendet werden, um Flux des Wiederaufnahme-Inhibitors über die Haut zu erhöhen. Die Rate eines derartigen Fluxes kann gesteuert werden, indem entweder die Rate steuernde Membran bereitgestellt wird, oder indem die Verbindung in einer Polymermatrix oder einem Gel dispergiert wird.
Zur parentheralen Verabreichung geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen eine oder mehrere erfindungsgemäße Verbindungen zusammen mit einer oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren, isotonischen wässrigen oder nicht wässrigen Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen oder sterilen Pulvern., welche in sterilen, injizierbaren Lösungen oder Dispersionen unmittelbar vor Verwendung wiederhergestellt werden können, welche Antioxidantion, Puffer, Bakterius-Statika gelöste Stoffe enthalten können, welche die Formulierung zum Blut des beabsichtigten Rezepienten isotonisch machen, oder suspendierende oder verdickende Mittel.
Beispiele für geeignete wässrige und nicht wässrige Träger, welche in den pharmazeutischen Zusammensetzungen eingesetzt werden können, beinhalten Wasser, Ethanol, Polyole (wie Glycerin, Polyethylenglycol und dergleichen) und geeignete Gemische davon, Gemüse, Öle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Eine geeignete Fluidität kann beispielsweise die Verwendung von Beschichtungsmaterialien aufrechterhalten werden, wie Lecitin durch aufrechterhalten der erforderlichen Teilchengröße in fall von Dispersionen und durch Verwendung von Oberflächen- aktiven Flächen. Diese Zusammensetzungen können darüber hinaus Hilfsstoffe, wie Konservierungsmittel, Benetzungsmittel, Emulgatoren und Dispersionsmittel enthalten. Auswirkungen von Mikroorganismen können verhindert werden, indem unterschiedliche bakterielle und antifungizide Mittel eingeschlossen werden, beispielsweise Rabin, Chlorbutanol, Phenolsorbinsäure und dergleichen. Es kann darüber hinaus erwünscht sein, isotonische Mittel wie Zucker, Natriumchlorid und dergleichen in die Zusammensetzungen einzubringen. Darüber hinaus kann eine verlängerte Absorption der injizierbaren pharmazeutischen Form durch einbringen von Mitteln herbeigeführt werden, welche die Absorption verzögwern, wie Aluminiummonostearat und Gelatine.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, um die Auswirkung eines Arzneimittels zu verzögern, die Absorption des Arzneimittels aus subkutaner oder intramuskulärer Injektion herabzusetzen. Dies kann durch Verwendung einer flüssigen Suspension aus Kristallinen oder Morphemmaterial mit einer geringen Wasserlöslichkeit erreicht werden. Die Absorptionsrate des Arzneimittels hängt dann von deren Auflösungsrate ab, welche wiederum von der Kristallgröße und der Kristallform abhängt. Alternativ wird eine verzögerte Absorption einer parenteral verabreichten Arzneimittel-Form durch auflösen oder suspendieren des Arzneimittels in einem Öl-Träger erreicht.
Indizierbare Depotformen können durch ausbilden von Mikro-Verkapselter Matrizen der jeweiligen Verbindungen in biologisch abbaubaren Polymeren, wie Polyactid-Polyglycolid, hergestellt werden. In Abhängigkeit von dem Verhältnis des Arzneimittels zu Polymer und der Natur des bestimmten verwendeten Polymers kann die Rate der Freisetzung des Arzneimittels gesteuert werden. Beispiele anderer biologisch abbaubarer Polymere umfassen Poly(orthoester) und Poly(anhydride). Injizierbare Depot-Formulierungen können darüber hinaus durch einschließen das Arzneimittel in Liposomen oder Mikro-Emulsionen, welche mit dem Körpergewebe verträglich sind, hergestellt werden. Werden die Verbindungen als Arzneimittel an Menschen und Tiere verabreicht, dann können sie als solche verabreicht werden oder als eine pharmazeutische Zusammensetzung mit beispielsweise 0,1 bis 99,5% (mehr bevorzugt 0,5 bis 90%) an aktiven Inhaltsstoff zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Der Zusatz der aktiven Verbindung zu Tierfutter wird vorzugsweise durch herstellen eines geeigneten Futter-premixes bzw. Futtervormischung erreicht, welche die aktive Verbindung in einem wirksamen Meng enthält und Einbringen des Premixes in die vollständige Ration.
Alternativ kann ein Zwischenkonzentrat oder Nahrungsmittelergänzungsstoff mit dem aktiven Inhaltsstoff in das Futter eingemischt werden. Der Weg, auf dem derartige Futter-Premixe und vollständige Rationen hergestellt werden können und verabreicht werden, sind in Textbüchern beschrieben wie („Applied Animal Nutrition", W.H. Freedman and Co., San Francisco, USA, 1969 oder „Livestock Feeds and Feeding" O and B Bücher, Corvallis, Ore, USA 1977).
V Beispielhafte Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen
Erfindungsgemäß wird daher die Verwendung eines Antagonisten eines mGluR Gruppe I bereitgestellt wie mGluR 5, vorzugsweise eines menschlichen mGluR 5, zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung von fragilem X Syndrom und anderen Formen mentaler Retadierung, oder Autismus. In verschiedenen Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Arten der Behandlung und Prophylaxe, bei denen ein oder mehrer der entsprechenden mGluR-Antagonisten zum Einsatz kommen.
Die neuralen Mechanismen, welche der mentalen Retardation zugrunde liegen, sind im Großen und Ganzen unbekannt. Die Entdeckung der genetischen Grundlage einiger Formen von mentaler Retardation wie fragilem X Syndrom gaben eine Einsicht in die zellulären Mechanismen, welche für die kognitiven Defizite welche mit mentaler Retardation einhergehen verantwortlich sind. Fragiles X-Syndrom ist die am häufigsten vererbte Form der Retardation, und betrifft einen von 1500 Männern und eine von 2000 Frauen (de Vries, et al, 1993). Die meisten Patienten zeigen viele neurologische Defizite einschließlich moderate bis schwere mentale Retardation (IQ = 30-70), Anfälle während der Kindheit, visuelle räumliche Defekte, Lernschwierigkeiten und Eigenschaften von Autismus. Im Gegensatz zu anderen mentalen Formen der Retardation zeigen Patienten mit fragilem X-Syndrom keine größeren neuro-anatomischen Veränderungen, von denen angenommen wird, dass sie zu kognitiven Defiziten führen (Hinton, et al., 1991; Wisniewski, et al., 1991). Es gibt anstelle dessen eine Neuropathologie in kleineren Maßstab auf dem Niveau der Synapse. Kortische Neuronen von Patienten mit fragilem X-Syndrom sind durch eine reduzierte dendritische Länge und eine Anzahl irregulärer sehr langer, dünner und gewundener dendritischer Dornen gekennzeichnet, und einer Reduzierung von reifen, kurzen und stoppeligen Dornen. Diese langen dünnen Dornen ähneln nicht reifen Dornen oder dendritischen Phylopodia, welche während der Reifung der Synapse in sich entwickelten Neuronen tatsächlich vorkommen (Fiala, et al., 1998) Vergleichbare dendritische Neurologien sind mit anderen Formen mentaler Redatation wie Down's oder Rett-Syndrom assoziiert (Marin-Padilla, 1972; Kaufmann and Moser, 2000). Fehlfunktionen bei der dendritischen Entwicklung und der Funktion können daher einen gemeinsamen Mechanismus darstellen, der der mentalen Retardation zugrunde liegt.
Die molekulare Basis für fragiles X-Syndrom wurde entdeckt, als gefunden wurde, das Patienten mit fragilem X-Syndrom eine Verlängerung in dem 5' nicht translatierten Bereich des fragilen X mentalen Retardation-Gen auf (FMR1) aufweisen, was zu einer Stilllegung der Transkription (erläutert von (Imbert et al., 1998)) führt. Der Verlust des FMR1-Genproduktes, des fragilen X mentalen Retardation-Proteins (FMRP) ist daher für den fragilen X Phänotyp verantwortlich (Piaretti et al., 1991; Verheij, et al., 1993). Als Stütze für diese Hypothese wurde ein Mausmodell für fragiles X-Syndrom durch Knockout des FMR1-Gens entwickelt (Bakker and Consortium, 1994). Die FMR1-KO Maus wies viele der Symptome auf von humanen fragilem X-Syndrom auf, einschließlich Lerndefizite und Hyperaktivität (Fisch et al., 1999; Paradee et al., 1999).
Untersuchungen der normalen Funktion von FMRP zeigten, dass FMRP ein Regulator der Proteinsynthese oder mRNA-Translation ist. FMRP weist zwei RNA-Bindungsbereiche auf und assoziiert mit translatierenden Polyribosomen und eine Untergruppe von Hirn mRNAs (Khandjian et al., 1996, Tamanini et al. 1996). Eine äußerst seltene jedoch schwere Form von fragilem X-Syndrom wird durch eine Mutation einer einzigen Aminosäure (I304N) in einer der RNA Bindungsdomänen von FMRP bewirkt. Die schwere des fragilen X-Phänotyps, der bei der I304N Mutation beobachtet wird, zeigt, dass RNA-Bindung und -Assoziierung mit Polyribosomen für die Funktion von FRMP von höchster Bedeutung ist (Siomi et al., 1994). Interessanterweise ist nun bekannt, dass Polyribosome und FRMP in dendritischen Dornen vorhanden sind, wobei Synapsen die Fähigkeit haben, Protein zu synthetisieren was nahe legt das FRMP dahingehend wirkt, das es spezifisch die Proteinsynthese lokal bei den Synapsen reguliert (Stewart and Reeves, 1988; Feng et al., 1997).
Kürzlich zeigten eine Anzahl von Untersuchungen, dass die Mechanismen der Aktivität abhängigen synaptischen Stärkung und Schwächung wie Langzeitverstärkung (LTP) oder Langzeitdepression (LTD) zur Synapsenbildung und Reifung beiträgt (erläutert von Collin et al., 1997; Constantine-Paton and Cline, 1998). Sowohl als LTP als auch LTD können eine Änderung des Ausmaßes der Oberflächendicht von Neurotransmitterrezeptoren im synaptischen Bereich von Neuronmembranen widerspiegeln. So kann beispielsweise bei LTD die Oberflächenexpression von sowohl dem NMDA Rezeptor als auch dem AMPA-Rezeptor erniedrigt oder bei LTP erhöht sein. Eine Veränderung der aktivitätsabhängigen synaptischen Plastizität während der Reifung der Synapse kann daher eine zugrunde liegende Ursache der Dorn-Abnormalitäten und dem fragilen X-Phänotyp sein. Darüber hinaus wir davon ausgegangen, das andauernde Änderungen auf der Stufe der Synapse die neurale Basis von lernen und Gedächtnisbildung im Erwachsenen darstellen. Eine veränderte Aktivitätsabhängige Plastizität im reifen Hirn befallenen Patienten kann ein Faktor für die Lernschwächen sein, die bei fragilem X-Syndrom auftreten.
Autismus ist eine körperlich behindernde, neurologische Störung, welche tausende Amerikaner beeinträchtigt und eine Anzahl an Untergruppen umfasst mit verschiedenen möglichen Ursachen und nur wenig dokumentierten helfenden Behandlungen. Die Störungen des autistischen Spektrums können bei Geburt vorhanden sein oder später auftreten, beispielsweise im Alter von 2 oder 3. Es gibt keine klaren biologischen Marker für den Autismus. Eine Diagnose der Störung wird durch beobachten des Ausmaßes erstellt, mit dem das Kind dem Verhaltenssyndrom gleicht, welches durch Defizite in der Sozialisierung, Defizite in der gegenseitigen verbalen und nicht-verbalen Kommunikation zusammen mit restriktiven, wieder auftretenden oder stereotypischen Verhalten charakterisiert ist.
Eine genetische Basis von Autismus wird durch Beobachtungen nahe gelegt wie entwicklungsmäßige Anomalitäten in autistischen Patienten, erhöhtem Auftreten von Autismus in Geschwistern autistischer Patienten und einer Tendenz für beide eines Satzes monozygoter Zwillinge entweder autistisch oder nicht autistisch zu sein (auch als "Konkordanz" für eine Störung bezeichnet). In den meisten (75-80%) der autistischen Personen wird jedoch für den Autismus keine zugrunde legende Ursache aufgefunden. Kürzliche Untersuchungen zeigten Abnormalitäten, welche Neurotransmitter, einschließlich Serotonin, Norpinephrin und Histamin in einigen Fällen von Autismus beinhalteten. Andere ursächliche Faktoren können Rubella, Probleme während der Schwangerschaft, Anstrengung und Niederkunft, cytomegalische Einschlusserkrankungen, Phenylketonurie und fragiles X-Syndrom umfassen. Autistische Kinder weisen darüber hinaus ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung von Anfalls-Störungen auf, beispielsweise Epilepsie, insbesondere während deren Teen-Jahren bzw. Jugendzeit.
Eine Anzahl unterschiedlicher Behandlungen für Autismus wurde entwickelt. Viele der Behandlungen betrifft jedoch die Symptome der Erkrankung und nicht deren Ursache. So wurden beispielsweise Therapien von Psychoanalyse bis Psychopharmakologie bei der Behandlung von Autismus eingesetzt. Obwohl einige klinische Symptome durch diese Behandlungen verringert werden konnten, wurde jedoch nur eine bescheidene Verbesserung, wenn überhaupt, bei lediglich einem kleinen Teil dieser Fälle gezeigt. Nur ein kleiner Prozentsatz autistischer Personen war in der Lage, als selbständige Erwachsene zu fungieren.
Down's-Syndrom eine hauptsächliche Ursache von congenitaler mentaler Retardation ist darüber hinaus die häufigste Geburtserkrankung bei Menschen. Down's-Syndrom tritt in etwa einem von 800 Neugeborenen auf, wobei der Vorfall bei Kindern von Frauen über 35 Jahren stark zunimmt. Da es schätzungsweise 1 000 000 Amerikaner betrifft ist es die hauptsächlich genetische Ursache mentaler Retardation und mit einer kürzeren als der durchschnittlichen Lebenserwartung assoziiert. Andere Symptome sind Herz- oder Darm-Defekte, Probleme mit den Immunen und Endokrinen Systemen, grundsätzlichem Gewebe- und Skelett-Deformationen.
Über 90% der Personen mit Down's-Syndrom weisen ein zusätzliches Chromosom Nummer 21 in all deren Zellen auf, wobei jede Zelle insgesamt 47 Chromosomen anstatt der normalen 46 enthält. Aus diesem Grund ist dieser Zustand auch als „Trisomie 21" bekannt. Trisomie 21 rührt von einer fehlerhaften Chromosomen-Trennung oder einem Fehler der Chromosomen sich während entweder der Mayose- oder Mitose-Teilung zu trennen. Die meisten Personen mit Down's-Syndrom weisen Trisomie 21 auf, wobei umgekehrt Personen, welche eine Translokation unter Einschluss von Chromosom 21 aufweisen und im Mosaik sowohl trisomische und normale Zellen besitzen, die Eigenschaften des Syndroms aufweisen. Es gibt jedoch seltene Formen von Down's-Syndrom, bei denen nur ein Teil des Chromosoms 21 in dreifacher Form vorhanden ist.
Beispiele:
Die Erfindung die nun im Allgemeinen beschrieben wurde, wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verständlich, welche nur zum Zwecke der Erläuterung bestimmter Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gegeben werden und nicht zur Begrenzung der Erfindung verstanden werden soll.
Beispiel 1:
Chemische Induktion von mGluR5 und Proteinsynthese abhängige Langzeit-Depression im Hippocampusbereich CA1
a. Zusammenfassung
Kürzlich durchgeführte Arbeiten zeigten, dass spezifische Muster an synaptischer Stimulierung im bereich CA1 Langzeit-Depression (LTD) induzieren kann, welche von der Aktivierung von metabotropischen Glutamat-Rezeptoren (mGluRs) und einer schnellen Proteinsynthese abhängen. Es wird hier gezeigt, dass die gleiche Form synaptischer Modifizierung durch eine kurze Anwendung des selektiven mGluR-Agonisten (RS)-305-Di-hydroxyphenylglycin (DHPG) induziert werden kann. DHPG-LTD-1) ist eine saturierbare Form einer synaptischer Plastizität, erfordert 2) mGluR5, ist 3) mechanistisch unterschiedlich von N-methyl-D-Aspartat Rezeptor (NMDAR) abhängigen LTD und teilt 4) einen gemein samen Expressionsmechanismus mit Proteinsynthese abhängigen LTD, welcher unter Verwendung synaptischer Stimulierung hervorgerufen wird. DHPG-LTD sollte für die biochemische Analyse von mGluR5- und Proteinsynthese-abhängiger synaptischer Modifizierung nützlich sein.
b. Einführung
Homosynaptische Langzeit-Depression (LTD) ist eine bereits exprimierte Form bereits synaptischer Elastizität im Hirn. Der am Besten verstanden Typ von LTD wird im Hypocampusbereich CA1 durch niederfrequenz synaptische Stimulierung (LFS) über einen N-methyl-D-Aspartat (NMDA)-rezeptor-abhängigen Anstieg an postsynaptischen intrazellulärem CA²⁺ und der Aktivierung einer Proteinphosphatase-Kaskade (Bear and Abraham 1996) induziert. Unter den geeigneten Bedingungen kann eine pharmakologische Aktivierung von NMDA-Rezeptoren (NMDARs) weiter diesen Typ LTD induzieren. Dieser „chem-LTD" Ansatz war für die biochemische Charakterisierung des Mechanismuses nützlich, was zeigte, das beispielsweise NMDAR-abhängige LTD mit der Dephosphorylierung der GluR1 Untereinheit der postsynaptischen α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionsäure (AMPA) Rezeptor (Lee et al. 1998).
Kürzlich durchgeführte Arbeiten zeigten, dass mechanistisch unterschiedliche Typen von LTD weiter im CA1 durch andere Typen synaptischer Stimulierung induziert werden können. So induzierte beispielsweise eine bei 1Hz für 15 min. paargepulste Stimulierung (PP-LFS) LTD, welche von NMDAR sundabhängig ist und Aktivierung metabotropischer Glutamat-Rezeptoren (mGluRs) benötigt (Huber et al 2000; Kemp and Bashir 1999). Diese mGlur-abhängigen Form von LTD ist von besonderem Interesse, da sie weiter eine schnelle Translation bereits bestehender mRNA erfordert (Huber et al. 2000). Ein „chem LTD" Ansatz könnte insbesondere zur Aufklärung dieses neuen Mechanismuses nützlich sein. So zeigen tatsächlich Bericht von mehreren Gruppen, dass eine transiente Aktivierung von mGluRs der Gruppe I mit dem selektiven Agonisten (RS)-3,5-dihydroxyphenylglycin (DPHG) LTD induzieren kann (Camodeca et al 1999; Fitzjohn et al 1999; Huber et al 2000; Palmer et al 1997). Es ist jedoch klar, dass nicht alle Protokolle äquivalent sind. So sind beispielsweise einige nur unter Bedingungen bei geringen MG²⁺ wirksam und teilweise von NMDARs abhängig (Palmer et al 1997; Abel et al. 1999).
Wir charakterisieren hier ein chemisches induzierungs-chemisches Protokoll, mit dem zuverlässig Proteinsynthese abhängiges LTD hervorgerufen werden kann (Huber et al. 2000). Wir zeigen, das mGluR5 zur LTD-Induzierung erforderlich ist und liefern neuen Beweis, dass dieses chemisch induzierte LTD eine gemeinsamen saturierbaren Expressions-Mechanismus mit LTD teilt, welche unter Verwendung von PP-LFS induziert wurde. Wir antizipieren, dass das Verfahren welches hier beschrieben wird zum Verständnis nützlich sein wird, wie mGluR-Aktivierung, mRNA-Translation und die Expression von synaptischen LTD reguliert.
c. Verfahren
Alle Tiere wurden gemäß der durch das Brown Universitätsinstitut zur Tierpflege und Verwendungsausschuss anerkannten Verfahren eingesetzt. Hippocampus Schnitte wurden am postnatalen Tag 21-30 (P21-30) von Long Evans Ratten (Charles River, Cambridge, MA) und mGluR5 Knockoutmäusen (Lu et al. 1997) wie bereits beschrieben (Huber et al. 2000) hergestellt. CA3 wurde für die meisten Versuche unmittelbar nach einem Schneiden entfernt. Schnitte wurden für 1-2 h bei Raumtemperatur (Ratten) oder bei 30°C (Mäuse) in künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF wieder hergestellt, die (in mM) 124 NaCl, 5 KCl, 1,25 NaH₂PO₄, 26 NaHCO₃, 1 MgCl₂, 2 CaCl₂, und 10 Dextrose enthielt und mit 95% O₂- 5% CO₂ gesättigt ist. Zur Aufnahme wurden Schnitte in einer Submersionsaufnahmekammer platziert und ACSF von 30°C bei einer Rate von 2 ml/min perfundiert.
Synaptisch hervorgerufene Feldpotentiale (FPs) wurden vom Bereich CA1 wie vorstehend beschrieben (Huber et al. 2000) aufgenommen. Sharp-Mikroelektroden- und Ganzzell-Klemmspannungs-Aufnahmen wurden jeweils unter Einsatz von Axoclamp 2B und Axopatch 1D Verstärkern (Axon Instruments) durchgeführt. Sharpelektroden (80-120 MΩ) wurden mit 3 M K-Acetat und 10 mM KCl gefüllt und Patchpipetten (3-7 MΩ) wurden mit (in mM) 134 K-Gluconat, 6 KCl, 4 NaCl, 10 HEPES, 0,2 EGTA, 4 Mg ATP, 0,3 Tris GTP und 14 Phosphokreatin gefüllt. Der pH der inneren Lösung wurde mit KOH auf 7,25 eingestellt und die Osmolarität wurde mit H₂O oder Sucrose auf 300 mOsm eingestellt. Ausschließlich Versuche bei denen weniger als 15% Änderung beim Vorwiderstand vorlag wurden in die Analyse aufgenommen. Wellenformen wurden bei 2 kHz gefiltert und erfasst, und bei 10 kHz auf einem PC unter Einsatz der Experimenter'sWorkbench (DataWave Systems, Boulder, CO) digitalisiert.
Basislinienreaktionen wurden alle 10-30 s unter Einsatz einer Stimulationsintensität 10-30 µA; 0,2 ms) aufgenommen, was 50-60% der maximalen Reaktion ergab. Versuche in denen eine > 5% Abweichung bei der Reaktionsgrößenordnung vor dem 20 min. Basislinienzeitraum vor DHPG oder LFS vorlag, wurden von einer weiteren Analyse ausgeschlossen. Alle Versuche mit mGluR5 KO Mäusen setzten Wildtyp Littermaten als Kontrollen ein und wurden blind für den Genotyp durchgeführt und später durch Therion (Troy, NY) bestimmt. LFS bestanden aus 900 Pulsen bei 1 Hz. PP-LFS bestanden aus 900 Stimulationspaaren (50 ms Intervall zwischen den Stimuli), die bei 1 Hz abgegeben wurden. In Sättigungsversuchen wurde die Stimulusdauer von 0,2 auf 0,4 ms während PP-LFS erhöht.
Die Gruppendaten wurden wie nachstehend analysiert: 1) Die anfänglichen Steigungen der FPs und angeregten postsynaptischen Potentiale (EPSPs), oder die Amplitude der angeregten postsynaptischen Ströme (EPSCs) wurden für jeden Versuch als Prozentsätze der Präkonditionierung des DHPG Basisliniendurchschnitts ausgedrückt, 2) die Zeitskala in jedem Versuch wurde in Zeit nach dem Beginn einer Konditionierung oder DHPG umgewandelt, und 3) die zeitlich angepassten, normalisierten Daten wurden über die Versuche gemittelt und in dem Text und den Figuren als das Mittel ± SE ausgedrückt. Wesentliche Unterschiede zwischen Gruppen wurden unter Einsatz eines unabhängigen t-Tests oder ANOVA bestimmt, welche in einem 5 Min. Schnitt und 1 h nach LFS oder DHPG Anwendung durchgeführt wurde.
R,S-DHPG und D-2-Amino-5-phosphonopentansäure (D-AP5) wurden von Tocris (St. Louis, MO) erworben; alle anderen Chemikalien von Sigma Chemical (St Louis, MO). DHPG wurde als 100-facher Bestand (stock) in H₂O hergestellt, aliquotiert und bei –20°C gelagert. Frische Bestände wurden einmal pro Woche hergestellt. Ein 10-facher Bestand AP5 wurde in ACSF hergestellt und bei 4°C gelagert. Diese Bestände wurden in ACSF verdünnt, um ihre Endkonzentrationen zu erhalten. Picrotoxin wurde unmittelbar vor Verwendung in ACSF direkt gelöst.
d. Ergebnisse
Anwendung von DHPG für 5 Min. erzeugte einen akuten, dosisabhängigen Abfall von hervorgerufenen FPs (1A). Bei Konzentrationen ≥ 50 µM erholte sich das FP nach Arzneimittelauswaschung nicht vollständig. Stattdessen stabilisierten sich die synaptischen Antworten bei einem abgesenkten Niveau (50 µM : 69 ± 5%, Mittel ± SE, von prä-DHPG Basislinie; n = 11; 100 µM : 48 ± 1%; n = 4). Bei allen nachfolgenden Studien wurden 50 µM DHPG (5 Min.) eingesetzt, um zu induzieren was wir als DHPG-LTD bezeichnen. Anwendung einer anderen Gruppe 1 mGluR Agonist, Quisqualsäure (5 Min.; 5 µM) erzeugten ebenso LTD (81 ± 2%; n = 4), was bestätigt, dass die Wirkung DHPG nicht eigen ist. Zweipfadversuche (n = 4), in denen ausschließlich ein Eingang während DHPG stimuliert wurde, zeigt an, dass DHPG-LTD keine gleichzeitige synaptische Stimulation (stimuliert: 62 ± 4%; nicht stimuliert: 68 ± 5%, P > 0,2; 1B) benötigt. DHPG zeigte ebenso einen Hinweis auf Sättigung; zwei Anwendungen von 50 µM DHPG waren ausreichend, um einen maximalen Abfall (1C) zu erzeugen.
Intrazelluläre Aufnahmen bestätigten, dass das DHPG-LTD von FPs eine verringerte synaptische Übertragung wiedergibt. Sowohl Sharp Elektrodenaufnahme von EPSPs als auch Ganzzell-Klemmspannungs-Aufnahme von EPSCs (aufgenommen bei –70 mV) zeigten stabiles LTD (EPSP: 61 ± 5%; n = 6; 1D; EPSC: 69 ± 5%; n = 5; 1E). Im Gegensatz dazu lagen keine wesentlichen, lang anhaltenden Änderungen beim Membranpotential, Eingabewiderstand oder Membranerregbarkeit vor, die 1 h nach DHPG (Daten nicht gezeigt) gemessen wurde. Daher ist DHPG-LTD eine lang andauernde Änderung synaptischer Übertragung. Der kompetitive NMDAR Antagonist AP5 (50 µM) wies keine Wirkung auf die Größenordnung von DHPG-LTD auf, sofern mit ausgelassenen Kontrollschnitten (AP5: 83 ± 3%, n = 5; Kontrolle: 85 ± 3%, n = 4; P > 0,3; 2A) verglichen. Mit 5 µM Quisqualsäure induziertes LTD wurde ebenso von AP5 (79 ± 2%; n = 3) nicht beeinflusst. Daher benötigt LTD, das durch pharmakologische Aktivierung von Gruppe 1 mGluRs bei diesen Versuchsbedingungen induziert wurde, keine gleichzeitige NMDAR Aktivierung.
Um die Beteiligung von mGluR5, die Hauptgruppe 1 mGluR im Bereich CA1 pyramidaler Neuronen (Romano et al. 1995), zu bewerten, wurde DHPG-LTD bei Mäusen versucht, denen dieser Rezeptor fehlt. DHPG-LTD lag in den mGluR5 homozygoten Mutanten (98 ± 3% gemessen 1 h nach DHPG Anwendung; n = 8; 2A) nicht vor. Eine Zwischenmenge LTD wurde in heterozygoten Mutanten (84 ± 4%; n = 6) beobachtet, sofern mit Wildtyp Litermate Kontrollen (77 ± 2%; n = 9; 2B) verglichen. Eine Einweg ANOVA zeigte eine wesentliche Wirkung des Genotyps [F (2,19) = 10,33, P < 0.001] auf. Ein anschließender Tukeytest zeigte auf, dass sowohl die Wildtyp als auch Heterozygoten wesentlich von Homozygoten (P < 0,025) verschieden waren. Obgleich ein Trend für DHPG-LTD in den Heterozygoten besteht weniger als Wildtypen zu sein, ist dies nicht von Bedeutung (P = 0,5). Daher beruht DHPG-LTD strikt auf mGLuR5 und die Anwesenheit eines Allels für mGluR5 ist für eine LTD Induktion ausreichend. Im Gegensatz zu DHPG-LTD, wurden gewöhnliches mit LFS induziertes NMDAR-abhängiges LTD in den homozygoten Mutanten (87 ± 2%; n = 6; P > 0,6; 2C) im Vergleich zu dem Wildtyp Mäusen beobachtet (89 ± 5%; n = 6). Diese Ergebnisse zeigen, dass zwei verschiedene Wege einer LTD Induktion im Bereich CA1 vorliegen: einer auf NMDARs und ein anderer auf mGluR5 beruhender.
Die Ergebnisse der mGluR5 Knockouts zeigen, dass der Induktionsmechanismus von NMDAR-abhängigen LTD und DHPG-LTD verschieden sind. Der nächste Versuch wurde ausgestaltet, um zu testen ob in diesen beiden Formen von LTD ähnliche Expressionsmechanismen eingesetzt werden. Wiederholte Episoden von LFS wurden zum Sättigen NMDAR-abhängigen LTD (3A) geliefert. DHPG wurde anschließend angewendet und die Größenordnung von LTD wurde durch erneutes Normalisieren von FP Steigungswerten auf eine prä-DHPG Basislinie gemessen. Falls in NMDAR-abhängigen LTD und DHPG-LTD ein gemeinsamer Expressionsmechanismus eingesetzt wird, sollte eine vorherige Sättigung von NMDAR-abhängigem LTD DHPG-LTD verringern oder ausschließen. Allerdings unterdrückte DHPG immer noch synaptische Antworten signifikant (81 ± 5% der prä-DHPG Basislinie, n = 5; P < 0,05; 3B), was nahe legt, dass bei NMDAR-abhängigem LTD und DHPG-LTD verschiedene Expressionsmechanismen eingesetzt werden.
Der gleiche Ansatz wurde bei einer Bewertung eingesetzt, ob bei DHPG-LTD der gleiche saturierbare Expressionsmechanismus wie bei synaptisch hervorgerufenem mGluR5-abhängigen LTD verwendet wird. PP-LFS in der Anwesenheit der NMDAR Antagonisten D-AP5(50 µM) wurde eingesetzt, um mGluR-abhängiges LTD zu sättigen, wobei anschließend DHPG (50 µM) auf den Schnitt (3C) aufgegeben wurde. Im Gegensatz zum vorstehenden Ausschlussversuch, induzierte DHPG Anwendung nach Sättigung in LTD mit PP-LFS kein weiteres LTD (100 ± 5% der prä-DHPG Basislinie; n = 5; P > 0,5; 3D). Diese Ergebnisse weisen stark darauf hin, dass mit DHPG induziertes mGluR-LTD und PP-LFS gemeinsame Expressionsmechanismen teilen.
e. Diskussion
Eine Anzahl verschiedener Protokolle wurden einbezogen, um homosynaptisches LTD in CA1 (Berretta und Cherubini 1998; Camodeca et al. 1999; Dudek und Bear 1992; Fitzjohn et al. 1999; Huber et al. 2000; Kemp and Bashir 1999; Oliet et al. 1997; Overstreet et al. 1997; Palmer et al. 1997) zu induzieren. Obgleich eine Beteiligung von mGluR für viele von diesen vorgeschlagen wurde, ist die Konstellation der Erkenntnisse irreführend und nicht gänzlich mit einer einzelnen mGluR-abhängigen Form von LTD übereinstimmend. Es wurde beispielsweise berichtet, dass eine Anwendung von 100 µM DHPG für 10 Min. auf hippocampale Schnitte von Erwachsenen wenig LTD hervorruft, bis die Schnitterregbarkeit durch Entfernen von Mg²⁺ von dem extrazellulären Medium (Palmer et al. 1997; Schnabel et al. 1999) erhöht wird. Das erhaltene LTD wird durch NMDAR Antagonisten teilweise blockiert. PP-LFS kann darüber hinaus in hippocampalen Schnitten von Erwachsenen offensichtlich LTD über Aktivierung von entweder Gruppe 1 mGluRs oder Aktivierung von AMPA/Kainat Rezeptoren (Kemp und Bashir 1999) hervorrufen. Im Gegensatz dazu haben wir neuerdings gezeigt, dass in P21-30 Ratten sowohl PP-LFS als auch DHPG (50 µM, 5 Min.) LTD induzieren, was 1) von einer NMDAR Aktivierung unabhängig, 2) durch mGluR Antagonisten vollständig blockiert, und 3) von einer Übergangsphase einer mRNA Translation (Huber et al. 2000) abhängig ist. Die letztere Erkenntnis ist von besonderer Bedeutung, da dieses mGluR-LTD Modell nützlich sein sollte, um die Regulierung und Funktion dendritischer Proteinsynthese aufzuklären, die bei fragiler-X Entwicklungsverzögerung bzw. Retardation (Jin und Warren 2000) gestört sein kann.
Aufgrund der verschiedenen Wirkungen von DHPG und PP-LFS könnte angenommen werden, dass vorherige Erkenntnisse bei verschiedenen Versuchsbedingungen auf unser Modell anwendbar wären. Es war daher notwendig, die Proteinsynthese-abhängige Form von mGluR-LTD zu charakterisieren. Wir haben hierin gezeigt, dass DHPG-LTD eine saturierbare Form synaptischer Plastizität ist, dass es mGluR5 benötigt, dass es von NMDAR-abhängigen LTD mechanistisch verschieden ist und, von Bedeutung, dass es einen gemeinsamen saturierbaren Expressionsmechanismus mit dem LTD teilt, der durch einen Einsatz von PP-LFS hervorgerufen wird. Da DHPG-LTD keine gleichzeitige synaptische Stimulation benötigt, stellt es eine Form eines "chem-LTD" (Lee et al. 1998) dar, die bei biochemischen und biophysikalischen Studien von Nutzen sein sollte.
Literaturhinweis

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Camodeca N, Brealcwell NA, Rowan MJ, und Anwyl R. Induction of LTD by activation of group 1 mGluR in dentate gyrus in vitro. Neuropharmacology; 38 (1999); 1597-1606.
Dudek SM, und Bear MF. Homosynaptic long-term depression in area CA1 of hippocampus and effectsof N-methyl-D-aspartate receptor blockade. Proc Nat1 Acad Sci USA; 89 (1992); 4363-4367.
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Lu YM, Jia Z, Janus C, Henderson JT, Gerlai R, Wojtowicz JM, und Roder JC. Mice lacking metabotropic glutamate receptor 5 show impaired learning and reduced CA1 long-term potentiation (LTP) but normal CA3 LTP. J Neuroscience; 17 (1997); 5196-5205.
Oliet SH, Malenlca RC, und Nicoll RA. Two distinct forms of long-term depression coexist in CA1 hippocampul pyramidal cells. Neuron; 18 (1997) 969-982.
Overstreet LS, Pasternak JF, Colley PA, Slater NT, und Trommer BL. Metabotropic glutamate receptor mediated long-term depression in developing hippocampus. Neuropharmacology 36 (1997); 831-844, 1997.
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Beispiel 2: Internalisierung ionotrophischer Glutamatrezeptoren in Antwort auf mGluRA Aktivierung
a. Zusammenfassung
Aktivierung von Gruppe 1 metabotrophischer Glutamatrezeptoren (mGluRs) stimuliert dendritische Proteinsynthese und lang andauernde synaptische Schwächung (LTD), wobei es allerdings nicht klar verbleibt, wie diese Wirkungen zusammenhängen. Hierin stellen wir einen Hinweis bereit, dass eine Folge einer mGluR Aktivierung in dem Hippocampus der schnelle Verlust von sowohl AMPA als auch NMDA Rezeptoren von Synapsen ist. Die stabile Expression dieser Änderung erfordert, wie bei mGluR-LTD, eine Proteinsynthese. Diese Daten legen nahe, dass eine Expression von mGluR-LTD zumindest teilweise postsynaptisch ist und dass eine funktionelle Folge einer dendritischen Proteinsynthese in der Regulierung des Glutamatrezeptor-Verkehrs besteht.
b. Einführung
Zwei mechanistisch verschiedene Formen homosynaptischer lang andauernder Schwächung (LTD) koexistieren im Hippocampus. Induktion von einer Form hängt von einer Aktivierung von N-Methyl-D-aspartat Rezeptoren (NMDARs) und postsynaptischer Proteinphosphatasen ab, und eine Induktion der anderen hängt von einer Aktivierung der postsynaptischen Gruppe 1 metabotrophischen Glutamatrezeptoren (mGluRs) und der örtlichen Translation dendritischer mRNA¹ ab. Es gibt deutliche Hinweise für den Gedanken, dass NMDAR-abhängiges LTD (NMDAR-LDT) eine Folge einer verringerten synaptischen Expression von α-Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-propionat Rezeptoren (AMPARs)^2-7 ist. Wenig ist über eine Expression von mGluR-abhängigen LTD (mGluR-LTD) bekannt, obgleich ein präsynaptischer Mechanismus vorgeschlagen wurde^8,9.
Bis vor Kurzem wurde ein Fortschritt bei mGluR-LTD durch den Mangel an einem verlässlichen synaptischen Induktionsprotokoll behindert. Ein alternatives Verfahren bestand darin, Gruppe 1 mGluRs mit dem selektiven Agonisten (R,S)-3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG)^10-13 vorübergehend zu aktivieren. In hippocampalen Schnitten induziert DHPG (50 µM, 5 Min.) LTD derart, dass Proteinsynthese¹³ benötigt wird, wobei bei jener der gleiche saturierbare Expressionsmechanismus eingesetzt zu werden scheint, der mit einer gemusterten synaptischen Aktivität¹⁴ hervorgerufen wird. Wir setzten daher dieses chemische Induktionsprotokoll für hippocampale Neuronen in Kultur und bei Schnitten ein, um die Möglichkeit zu untersuchen, dass mGluR-LTD als eine Änderung bei postsynaptischer Glutamatrezeptor Expression exprimiert wird.
c. Ergebnisse
1) DHPG stimuliert eine Internalisierung von AMPARs.
Um die Wirkung einer mGluR Aktivierung auf AMPARs zu untersuchen, die auf der Oberfläche hippocampaler Neuronen exprimiert sind, setzten wir ein immunocytochemisches Färbeprotokoll³ mit sauren Streifen ein. Oberflächenrezeptoren auf lebenden kultivierten hippocampalen Neuronen wurden mit Antikörpern markiert, die gegen den extrazellulären N-Terminus der GluR1 Untereinheit gerichtet sind. Die Zellen wurden mit entweder DHPG (50 µM, 5 Min.) oder Kontrollmedium behandelt und, nach verschiedenen Zeitabständen, wurden die verbleibenden Oberflächenantikörper mit einem Waschschritt mit Essigsäure abgestreift. Die Neuronen wurden fixiert und Immunocytochemie wurde bei Membran-durchlässigen Bedingungen durchgeführt, um an internalisierte AMPARs gebundene Antikörper nachzuweisen. Alle Analysen wurden blind ohne Wissen des Versuchsdurchführenden über die Behandlungsbedingungen durchgeführt.
DHPG Anwendung für 5 Minuten stimulierte eine größer als 2-fache Zunahme bei internalisierten GluR1 Punkten, die so früh wie 15 Minuten nach Behandlungsbeginn beobachtet wurden (Punkte pro 10 µm Dendrit, Kontrolle, 0,62 ± 0,09, n = 65 Zellen; DHPG, 1,44 ± 0,17, n = 60 Zellen; p < 0,0002) und widerstanden für mindestens 1 Stunde (Kontrolle, 0,58 ± 0,08, n = 42 Zellen; DHPG, 1,14 ± 0,15, n = 38 Zellen; 4a und b). Die zugenommene Internalisierung von GluR1 war eine bestimmte Folge der aktivierenden Gruppe 1 mGluRs, wie sie durch den mGluR Antagonisten LY344545 (Ref. 15;100 µM; Kontrolle, 0,42 ± 0,10, n = 15; DHPG, 1,39 ± 0,34, n = 14; LY344545 allein, 0,32 ± 0,08, n = 13; DHPG + LY344545, 0,29 ± 0,04, n = 17; 4c) vollständig blockiert wurde. Im Gegensatz dazu wies der NMDAR Antagonist 2-Amino-5-Phosphonovaleriansäure (APV, µ50 M) keine Wirkung auf (Kontrolle, 0,74 ± 0,19, n = 7; DHPG, 1,49 ± 0,22, n = 10; DHPG + APV, 1,51 ± 0,3, n = 10).
Eine stabile Expression von mGluR-LTD benötigt dendritische Proteinsynthese¹³. Wir fanden, dass eine Vorbehandlung von Kulturen mit dem mRNA Translationsinhibitor Cycloheximid (chx,60 µM, 15 Min. vor DHPG angewendet) die DHPG-induzierte Zunahme an internalisierten mGluR1 ebenso signifikant inhibierte, die bei 60 Minuten gemessen wurden (Kontrolle, 0,85 ± 0,14, n = 24; DHPG, 1,5 ± 0,27, n = 20; DHPG + chx, 1,02 ± 0,12, n = 25, verschieden von DHPG allein bei p < 0,03, 4d). Ein mechanistisch verschiedener Proteinsyntheseinhibitor, Anisomycin, blockierte ebenso mGluR-stimulierte Endocytose (Daten nicht gezeigt). Weder Cycloheximid noch Anisomycin wiesen eine signifikante Wirkung auf Basalniveaus auf internalisierte Punkte auf (Kontrolle + chx, 0,76 ± 0,09, n = 10, 4d).
2) Oberflächen AMPARs haben die nachstehende DHPG Behandlung nicht erfahren (are lost).
Wir bestimmten anschließend, ob die DHPG-induzierte Zunahme an internalisierten AMPARs von einer Nettoabnahme an Oberflächen exprimierten Rezeptorclustern an Synapsen begleitet wird. Bei verschiedenen Zeitabständen nach DHPG Auswaschung wurden Zellen fixiert und Oberflächen GluR2 oder GluR1 wurde mit N-terminalen Antikörpern ohne Permeabilisierung markiert. Die Kulturen wurden anschließend permeabilisiert und Synapsen wurden unter Einsatz eins Antikörpers gegen präsynaptischen Marker Synapsin I oder Synaptophysin, gekoppelt an den entsprechenden sekundären Antikörper, markiert. Bei Kontrollbedingungen waren die meisten Synapsen für AMPAR Cluster immunoreaktiv (GluR2, 80,6 ± 9,0%; n = 10 Zellen, 200 Synapsen, 5a-d; GluR1, 72,5 ± 4,7%; n = 15 Zellen, 225 Synapsen; 5e und f).
Der Prozentsatz an Synapsen mit AMPAR Clustern wurde durch eine DHPG Behandlung drastisch verringert. Ausschließlich 40,8 ± 11% der Synapsen wiesen eine Oberflächenfärbung für GluR2 (n = 10 Zellen, 200 Synapsen; p < 0,03) auf, wie 1 Stunde nach Behandlung (5g-i) gemessen. Ähnliche Ergebnisse wurden in zusätzlichen Versuchen mit GluR1 (29,3 ± 5,4% GluR1-positive Synapsen 15 Min. nach DHPG Behandlung, n = 14 Zellen, 210 Synapsen; 20,0 ± 12,0% GluR1-positive Synapsen 60 Min. nach DHPG Behandlung, n = 15 Zellen, 225 Synapsen; 5j und k).
Eine Vorbehandlung der Kulturen mit Cycloheximid cycloheximide (60 µM, 15 Min. vor DHPG angewendet) inhibierte die DHPG-induzierte Abnahme bei synaptischen GluR1 Clustern, wie bei 60 Minuten bestimmt (Synapsen mit GluR1, 55,7 ± 5,1%, n = 15 Zellen, 225 Synapsen; p < 0,05 gegen DHPG allein; 5k). Die Anzahl an GluR1-positiven Synapsen nahm allerdings nach DHPG Beginn in der Anwesenheit des Inhibitors ab (Synapsen mit GluR1, 37,8 ± 3,8%, n = 15 Zellen, 225 Synapsen; 5j). Diese Erkenntnisse legen nahe, dass Proteinsynthese beim Bestimmen des Schicksals der internalisierten Rezeptoren aber nicht in die anfängliche Endocytose einbezogen ist, die durch mGluR Aktivierung stimuliert wird.
Um die Wirkung einer mGluR Aktivierung auf Oberflächen AMPARs unter Einsatz einer alternativen Annäherung zu bestätigen, behandelten wir Kulturen von hoher Dichte mit DHPG (50 µM, 5 Min.) oder Kontrollmedium, wobei Oberflächenrezeptoren 60 Minuten später mit Biotin markiert wurden. Biotinylierte Rezeptoren wurden gefällt und as Verhältnis an Oberflächen- zu Gesamt-GluR1 wurde durch quantitatives Westernblotting bestimmt. Die biochemische Analyse bestätigte, dass Oberflächen AMPARs durch eine DHPG Behandlung auf nur 56,8 ± 4,0% des Werts in Kontrollkulturen (n = 4 in jeder Behandlungsgruppe; p < 0,01; 6) verringert sind.
3) DHPG Anwendung verringert mEPSC Häufigkeit.
Die immunocytochemischen und biochemischen Versuche legen nahe, dass eine DHPG Behandlung wahrscheinlich ist eine wesentliche Wirkung auf AMPAR-vermittelte Übertragung in kultivierten Neuronen aufzuweisen. Um diese Möglichkeit direkt zu untersuchen, untersuchten wir die Wirkung von DHPG auf AMPAR-vermittelte mEPSCs. Wie für andere Handhabungen berichtet, welche eine Rezeptorinternalisierung stimulieren (siehe beispielsweise Ref. 16), beobachteten wir eine wesentliche Abnahme bei der Häufigkeit an mEPSCs. Das Intervall zwischen den Ereignissen betrug 315% der Basislinie bei 15 Min. nach DHPG Behandlung (n = 11 Zellen, p < 0,05) und 319% der Basislinie bei 60 Minuten (n = 9 Zellen, p < 0,002; 7).
Zusätzlich zu der Änderung bei der Häufigkeit, bestand ebenso ein Trend zu einer abgeschwächten mEPSC Amplitude bei 15 (94,2% Basislinie; n = 11 Zellen) und 60 (92,2% Basislinie; n = 9 Zellen; 7) Minuten folgend DHPG, wobei diese Wirkung allerdings keine statische Signifikanz erzielte. Zusammenschauend mit den Abbildungs- und biochemischen Ergebnissen besteht die geradlinigste Auslegung der mEPSC Daten darin, dass DHPG eine einzelne Population von Synapsen abdämpft bzw. ausschaltet, da sein gesamtes Komplement an AMPARs internalisiert wird.
4) Oberflächen NMDARs haben die nachstehende DHPG Behandlung nicht erfahren (are lost).
Von einer NMDAR Aktivierung wurde berichtet einen Verlust an synaptischer AMPARs zu stimulieren ohne NMDARs² zu beeinflussen. Zellen wurden mit DHPG behandelt, fixiert und mit einem N-terminalen Antikörper auf die NR1 Untereinheit des NMDAR unter nicht-permeabilisierenden Bedingungen gefärbt, um zu bestimmen, ob eine mGluR Stimulation NMDAR Cluster betrifft. Die Zellen wurden anschließend permeabilisiert und Synapsen wurden unter Einsatz eines Antikörpers gegen Synapsin I markiert. In Kontrollneuron enthielten 67 ± 4% der Synapsen (n = 20 Zellen, 300 Synapsen) NR1 immunoreaktive Punkte (8a-d und g). Folgend einer DHPG Behandlung wurde der Prozentsatz an NR1-positiven Synapsen auf 28 ± 6% bei 15 Minuten (n = 16 Zellen, 240 Synapsen, p < 0,003) und 21 ± 3% bei 60 Minuten (n = 19 Zellen, 285 Synapsen; 8e und g) verringert. Wie es bei AMPARs der Fall war, wurde die Änderung bei Oberflächen NR1 Clustern folgend DHPG bei 60 Minuten wesentlich betroffen, sofern die Kulturen mit Cycloheximid (42 ± 5% NR1-markiert bei 60 Min.; n = 20 Zellen, 300 Synapsen; p < 0,05 gegen DHPG allein; 8g) behandelt wurden.
Der Verlust an NMDARs von Synapsen folgend DHPG war überraschend. Um die Möglichkeit nicht spezifischer Änderungen in den postsynaptischen Neuronen auszuschließen, beobachteten wir Änderungen bei der Verteilung synaptischer GABA_A Rezeptoren unter Einsatz eines Antikörpers gegen den N-Terminus der β₁ Untereinheit. DHPG wies, unähnlich zu Synapsen mit Glutamatrezeptoren, keine Wirkung auf den Prozentsatz an Synapsin-markierten Punkten mit GABA_Aβ₁ Clustern auf (Kontrolle, 11,8 ± 4%, n = 10 Zellen, 150 Synapsen; 60 Min. nach DHPG Behandlung, 10,9 ± 2%, n = 10; Daten nicht gezeigt). Kulturen hoher Dichte wurden mit DHPG (50 µM, 5 Min., n = 5), DHPG + Cycloheximid (60 µM; n = 4), oder Kontrollmedium (n = 5) behandelt und Oberflächen NMDARs wurden 60 Minuten später mit Biotin markiert, um den Verlust an Oberflächen NMDARs folgend DHPG zu bestätigen. Biotinylierte Rezeptoren wurden gefällt und das Verhältnis an Oberflächen- zu Gesamt-NR1 wurde durch quantitatives Westernblotting bestimmt (8h und i). Diese Analyse bestätigte, dass Oberflächen NMDARs durch DHPG Behandlung auf 32,3 ± 8,2% des Werts in Kontrollkulturen wesentlich verringert werden und dass diese Änderung durch Cycloheximid (79,1 ± 14,5 der Kontrolle, 8i) inhibiert wird.
5) LTD von NMDAR-EPSCs.
Der Verlust an synaptischen NR1 Clustern unterscheidet eindeutig die Wirkung von DHPG von anderen Behandlungen. Welche AMPAR^2,17-19 selektiv beeinflussen. Unsere Daten legen daher nahe, dass zusätzlich zu der Schwächung der AMPAR-vermittelten synaptischen Übertragung eine Induktion von mGluR-LTD ebenso eine durch NMDARs vermittelte Übertragung betreffen sollte. Wir induzierten LTD chemisch in hippocampalen Schnitten von postnatalen Tag 21-28 (P21-28) Raten mit DPHG¹⁴ ebenso wie wir NMDAR vermittelte postsynaptische Erregungsströme (EPSCs) in CA1 Neuronen mit Klemmspannung bei +40 mV, wie vorstehend beschrieben²⁰, beobachteten, um diese Hypothese zu testen. Diese Versuche zeigten, dass eine Anwendung von DHPG (5 Min.) eine Dosisabhängige LTD von NMDAR-EPSCs erzeugte (EPSC Amplitude 30 Minuten nach DHPG Behandlung als Prozentsatz der Basislinie, 50 µM, 70,7 ± 2,9, n = 3, p < 0,05; 100 µM: 57,7 ± 1,0, n = 5; verschieden von der Basislinie bei p < 0,00005, gepaarter t-Test; 9a).
Als einen zusätzlichen Test für einen mGluR-induzierten Verlust an einer NMDAR Funktion untersuchten wir die Wirkungen von 100 µM DHPG (5 Min.) auf durch NMDA hervorgerufene Ströme, welche nahe dem proximalen Abschnitt des primären apikalen Dendriten (9b) angewandt wurde. Eine wesentliche Schwächung von NMDAR Strömen trat auf (Prozentsatz Basislinie bei 50-60 Min. nach DHPG Behandlung, DHPG, 61,1 ± 12,0, n = 7; Kontrolle, 97,3 ± 9.4; n = 7; p < 0,05); wobei der zeitliche Verlauf dies Änderung allerdings viel geringer ausfiel als für synaptisch hervorgerufene EPSCs beobachtet. Die NMDA-hervorgerufenen Ströme potenzierten sich vorübergehend (wie vorstehend mit dem Agonisten 1-Amino- cyclopentan-1, 3-dicarboxylsäure (ACPD)^10,21 beschrieben) und nahmen anschließend über eine Stunde hinweg ab unähnlich zu den EPSCs, welche sofort abschwächten. Das frühe LTD der EPSCs könnte durch einen präsynaptischen Mechanismus oder durch die schnelle Verteilung synaptischer NMDARs (ohne sofortige Internalisierung) erklärt werden. Eine Migration von NMDARs in der Membran wurde sowohl in kultivierten Zellen²² als auch in Schnitten²³ gezeigt. Ohne Berücksichtung der frühen Folgen ist die parallele Schwächung von NMDAR EPSCs und NMDA-hervorgerufenen Antworten 60 Minuten nach DHPG Behandlung mit einer möglichen Verringerung bei einer Oberflächen NMDAR Expression währen mGluR-LTD übereinstimmend.
d. Diskussion
Unsere Daten zeigen, dass eine Aktivierung von Gruppe 1 mGluRs in kultivierten hippocampalen Neuronen eine Internalisierung synaptischer AMPA und NMDA Rezeptoren stimuliert und dass die stabile Expression dieser Änderungen auf Proteinsyntheseinhibitoren empfindlich ist. Die gleiche DHPG Behandlung (50 µM, 5 Min.) in hippocampalen Schnitten stimuliert mGluR-LTD, das von einer postsynaptischen Translation 13 abhängt, und, wie wir jetzt zeigen, als eine Änderung in NMDAR-ebenso wie AMPAR-vermittelter Übertragung exprimiert wird. Ein Entfernen von synaptischen Glutamatrezeptoren ist daher ein möglicher Mechanismus für die Expression von mGluR-LTD im Hippocampus. Diese Ansicht stimmt mit der Erkenntnis überein, dass zerebrales LTD, welches ebenso durch Aktivierung von Gruppe 1 mGluRs ausgelöst wird, postsynaptische Endocytose von AMPARs²⁴ benötigt.
Von hippocampalen mGluR-LTD wurde bereits gezeigt mit einer verringerten Häufigkeit spontaner und hervorgerufener postsynaptischer Antworten zusammenzuhängen, welche gemäß der herkömmlichen Annahmen der Quantenanalyse einen präsynaptischen Expressionsmechanismus^8,9 nahe legten. Diese Daten stimmen allerdings ebenso mit "synaptischer Auslöschung" überein, welche durch den vollständigen Verlust an Rezeptoren bei einer aktivierten Synapse^16,17,25 entsteht.
NMDA-LTD hängt ähnlich zu dem, was wir folgend einer mGluR Aktivierung beobachten, mit einer verringerten Expression postsynaptischer AMPARs zusammen (und einer erniedrigten Häufigkeit spontan erregter postsynaptischer Ströme²). Grundsätzlich könnten die beiden Wege einer LTD Induktion in einem gemeinsamen saturierbaren Expressionsmechanismus an den gleichen Synapsen zusammenlaufen; wobei diese Hypothese allerdings mit der Erkenntnis in Konflikt steht, dass mGluR-LTD und NMDA-LTD sich nicht wechselseitig ausschließen^9,14. Eine Alternative besteht darin, dass mGluRs und NMDARs getrennte Population von AMPARs, vielleicht bei einzelnen Synapsenpopulation, regulieren.
Mehrere vorige Studien legten nahe, dass synaptische NMDARs relativ statisch im Vergleich zu AMPARs^4,19,27 sind. Wir finden allerdings, dass sowohl NMDARs als auch AMPARs mit einem ähnliche zeitlichen Verlauf (< 15 Min.) folgend einer DHPG Behandlung internalisiert werden. Eine schnelle Endocytose von NMDARs wurde ebenso bei unreifen kortikalen Kulturen unter Basalbedingungen²⁸ gezeigt. Diese Rezeptorinternalisierung wurde durch das Binden des postsynaptischen Dichteproteins PSD95 an den C-Terminus der NR2B Untereinheit inhibiert. Ein möglicher Mechanismus für eine DHPG-stimulierte NMDAR Endocytose könnte daher eine Regulierung der Wechselwirkung von PSD95 und NR2B einbeziehen.
Neben ihrer offenkundigen Bedeutung für hippocampales mGluR-LTD, liegt es nahe, dass unsere Erkenntnisse von zusätzlicher Bedeutung sind. Wir zeigen zuerst eine einzigartige Funktion für Proteinsynthese, welche, im Anbetracht vorheriger Erkenntnisse^13,26,29, wahrscheinlich in dem postsynaptischen Neuron als eine bestimmte Folge synaptischer Aktivität auftritt. Unter Einsatz von Glutamat-Rezeptor-Verkehr als Assay sollte diese Präparation sehr nützlich für ein aufgliedern des molekularen Mechanismus sein, der eine mGluR Aktivierung mit dendritischer mRNA Translationsregulierung koppelt. Der Verlust ionotropher Rezeptoren auf hippocampalen Neuronen folgend DHPG erinnert zweitens an das was an der neuromuskularen Verbindung vor einer Synapsenauslöschung³⁰ geschieht, wobei Gruppe 1 mGluRs neuerdings in den Verlust von Kletterfassersynapsen in dem entwickelnden Cerebellum³¹ einbezogen wurden. Daher sollte das Modell, welches wir hier beschreiben, für ein Testen der lange bestehenden Hypothese von Nutzen sein, dass mGluRs und der Mechanismus von LTD in eine aktivitätsabhängige Synapsenauslöschung in dem zerebralen Kortex^32,33 einbezogen sind.
e. Verfahren
Immunocytochemisches Protokoll mit sauren Streifen.
Kulturen geringer Dichte von Ratten hippocampalen Neuronen wurden wie bereits beschrieben³⁴ hergestellt. Alle Ratten wurden in der Tierpflegeeinrichtung der Brown Universität gehalten und alle Verfahren wurden durch den Tierpflege und Einsatzausschuss Brownuniversität anerkannt. In Kürze, wurde der Hippocampus von E18 Rattenföten entfernt, tryptinisiert (0,25%), durch Zerreibung dissoziiert und auf Poly-L-Lysin (1 mg/ml) beschichteten Deckgläsern aus Glas (80.000 Zellen/ml) für 4 h plattiert. Die Deckgläser wurden anschließend auf Teller übertragen, die eine Monoschicht Glialzellen in Wachstums medium enthalten, und den Neuronen wurde erlaubt 14-22 Tage zu reifen. Oberflächen AMPARs wurden auf lebende Zellen mit einem Antikörper markiert, der gegen dem extrazellularen N-Terminus der GluR1 Untereinheit (Aminosäuren 271-285; 5 µg pro ml; Oncogene Research, San Diego, Kalifornien und ein Geschenk von R. Huganir ist) gerichtet ist. Die Neuronen wurden anschließend mit einem bestimmten Agonisten der Gruppe 1 mGluRs DHPG, 50 µm in Medium oder Kontrollmedium für 5 Min. behandelt. Zehn oder fünfundfünfzig Minuten nach der Behandlung wurden die Zellen in 4°C Tris-gepufferter-Salzlösung (TBS) zum Anhalten der Endocytose gekühlt und anschließend 0,5 M NaCl/0,2 M Essigsäure (pH 3,5) für 4 Min. auf Eis ausgesetzt, um an extrazelluläres GluR1 gebundenen Antikörper zu entfernen. Die Kulturen wurden gewaschen und in 4% Paraformaldehyd mit 4% Sucrose fixiert. Ein unbestimmtes Färben wurde blockiert und die Zellen wurden in TBS permeabilisiert, das 0,1% Triton-X, 4% Ziegenserum und 2% BSA enthielt.
2) Immunochemische Lokalisierung synaptischer Rezeptoren.
Folgend einer Versuchsbehandlung wurden Kulturen geringer Dichte in 4% Paraformaldehyd mit 4% Sucrose für 5 Min. fixiert. Die Kulturen wurden in PBS gewaschen und anschließend in PBS mit 20% fötalem Rinderserum für 1 h blockiert. Die Kulturen wurden mit N-terminalen Rezeptorantikörpern über Nacht bei 4°C gefärbt (GluR2, 1:100, Chemicon, Ternecula, Kalifornien; GluR1, 1:100, Geschenk von R. Huganir; NR1, 1:500, Chemicon MAB363; GABA_Aβ₁, 1:100 Santa Cruz Biologicals, Santa Cruz, Kalifornien). Die Kulturen wurden anschließend in Blockpuffer für 20 Min. gewaschen, der 0,1% Triton X enthielt, und für 1 h bei Raumtemperatur Antikörpern ausgesetzt, die gegen präsynaptische Proteine gerichtet sind (Synapsin 1, 1:1000, Chemicon; Synaptophysin, 1:100, Boehringer Manheim, Irvine, Kalifornien). Die Kulturen wurden anschließend gewaschen und den geeigneten fluoreszierenden sekundären Antikörpern (Jackson Immunoresearch, West Grove, Pennsylvania) ausgesetzt.
3) Analyse der immunocytochemischen Daten.
Mikroskopie wurde mit einem Nikon E800 Mikroskop unter Einsatz eines 60 × 1,4 NA Objektivs (Melville, New York) durchgeführt. Fluoreszenzbilder wurden mit eines Sansys gekühlten CCD Kamera aufgenommen und mit IP-Labs Software analysiert. Zusätzliche Bilder wurden mit einem Olympus Fließansicht konfokalen Mikroskop mit einem 60 × 1,2 NA Objektiv aufgenommen. Alle Analysen wurden blind zu der Stimulationshistorie der Kultur durchgeführt. Mikroskopfelder wiesen 1-3 Neuronen mit mehreren verschiedenen Verfahren auf, welche eine weiche somatische und im Allgemeinen gesunde Morphologie zeigen. Immunofluoreszenz wurde entlang der proximalen 50 µm von 3 oder mehr Dendriten pro Neuron analysiert. Immunoreaktive Punkte wurden als einzelne Punkte entlang dem Dendriten mit einer zu der Hintergrundfärbung des Neurons doppelten Fluoreszenzintensität festgelegt. Fünf Zellen pro Kultur wurden analysiert und 3-6 Kulturen wurden pro Bedingung analysiert. Getrennte Kontrollen wurden mit jedem Versuch durchgeführt und ein Student t-Test wurde für eine Bestimmung statistischer Signifikanz eingesetzt. Daten sind als Punkte pro 10 µm Dendrit ausgedrückt sofern nicht anders angegeben.
4) Biochemische Messungen von Oberflächenexprimierten Rezeptoren
Biotinylierungsversuche wurden wie vorstehend beschrieben³⁵ durchgeführt. In Kürze, 2-Wochen alte kultivierte hippocampale Neuronen hoher Dichte wurden mit entweder Kontrollmedium oder 50 µM DHPG für 5 Min. behandelt und für 1 h bei 37°C inkubiert, um ein Auftreten der Endocytose zu ermöglichen. Die Schwesterkulturen wurden auf Eis platziert, und Endocytose anzuhalten, und zweimal mit eiskalter künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF) gewaschen, die 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 26 mM NaHCO₃, 0,8 mM MgCl₂, 1,8 mM CaCl₂ und 10 mM Dextrose enthielt und mit 95% O₂, 5% CO₂ gesättigt war. Die Kulturen wurden anschließend mit ACSF für 30 Min. auf Eis inkubiert, welches 1 mg/ml Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Die Kulturen wurden mit TBS gewaschen, um die Biotinreaktion zu quenchen. Die Kulturen wurden in 300 µl modifiziertem RIPA Puffer (1% TritonX-100, 0,1% SDS, 0,5% Deoxycholsäure, 50 mM NaPO₄, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF, 10 mM Natriumpyrophosphat, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 mM PMSF und 1 mg/ml Leupeptin) lysiert. Die Homogenate wurden bei 14.000 × g für 15 Min. bei 4°C zentrifugiert. Fünfzehn Mikroliter (5%) des Überstands wurden entfernt, um Gesamt-GluR1 oder NR1 zu messen; 200 µl (66,67%) des verbleibenden Überstands wurden mit 100 µl 50% Neutravidin Agarose (Pierce Chemical Company) für 3 h bei 4°C gewaschen und gebundene Proteine wurden in 40 µl SDS Probenpuffer wieder gelöst und gekocht. Quantitative Westernblots wurden sowohl mit Gesamt- als auch mit biotinylierten (Oberflächen) Proteinen unter Einsatz von anti-GluR1 C-terminalen (1:1000, Upstate Biotechnology, Lake Placid, New York) und anti-NR1 N-terminalen Antikörpern (1:1000, Chemicon) durchgeführt. Immunoreaktive Banden wurden durch verstärkte Chemilumineszenz (ECL, Amersham, Piscataway, New Jersey) sichtbar gemacht, eingefangen auf Autoradiographiefilmen (Amersham Hyperfilm ECL). Digitale Bilder, welche durch desitometrische Abtastung auf Autoradiographien auf einem ScanJet IIcx (Hewlett Packard, Palo Alto, Kalifornien) mit DeskScan II software (Hewlett Packard) erzeugt wurden, wurden unter Einsatz von NIH Image 1.60 Software quantifiziert. Das Oberflächen/Gesamt-Verhältnis wurde für jede Kultur berechnet und Behandlungsgruppen wurden unter Einsatz eines gepaarten t-Tests verglichen. Kontrollversuche bestätigten, dass das intrazelluläre Protein Aktin in diesem Assay nicht biotinyliert war. Die Daten sind aus Anzeigegründen als das Verhältnis von DHPG zu Kontrollwerten ausgedrückt.
5) mEPSC Aufnahmen und Analyse.
Kultivierte hippocampale Zellen wurden bei Raumtemperatur bei 1 ml/Min. in Medium superfusioniert (superfused), welches 140 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 10 mM HEPES, 20 mM Glucose, 1,8 mM CaCl₂, 0,8 mM MgCl₂, 0,05 mM Picrotoxin, 0,001 mM TTX enthielt, und der pH wurde mit NaOH auf 7,4 eingestellt. Patchelektroden (4-5 mΩ) wurden mit 116 mM K Gluconat, 6 mM KCl, 20 mM HEPES, 0,5 mM EGTA, 2 mM NaCl, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP, 10 mM Natriumphosphokreatin befüllt und auf pH 7,3 und eine Osmolarität von 300 mM eingestellt. Die Zellen wurden einer Klemmspannung von ~60 mV (nahe dem verbleibenden Membranpotential der Zellen) unterzogen und mEPSCs wurden unter Einsatz des Axopatch 1D Amplifier amplifiziert. Aufnahmen wurden bei 2 kHz gefiltert, bei 10 Hz digitalisiert und auf einem Computer unter Einsatz der Experimenter's Workbench (DataWave Systems, Boulder, Colorado) und auf einem Videoband gespeichert. Vor- und Eingangswiderstände wurden über den Versuch hinweg überwacht und ausschließlich jene Zellen, welche bei diesen Parametern stabil waren (< 15% Änderung), wurden in die Analyse aufgenommen. Der durchschnittliche Eingangswiderstand betrug ~600 MΩ und der durchschnittliche Vorwiderstand betrug ~15 MΩ. Ereignisse wurden lokal unter Einsatz eines automatischen Nachweisprogramms (MiniAnalysis, Synaptosoft, Decatur, Georgia) mit einem Nachweisschwellenwert nachgewiesen, der auf einen Wert größer als mindestens zwei Standardabweichungen der Werte des Hintergrunds gesetzt war. Der Nachweisschwellenwert verblieb für die Dauer von jedem Versuch konstant. Ausschließlich Ereignisse mit einer monoton ansteigenden Zeit und exponentieller Abnahme wurden in die Analyse aufgenommen. Intervalle zwischen den Ereignissen und mEPSC Amplitude wurden während eines 10 min. Basislinienzeitraums und in 10 min. Fenstern 15 und 60 Minuten nach Anwendung von 50 µM DHPG für 5 Min. verglichen. Aufgrund ungewöhnlicher Verteilungen der mEPSC Parameter wurden Statistiken unter Einsatz des Wilcoxon signedrank Tests durchgeführt und die Signifikanz wurde bei p < 0,05 platziert.
6) Hippocampale Schnittphysiologie.
Hippocampale Schnitte wurden auf P21.30 Long Evans Ratten (Charles River, Cambridge, Massachusetts) wie vorstehend beschrieben^13,14 hergestellt. Die Schnitte wurden für 1-2 h bei Raumtemperatur in künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit (ACSF) wiederhergestellt, die 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 26 mM NaHCO₃, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂ und 10 mM Dextrose enthielt und mit 95% O₂, 5% CO₂ gesättigt war. Die Schnitte wurden für eine Aufnahme in einer Submersionsaufnahmekammer platziert und mit 30°C ACSF bei einer Rate von 2 ml/min perfundiert.
Synaptisch hervorgerufenene NMDAR-vermittelte EPSCs wurden aus einem Bereich CA1, wie vorstehend für den visuellen Kortex²⁰ beschrieben, aufgenommen. NMDA-hervorgerufene Ströme wurde durch Pikospritzing 1 mM NMDA (hergestellt in ACSF) untersucht, welches für 3,5-12,5 ms nahe dem proximalen Abschnitt des primären apikalen Dendriten angewendet wurde. NMDA-hervorgerufene Ströme wurden jede zwei Minuten einmal ausgelöst. Simulationsintensität oder Pikospritzpuls-Dauer/Druck wurden eingestellt, um einen inneren Strom (inward current) mit einer Amplitude von 50 pA oder größer hervorzurufen.
f. Literaturhinweise

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Äquivalente
Der Fachmann wird unter Einsatz von nicht mehr als üblicher Versuchsdurchführung viele Äquivalente zu den bestimmten Ausführungsformen der hierein beschriebenen Erfindung erkennen oder in der Lage sein zu überprüfen. Es ist beabsichtigt, dass derartige Äquivalente von den nachstehenden Ansprüchen umfasst sind.

Claims

Verwendung eines Gruppe I mGluR Antagonisten für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Subjekts, das mindestens einen Zustand ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fragiles-X-Syndrom, Autismus und geistiger Zurückgebliebenheit, aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Gruppe I mGluR Antagonist eine ED50 für einen Antagonismus eines Gruppe I Rezeptors aufweist, die mindestens 10 mal geringer als die ED50 für einen Antagonismus eines Gruppe II oder Gruppe III Rezeptors ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der mGluR Antagonist ein mGluR5 Antagonist ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Gruppe I mGluR Antagonist eine ED50 für einen mGluR5 Antagonismus aufweist, die mindestens 10 mal geringer als die ED50 für einen mGluR1 Antagonismus ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Gruppe I mGluR Antagonist eine ED50 für einen Antagonismus eines ionotropen Glutamat-Rezeptors aufweist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Gruppe I mGluR Antagonist an einen mGluR Rezeptor oder ein intrazelluläres G Protein bindet, das an der mGluR Rezeptorsignaltransduktion beteiligt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Gruppe I mGluR Antagonist ausgewählt ist aus (E)-6-Methyl-2-styryl-pyridin (SIB 1893), 6-Methyl-2-(phenylazo)-3-pyridinol, α-Methyl-4-carboxyphenylglycin (MCPG), 2-Methyl-6-(phenylethinyl)-pyridin (MPEP).
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Gruppe I mGluR Antagonist in einer Dosis verabreicht wird, die sich von 10 bis 1000 mg/kg Körpergewicht/Tag erstreckt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Gruppe I mGluR Antagonist aufweist, eine ED50 von 1 µM oder weniger; wobei sie optional 100 nM oder weniger beträgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Gruppe I mGluR Antagonist einen therapeutischen Index (TI, therapeutic index) von 10 oder mehr aufweist; wobei er optional 100 oder mehr beträgt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Subjekt ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der mGluR Antagonist ein mGluR1 Antagonist ist.